Bestämning av plasmamembranet partitionering för perifert-associerade proteiner

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra en kvantitativ analys av plasmamembran föreningen för fluorescently-taggade perifert-associerade protein. Metoden är baserad på computational nedbrytning av membran och cytoplasmiska komponent signal som observerats i celler märkta med plasmamembranet fluorescerande markör.

Abstract

Denna metod ger en snabb metod för bestämning av plasmamembranet partitionering av någon fluorescently-taggade perifert-associerade protein använder profiler för fluorescensintensiteten över plasmamembranet. Uppmätta fluorescens profiler monteras av en modell för membran och cytoplasman fluorescens fördelning längs en linje tillämpas vinkelrätt till cell periferin. Denna modell är tillverkad av fluorescens intensitetsvärdena i referens celler som uttrycker en fluorescently-taggade markör för cytoplasman och med FM 4-64-märkt plasmamembranet. Metoden kan tillämpas på olika typer av celler och organismer. dock kan endast plasma membran av icke-angränsande celler utvärderas. Denna snabbt mikroskopi-baserade metod är lämplig för experiment, där subtila och dynamiska förändringar av plasmamembran-associerade markörer väntas och behöver kvantifieras, t.ex., i analysen av muterade versioner av proteiner, hämmare behandlingar, och signal transduktion observationer. Metoden är implementerad i en multi-plattform R-paket som är kopplat till ett ImageJ-makro som fungerar som ett användarvänligt gränssnitt.

Introduction

Perifert-associerade plasmamembran proteiner är de viktigaste komponenterna i cell signalering vägar. En av deras grundläggande roller är deras övergående plasmamembranet association och dissociation, vilket är viktigt för signaltransduktion mellan plasmamembranet och cytoplasman. Perifert-associerade plasmamembranet proteiner kan fästas på plasmamembranet av lipid ankare (N-myristoylation, S-acylation eller prenylation) eller av lipid bindande domäner (interagerar med fosfatidylinositol fosfater, fosfatidsyror acid, etc.).

Plasmamembran bindande egenskaper av dessa proteiner kan vara undersökt i vivo, t.ex., när ett fluorescently-taggade protein ändras genom en webbplats riktad mutagenes av viktiga aminosyror, eller när det behandlas med olika hämmare påverkar lipid signalering. Fördelningen av perifera plasma membranproteiner utvärderas mestadels kvalitativt, särskilt i fall, när protein omfördelning är uppenbart. Den presenterade metoden är optimal för situationer när protein omfördelning är endast delvis och kvantitativ utvärdering är nödvändig. En vanliga tillvägagångssätt när plasmamembranet föreningen uppskattas från confocal laser scanning mikroskopi bilder som en andel av fluorescens stödnivåer vid plasmamembranet- och i cytoplasman^1,2, är enkel, men inte korrekt. Fluorescens intensiteter på plasmamembranet återspeglar en överlagring av plasmamembran och cytoplasman signalen på grund av det lätta diffraktion kännetecknet för viss fluorescence mikroskopi teknik och optiska element används³. Följaktligen ingår den cytoplasmiska signalen också i regionen membran. Av denna anledning kan inte FM 4-64 färgning mönster användas som en mask för en membran signal urval⁴. Dessutom enkla mätningar av membran signal på den ståndpunkt som fastställts av FM 4-64 färgningen maximal alltid systematiskt överskattar riktiga plasmamembran-signalen av perifert-associerade plasma-membran protein på grund av överlagring av de membranet och cytoplasmiska förening. Maximalt antalet observerade signaler för fluorescently-taggade perifert-associerade proteiner också samtidig lokalisera inte med maximum av plasmamembranet markören (dvs, FM 4-64 styryl färgämne), men är skiftat mot cytoplasman. En annan begränsning är baserad på det faktum att FM 4-64 utsläpp peak är bredare i jämförelse med utsläpp toppar för grön fluorescerande proteiner såsom god Jordbrukarsed på grund av våglängd-beroendet av ljus diffraktion³.

I den metod som beskrivs här, monteras märkta proteinet signalen av två empiriska funktioner som beskriver en hypotetisk distribution av plasmamembran och cytoplasman signal, respektive. Denna signal nedbrytning används linjär fluorescens profiler som tillämpas på cellens yta vinkelrätt till plasmamembranet i källa bilder, som är regelbundna, två-kanals confocal delar av fluorescently-märkta proteinet uttrycker celler märkta med FM 4-64 färgämne.

Den första funktionen som används för montering beskrivs en diffraktion av cytoplasman signaler i cellen utkanten. Det erhålls från tidigare förvärvade fluorescens profiler som mättes i celler som uttrycker cytoplasma protein markör märkta av samma kromoforen som plasmamembranet perifert-associerade protein av intresse. Den andra funktionen som beskriver en diffraktion plasmamembran signal härleds från fluorescensen av FM 4-64. Denna signal är för det första tillnärmas genom en Gaussisk funktion som används för en ungefärlig modellering av light diffraction av en punktkälla. För det andra, denna modell, giltig för röda FM 4-64 utsläpp, matematiskt förvandlas till formuläret som är relevant för emissionsvåglängden kromoforen används för märkning av perifert-associerade proteiner av intresse på plasmamembranet. Båda funktionerna är normaliserade genom maximal intensitet och medelvärdet från 10% av de högsta värdena för FM 4-64 signal och cytoplasmatiska protein signal, respektive. Av denna signal nedbrytning (icke-linjära minst fyrkantig passande metod), kan förhållandet mellan plasmamembranet och cytoplasman fraktionen av proteinet undersökta uppskattas enkelt och exakt. Den verkliga fysiska dimensionen av beräknade partitionering koefficient är i spänna av mikrometer, eftersom cytoplasmiska volym koncentration jämförs med surface koncentration på plasmamembranet. Den definierar avståndet från plasmamembranet till cytoplasman, där samma mängd proteiner är lokaliserad i det närgränsande området av plasmamembranet. Detta värde motsvarar partitioneringen koefficient K₂ introducerat tidigare⁵. Metoden är mycket snabb, kräver endast enstaka confocal sektioner förvärvade använder rutinmässigt confocal laserscanning mikroskopet, och det är inte beräkningsmässigt krävande. Analys kärnan har genomförts i en bärbar R-paket och ett ytterligare ImageJ makro skrevs att tillhandahålla grafiskt användargränssnitt för att köra analysen från de intuitiva dialogrutorna. Programvara och mer detaljerad beskrivning av metoden (tidigare publicerade⁶) kan hittas på http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

Metoden är lämplig för isolerade celler, protoplasts och vävnader, där plasmamembranet av enskilda celler är klart urskiljbara, uttrycker en fluorescently-taggade konstruktion av undersökt perifert-associerade protein. En kromofor kompatibel med FM 4-64 färgning måste användas. FM 4-64 avger röd fluorescens; undersökta protein kan därför vara märkta av ett fluorescens protein med blå, gröna eller gula utsläpp (t.ex., GFP, GFP, YFP). Stabil omvandling av biologiskt material rekommenderas eftersom det möjliggör mindre konstgjord och mer reproducerbara observationer av protein distribution. Det är nödvändigt att det undersökta proteinet har en relativt homogen cytoplasmisk fördelning. Lokaliseringen av ett protein i det endoplasmatiska retiklet eller en annan intracellulära membran kan ge konstgjord resultat.

Samma biologiska material att uttrycka en cytoplasmiska markör måste dessutom användas för jämförelse. Celler kan omvandlas genom en gratis chomophore (samma som används för perifera protein taggning, t.ex., gratis GFP) eller märkta proteinet sevärdheter med avskaffade membran bindande kapacitet. Membranet bindande kapacitet kan avskaffas, exempelvis genom trimning av membran-bindande domänen eller webbplats riktad mutagenes av viktiga aminosyran resittillstånd (e.g., platser för N-myristoylation, S-acylation, eller prenylation, etc.).

För skanning konfokalmikroskopi, måste celler märkas av en membran markör som FM 4-64 färgämne. Om FM 4-64 färgning inte är lämplig för det studera materialet (på grund av störande autofluorescens, dålig dye penetration, etc.), kan plasmamembranet märkas, exempelvis genom integrerad plasma membranprotein taggade till en lämplig chomophore ( mCherry, RFP, etc.). Det är viktigt att markören har försumbar lokalisering i de intracellulära membran fack (endomembranes).

Om arbetar med fasta prover och antikroppar, kan fastställbara analog FM 4-64FX eller plasmamembran märkning av antikroppar mot ett lämpligt mål användas. I det här fallet är det viktigt att mycket noga utvärdera resultaten eftersom fixering förfaranden kan leda till selektiv förlust av proteiner från både cytoplasman och plasmamembranet.

Protocol

1. beredning av biologiskt Material

1. Förbereda biologiskt material att uttrycka fluorescently märkta proteinet av intresse, liksom en cytoplasmiska markör. Följa de procedurer som nämndes i inledningen.

2. confocal Microscopy för laserscanning

1. Färga det material som beretts i avsnitt 1 med FM 4-64 dye⁷.
   1. Applicera en färgning protokoll som är lämplig för det studera materialet. För tobak BY-2 celler, fläcken 200 μl cellsuspension med 0.2 μL 10 mm FM 4-64 lösning i dimetylsulfoxid.
      Obs: Den typiska färgning koncentrationen av FM 4-64 dye handlar om 10 μM med 10 mM stamlösning i dimetylsulfoxid. Använd den lägsta möjliga koncentrationen av FM 4-64 för korrekt färgning och inte Inkubera cellerna på is (FM 4-64 och låg temperatur kan påverka plasmamembranet egenskaper). Fortsätta med observation med konfokalmikroskopi omedelbart. Intervallet mellan färgningen och bild förvärv bör inte vara längre än 10 min; endocytos av färgämnet kommer annars att påverka FM 4-64 färgning.
   2. Bearbeta flera prover i följd och inte fläckar alla prover i början av experimentet.
2. Fånga en confocal tvärsnittsdiametern per en cell.
   1. Ange en sekventiell två-kanals skanning för kromoforen används som protein-taggen (måste vara i den första kanalen) och FM 4-64 (måste vara i den andra kanalen). Ange en högre optisk upplösning (10 – 20 px/μm). Ett exempel set-up: 63 X olja nedsänkning mål, NA 1.3, bildstorlek 1024 x 1,024 px. Säkerställa att plasmamembranet planet är vinkelrät mot confocal-avsnitt planet i förvärvade bilder.
   2. Fånga minst 20 celler per prov att ha tillräckligt med data för statistisk utvärdering (beroende på signal variabiliteten i bearbetat material).

3. krävs programinstallation

1. Installera Fiji ImageJ distribution⁸och önskad makrot perifera.
   1. Hämta programvara från webbplats https://fiji.sc/#download och installera dem genom att packa upp.
   2. Starta Fiji genom att dubbelklicka på filen ”ImageJ(.exe)” i den uppackade katalogen ”Fiji.app”.
   3. Hämta ett makro ”perifera” från följande webbplats:
      http://kfrserver.natur.Cuni.cz/LiDE/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.IJM.
   4. I Fiji, Välj Plugins | Makron | Installera... i huvudmenyn och ange sökvägen till den nedladdade filen ”Peripheral_.ijm”.
      Obs: Två nya verktyg installerade makro ”perifera” visas i verktygsfältet Fiji: ”ta profil verktyg” och ”perifer Protein meny”.
2. Installera R-projektet programvara⁹och paket som krävs.
   1. Följ instruktionerna på den webbplatsen https://cloud.r-project.org/ för R-projektet installation.
      Obs: Den övergripande analysen utförs i Fiji. R programvaran kommer att kallas endast internt av Fiji makrot ”perifera” under beräkningen.
   2. Kör R GUI, Välj paket | Installera paket... i huvudmenyn, och ange närmaste repository och paketet ”ggplot2” för installation.
      Obs: Du kan också skriva till R kommandoraden: install.packages("ggplot2").
   3. Hämta en R package perifera från målet: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Installera dem genom att välja paket | Installera paket från lokala filer....
      Alternativt, skriv till R kommandoradsverktyget detta kommando endast:
      install.packages (”http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz”, reporäntan = NULL, typ = ”källa”).

4. bildanalys i Fiji

1. Behandla de confocal bilderna av cytoplasmisk marker.
   1. Importera bilder till Fiji med Plugins | Bio-format | Bio-format importör från menyn Fiji med standardinställningarna.
   2. Kontrollera om Bio-format importören korrekt bild kalibreringen. Dimensionen bild visas i fönstret övre vänstra information fältet bild måste vara lika med de ursprungliga bilden dimensionerna.
   3. Behandla felaktigt kalibrerad bilder med den felaktiga mått individuellt, t.ex., genom att ange korrekta parametrar i dialogfönstret analysera | Ange skala... från menyn Fiji: Fyll bildbredd i bildpunkter i fältet avståndet i bildpunkter och den verkliga bredden i lämplig längd enhet i fältet känt avstånd ).
      Obs: Om Leica LCS LEI filerna är felaktigt kalibrerad, Följ steg 4.2.1.
2. Kör Import alternativ makro för en analys. Aktivera makrot genom ett av tre olika sätt: Välj Plugins | Makron | Importera alternativ [f1] i Fiji huvudmenyn, Välj samma punkt efter att klicka på verktyget menyn Perifera Protein-menyn, eller tryck på tangentbordet genväg F1. Ställ in parametern anropade makrot i dialogfönstret.
   1. Vid det Leica LCS LEI-formatet, lösa felaktig kalibrering genom att aktivera Leica.lei bilder -kryssrutan. Här alternativet importeras korrekt bildens dimensioner från filen med tillägget ”lei”.
   2. Ange lämpligt värde i fältet Gaussian blur radius (px). Detta påverkar bilden utjämning och buller minskning. Ett lågt värde (1 px) är tillräcklig och orsakar inte någon bild informationsförlust.
   3. Ange ett värde i fältet profil linjebredd (px). En tjockare linje orsakar högre utjämning av profil kurvor. Ett standardvärde 10 px rekommenderas.
   4. Ange en bild titel tolkning av definitionen av ”prov avgränsare” och ”exporterade objekt”.
      Obs: En bild titel (filnamn utan förlängning, t.ex.: ”Experiment-1_line-02_cell-11”) delas runt alla de tecken som anges i fältet ”prov avgränsare” (t.ex.”:-_”) i en uppsättning av objekt (”Experiment”, ”1” ”, (linje ”,” 02 ”,” cell ”och” 11 ”) som kan användas som gruppering faktorer (prov, cell, rad eller behandling identitet) i följande analys. Definiera vilka artiklar som ska användas genom att skriva deras sekvensnumret (”0” för det första objektet) i den arkiverade ”exporterade objekt”. Använda blankteckenavgränsad, t.ex., ”3 5”. I det här exemplet refereras objekt ”02” och ”11” till som gruppering faktorer som heter ”Fac_0” och ”Fac_1”. Dessutom kommer att identiteten för varje mätning kallas ”jag” faktor.
   5. Alternativt hålla provet avgränsare tomt och ange 0 till de exporterade poster om hela bilden titeln får behållas.
   6. På Windows-operativsystemet, kontrollera om sökvägen till R programvaran kommer att vara korrekt automatisk-upptäckt i fältet sökväg till R.exe. Annars, ange den fullständiga sökvägen till filen R.exe i systemet (t.ex., ”C:\Program Files\R\bin\R.exe”).
   7. Klicka på OK. Kontrollera titeln parsing i nästa dialogfönster och klicka på OK eller tillbaka till Återställ.
      Obs: Alla bilder kommer att vara automatiskt jämnas och så småningom omkalibreras. En lista över alla exporterade gruppering faktorer visas i fönstret resultat.
3. Utföra en linjär urval över plasmamembranet regionen i de bearbetade bilderna och mäta fluorescens profilerna.
   1. Välj verktyget Fiji rak linje från verktygsfältet i Fiji. Klicka på bilden och dra en linje över plasmamembranet regionen. Raden måste börja i extracellulära och bör vara vinkelrätt mot plasmamembranet. Välj regioner med en tjockare och mer homogena skikt av kortikala cytoplasman. Den optimala längden på en linjär markering är 5-10 μm.
   2. Kör den ta profil makro genom analogiskt metod som i steget 4.2 (genväg ”x”) eller ta profil verktyg i verktygsfältet Fiji. Automatisk mätning av fluorescens profiler i båda kanalerna kommer att utföras och data visas i fönstret resultat.
   3. Om med ”x”-tangenten anses användarovänligt, öppna makrot källfilen Peripheral_.ijm i textredigeraren, ersätta ”x”-symbolen i raden ”makro” ta profil [x] ”{' med en mer gynnsam symbol (som inte används i Fiji miljö som en aktiva tangentbordet genväg) och spara filen. Installera om makrot (steg 3.1.4) och starta analysen från den image-importen.
   4. Enligt enskilda signalen variabilitet, ta representativa siffror av profiler för varje cell.
   5. Spara data via fil | Spara som.... Alltid använda tillägget ”csv”; Det är nödvändigt för korrekt dataformat.
4. Kör den Rita profil datamakro (genväg F5) till grafisk visualisering av uppmätta profiler. Ställ in parametern anropade makrot i dialogfönstret.
   1. Hålla kryssrutan använda filtrering för dataunderlag? omarkerade.
   2. Ange om tomten ska skapas från senaste data i fönstret resultat från en enskild CSV-fil eller från alla CSV-filer i en angiven katalog genom att klicka på lämplig alternativknapp.
      Obs: Om tomten skapas från senaste resultat, data sparas först (Spara som... dialogrutan aktiveras automatiskt).
   3. Ange vilka gruppering faktorer kommer att användas för att rita genom att markera kryssrutorna. Välj faktorn ”i.” om alla profiler ska visas i unika tomter. Hålla kryssrutor omarkerade, om alla data bör av ritade i en enda tomt.
      FÖRSIKTIGHET: För att välja av en gruppering faktor som inte existerar i bearbetade resultat orsakar fel under tomt skapande.
   4. Ange filnamn när du sparar en tomt i fältet utgång fil prefix och definiera tomt bilddimensionerna i filer tomt hög och tomt bredd.
      Obs: Den resulterande tomten kommer att sparas i en källkatalog data som en PNG-fil.
   5. Välj den PDF-utdata? kryssrutan om en ytterligare PDF utdata kan produceras.
   6. Klicka på OK. Ange sökvägen för att spara resultaten eller så småningom för data importera nästa i dialogfönstret. Bekräfta analys genom att klicka på OK i dialogrutan windows visar utförs R koden.
      Obs: Tomten kommer att öppnas i ett nytt bildfönster och R analys utdata visas i textfönstret.
5. Kör profil filtrering setup makro (genväg F2) om vissa plottade profiler har överdrivna signaler i extracellulära (för märkta proteinet) eller i intracellulära utrymmet (för signalen FM 4-64). Följ genom att ange parametrarna i det anropade makrot dialogfönstret.
   Obs: Filtrering möjliggör avlägsnande av dålig profiler enligt högsta tillåtna stödnivå tröskeln på angivna x-koordinater.
   1. För varje kanal, ange lämplig intensitet tröskelvärde i filen ta bort mätningar med en överdriven extracellulära (intracellulära) signal. Ange region där tröskeln intensitet ska tillämpas i det fältet på x-koordinater lägre (större) än.
   2. Kör den Rita profil datamakro (steg 4,4) igen med kryssrutan använda filtrering för dataunderlag? markerad. Se till att alla avvikande profiler var tagits bort. Annars, förbättra filtrering parametrar (steg 4.5.1).
6. Kör skapa modell makro (genväg F3) för att skapa en modell av plasmamembranet och cytoplasman fluorescens fördelningen utifrån kalibreringsdata. Följ genom att ange parametrarna i det anropade makrot dialogfönstret.
   1. Ange om indata ska vara filtrerad (steg 4,5) genom att välja den använda filtrering för dataunderlag? kryssrutan.
   2. Ange vilka källdata tanke som i steg 4.4.2.
   3. Ange ett intervall som modellen kommer förutsägas av definitionen av ”start”, ”slut”, och ”steg” värden i μm.
      Obs: Alla profil mätningar bör vara längre än det angivna intervallet.
   4. Ange våglängder av fluorescens excitation och utsläpp maxima av de chromophores som används i lämpliga fält. Ange standardinställningar för god Jordbrukarsed och FM 4-64 kombination.
      Obs: ”God Jordbrukarsed” kromoforen används för proteinet taggning (GFP, GFP, YFP, etc.) och ”FM4” anger kromoforen används för en plasma membran färgning (vanligtvis FM 4-64).
   5. Ange fältet Output fil prefix . Prefix används för att spara en resulterande modell som RData filen till en källkatalog data.
   6. Markera kryssrutan tomt modell? Om grafiska utdata krävs. Tomten kommer att sparas som PNG och även som PDF-filen om den PDF-utdata? kryssrutan är markerad.
   7. Klicka på OK. Ange indata eller utdata stigar i de nästa dialogfönster och bekräfta analysen genom att klicka på OK i dialogrutan visar utförs R koden.
      Obs: Handlingen av den modellerade cytoplasmiska och membran förening av perifert-associerade protein fluorescensen visas i det nya bildfönstret och R analys utdata visas i textfönstret.
7. Bearbeta bilder av de celler som uttrycker proteinet av intresse.
   1. Importera bilder tanke som i steg 4.1.
   2. Ställa in analysen tanke som i steg 4,2. Utjämning och linje bredd bör vara identiska.
   3. Mäta profilerna tanke som i steg 4,3.
   4. Kontrollera riktigheten av profilerna genom att rita (steg 4,4) och ange filtrering om så önskas (steg 4,5).
8. Kör beräkna fördelningen makro (genväg F4) för beräkning av ett protein som partitionering mellan plasmamembranet och i cytoplasman. Följ parameterinställningen anropade makrot i dialogfönstret.
   1. Tanke med det föregående steget (steg 4,4), Ange datakälla, filtrering och filnamnsprefix.
   2. Ange om den modellen för beräkning av protein fördelningen kommer att laddas från senaste modell uträkningen i den senaste instansen av de ”perifera” makron på Fiji (Välj kryssrutan senaste resultat) eller från den RData fil ( Markera kryssrutan ”från fil”).
   3. Hålla kryssrutan ta bort resultat med kvarvarande variabilitet större än aktiveras om ett resultat filtrering önskas. Ange tröskelvärdet för den maximalt tillåtna kvarstående variationen som kan vara oförklarlig av signal nedbrytning av individuell profil mätningen. Till exempel: 0,200 värdet anger att alla mätning med oförklarliga variabilitet högre än 20% av den totala variationen av fluorescensintensiteten i profilen kommer att slängas.
   4. Välj prov gruppering faktorer, som kan användas för lådagram skapa (steg 4.4).
   5. Aktivera kryssrutan PDF-utdata? för att spara rutan-tomten som PDF-fil.
   6. Klicka på OK, ange indata eller utdata sökvägar och bekräfta analysen genom att klicka på OK i dialogrutan visar utförs R koden.
      Obs: Box-handlingen i perifert-associerade protein partitionering mellan plasmamembranet och cytoplasman visas en ny bild-fönster, och R analys utdata visas i textfönstret.
   7. För extern behandling, Spara resultaten som visas i fönstret resultat via fil | Spara som... i fönstermenyn.

Representative Results

DREPP¹⁰ är ett anläggningsspecifika perifert-associerade plasma-membran protein som associeras med plasmamembranet via en N-myristoylation och en elektrostatisk interaktion med fosfatidylinositol fosfater^{11, 12}. DREPP beskrevs som en komponent av Kalciumsignalering maskiner i cellen växt och samverkar också med cytoskelettet^13,14. I presenterade experimentet, vildtyp tobaken DREPP2 och dess icke-myristoylated mutant version (Gly2 ersättas av Ala) var GFP-märkta⁶ och uttryckt i tobak BY-2 suspension celler¹⁵ under den CaMV 35S promotor¹⁶. Plasmamembranet delningen av dessa proteiner mättes i 3 dagar gamla (3 dagar efter utspädning), FM 4-64-märkt (8 µM) cell kulturer⁶ med (figur 1A) och utan (figur 1B), tillägg av fosfoinositid 3-Kinas hämmare Wortmannin (10 µM)¹⁷, enligt de protokoll som beskrivs ovan. Den klippta versionen DREPP2(Δ1-23) saknar plasmamembranet bindande domän⁶ användes som en cytoplasman markör för fluorescens distribution modell konstruktion (figur 1 c).

Beräknade data var torget-root omvandlas (det positiva värdet motsvarar det lägsta negativa värdet lades till alla data som ska hämtas endast positiva data), och data testades av tvåvägs ANOVA i R⁹. Effekterna av mutation och hämmare behandling var mycket betydelsefullt (p < 2,2 x 10^-16 ***). Alla grupper jämfördes genom Tukey HSD test; alla grupper skiljde sig signifikant med undantag av DREPP2 behandlas av Wortmannin och icke-behandlade DREPP2(G2A) (figur 1 d).

Dessa resultat visar tydligt att plasmamembran föreningen av tobak DREPP2 protein är resultatet av en N-myristoylation och elektrostatiska växelverkan, som fungerar tillsammans. Endast de ömsesidig effekten av N-myristoylation webbplats mutation och Wortmannin behandling orsakade en fullständig dissociation av proteinet DREPP2 från plasmamembranet. Dessa resultat är i enlighet med tidigare publicerade data⁶.

Figur 1 : Effekt av mutation i N-myristoylation webbplats och Wortmannin behandling på plasmamembranet delningen av perifert-associerade plasmamembran protein DREPP, som är involverad i en calcium signalering utbildningsavsnitt i cellen växt. (A) mediala confocal delar av tobak BY-2-celler som uttrycker den vilda formen DREPP2-GFP och mutant bilda DREPP2 (Gly2Ala)-GFP (gröna kanalen). Cellerna var märkt med FM 4-64 färgämne (magenta kanal), skala bar 10 µm. (B) samma cell linje behandlades av 10 µM Wortmannin (WM). (C) celler som uttrycker cytoplasma markör DREPP2(Δ1-23). (D) den uppskattade plasmamembranet partitionering för alla prover. Betydelsen av både effekter testades av tvåvägs ANOVA (p < 2,2 x 10^-16 *** i båda fallen; var originalinformationen kvadratroten-omvandlad). Bokstäver anger grupper som inte avsevärt skiljer sig från varandra som bestäms av Tukey HSD testet. Morrhår av box-tomterna anger 95% konfidensintervall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den metod som beskrivs här ger en mer exakt uppskattning av plasmamembranet partitionering för perifert associerade proteiner jämfört med andra tillvägagångssätt baserat på mätning av fluorescens stödnivåer⁵. Större förbättring av denna metod är att det tar hänsyn till de lätta diffraktion och överlagring av plasmamembranet- och cytoplasmiska signaler. Även om dessa metod resultat i korrelation med resultaten av en enkel metod som bygger på jämförelse av fluorescensintensiteten vid membran position med genomsnittligt cytoplasmiska signal (som tidigare⁶), den stora fördelen med denna nya metod är bestämning av kvarstående variationen (oförklarlig genom signal nedbrytning) som tillåter skattning av relevansen av resultaten, särskilt där plasmamembranet signalen är lägre än den cytoplasmiska signalen. Den beskrivna metoden är också mer robust att det signal-bruset eftersom uträkningen av protein partitionering inte är baserad på endast en punkt.

Analysen kräver endast enstaka två-kanals confocal bilder. I motsats till FRAP metoder¹⁸ baserat på mätningar av protein diffusion dynamics i längre tid windows, är den beskrivna metoden mer tillämplig för dynamisk i vivo tillvägagångssätt, när snabb bild förvärv är ett avgörande krav ( e.g., signal transduktion utforskningar, hämmande analyser). Metoden är lämplig för att snabbt erhålla stora mängder data som är tillräckliga för statistisk utvärdering.

Metoden är begränsad till endast ett enda membran. Analys av signaler från två tätt intilliggande membran av angränsande celler stöds för närvarande inte. I detta fall är signalen montering mer krävande med en högre risk av artefakter.

Men analysen utformades ursprungligen för växt suspension celler¹⁵, och det kan användas för analyser av andra celltyper samt. Pollen-rör och rothår representerar potentiellt mycket bra mål av denna metod i växtbiologi. Yttre membran av växten epidermala celler kan analyseras efter föregående kontroll av att cellväggarna inte är märkta av FM 4-64 och inte uppvisar störande autofluorescens. Färglösa celler som är fri från störande autofluorescens, jästceller, svampceller, samt djurceller med smidig plasmamembranet kan analyseras med den beskrivna metoden; dock för djurceller kan inte analysen av protein fördelningen på framkanten av fibroblast celler eller borste gränsen av epitelceller vara möjligt. Tack vare de flexibla inställningarna taggade FM 4-64 färgning kan ersättas av andra plasmamembranet visualisering metoder, såsom fluorescently proteiner. Med försiktighet, kan metoden användas för fasta celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer