Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bepaling van het plasmamembraan partitioneren voor zijdelings-geassocieerde eiwitten

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57837
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

ERRATUM NOTICE

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een kwantitatieve analyse van het niveau van de plasma-membraan vereniging voor fluorescently-tagged verbond-geassocieerde proteïne. De methode is gebaseerd op de computationele decompositie van membraan en cytoplasmatische onderdeel van signaal waargenomen in cellen die zijn gemarkeerd met plasmamembraan fluorescerende marker.

Abstract

Deze methode biedt een snelle aanpak voor de bepaling van het plasmamembraan partitioneren van elke fluorescently-tagged verbond-geassocieerde proteïne met behulp van de profielen van de intensiteit van de fluorescentie in het plasma-membraan. Gemeten fluorescentie profielen zijn voorzien van een model voor membraan en cytoplasma fluorescentie distributie langs een lijn die loodrecht op de rand van de cel toegepast. Dit model is opgebouwd uit de intensiteitswaarden van de fluorescentie in verwijzingen naar cellen, uiting van een marker van fluorescently gelabeld voor cytoplasma en met FM 4-64-geëtiketteerden plasma membraan. De methode kan worden toegepast op verschillende soorten cellen en organismen; echter kunnen alleen plasma membranen van niet-aangrenzende cellen worden geëvalueerd. Deze snel microscopie gebaseerde methode is geschikt voor de experimenten, waar subtiele en dynamische veranderingen van plasmamembraan-geassocieerde markers worden verwacht en moeten worden gekwantificeerd, bijvoorbeeldbij de analyse van de mutant versies van eiwitten, remmer behandelingen, en signaal transductie opmerkingen. De methode is geïmplementeerd in een multi-platform R-pakket dat is gekoppeld aan een macro ImageJ die als een gebruikersvriendelijke interface fungeert.

Introduction

Plasma-membraan verbond-geassocieerde eiwitten zijn de belangrijkste onderdelen van cel signalering trajecten. Een van hun fundamentele rol is hun voorbijgaande plasmamembraan associatie en dissociatie, die belangrijk is voor de signaaltransductie tussen het plasmamembraan en cytoplasma. Plasmamembraan verbond-geassocieerde eiwitten kunnen worden aangesloten op plasma membraan door lipide ankers (N-myristoylation, S-acylering of prenylation) of door lipide bindende domeinen (interactie met phosphatidylinositol fosfaten, phosphatidic zuur, etc.).

Plasma-membraan bindende eigenschappen van deze eiwitten kunnen worden onderzocht in vivo, bijvoorbeeldwanneer een fluorescently-tagged proteïne is gewijzigd door een plaats-geleide mutagenese van essentiële aminozuren, of wanneer het wordt behandeld met verschillende remmers beïnvloeden Lipide signalering. De verdelingen van perifere plasma membraaneiwitten worden meestal geëvalueerd kwalitatief, met name in gevallen, wanneer de herverdeling van eiwit duidelijk is. De onderhavige methode is optimaal voor situaties wanneer de herverdeling van de eiwitten is slechts gedeeltelijke en kwantitatieve beoordeling noodzakelijk is. Een veelgebruikte benadering van wanneer plasmamembraan vereniging wordt geschat uit confocale laser scanning microscopie beelden als een ratio van de intensiteit van de fluorescentie op het plasma-membraan en in het cytoplasma,1,2, is simpel, maar niet nauwkeurig. Intensiteit van de fluorescentie op het plasma-membraan weerspiegelen een superpositie van het signaal van het plasma-membraan en cytoplasma vanwege het lichte diffractie-kenmerk voor de techniek van specifieke fluorescentie microscopie en optische elementen gebruikt3. Bijgevolg is de cytoplasmatische signaal ook opgenomen in de membraan-regio. Om deze reden worden niet als een masker voor een membraan signaal selectie4FM 4-64 kleuring patroon gebruikt. Bovendien eenvoudige metingen van membraan signaal op de positie die is gedefinieerd door de FM 4-64 kleuring maximale altijd systematisch overschat het signaal van de echte plasma-membraan van plasma-membraan verbond-geassocieerde proteïne als gevolg van de superpositie van de membraan en cytoplasmatische compound. Het maximum van waargenomen signalen voor fluorescently-tagged verbond-geassocieerde eiwitten ook doet niet mede lokaliseren met het maximum van de markering van het plasma membraan (dat wil zeggen, FM 4-64 styryl kleurstof), maar is verschoven naar het cytoplasma. Een andere beperking is gebaseerd op het feit dat de FM 4-64 uitstoot piek groter in vergelijking met de toppen van de emissie voor de groen fluorescente proteïnen zoals GFP als gevolg van de golflengte-afhankelijkheid van lichte diffractie3 is.

In de hier beschreven methode, is het gecodeerde eiwit signaal door twee empirische functies, respectievelijk het beschrijven van een hypothetische verdeling van het plasmamembraan en het cytoplasma signaal, gemonteerd. Deze decompositie signaal wordt toegepast op lineaire fluorescentie-profielen die worden toegepast op het celoppervlak loodrecht op het plasma-membraan in de bronbeelden, die zijn regelmatige, twee-kanaals confocal secties fluorescently-tagged eiwit uiting te geven aan cellen voorzien van FM 4-64 kleurstof.

De eerste functie die wordt gebruikt voor montage beschrijft een diffractie van een signaal van het cytoplasma op de rand van de cel. Het wordt verkregen uit eerder verkregen fluorescentie-profielen die werden gemeten in cellen uiten een cytoplasma eiwit marker gelabeld door de dezelfde chromofore als het plasmamembraan verbond-geassocieerde proteïne van belang. De tweede functie beschrijven een diffractie van een plasmamembraan signaal is afgeleid van de fluorescentie van FM 4-64. Dit signaal wordt ten eerste benaderd door een Gauss functie die wordt gebruikt voor een geschatte modellering van lichte diffractie van een puntbron. In de tweede plaats is dit model, geldig voor rode FM 4-64 emissie, wiskundig getransformeerd naar het formulier die relevant zijn voor een golflengte van de emissie van de chromofore gebruikt voor de codering van zijdelings-geassocieerde eiwitten van belang op het plasma-membraan. Beide functies worden genormaliseerd door de maximale intensiteit en door het gemiddelde van 10% van de hoogste waarden voor FM 4-64 signaal en cytoplasmatische eiwit signaal, respectievelijk. Door deze ontleding van het signaal (niet-lineaire kleinste vierkante montage methode), kunnen de verhouding van het plasma-membraan en het cytoplasma breuk van het onderzochte eiwit worden geschat gemakkelijk en nauwkeurig. De echte fysieke dimensie van berekende partitionering coëfficiënt is in het bereik van micrometer, omdat cytoplasmatische volume concentratie wordt vergeleken met de oppervlakte concentratie op het plasma-membraan. Het definieert de afstand van het plasma-membraan naar het cytoplasma, waarbinnen de dezelfde hoeveelheid eiwitten is gelokaliseerd in het aangrenzende gebied van het plasma-membraan. Deze waarde is gelijk aan de partitionering coëfficiënt K2 introduceerde eerder5. De methode is zeer snel, waarvoor slechts één confocal secties verworven met behulp van routine confocale laser scanning microscoop, en het vraagt niet om computationeel. De kern van de analyse is uitgevoerd in een draagbaar R-pakket en een extra ImageJ macro is geschreven om grafische gebruikersinterface voor het uitvoeren van de analyse van de intuïtieve dialoogvensters. Software en meer gedetailleerde beschrijving van de methode (verschenen eerder6) kan gevonden worden op http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

De methode is geschikt voor de geïsoleerde, protoplasten, weefsels en cellen, indien het plasma-membraan van afzonderlijke cellen duidelijk te onderscheiden is, uiting geven aan een fluorescently-tagged constructie van onderzocht ook-geassocieerde eiwit. Een chromofore compatibel met FM 4-64 kleuring moet worden gebruikt. FM 4-64 stoot rode fluorescentie; Daarom kan onderzocht eiwit worden gecodeerd door een fluorescentie eiwit met blauwe, groene of gele emissie (bijvoorbeeldGFP, GVB, YFP). Stabiele transformatie van biologisch materiaal wordt aanbevolen omdat hierdoor minder kunstmatig en meer reproduceerbare opmerkingen van eiwit verdeling. Het is noodzakelijk dat het onderzochte eiwit een relatief homogene cytoplasmatische distributie heeft. De lokalisatie van een eiwitten in het endoplasmatisch reticulum of een andere intracellulaire membraan compartiment kan kunstmatige resultaten opleveren.

Bovendien moet het hetzelfde biologisch materiaal uiting van een cytoplasmatische marker worden gebruikt voor de vergelijking. Cellen kunnen worden getransformeerd door een gratis chomophore (dezelfde als gebruikt voor perifere eiwitten tagging, bijvoorbeeldgratis GFP) of gecodeerde proteïne van belang met afgeschaft membraan bindingscapaciteit. Membraan bindingscapaciteit kan worden afgeschaft, bijvoorbeeld door trimmen van de membraan-bindend domein of plaats-geleide mutagenese van essentiële aminozuur residua (bijv., sites voor N-myristoylation, S-acylering, of prenylation, enz.).

Voor confocale scanning microscopie, moeten de cellen worden gemarkeerd door een membraan marker zoals FM 4-64 kleurstof. Als FM 4-64 kleuring is niet geschikt voor het bestudeerde materiaal (als gevolg van storende autofluorescence, slechte kleurstofpenetratie, enz.), kan het plasma-membraan worden aangeduid, bijvoorbeeld door integraal plasmamembraan eiwit een passende chomophore (tagged mCherry, RFP, enz.). Het is essentieel dat de markering te verwaarlozen lokalisatie in het membraan van de intracellulaire compartimenten (endomembranes is).

Als u werkt met vaste samples en antilichamen, kan corrigeerbare analoge FM 4-64FX of plasmamembraan labelen door antilichaam tegen een juiste target worden gebruikt. In dit geval, is het essentieel om te evalueren van de resultaten zeer zorgvuldig omdat fixatie procedures tot selectieve verlies van eiwitten uit zowel het cytoplasma en het plasma membraan leiden kunnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van biologisch materiaal

  1. Biologisch materiaal uiten de fluorescently tagged proteïne van belang, evenals een cytoplasmatische marker voor te bereiden. Volg de procedures vermeld in de inleiding.

2. Confocale Laser Scanning Microscopie

  1. Vlekken van het materiaal opgesteld in sectie 1 met FM 4-64 kleurstof7.
    1. Een kleuring protocol die geschikt is voor het bestudeerde materiaal toepassen. Vlek 200 μL van celsuspensie met 0,2 μL van 10 mM FM 4-64 oplossing in dimethylsulfoxide voor tabak BY-2 cellen.
      Opmerking: De typische kleuring concentratie van FM 4-64 kleurstof is over 10 μM 10 mM stockoplossing met dimethylsulfoxide. Gebruik de laagste mogelijke concentratie van FM 4-64 voor de juiste kleuring en doen niet broeden cellen op ijs (FM 4-64 en lage temperatuur kan invloed hebben op de eigenschappen van het plasmamembraan). Ga verder met observatie confocale microscopie meteen gebruiken. Het interval tussen de kleuring en de Beeldacquisitie mag niet langer dan 10 min; anders endocytose van de kleurstof zal van invloed zijn op de FM 4-64 kleuring.
    2. Meerdere monsters opeenvolgend verwerkt en doen geen vlekken alle monsters aan het begin van het experiment.
  2. Vastleggen van een confocal dwarsdoorsnede per één cel.
    1. Stel een sequentiële scannen van het twee-kanaals voor de chromofore gebruikt als de tag van de eiwitten (moet in het eerste kanaal) en FM 4-64 (moet in het tweede kanaal). Stel een hogere optische resolutie (10 – 20 px/μm). Een voorbeeld set-up: 63 X olie-immersie objectief, NA 1.3, Afbeeldingsgrootte 1024 x 1024 px. Zorg ervoor dat het plasmamembraan vlak loodrecht op het vlak van de confocal-sectie in de verworven beelden.
    2. Vastleggen van ten minste 20 cellen per monster dat voldoende gegevens voor de beoordeling van statistiek (afhankelijk van de variabiliteit van het signaal in verwerkt materiaal).

3. vereiste Software-installatie

  1. Fiji ImageJ distributie8en de vereiste macro perifere installeren.
    1. Software downloaden vanaf de website https://fiji.sc/#download en installeren door het uitpakken.
    2. Fiji starten door te dubbelklikken op het bestand "ImageJ(.exe)" in de uitgepakte map "Fiji.app".
    3. Een macro "perifere" downloaden vanaf de volgende website:
      http://kfrserver.Natur.CuNi.cz/LiDE/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.IJM.
    4. Selecteer in Fiji, Plugins | Macro's | Installeren... in het hoofdmenu en geef het pad naar het gedownloade bestand "Peripheral_.ijm."
      Opmerking: Twee nieuwe instrumenten van de geïnstalleerde macro "perifere" verschijnt op de werkbalk van Fiji: "Take profiel Tool" en "Perifere eiwitten Menu."
  2. De R-project software9en de benodigde pakketten te installeren.
    1. Volg de instructies op de site https://cloud.r-project.org/ voor installatie van R-project.
      Opmerking: De algemene analyse zal worden uitgevoerd in Fiji. De R-software wordt alleen intern aangeroepen door de Fiji macro "perifere" tijdens de berekening.
    2. Stormloop van R GUI, uitgezocht pakketten | Installeren van pakket(ten)... in het hoofdmenu en geef de dichtstbijzijnde repository en pakket "ggplot2" voor installatie.
      Nota: Alternatief, typ de opdrachtregel r: install.packages("ggplot2").
    3. Download een perifere R-pakket van de bestemming: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Deze alsnog installeren door het selecteren van pakketten | Installeren van pakket(ten) van lokale bestanden....
      Nota: Alternatief, typ de opdrachtregel r deze opdracht alleen:
      install.packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo = NULL, type = "bron").

4. beeldanalyse in Fiji

  1. Het verwerken van de confocal beelden van de cytoplasmatische markering.
    1. De afbeeldingen importeren naar Fiji met behulp van Plugins | Bio-formaten | Bio-formaten importeur in het menu van de Fiji met standaardinstellingen.
    2. Controleer als de Bio-formaten-importeur de kalibratie van de afbeelding op de juiste wijze herkend. De dimensie van de foto weergegeven in het bovenste linker informatie veld afbeeldingsvenster moet gelijk zijn aan de oorspronkelijke afmetingen van de afbeelding.
    3. Traktatie niet correct gekalibreerd afbeeldingen met onjuiste afmetingen individueel, bijvoorbeelddoor het instellen van de juiste parameters in het dialoogvenster analyseren | Stel schaal... in het menu van Fiji: vult de breedte van de afbeelding in pixels in het veld van de afstand in pixels en de echte breedte in de juiste lengte-eenheid in het veld bekend afstand ).
      Opmerking: Als de Leica LCS LEI-bestanden niet correct zijn gekalibreerd, voert u stap 4.2.1.
  2. De Import opties macro voor de set-up van een analyse worden uitgevoerd. Activeren van de macro door drie verschillende manieren: Selecteer Plugins | Macro's | Importopties [f1] in het hoofdmenu van Fiji, Selecteer hetzelfde item na het klikken op het menu gereedschap Perifere eiwitten Menu, of druk op het toetsenbord short-cut F1. Stel de parameter in de aangeroepen macro tweespraak venster.
    1. In het geval van de Leica LCS LEI-indeling, lossen onjuiste kalibratie door het activeren van Leica.lei beelden -selectievakje. Deze optie importeert goed de afmetingen van de afbeelding uit het bestand met de extensie "lei".
    2. Definieert de juiste waarde in het veld Gaussian blur radius (px). Dit beïnvloedt de afbeelding vloeiend maken en lawaai-vermindering. Een lage waarde (1 px) is voldoende en leidt niet tot enig verlies beeld informatie.
    3. Stel een waarde in het veld lijndikte Profiel (px). Een dikkere lijn veroorzaakt hogere gladstrijken van de profiel-curven. Een 10 px is de aanbevolen standaardwaarde.
    4. Stel een afbeelding titel parseren door de definitie van "Monster scheidingstekens" en "Geëxporteerde items."
      Opmerking: Een afbeelding titel (bestandsnaam zonder extensie, bijvoorbeeld: "Experiment-1_line-02_cell-11") zal worden verdeeld rond alle tekens vermeld in het veld "Monster scheidingstekens" (bijvoorbeeld: "-_") in een set items ("Experiment", "1"," lijn","02","cel", en"11") die kunnen worden gebruikt als het groeperen van factoren (monster, cel, lijn of behandeling identiteit) in de volgende analyse. Bepalen welke items worden gebruikt door hun volgnummer ("0" voor het eerste item) typen in de gearchiveerde "Items geëxporteerd." Gebruik door spaties gescheiden indeling, bijvoorbeeld"3 5." In dit voorbeeld zal items "02" en "11" worden verwezen als het groeperen van factoren met de naam "Fac_0" en "Fac_1." Bovendien, zal de identiteit van elke meting worden hierna aangeduid als "ik" omstandigheid.
    5. Anderzijds houden de monster scheidingstekens leeg en 0 aangaan met de geëxporteerde items , indien de volledige afbeelding titel kan worden behouden.
    6. Op het Windows-besturingssysteem, moet u controleren als het pad naar de R-software correct automatische detectie in het veld pad naar R.exe zullen. Anders, geef het volledige pad naar het bestand R.exe in het systeem (bijvoorbeeld"C:\Program Files\R\bin\R.exe").
    7. Klik op OK. Controleer de titel parseren in het volgende dialoogvenster en klikt u op OK of terug om te resetten.
      Opmerking: Alle afbeeldingen worden automatisch gladgestreken en uiteindelijk passen. Een lijst van alle geëxporteerde groepering factoren zal worden weergegeven in het resultatenvenster.
  3. Uitvoeren van een lineaire selectie in de hele regio in de verwerkte beelden plasmamembraan en meten van de fluorescentie-profielen.
    1. Selecteer het gereedschap van de Fiji rechte lijn in de werkbalk van Fiji. Klik op de afbeelding en sleept u een lijn in de hele regio plasmamembraan. De lijn moet beginnen in de extracellulaire ruimte en moet loodrecht op het plasma-membraan. Kies regio's met een dikkere en meer homogene laag van corticale cytoplasma. De optimale lengte van de lineaire selectie is 5-10 μm.
    2. Voer de nemen profiel macro door analogisch methode zoals in de stap 4.2 (snelkoppeling 'x') of door te klikken op profiel Tool nemen op de Fiji-werkbalk. De automatische meting voor fluorescentie profiles in beide kanalen zullen worden uitgevoerd en gegevens worden weergegeven in het resultatenvenster.
    3. Als met behulp van de toets "x" wordt beschouwd als museumervaring, opent u het bronbestand van de macro Peripheral_.ijm in de teksteditor, vervangen door het symbool "x" in de regel "macro"Take profiel [x]"{' met een gunstiger symbool (die wordt niet gebruikt in de omgeving van Fiji als een het actieve toetsenbord short-cut) en sla het bestand. Installeer de macro (stap 3.1.4) en beginnen met de analyse van de afbeelding importeren.
    4. Nemen volgens individuele signaal variabiliteit, representatieve cijfers van de profielen voor elke cel.
    5. Opslaan van de gegevens via de bestand | Opslaan als.... Gebruik altijd de extensie "csv"; het is noodzakelijk voor de juiste dataformaat.
  4. Voer de Plot profiel gegevens macro (short-cut F5) voor grafische visualisatie van de gemeten profielen. Stel de parameter in de aangeroepen macro tweespraak venster.
    1. Houden het selectievakje Gebruik filters voor invoer? niet geselecteerd.
    2. Als het perceel moet worden gemaakt van recente gegevens in het venster resultaat uit een enkele CSV-bestand of uit alle CSV-bestanden in een opgegeven map door te klikken op het bijbehorende keuzerondje opgeven
      Opmerking: Als de plot is gemaakt op basis van recente resultaten, gegevens worden opgeslagen eerst (dialoogvensterOpslaan als … zal worden automatisch geactiveerd).
    3. Opgeven welke groepering factoren zal worden gebruikt voor het uitzetten door de desbetreffende selectievakjes te selecteren. Selecteer de factor "i." als alle profielen op de unieke percelen moeten worden weergegeven. Houd de selectievakjes uitgeschakeld, als alle gegevens moeten door die zijn uitgezet in een enkel perceel.
      Let op: Het selecteren van een groepering factor die niet in de verwerkte resultaten oorzaken fout tijdens het maken van het perceel bestaat.
    4. De bestandsnaam opgeven bij het opslaan van een perceel in het veld Output bestand voorvoegsel en de plot afbeelding afmetingen opgeven in bestanden Plot hoge en breedte van het perceel.
      Opmerking: De resulterende plot zal worden opgeslagen in een bronmap gegevens als een PNG-bestand.
    5. Selecteer de PDF-uitvoer? -selectievakje als een extra PDF uitvoer kan worden geproduceerd.
    6. Klik op OK. Specificeer het pad voor het opslaan van de resultaten of uiteindelijk voor gegevens importeren in het volgende dialoogvenster. Analyse bevestigen door te klikken op OK in het dialoogvenster windows de uitgevoerde R-code weergegeven.
      Opmerking: Het perceel zal worden geopend in een nieuw afbeeldingsvenster en de output R analyse zullen worden vermeld in het tekstvenster.
  5. Voer de filters in het profiel setup macro (short-cut-F2) hebt aantal uitgezette profielen buitensporige signalen in de extracellulaire ruimte (voor het gecodeerde eiwit) of in de intracellulaire ruimte (voor het signaal van de FM 4-64). Volg door het instellen van de parameters in de aangeroepen macro tweespraak venster.
    Opmerking: Filtering kunt het verwijderen van slechte profielen volgens de toegestane maximumlichtsterkte drempel op opgegeven x-coördinaten.
    1. Instellen voor elk kanaal, de juiste intensiteit drempel in het bestand verwijderen van metingen met een buitensporige extracellulaire (intracellulaire) signaal. Geef de regio waar de intensiteit drempel zal worden toegepast in het veld op x-coördinaten (groter) dan lager.
    2. De Plot profiel gegevens macro (stap 4.4) opnieuw uitvoeren met het selectievakje Gebruik filters voor invoer? geselecteerd; Zorg ervoor dat alle afwijkende profielen werden verwijderd. Anders, verbeteren de filtering parameters (stap 4.5.1).
  6. Voer de maken model macro (short-cut F3) als u wilt maken van een model van het plasma-membraan en het cytoplasma fluorescentie verdeling op basis van de kalibratiegegevens. Volg door het instellen van de parameters in de aangeroepen macro tweespraak venster.
    1. Geef als de invoergegevens gefilterde (stap 4.5) worden door het selecteren van moeten de Gebruik filters voor invoer? -selectievakje.
    2. Geef de brongegevens analogisch zoals in stap 4.4.2.
    3. Een interval waarin het model zal worden voorspeld door de definitie van "start", "einde", en "stap" waarden opgeven in micrometer.
      Opmerking: Alle profiel metingen mag langer zijn dan het opgegeven interval.
    4. De golflengten van fluorescentie excitatie en emissie-maxima van de chromophores gebruikt, in de desbetreffende velden opgeven. De standaardwaarden instellen voor GFP en FM 4-64 combinatie.
      Opmerking: "GFP" duidt de chromofore gebruikt voor de proteïne tagging (GFP, GVB, YFP, enz.) en "FM4" duidt de chromofore gebruikt voor een plasmamembraan kleuring (meestal FM 4-64).
    5. Het veld van de Output bestand voorvoegsel opgeven. Het voorvoegsel wordt gebruikt voor het opslaan van een resulterende model als het bestand RData een bronmap voor gegevens.
    6. Schakel het selectievakje Plot model? Als de grafische output vereist is. De plot wordt opgeslagen als het PNG-bestand, en ook als het PDF-bestand als de PDF-uitvoer? -selectievakje is ingeschakeld.
    7. Klik op OK. Geef de input of output paden in de volgende dialoogvensters en de analyse bevestigen door te klikken op OK in het dialoogvenster de uitgevoerde R-code weergegeven.
      Opmerking: De plot van de gemodelleerde cytoplasmatische en membraan samenstelling van de fluorescentie verbond-geassocieerde proteïne worden getoond in het venster van de nieuwe afbeelding, en de output R analyse zal worden vermeld in het tekstvenster.
  7. Het verwerken van de beelden van de cellen de uiting van de proteïne van belang.
    1. De afbeeldingen analogisch zoals in stap 4.1 importeren.
    2. De analyse analogisch zoals in stap 4.2 instellen. De demping en de standaardlijndikte moet identiek zijn.
    3. Het meten van de profielen analogisch zoals in stap 4.3.
    4. Controleren van de nauwkeurigheid van de profielen door plotten (stap 4.4) en het filter desgewenst (stap 4.5) instellen.
  8. Voer de berekenen distributie macro (short-cut F4) voor de berekening van een eiwit partitionering tussen het plasmamembraan en in het cytoplasma. Volg de parametrering in de aangeroepen macro tweespraak venster.
    1. Analogisch met de vorige stap (stap 4.4), geef de gegevensbron filteren en voorvoegsel van de bestandsnaam.
    2. Opgeven als het model voor eiwit verdeling berekening zal worden geladen vanuit de laatste model berekening in het recente geval van de "Perifere" macro op Fiji (select-selectievakje de nieuwste resultaten) of vanuit de RData bestand ( selectievakje- "vanuit bestand").
    3. Houd het selectievakje verwijderen van resultaten met residuele variabiliteit groter dan desgewenst een resultaat filteren is geactiveerd. De drempel van de maximale toegestane residuele variabiliteit die kan worden onverklaarbaar door de ontleding van het signaal van de meting van het individuele profiel opgeven Bijvoorbeeld: 0.200 de waarde geeft aan dat alle metingen met onverklaarbare variabiliteit hoger is dan 20% van de totale variabiliteit van de intensiteit van de fluorescentie in het profiel zal worden weggegooid.
    4. Selecteer monster groepering factoren, die kan worden gebruikt voor-Boxplot maken (stap 4.4).
    5. Activeren van het selectievakje PDF-uitvoer? voor het opslaan van de Boxplot als het PDF-bestand.
    6. Klikt u op OK, geef de input of output paden en de analyse bevestigen door te klikken op OK in het dialoogvenster de uitgevoerde R-code weergegeven.
      Opmerking: De box-plot van het verbond-geassocieerde proteïne partitionering tussen het plasmamembraan en het cytoplasma worden getoond in een nieuw afbeeldingsvenster, en de output R analyse zal worden opgenomen in het tekstvenster.
    7. Voor externe verwerking, de resultaten weergegeven in het resultatenvenster via bestand opslaan | Opslaan als... in het venstermenu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DREPP10 is een plant-specifieke verbond-geassocieerde plasma-membraan eiwit dat is gekoppeld aan het plasmamembraan via een N-myristoylation en een elektrostatische interactie met phosphatidylinositol fosfaten11, 12. DREPP werd beschreven als een onderdeel van calcium-signalering in de plant cel machines en ook samenwerkt met het cytoskelet13,14. In de gepresenteerde experiment, de tabak van de wild-type DREPP2 en de niet-myristoylated mutant versie (Gly2 vervangen door Ala) waren GFP-gelabeld6 en uitgedrukt in tabak BY-2 schorsing cellen15 onder de CaMV 35S promotor16. Het plasmamembraan partitioneren van deze proteïnen werden gemeten in 3 dagen oude (3 dagen na verdunning), FM 4-64-label (8 µM) cel culturen6 met (figuur 1A) en zonder (figuur 1B) de toevoeging van phosphoinositide 3-kinase remmer Wortmannin (10 µM)17, volgens het protocol zoals hierboven beschreven. De bijgesneden versie DREPP2(Δ1-23) ontbreekt het plasmamembraan bindend domein6 werd gebruikt als een marker van het cytoplasma voor de modelbouw van de fluorescentie-distributie (Figuur 1 c).

Berekende gegevens waren vierkantswortel getransformeerd (de positieve waarde overeenkomt met de laagste negatieve waarde is toegevoegd aan alle gegevens moeten worden opgehaald alleen positieve gegevens), en gegevens werden getest door two-way ANOVA in R9. De effecten van de mutatie en remmer behandeling waren zeer significant (p < 2.2 x 10-16 ***). Alle groepen werden vergeleken door Tukey HSD test; alle groepen verschilden significant met uitzondering van de DREPP2 door Wortmannin en niet-behandelde DREPP2(G2A) (Figuur 1 d) behandeld.

Deze resultaten tonen duidelijk aan dat de vereniging van de plasma-membraan van tabak DREPP2 eiwit is het resultaat van een N-myristoylation en elektrostatische interactie, die gezamenlijk functioneren. Alleen het wederzijdse effect van de N-myristoylation site mutatie en Wortmannin behandeling veroorzaakt een volledige dissociatie van het DREPP2 eiwit van het plasma-membraan. Deze resultaten zijn in overeenstemming met eerder gepubliceerde gegevens6.

Figure 1
Figuur 1 : Effect van de mutatie in de N-myristoylation site en Wortmannin behandeling op het plasmamembraan partitioneren van plasma-membraan verbond-geassocieerde proteïne DREPP, die betrokken is bij een calcium signalering traject in de plant cel. (A) mediale confocal secties van tabak door-2 cellen, uiting geven aan het wild type formulier DREPP2-GFP en de mutant vormen DREPP2 (Gly2Ala)-GFP (groene kanaal). Cellen waren gelabeld met FM 4-64 kleurstof (magenta kanaal), schaal bar 10 µm. (B) de dezelfde cellijn werd behandeld door 10 µM Wortmannin (WM). (C) cellen uiten cytoplasmatische markering DREPP2(Δ1-23). (D) de geschatte plasmamembraan partitioneren voor alle monsters. De betekenis van beide effecten werd getest door two-way ANOVA (p < 2.2 x 10-16 *** in beide gevallen; de oorspronkelijke gegevens werden vierkantswortel-getransformeerd). Brieven geven groepen die niet significant verschillend van elkaar als bepaald door de Tukey HSD-test. Snorharen van de vak-percelen geven 95%-betrouwbaarheidsinterval. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven methode genereert een nauwkeuriger schatting van het plasmamembraan partitioneren voor ook geassocieerde eiwitten in vergelijking met andere benaderingen gebaseerd op de meting van de fluorescentie intensiteiten5. De grote verbetering van deze methode is dat het houdt rekening met de lichte diffractie en superpositie van het plasma-membraan en de cytoplasmatische signalen. Hoewel deze methode resultaten in verband met de resultaten van een eenvoudige methode gebaseerd op de vergelijking van de intensiteit van de fluorescentie op de membraan positie met het gemiddelde cytoplasmatische zijn signaal (zoals eerder6), het grote voordeel van deze nieuwe methode is de bepaling van de resterende variabiliteit (onverklaarbaar door de ontleding van het signaal), waarmee de schatting van de relevantie van de resultaten, met name waar het plasmamembraan signaal is lager dan de cytoplasmatische signaal. De beschreven methode is ook robuuster aan de signaal-ruisverhouding, omdat de berekening van het partitioneren van de eiwitten is niet gebaseerd op slechts één punt.

De analyse vereist alleen enkele twee-kanaals confocal beelden. In tegenstelling tot FRAP benaderingen18 gebaseerd op metingen van eiwit diffusie dynamiek in langere tijd windows, geldt de beschreven methode meer voor dynamische in vivo benaderingen, wanneer snelle Beeldacquisitie een essentiële eis ( is bijvoorbeeld, signaal transductie verkenningen, remmende testen). De methode is geschikt voor het snel verkrijgen van grote hoeveelheden gegevens die toereikend zijn voor statistische evaluatie.

De methode is beperkt tot slechts een enkele membraan. De analyse van de signalen van twee nauw grenzend membranen van naburige cellen wordt momenteel niet ondersteund. In dit geval is de signaal-montage veeleisender met een hoger risico van artefacten.

Echter de analyse werd oorspronkelijk ontworpen voor cellen15van de opschorting van de plant, en kan worden toegepast voor analyses van evenals andere celtypes. Stuifmeel buizen en root haren vertegenwoordigen potentieel zeer goede doelen van deze methode in plantenbiologie. Externe membranen van epidermale cellen van de plant kunnen worden geanalyseerd na eerdere verificatie dat de celwanden worden niet aangeduid door FM 4-64 en geen storende autofluorescence vertonen. Protist cellen die vrij van storende autofluorescence, gistcellen, schimmel cellen, alsmede dierlijke cellen met gladde plasmamembraan zijn kunnen worden geanalyseerd met behulp van de beschreven methode; echter, voor dierlijke cellen kan de analyse van eiwit verdeling op de voorrand van de cellen van de fibroblast of op de rand van de borstel van epitheliale cellen niet mogelijk. Vanwege de instellingen voor flexibele analyse geëtiketteerde FM 4-64 kleuring kan worden vervangen door andere plasmamembraan visualisatie benaderingen, zoals fluorescently eiwitten. Met de nodige voorzichtigheid, kan de methode worden gebruikt voor vaste cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit project werd ondersteund door Binengrenzen I, LO1417 (Ministerie van onderwijs, jeugd en sport van de Tsjechische Republiek).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FM 4-64 ThermoFisher Scientific T13320 Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D4540 Sigma Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
  2. Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer. Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).
  3. Kubitscheck, U. Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , John Wiley & Sons. (2013).
  4. Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts. J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).
  5. Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).
  6. Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins. Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).
  7. Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).
  10. Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development. Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).
  11. Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane. J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).
  12. Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure. J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).
  13. Li, J., et al. MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).
  14. Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments. Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).
  15. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 Cell Line as the "HeLa" Cell in the Cell Biology of Higher Plants. Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).
  16. Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).
  17. Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Jr Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells. Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).
  18. Laňková, M., et al. Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy. Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).

Tags

Biologie kwestie 136 plasmamembraan verbond-geassocieerde proteïne membraan affiniteit membraan partitioneren confocal microscopie ImageJ R-project FM 4-64 deconvolution

Erratum

Formal Correction: Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins
Posted by JoVE Editors on 11/02/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. The Affiliations section was updated.

One of the affiliations was updated from:

Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University

to:

Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

Bepaling van het plasmamembraan partitioneren voor zijdelings-geassocieerde eiwitten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vosolsobě, S.,… More

Vosolsobě, S., Schwarzerová, K., Petrášek, J. Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. J. Vis. Exp. (136), e57837, doi:10.3791/57837 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter