Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحديد التقسيم غشاء البلازما للبروتينات المرتبطة محيطيا

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57837
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

ERRATUM NOTICE

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لإجراء تحليل الكمي لمستوى رابطة غشاء البلازما لمعلم فلوريسسينتلي البروتينات المرتبطة بالمحيط. الأسلوب يستند إلى عنصر هيولى من الإشارات التي لوحظت في الخلايا المسماة بعلامة نيون غشاء البلازما وتحلل الغشاء الحسابية.

Abstract

يوفر هذا الأسلوب نهجاً سريعة للبت في غشاء البلازما تقسيم أي معلم فلوريسسينتلي المرتبطة محيطيا البروتين باستخدام التشكيلات الجانبية لشدة الأسفار عبر غشاء البلازما. التشكيلات الجانبية للأسفار المقاسة مزودة بنموذج لتوزيع الأسفار الغشاء والسيتوبلازم على طول خط تطبيق هامش الخلية عمودياً. يتكون هذا النموذج من قيم الكثافة fluorescence في خلايا مرجع معربا عن علامة معلم فلوريسسينتلي السيتوبلازم، ومع وزير الخارجية 4-64-المسمى غشاء البلازما. الطريقة التي يمكن تطبيقها على مختلف أنواع الخلايا والكائنات الحية؛ ومع ذلك، يمكن تقييم فقط البلازما في أغشية الخلايا غير المجاورة. هذا الأسلوب السريع القائم على الفحص المجهري ومناسبة للتجارب، حيث يتوقع تغييرات خفية ودينامية العلامات المرتبطة بغشاء البلازما والحاجة إلى القياس الكمي، مثلاً، في تحليل الإصدارات متحولة من البروتينات، والعلاجات المانع، وتدل الملاحظات توصيل. يتم تطبيق الأسلوب في صفقة R منصة متعددة ويقترن مع ماكرو إيماجيج الذي يعمل كواجهة سهلة الاستخدام.

Introduction

غشاء البلازما المرتبطة محيطيا البروتينات هي المكونات الرئيسية للخلية إشارات المسارات. أحد أدوارها الأساسية هي رابطة عابر غشاء البلازما، والانفصال، وهامة لتوصيل الإشارة بين غشاء البلازما والسيتوبلازم. يمكن إرفاق البروتينات المرتبطة محيطيا غشاء البلازما في غشاء البلازما بالدهن المراسي (N-ميريستويليشن, S-أسيليشن، أو برينيليشن) أو بواسطة مجالات ملزمة الدهون (التفاعل مع الفوسفات فوسفاتيديلينوسيتول، وحامض فوسفاتيديك، إلخ).

درس ملزمة غشاء البلازما يمكن أن تكون خصائص هذه البروتينات في فيفو، مثلاً، عندما يتم تعديل بروتين فلوريسسينتلي معلم بالطفرات موقع الموجه من الأحماض الأمينية الأساسية، أو عند فإنه يتم التعامل مع الموانع المختلفة التي تؤثر على مما يشير إلى المادة الدهنية. توزيعات البروتينات الطرفية غشاء البلازما معظمها يجري تقييم نوعيا، ولا سيما في الحالات عند إعادة توزيع البروتين من الواضح. طريقة عرض الأمثل للحالات عند إعادة توزيع البروتين فقط جزئية والتقييم الكمي ضروري. اتباع نهج المستخدمة بشكل متكرر من عندما تقدر الرابطة غشاء البلازما من [كنفوكل] ليزر المسح المجهري الصور كنسبة شدة الأسفار في الغشاء البلازما وفي السيتوبلازم1،2، بسيط، ولكن ليس دقيقة. كثافات fluorescence في غشاء البلازما تعكس تراكب الإشارات غشاء البلازما والسيتوبلازم نظراً لأن الخاصية حيود الضوء لتقنية مجهرية خاصة الأسفار والعناصر البصرية تستخدم3. ونتيجة لذلك، يتم تضمين إشارة هيولى أيضا في منطقة الغشاء. ولهذا السبب، لا يمكن استخدام نمط المصبوغة FM 4-64 كقناع لغشاء إشارة تحديد4. وعلاوة على ذلك، القياسات البسيطة من الغشاء إشارة في الموقف الذي حدده وزير الخارجية 4-64 تلطيخ الحد الأقصى دائماً بصورة منهجية المبالغة إشارة غشاء البلازما الحقيقية للبروتين غشاء البلازما المرتبطة محيطيا بسبب التراكب الغشاء ومجمع هيولى. الحد أقصى الإشارات الملحوظة لمعلم فلوريسسينتلي البروتينات المرتبطة محيطيا أيضا تعريب لا يشترك مع الحد أقصى علامة غشاء البلازما (أي، إف أم صبغ ستيريل 4-64)، ولكن هو تحول نحو السيتوبلازم. قيد آخر يستند إلى حقيقة أن وزير الخارجية ذروة الانبعاث 4-64 أوسع بالمقارنة مع قمم الانبعاثات للبروتينات الفلورية الخضراء مثل التجارة والنقل بسبب الطول الموجي-التبعية من حيود الضوء3.

في الأسلوب الموصوفة هنا، إشارة البروتين المعلمة مزودة باثنين من المهام التجريبية تصف توزيع افتراضية لغشاء البلازما وإشارة السيتوبلازم، على التوالي. يتم تطبيق هذا التحلل إشارة إلى الملامح الفلورية الخطية التي يتم تطبيقها على سطح الخلية عمودياً إلى غشاء البلازما في مصدر الصور، وأقسام [كنفوكل] العادية، والقناة الثانية للتعبير عن البروتين معلم فلوريسسينتلي الخلايا المسماة بصبغ FM 4-64.

وصف الدالة الأولى المستخدمة لتركيب حيود إشارة السيتوبلازم على حافة الخلية. يتم الحصول عليها من الملامح المكتسبة سابقا الأسفار التي قيست في الخلايا معربا عن علامة بروتين السيتوبلازم معلم قبل chromophore نفسه كالبروتين المرتبطة محيطيا غشاء البلازما للفائدة. الدالة الثانية تصف حيود إشارة غشاء البلازما مشتق من الأسفار FM 4-64. أولاً هو تقريب هذه الإشارات من دالة ضبابي الذي يتم استخدامه لنمذجة تقريبي من حيود الضوء من مصدر نقطة. وثانيا، هذا النموذج، صالحة للاحمر FM 4-64 الانبعاثات، رياضيا تتحول إلى النموذج المرتبط الطول موجي انبعاثات من chromophore المستخدمة لوضع علامات على البروتينات المرتبطة محيطيا للفائدة في غشاء البلازما. يتم تطبيع كلتا الوظيفتين بكثافة قصوى ويعني من 10 في المائة من أعلى القيم لإشارة FM 4-64 والبروتين هيولى إشارة، على التوالي. بهذا التحلل إشارة (الأسلوب المناسب مربعة أقل غير الخطية)، يمكن تقدير نسبة غشاء البلازما والكسر السيتوبلازم لفحص البروتين بسهولة ودقة. البعد المادي الحقيقي لمعامل التقسيم محسوب في نطاق ميكرومتر، نظراً لتركيز وحدة التخزين هيولى بالمقارنة مع تركيز السطحية في غشاء البلازما. وهو يحدد المسافة من غشاء البلازما إلى السيتوبلازم، الذي هو مترجم على نفس القدر من البروتينات كما هو الحال في المنطقة المتاخمة لغشاء البلازما. هذه القيمة مكافئة لتقسيم معامل ك2 قدم سابقا5. الطريقة سريعة جداً وتتطلب واحد فقط الأقسام [كنفوكل] اكتسب استخدام الليزر [كنفوكل] روتينية فحص المجهر، وأنها لا تطالب حسابياً. نفذت التحليل الأساسية في مجموعة R محمولة وتمت كتابة ماكرو إيماجيج إضافية لتوفير واجهة مستخدم رسومية لتشغيل التحليل من مربعات الحوار بديهية. البرمجيات ووصف أكثر تفصيلاً للطريقة (نشرت سابقا6) يمكن الاطلاع على http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

الأسلوب مناسبة لعزل الخلايا وبروتوبلاستس، والأنسجة، حيث يمكن تمييزها الواضح غشاء بلازما خلايا فردية، معربا عن بناء معلم فلوريسسينتلي لفحص البروتينات المرتبطة بالمحيط. Chromophore متوافقة مع وزير الخارجية يجب أن تستخدم تلطيخ 4-64. 4-64 FM تنبعث ومضان أحمر؛ ولذلك، يمكن الموسومة دراسة البروتين بروتين الأسفار مع الانبعاثات الأزرق أو الأخضر أو الأصفر (مثلاً، التجارة والنقل، والحركة، يفب). يوصي بتحويل مستقرة للمواد البيولوجية لأنها تمكن الملاحظات أقل مصطنعة واستنساخه بأكثر من توزيع البروتين. فمن الضروري أن فحص البروتين قد توزيع هيولى متجانسة نسبيا. إضفاء الطابع المحلي على البروتين في هيولى أو آخر داخل الخلايا غشاء المقصورة يمكن أن تنتج نتائج مصطنعة.

بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تستخدم نفس المواد البيولوجية معربا عن علامة هيولى للمقارنة. يمكن أن تتحول خلايا تشوموفوري حرة (نفس المستخدمة للبروتين الطرفية العلامات، مثلالتجارة الحرة والنقل) أو البروتين المعلمة للفائدة مع القدرة الملزمة غشاء الملغاة. يمكن إلغاء القدرة الملزمة الغشاء، على سبيل المثال، بالتشذيب الملك ملزمة غشاء أو بواسطة الطفرات موقع الموجه للمتبقي من الأحماض الأمينية الأساسية (مثلاً، مواقع ميريستويليشن ن، ق-أسيلاتيون، أو برينيليشن، إلخ).

للفحص المجهري المسح [كنفوكل]، يجب تمييز الخلايا بعلامة غشاء مثل صبغ FM 4-64. إذا FM تلطيخ 4-64 ليست مناسبة للمواد المدروسة (بسبب أوتوفلوريسسينسي التدخل والاختراق صبغ الفقراء، إلخ)، غشاء البلازما يمكن أن يكون المسمى، على سبيل المثال، بالبروتين غشاء البلازما لا يتجزأ معلم تشوموفوري مناسبة ( مشري، طلب تقديم العروض، إلخ). فمن الضروري أن العلامة قد التعريب لا يعتد بها في المقصورات غشاء داخل الخلايا (اندوميمبرانيس).

إذا كان يعمل مع عينات ثابتة، والأجسام المضادة، ويمكن استخدام يمكن حلها التماثلية FM 4-64FX أو وسم غشاء البلازما من الأجسام المضادة ضد هدف مناسب. وفي هذه الحالة، من الضروري تقييم النتائج بعناية شديدة لأن إجراءات التثبيت يمكن أن يؤدي إلى فقدان الانتقائي للبروتينات من السيتوبلازم والغشاء البلازما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد المواد البيولوجية

  1. إعداد المواد البيولوجية معربا عن البروتين المعلمة فلوريسسينتلي للفائدة، فضلا عن علامة هيولى. اتبع الإجراءات المذكورة في المقدمة.

2-[كنفوكل] ليزر المسح المجهري

  1. وصمة عار المواد التي أعدت في القسم 1 مع وزير الخارجية 4-64 صبغ7.
    1. تطبيق بروتوكول المصبوغة المناسب للمواد المدروسة. لخلايا التبغ بمقدار 2، وصمة عار 200 ميكروليتر من تعليق خلية مع ميكروليتر 0.2 مم 10 FM الحل 4-64 في ديميثيلسولفوكسيدي.
      ملاحظة: تركيز المصبوغة نموذجي FM صبغ 4-64 عن 10 ميكرومترات استخدام 10 مم حل الأسهم في ديميثيلسولفوكسيدي. استخدام أدنى تركيز ممكن FM 4-64 لتلطيخ السليم وعدم احتضان خلايا على الجليد (FM 4-64 ودرجة حرارة منخفضة يمكن أن تؤثر على خصائص غشاء البلازما). تواصل مع ملاحظة استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] فورا. الفاصل الزمني بين تلطيخ واقتناء الصور يجب أن لا أطول من 10 دقائق؛ خلاف ذلك، سيؤثر الالتقام الصبغة FM تلطيخ 4-64.
    2. تجهيز عينات متعددة متتالية، ولا وصمة عار جميع العينات في بداية التجربة.
  2. التقاط مقطع [كنفوكل] الاستوائية واحد كل خلية واحدة.
    1. قم بمسح ثنائي القناة متسلسلة ل chromophore المستخدمة كعلامة البروتين (يجب أن تكون في القناة الأولى) ووزير الخارجية 4-64 (يجب أن تكون في القناة الثانية). تعيين دقة بصرية أعلى (10 – 20 بيكسل/ميكرومتر). إنشاء مثال: النفط 63 X حجم الصورة الهدف، 1.3 نا، الغمر 1,024 x 1,024 px. تأكد من أن الطائرة غشاء البلازما عمودي على الطائرة [كنفوكل] قسم في الصور المكتسبة.
    2. القبض على 20 على الأقل من الخلايا كل عينة لديها ما يكفي من البيانات لتقييم الإحصاء (يعتمد على التغير إشارة في المواد المصنعة).

3. تثبيت البرامج المطلوبة

  1. تثبيت ImageJ فيجي توزيع8والماكرو المطلوب المحيطية.
    1. تحميل برنامج من https://fiji.sc/#download الموقع، وتثبيتها بالتفريغ.
    2. بدء فيجي بالنقر المزدوج فوق الملف في الدليل "Fiji.app" تفكيك "ImageJ(.exe)".
    3. تحميل ماكرو "هامشية" من الموقع التالي:
      http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.ijm.
    4. وفي فيجي، حدد الإضافات | وحدات الماكرو | تثبيت... في القائمة الرئيسية، وتحديد المسار إلى الملف الذي تم تنزيله "Peripheral_.ijm."
      ملاحظة: سوف تظهر اثنين من أدوات جديدة من الماكرو المثبتة "هامشية" في شريط أدوات فيجي: "الشخصية تأخذ أداة" و "قائمة البروتين الطرفية."
  2. R-مشروع البرنامج9تثبيت الحزم المطلوبة.
    1. اتبع الإرشادات على https://cloud.r-project.org/الموقع للبحث والتطوير-مشروع التثبيت.
      ملاحظة: سيتم إجراء التحليل الشامل في فيجي. سوف يطلق برنامج البحث والتطوير داخليا فقط الماكرو فيجي "هامشية" أثناء العملية الحسابية.
    2. تشغيل واجهة المستخدم الرسومية R، حدد الحزم | تثبيت الحزمة (الحزم)... في القائمة الرئيسية، وتحديد أقرب مستودع و مجموعة "ggplot2" للتثبيت.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، اكتب إلى R سطر الأوامر: install.packages("ggplot2").
    3. تحميل حزمة آر هامشية من الوجهة: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. تثبيتها عن طريق تحديد حزم | تثبيت الحزمة (الحزم) من الملفات المحلية....
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، اكتب إلى R سطر الأوامر هذا الأمر فقط:
      install.packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", الريبو = NULL، نوع = "المصدر").

4-صورة التحليل في فيجي

  1. معالجة الصور [كنفوكل] علامة هيولى.
    1. استيراد الصور إلى فيجي باستخدام الإضافات | بيو-تنسيقات | بيو-صيغ "المستورد" من قائمة فيجي مع الإعدادات الافتراضية.
    2. تحقق إذا كان "المستورد" بيو-صيغ الاعتراف بشكل صحيح معايرة الصورة. يجب أن يكون البعد الصورة سيظهر في نافذة الصورة الميدانية معلومات الأيسر العلوي مساوية لإبعاد الصورة الأصلية.
    3. علاج خاطئ معايرة الصور غير صحيحة أبعاد كل على حدة، مثلاً، عن طريق إعداد المعلمات الصحيحة في إطار الحوار تحليل | تعيين المقياس... من القائمة فيجي: تعبئة عرض الصورة بالبكسل في الحقل المسافة بالبكسل والعرض الحقيقي في وحدة الطول المناسب في الحقل يعرف المسافة ).
      ملاحظة: إذا كانت غير سليمة يتم معايرة الملفات "ليات LCS إيكا"، اتبع الخطوة 4.2.1.
  2. تشغيل ماكرو خيارات الاستيراد الخاصة إعداد تحليل. تنشيط الماكرو بواحدة من ثلاث طرق مختلفة: حدد الإضافات | وحدات الماكرو | استيراد خيارات [f1] في فيجي القائمة الرئيسية، حدد نفس البند بعد النقر فوق أداة القائمة الطرفية البروتين القائمة، أو اضغط على لوحة المفاتيح المختصرة F1. تعيين المعلمة في إطار الحوار ماكرو تم استدعاؤه.
    1. في حالة التنسيق "ليات LCS إيكا"، حل المعايرة غير لائق بتنشيط خانة الاختيار الصور Leica.lei . هذا الخيار بشكل صحيح الواردات أبعاد الصورة من ملف بملحق "لي".
    2. حدد القيمة المناسبة في حقل غاوسي طمس دائرة نصف قطرها (px). وهذا يؤثر على صورة تجانس والحد من الضوضاء. قيمة منخفضة (1 px) كافية ولا يتسبب أي فقدان معلومات الصورة.
    3. لتعيين قيمة في الحقل عرض الخط الشخصية (px). خط أكثر سمكا يسبب تجانس أعلى من منحنيات الشخصية. قيمة افتراضية 10 ينصح px.
    4. تعيين عنوان صورة التحليل بتعريف "محددات عينة" و "العناصر المصدرة".
      ملاحظة: عنوان صورة (اسم الملف دون تمديد، مثلاً: "التجربة-1_line-02_cell-11") سوف تنقسم حول كافة الأحرف المعروضة في الحقل "محددات عينة" (مثلاً: "-_") إلى مجموعة من العناصر ("التجربة"، "1"، " خط "،" 02 "،" خلية "، و" 11 ") التي يمكن استخدامها تجميع العوامل (عينة، الخلية، خط، أو معاملة الهوية) في التحليل التالي. تحديد العناصر التي سيتم استخدامها بواسطة كتابة رقم تسلسل بهم ("0" للعنصر الأول) في قدم "تصدير العناصر." استخدام تنسيق مفصول، مثلاً، "3 5". في هذا المثال، البنود "02" و "11" وسوف يشار إليها باسم تجميع عوامل المسمى "Fac_0" و "Fac_1." بالإضافة إلى ذلك، هوية كل قياس سوف يكون المشار إليها كعامل "أنا".
    5. بدلاً من ذلك، تبقى محددات عينة فارغة وأدخل 0 في الأصناف المصدرة إذا يجوز الاحتفاظ بعنوان الصورة الكاملة.
    6. في نظام التشغيل Windows، تحقق من إذا كان المسار إلى برامج البحث والتطوير سيكون الكشف عن السيارات بشكل صحيح في حقل المسار إلى R.exe. وإلا، تحديد المسار الكامل إلى الملف R.exe في النظام (مثلاً، "C:\Program Files\R\bin\R.exe").
    7. انقر فوق "موافق". تحقق من عنوان التحليل في إطار الحوار التالي وانقر فوق موافق أو العودة إعادة تعيين.
      ملاحظة: سيتم تلقائياً ممهدة جميع الصور وتقويم في نهاية المطاف. سيتم عرض قائمة بعوامل التجميع جميع المصدرة في إطار نتائج.
  3. أداء مجموعة خطي عبر منطقة غشاء البلازما في معالجة الصور وقياس الملامح الأسفار.
    1. حدد أداة فيجي خط مستقيم من شريط الأدوات فيجي. انقر فوق الصورة، واسحب خط عبر منطقة غشاء البلازما. السطر يجب أن تبدأ في الفضاء خارج الخلية ويجب أن يكون عمودي على غشاء البلازما. اختيار المناطق مع طبقة أكثر سمكا وأكثر تجانساً من السيتوبلازم القشرية. الطول الأمثل للتحديد خطي 5-10 ميكرومتر.
    2. تشغيل الماكرو الشخصية تأخذ هاته الأسلوب كما في الخطوة 4، 2 (اختصار "x") أو بالنقر فوق تأخذ الشخصية أداة في شريط الأدوات فيجي. سيتم إجراء القياس التلقائي من التشكيلات الجانبية للأسفار في كل القنوات وسيتم عرض البيانات في إطار نتائج.
    3. في حالة استخدام مفتاح "×" يعتبر ودي، فتح ملف مصدر الماكرو Peripheral_.ijm في محرر النصوص، واستبدال الرمز "x" في السطر 'الماكرو"تأخذ الشخصية [x]"{' مع رمز أكثر ملاءمة (لا يستخدم في بيئة فيجي لوحة المفاتيح النشطة قطع قصيرة) وقم بحفظ الملف. إعادة تثبيت الماكرو (الخطوة 3.1.4) والبدء التحليل من استيراد الصورة.
    4. وفقا لتقلب إشارة فردية، أن إعداد الممثل من التشكيلات الجانبية لكل خلية.
    5. حفظ البيانات عن طريق الملف | حفظ as.... دائماً استخدام ملحق "csv"؛ من الضروري تنسيق البيانات الصحيحة.
  4. تشغيل في مؤامرة ماكرو البيانات الشخصية (قطع قصيرة F5) عن التصور رسومية من الملامح المقاسة. تعيين المعلمة في إطار الحوار ماكرو تم استدعاؤه.
    1. تبقى خانة الاختيار استخدام التصفية لإدخال البيانات؟ غير محددة.
    2. تحديد إذا كان الأرض ينبغي أن تنشأ من البيانات الأخيرة في إطار النتائج، من ملف CSV واحدة أو من جميع CSV الملفات في دليل محدد بواسطة النقر فوق زر الخيار المناسب.
      ملاحظة: إذا كان يتم إنشاء هذه المؤامرة من النتائج الأخيرة، سيتم حفظ البيانات أولاً (الحوارحفظ as... سوف يتم تفعيلها تلقائياً).
    3. تحديد عوامل التجميع التي ستستخدم للتآمر عن طريق تحديد خانات الاختيار المناسبة. حدد عامل "أولاً" إذا كان يجب أن يتم عرض كافة التشكيلات الجانبية في قطع فريدة من نوعها. تبقى خانات الاختيار غير محددة، إذا أن جميع البيانات التي المرسومة في قطعة واحدة.
      تنبيه: اختيار عامل التجميع غير موجود في نتائج معالجة أسباب خطأ أثناء تهيئة الأرض.
    4. تحديد اسم الملف عند حفظ مؤامرة في الحقل البادئة ملف الإخراج وتحديد الأرض أبعاد الصورة في ملفات المؤامرة ارتفاع و عرض الأرض.
      ملاحظة: سيتم حفظ الأرض الناتجة عن ذلك في دليل مصدر بيانات كملف PNG.
    5. حدد إخراج قوات الدفاع الشعبي؟ خانة الاختيار إذا كان إخراج ملف PDF إضافية قد يتم إنتاجها.
    6. انقر فوق "موافق". تحديد المسار لحفظ النتائج أو في نهاية المطاف لبيانات الاستيراد في إطار الحوار التالي. تأكيد التحليل بواسطة النقر فوق موافق في نوافذ الحوار إظهار رمز R المؤداة.
      ملاحظة: سيتم فتح هذه المؤامرة في نافذة صورة جديدة وسيتم سرد الإخراج تحليل R في نافذة النص.
  5. تشغيل تصفية الشخصية الماكرو الإعداد (F2 قطع قصيرة) إذا كان بعض الملامح المرسومة لها إشارات المفرط في الفضاء خارج الخلية (للبروتين المعلمة) أو في الفضاء داخل الخلايا (بالنسبة لإشارة FM 4-64). اتبع بتعيين المعلمات في إطار الحوار ماكرو تم استدعاؤه.
    ملاحظة: تصفية يمكن إزالة ملفات تعريف الفقراء وفقا لعتبة الحد الأقصى المسموح به كثافة في إحداثيات س المحددة.
    1. لكل قناة، تعيين عتبة كثافة مناسبة في ملف إزالة القياسات مع إشارة (داخل الخلايا) خارج الخلية مفرط. تحديد المنطقة التي سيطبق فيها عتبة كثافة في الميدان إحداثيات س أقل (أكثر).
    2. تشغيل في مؤامرة ماكرو البيانات الشخصية (الخطوة 4، 4) مرة أخرى مع خانة الاختيار استخدام التصفية لإدخال البيانات؟ المحددة؛ تأكد من أنه قد تم بنجاح إزالة كافة ملفات تعريف الشاذة. وبخلاف ذلك، تحسين معايير التصفية (الخطوة 4.5.1).
  6. تشغيل إنشاء نموذج الماكرو (قطع قصيرة F3) لإنشاء نموذج لغشاء البلازما وتوزيع الأسفار السيتوبلازم استناداً إلى بيانات المعايرة. اتبع بتعيين المعلمات في إطار الحوار ماكرو تم استدعاؤه.
    1. حدد إذا كان إدخال البيانات يجب أن تكون المصفاة (الخطوة 4، 5) عن طريق تحديد استخدام التصفية لإدخال البيانات؟ خانة الاختيار.
    2. حدد مصدر البيانات أنالوجيكالي كما في الخطوة 4.4.2.
    3. تحديد الفاصل الزمني الذي سيتم تنبأ النموذج بتعريف "ابدأ"، "إنهاء"، وقيم "خطوة" في ميكرومتر.
      ملاحظة: جميع القياسات الشخصية يجب أن تكون أطول من الفاصل الزمني المحدد.
    4. تحديد الأطوال موجية الأسفار الإثارة والانبعاثات الحدود القصوى من صباغات المستخدمة في الحقول المناسبة. تعيين الإعدادات الافتراضية للتجارة والنقل ووزير الخارجية تركيبة 4-64.
      ملاحظة: يشير إلى "التجارة والنقل" chromophore المستخدمة للبروتين علامات (التجارة والنقل، والحركة، يفب، إلخ)، ويشير إلى "FM4" chromophore المستخدمة لغشاء البلازما تلطيخ (عادة FM 4-64).
    5. تحديد الحقل البادئة ملف الإخراج . سيتم استخدام البادئة لحفظ نموذج الناتج كملف رداتا إلى دليل بيانات مصدر.
    6. حدد خانة الاختيار نموذج المؤامرة؟ إذا كان مطلوباً إخراج رسومية. الأرض سيتم حفظها في بابوا غينيا الجديدة وكذلك ملف PDF إذا إخراج قوات الدفاع الشعبي؟ يتم تحديد خانة الاختيار.
    7. انقر فوق "موافق". تحديد الإدخال أو الإخراج مسارات في نوافذ الحوار القادم وتأكيد التحليل بواسطة النقر فوق موافق في إطار الحوار إظهار رمز R المؤداة.
      ملاحظة: قطعة على غرار هيولى ومجمع الأغشية من الأسفار البروتينات المرتبطة محيطيا سيظهر في نافذة الصورة الجديدة، وسيتم سرد الإخراج تحليل R في نافذة النص.
  7. صور الخلايا معربا عن بروتين الفائدة العملية.
    1. استيراد الصور أنالوجيكالي كما في الخطوة 4، 1.
    2. قم بإعداد تحليل أنالوجيكالي كما في الخطوة 4، 2. تجانس وخط العرض ينبغي أن تكون متطابقة.
    3. قياس الملامح أنالوجيكالي كما في الخطوة 4، 3.
    4. تحقق من دقة التشكيلات الجانبية بالتآمر (الخطوة 4، 4) وتعيين التصفية إذا كان المطلوب (الخطوة 4، 5).
  8. تشغيل ماكرو حساب التوزيع (قطع قصيرة F4) لحساب البروتين التقسيم بين غشاء البلازما وفي السيتوبلازم. يتبع إعداد المعلمة في إطار الحوار ماكرو تم استدعاؤه.
    1. أنالوجيكالي مع الخطوة السابقة (الخطوة 4، 4)، حدد مصدر البيانات وتصفيتها وبادئة اسم الملف.
    2. تحديد إذا كان سيتم تحميل نموذج لحساب التوزيع البروتين من آخر نموذج الحساب في المقام الأخير الماكرو "هامشية" في فيجي (حدد خانة الاختيار النتائج الأخيرة)، أو من ( ملف رداتا حدد خانة الاختيار "من ملف").
    3. تبقى خانة الاختيار إزالة النتائج مع تقلب المتبقية أكبر من تنشيط إذا كان نتيجة تصفية هو المطلوب. تحديد عتبة الحد الأقصى المسموح به التغير المتبقية التي يمكن أن تكون غير المبررة التي تحلل إشارة قياس الشخصية الفردية. فعلى سبيل المثال: تشير قيمة 0، 200 إلى أنه سيتم تجاهل جميع القياس مع التقلبات غير المبررة أعلى من 20% من مجموع تباين كثافة fluorescence في التشكيل الجانبي.
    4. حدد عوامل التجميع عينة، التي يمكن استخدامها لخلق ارسم مربع (الخطوة 4، 4).
    5. تنشيط خانة الاختيار إخراج قوات الدفاع الشعبي؟ لحفظ المربع-المؤامرة كملف PDF.
    6. انقر فوق موافقوتحديد الإدخال أو الإخراج مسارات، وتأكيد التحليل بواسطة النقر فوق موافق في إطار الحوار إظهار رمز R المؤداة.
      ملاحظة: سيظهر المربع-المؤامرة من البروتينات المرتبطة محيطيا التقسيم بين غشاء البلازما والسيتوبلازم في نافذة صورة جديدة، وسيتم سرد الإخراج تحليل R في نافذة النص.
    7. لتجهيز خارجي، حفظ النتائج المعروضة في إطار النتائج عن طريق الملف | حفظ as... في القائمة إطار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

درب10 هو بروتين الخاصة بالنباتات المرتبطة محيطيا بلازما-غشاء الذي يرتبط بغشاء البلازما عبر N-ميريستويليشن وتفاعل الالكتروستاتيكي مع فوسفاتيديلينوسيتول الفوسفات11، 12-درب وصف بأنه مكون آلات مما يشير إلى الكالسيوم في الخلية النباتية ويتفاعل أيضا مع13،سيتوسكيليتون14. في التجربة المعروضة، التبغ البرية من نوع DREPP2 ونسخته متحولة غير ميريستويلاتيد (Gly2 محله علاء) معلم بروتينات فلورية خضراء6 وأعربت في التبغ بمقدار-2 تعليق الخلايا15 إطار كامب 35S بروموتور16. تقسيم هذه البروتينات غشاء البلازما وقيست في 3 أيام (3 أيام بعد التخفيف)، ووزير الخارجية 4-64-المسمى (8 ميكرومتر) الخلية الثقافات6 مع (الشكل 1A) ودون (الشكل 1B) إضافة فوسفوينوسيتيدي 3-كيناز مثبط وورتمانين (10 ميكرون)17، وفقا للبروتوكول، المذكورة أعلاه. إصدار المشذب DREPP2(Δ1-23) تفتقر إلى غشاء البلازما ملزمة المجال6 استخدمت كعلامة السيتوبلازم لبناء نموذج توزيع الأسفار (الشكل 1).

حساب الجذر التربيعي تحويل المعطيات (تمت إضافة القيمة الإيجابية المقابلة إلى أدنى قيمة سلبية لجميع البيانات لاسترداد البيانات الإيجابية فقط)، وتم اختبار البيانات قبل ANOVA ثنائي الاتجاه في ص9. آثار العلاج الطفرة ومثبط كانت هامة للغاية (ف < 2.2 × 10-16 * * *). جميع الفئات وقورنت باختبار HSD توكي؛ جميع الفئات تختلف اختلافاً كبيرا فيما عدا DREPP2 معاملة وورتمانين و DREPP2(G2A) غير المعالجة (الشكل 1).

هذه النتائج تظهر بوضوح أن رابطة التبغ البروتين DREPP2 غشاء البلازما هي نتيجة ميريستويليشن ن والتفاعل الالكتروستاتيكي، التي هي عمل تعاونية. إلا على الأثر المتبادل طفرة الموقع N-ميريستويليشن والعلاج وورتمانين تسببت تفكك كامل للبروتين DREPP2 من غشاء البلازما. هذه النتائج وفقا للبيانات المنشورة سابقا6.

Figure 1
الشكل 1 : تأثير الطفرة في الموقع N-ميريستويليشن والعلاج وورتمانين على تقسيم غشاء البلازما بروتين غشاء البلازما المرتبطة محيطيا درب، الذي يشارك في كالسيوم إشارات الطريق في الخلية النباتية- تشكيل الأقسام [كنفوكل] الآنسي (A) من خلايا التبغ حسب-2 التعبير عن نموذج نوع البرية DREPP2-التجارة والنقل والمسخ DREPP2 (Gly2Ala)-التجارة والنقل (قناة الأخضر). كانت تسمية الخلايا مع وزير الخارجية صبغ 4-64 (قناة أرجواني)، ومقياس بار 10 ميكرون. (ب) خط الخلية نفسها عومل من 10 ميكرون وورتمانين (وات). (ج) الخلايا معربا عن هيولى علامة DREPP2(Δ1-23). (د) تقسيم غشاء البلازما المقدرة لجميع العينات. تم اختبار مدى الآثار على حد سواء قبل ANOVA ثنائي الاتجاه (ف < 2.2 × 10-16 * * * في كلتا الحالتين؛ كانت البيانات الأصلية تحول الجذر التربيعي). تشير الأحرف إلى المجموعات التي لا تختلف كثيرا عن بعضها البعض كما يحدده اختبار HSD توكي. شعرات من المربع-القطع الإشارة فاصل الثقة 95%. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ينشئ الأسلوب الموصوفة هنا تقدير أكثر دقة لتقسيم غشاء البلازما للبروتينات المرتبطة محيطيا مقارنة بالنهج الأخرى استناداً إلى قياس كثافة الأسفار5. تحسن كبير لهذا الأسلوب أنه يأخذ بعين الاعتبار حيود الضوء والتراكب من الغشاء البلازما وإشارات هيولى. وعلى الرغم من هذه النتائج الأسلوب في ترابط مع نتائج طريقة بسيطة تقوم على المقارنة بين كثافة fluorescence في موضع غشاء مع متوسط هيولى إشارة (كما هو موضح سابقا6)، والفائدة الرئيسية من هذا الأسلوب رواية يتم تحديد التغير المتبقية (غير المبررة التي تحلل إشارة) التي تسمح تقدير مدى ملاءمة النتائج، ولا سيما حيث إشارة غشاء البلازما أقل من إشارة هيولى. طريقة وصف أيضا أكثر قوة للضوضاء إشارة لأنه لا يستند في حساب تقسيم البروتين في نقطة واحدة فقط.

ويتطلب التحليل فقط واحد ثنائي القناة الصور [كنفوكل]. على عكس فراب النهج18 استناداً إلى قياسات لديناميات نشر البروتين في إطارات زمنية أطول، الأسلوب المبين أكثر انطباقاً للنهج الديناميكي في فيفو ، عند الحصول على الصور بسرعة شرط حاسم ( مثل، والإشارات تنبيغ الاستكشافات، وتحليلات العناصر المثبطة). الأسلوب مناسبة لسرعة الحصول على كميات كبيرة من البيانات التي تعتبر كافية للتقييم الإحصائي.

الأسلوب الذي يقتصر على غشاء واحد فقط. تحليل إشارات من الأغشية المجاورة عن كثب اثنين من الخلايا المجاورة غير معتمد حاليا. وفي هذه الحالة، يتم تركيب إشارة أكثر تطلبا مع ارتفاع خطر الإصابة بالقطع الأثرية.

بيد أن التحليل كان مصمما أصلاً لمصنع تعليق الخلايا15وأنه يمكن تطبيق إجراء تحليلات لأنواع الخلايا الأخرى، وكذلك. جذر الشعر وأنابيب اللقاح تمثل أهداف يحتمل أن تكون جيدة جداً لهذا الأسلوب بالبيولوجيا النباتية. يمكن أن تحلل الأغشية الخارجية لخلايا البشرة النباتية بعد التحقق السابقة أن جدران الخلية غير المسماة بوزير الخارجية 4-64 ولا يحمل أوتوفلوريسسينسي التدخل. قد حلل خلايا طلائعيات خالية من التدخل أوتوفلوريسسينسي وخلايا الخميرة، والخلايا الفطرية، فضلا عن الخلايا الحيوانية مع السلس غشاء البلازما باستخدام الطريقة الموصوفة؛ ومع ذلك، للخلايا الحيوانية لا يمكن تحليل توزيع البروتين على حافة الرائدة في مجال الخلايا تنتجها الخلايا الليفية أو على الحدود الفرشاة من الخلايا الظهارية ممكن. بسبب إعدادات تحليل مرنة، معلم FM تلطيخ 4-64 يمكن الاستعاضة عن النهج التصور غشاء البلازما الأخرى، مثل فلوريسسينتلي البروتينات. مع توخي الحذر، يمكن استخدام الأسلوب للخلايا الثابتة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا المشروع وأيده نبو الأول، LO1417 (وزارة التربية والتعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FM 4-64 ThermoFisher Scientific T13320 Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D4540 Sigma Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
  2. Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer. Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).
  3. Kubitscheck, U. Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , John Wiley & Sons. (2013).
  4. Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts. J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).
  5. Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).
  6. Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins. Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).
  7. Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).
  10. Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development. Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).
  11. Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane. J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).
  12. Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure. J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).
  13. Li, J., et al. MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).
  14. Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments. Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).
  15. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 Cell Line as the "HeLa" Cell in the Cell Biology of Higher Plants. Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).
  16. Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).
  17. Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Jr Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells. Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).
  18. Laňková, M., et al. Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy. Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).

Tags

البيولوجيا، 136 قضية، بروتين غشائي البلازما المرتبطة محيطيا، وتقارب غشاء، تقسيم الغشاء، [كنفوكل] مجهرية، إيماجيج، deconvolution مشروع البحث والتطوير، ووزير الخارجية 4-64،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins
Posted by JoVE Editors on 11/02/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. The Affiliations section was updated.

One of the affiliations was updated from:

Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University

to:

Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

تحديد التقسيم غشاء البلازما للبروتينات المرتبطة محيطيا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vosolsobě, S.,… More

Vosolsobě, S., Schwarzerová, K., Petrášek, J. Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. J. Vis. Exp. (136), e57837, doi:10.3791/57837 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter