Bestemmelse af Plasma membran partitionering for perifert forbundet proteiner

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at udføre en kvantitativ analyse af niveauet af plasma-membran association for fluorescently markeret perifert forbundet protein. Metoden er baseret på den beregningsmæssige nedbrydning af membranen og cytoplasmatisk komponent af signal observeret i celler mærket med plasma membran fluorescerende markør.

Abstract

Denne metode giver en hurtig metode til bestemmelse af plasma membran partitionering af enhver fluorescently markeret perifert forbundet protein ved hjælp af profiler af fluorescens intensitet over plasmamembran. Målte fluorescens profiler er monteret af en model for membran og cytoplasma fluorescens distribution langs en linje vinkelret påføres celle periferien. Denne model er konstrueret af fluorescens intensitetsværdierne i reference celler, der udtrykker en fluorescently markeret markør for cytoplasma og med FM 4-64-mærket plasma membran. Metoden kan anvendes til forskellige celletyper og organismer; dog kan kun plasma membraner af ikke-tilstødende celler evalueres. Denne hurtigt mikroskopi-baseret metode er egnet til eksperimenter, hvor der forventes subtile og dynamiske ændringer af plasma membran-associerede markører og skal kvantificeres, f.eks., i analysen af muterede versioner af proteiner, hæmmer behandlinger, og signal transduktion observationer. Metoden er implementeret i en multi-platform R pakke, der er kombineret med en ImageJ makro, der fungerer som en brugervenlig grænseflade.

Introduction

Perifert forbundet plasma-membran proteiner er de centrale komponenter i celle signalering veje. En af deres grundlæggende roller er deres forbigående plasmamembran association og dissociation, hvilket er vigtigt for signaltransduktion mellem plasma membran og cytoplasma. Perifert forbundet plasma Membranproteiner kan fastgøres på plasma membran af lipid ankre (N-myristoylation, S-acylation eller prenylation) eller af lipid bindende domæner (interagere med phosphatidylinositol fosfater, phosphatidic syre, etc.).

Plasma-membran bindende egenskaber af disse proteiner kan blive undersøgt i vivo, f.eks., når en fluorescently mærkede protein er ændret af en site-directed mutagenese af vigtige aminosyrer, eller når det er behandlet med forskellige hæmmere, der påvirker lipid signalering. Fordelinger af perifere plasma Membranproteiner er for det meste bliver vurderet kvalitativt, især i tilfælde, hvor protein omfordeling er indlysende. Metoden præsenteres er optimal for situationer, når protein omfordeling er kun delvis og kvantitativ evaluering er nødvendig. Et hyppigt anvendte tilgang af Hvornår plasmamembran association anslås fra Konfokal laser scanning mikroskopi billeder som et forhold af fluorescens intensiteter på plasma-membran og i cytoplasmaet^1,2, er enkle, men ikke nøjagtig. Fluorescens intensiteter på plasmamembran afspejler en superposition af plasma-membran og cytoplasma signalet på grund af lyset diffraction karakteristisk for særlig fluorescens mikroskopi teknik og optiske elementer bruges³. Derfor, den cytoplasmatisk signal indgår også i regionen membran. Af denne grund, kan ikke FM 4-64 farvning mønster bruges som en maske til en membran signal udvalg⁴. Desuden enkle målinger af membran signal på den position, defineret af FM 4-64 farvning maksimale altid systematisk overvurderer den virkelige plasmamembran signal perifert forbundet plasmamembran protein på grund af superposition af de membran og cytoplasmatisk sammensatte. Maksimalt observerede signaler for fluorescently markeret perifert forbundet proteiner også co lokalisere ikke med maksimalt antal plasmamembran markør (dvs., FM 4-64 styryl farvestof), men er flyttet til cytoplasma. En anden begrænsning er at FM 4-64 emission peak er bredere i forhold til emissionen toppene for grøn fluorescerende proteiner som normal god landbrugspraksis som følge af bølgelængde-afhængighed af lyset diffraction³.

I metoden beskrevet her, er mærket protein signal monteret af to empiriske funktioner beskriver en hypotetisk fordeling af plasma membran og cytoplasma signal, henholdsvis. Dette signal nedbrydning anvendes lineær fluorescens profiler, der anvendes på celleoverfladen vinkelret til plasmamembran i kildebilleder, som er regelmæssige, to-kanals Konfokal sektioner fluorescently markeret protein at udtrykke celler mærket med FM 4-64 farvestof.

Den første funktion anvendes til montering beskriver en diffraktion af en cytoplasma signal udkanten celle. Det er fremstillet af tidligere erhvervede fluorescens-profiler, der blev målt i celler, der udtrykker en cytoplasma protein markør mærket af den samme farvelegeme som plasma membran perifert forbundet protein af interesse. Den anden funktion, der beskriver en diffraktion af et plasma-membran signal er afledt af fluorescens af FM 4-64. Dette signal er for det første tilnærmelse af Gaussisk funktion, der bruges til en omtrentlig modellering af lys diffraktion af en punktkilde. For det andet, er denne model, gyldig til røde FM 4-64 emission, matematisk omdannet til den formular, der er relevante for en emission bølgelængde af farvelegeme anvendes til mærkning af perifert forbundet proteiner af interesse på plasmamembran. Begge funktioner er normaliseret ved maksimal intensitet og middelværdi fra 10% af de højeste værdier for FM 4-64 signal og cytoplasmatisk protein signal, henholdsvis. Af dette signal nedbrydning (ikke-lineære mindste firkantet montering metode), kan forholdet mellem plasma membran og cytoplasma brøkdel af de undersøgte protein vurderes nemt og præcist. Den reelle fysiske dimension af beregnede partitionering koefficient er i rækken af mikrometer, fordi cytoplasmatisk volumetriske koncentration er sammenlignet med overflade koncentration på plasmamembran. Det definerer afstanden fra plasma membran til cytoplasma, inden for hvilke den samme mængde proteiner er lokaliseret i den tilstødende område af plasmamembran. Denne værdi svarer at opdelingen koefficienten K₂ indført tidligere⁵. Metoden er meget hurtig, kræver kun enkelt Konfokal sektioner anskaffes ved hjælp af rutinemæssig Konfokal laser scanning mikroskop, og det beregningsmæssigt krævende ikke. Analyse core er blevet gennemført i en transportabel R pakke og en yderligere ImageJ makro var skrevet at give anskuelighed brugergrænseflade hen til opstille analysen fra de intuitive dialogbokse. Software og mere detaljeret beskrivelse af metoden (offentliggjort tidligere⁶) kan findes på http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

Metoden er velegnet til isolerede celler, protoplasts og væv, hvor plasma membran af individuelle celler er tydeligt kan skelnes, udtryk for en fluorescently markeret konstruktion af undersøgt perifert forbundet protein. En farvelegeme kompatibel med FM 4-64 farvning skal bruges. FM 4-64 udsender røde fluorescens; Derfor kan undersøgte protein være markeret af et fluorescens protein med blå, grøn eller gul udledning (f.eks.normal god landbrugspraksis, fælles fiskeripolitik, YFP). Stabil transformation af biologisk materiale anbefales, fordi det giver mulighed for mindre kunstige og mere reproducerbare observationer af protein fordeling. Det er nødvendigt, at den undersøgte protein har en forholdsvis homogen cytoplasmatisk distribution. Lokalisering af en protein i det endoplasmatiske reticulum eller en anden intracellulære membran rum kan producere kunstige resultater.

Derudover skal den samme biologiske materiale udtrykker et cytoplasmatisk markør bruges til sammenligning. Celler kan transformeres ved et gratis chomophore, (det samme som anvendes til perifere protein tagging, fxgratis normal god landbrugspraksis) eller mærket protein af interesse med afskaffet membran bindende kapacitet. Membran bindende kapacitet kan afskaffes, for eksempel ved trimning af membran-bindende domæne eller ved site-directed mutagenese af vigtige aminosyre residuum (fx, websteder for N-myristoylation, S-acylation, eller prenylation, osv.).

For scanning konfokalmikroskopi, skal celler være mærket af en membran markør som FM 4-64 farvestof. Hvis FM 4-64 farvning ikke er egnet til det undersøgte materiale (på grund af interfererende autofluorescence, dårlig farvestof penetration, etc.), kan plasma membran mærkes, for eksempel, af integreret plasma membran proteiner markeret til en passende chomophore ( mCherry, RFP, osv.). Det er vigtigt, at markøren har ubetydelig lokalisering i intracellulære membran rum (endomembranes).

Hvis arbejder med faste prøver og antistoffer, kan fixable analoge FM 4-64FX eller plasma membran mærkning af antistof mod et passende mål bruges. I dette tilfælde er det vigtigt at evaluere resultaterne meget omhyggeligt, fordi fiksering procedurer kan føre til selektiv tab af proteiner fra både cytoplasma og plasmamembran.

Protocol

1. forberedelse af biologisk materiale

1. Forberede biologisk materiale udtrykker den fluorescently mærkede protein af interesse, samt et cytoplasmatisk markør. Følg de procedurer, der er nævnt i indledningen.

2. Konfokal Laser Scanning mikroskopi

1. Pletten materiale udarbejdet i afsnit 1 med FM 4-64 farvestof⁷.
   1. Anvende en farvnings-protokol, der er relevante for den undersøgte materiale. For tobak BY-2 celler, pletten 200 μl af cellesuspension med 0,2 μl af 10 mM FM 4-64 løsning i dimethylsulfoxide.
      Bemærk: Den typiske farvning koncentration af FM 4-64 farvestof er om 10 μM ved hjælp af 10 mM stamopløsning i dimethylsulfoxide. Bruge den laveste mulige koncentration af FM 4-64 til ordentlig farvning og ikke Inkuber celler på is (FM 4-64 og lav temperatur kan påvirke plasmamembran egenskaber). Fortsætte med observation benytter konfokalmikroskopi straks. Intervallet mellem farvning og image erhvervelse bør ikke være længere end 10 min; ellers påvirker endocytose af farvestoffet FM 4-64 farvning.
   2. Behandle flere prøver fortløbende, og ikke plette alle prøver i begyndelsen af eksperimentet.
2. Fange en Konfokal tværsnit pr. én celle.
   1. Angive en sekventiel to-kanals scanning for farvelegeme anvendes som protein tag (skal være i den første kanal) og FM 4-64 (skal være i den anden kanal). Indstille en højere optisk opløsning (10-20 px/μm). Et eksempel set-up: 63 X olie fordybelse mål, NA 1.3, billedstørrelse 1.024 x 1.024 px. Sikre, at plasma membran plan vinkelret Konfokal-sektion i de erhvervede billeder.
   2. Fange mindst 20 celler pr. prøve at have tilstrækkeligt med data til statistikken evaluering (afhænger af signal variabiliteten i forarbejdet materiale).

3. nødvendige softwareinstallation

1. Installere Fiji ImageJ distribution⁸og makroen kræves perifere.
   1. Downloade softwaren fra webstedet https://fiji.sc/#download, og installer dem ved udpakning.
   2. Start Fiji ved at dobbeltklikke på filen "ImageJ(.exe)" i mappen udpakket "Fiji.app".
   3. Download en makro "perifer" fra følgende websted:
      http://kfrserver.natur.CuNi.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.IJM.
   4. I Fiji, Vælg Plugins | Makroer | Installere... i hovedmenuen og angive stien til den downloadede fil "Peripheral_.ijm."
      Bemærk: To nye værktøjer til installerede makroen "perifer" vises i værktøjslinjen Fiji: "Tag profil værktøj" og "Perifer Protein menuen."
2. Installere Rasmussen-projektet software⁹og krævede pakker.
   1. Følg vejledningen på webstedet https://cloud.r-project.org/ for R-projektet installation.
      Bemærk: Den samlede analyse vil blive udført i Fiji. R software vil blive kaldt kun internt af Fiji makro "perifer" under beregning.
   2. Kør R GUI, Vælg pakker | Installer pakke(med)... i hovedmenuen og angive de nærmeste repository og pakke "ggplot2" til installation.
      Bemærk: Også skrive til R befale-kø: install.packages("ggplot2").
   3. Download en R pakke perifere fra destinationen: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Installere dem ved at vælge pakker | Installere pakke(r) fra lokale filer....
      Bemærk: Også skrive til R kommandolinjen denne kommando kun:
      install.Packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo = NULL, type = "kilde").

4. billedanalyse i Fiji

1. Behandle de Konfokal billeder af cytoplasmatisk markør.
   1. Importere billederne til Fiji ved hjælp af Plugins | Bio-formater | Bio-formater importør fra menuen Fiji med standardindstillingerne.
   2. Kontrollere hvis Bio-formater importøren ordentligt anerkendt image kalibrering. Dimensionen billede vist i øverste venstre felt billede oplysningsvinduet skal svare til de oprindelige billede dimensioner.
   3. Behandle forkert kalibreret billeder med den forkerte dimensioner enkeltvis, fxved at angive de korrekte parametre i dialogvinduet analyser | Sæt skala... fra menuen Fiji: Udfyld billedbredde i pixels i den afstand i pixel , og den rigtige bredde i passende længde enhed i feltet kendt afstand ).
      Bemærk: Hvis Leica LCS LEI filer er korrekt kalibreret, Følg trin 4.2.1.
2. Kør Import muligheder makro til en analyse set-up. Aktivere makroen ved en af tre forskellige måder: Vælg Plugins | Makroer | Importere indstillinger [f1] i Fiji hovedmenuen, Vælg den samme vare efter at klikke på menu værktøjet Perifere Protein Menu, eller tryk på tastaturet genvej F1. Indstil parameteren i dialogboksen startes makrovinduet.
   1. I tilfælde af Leica LCS LEI-format, skal du løse forkert kalibrering ved at aktivere Leica.lei billeder -afkrydsningsfeltet. Denne indstilling importerer korrekt Billeddimensionerne fra filen med filtypenavnet "lei".
   2. Definere den relevante værdi i feltet Gaussian blur radius (px). Dette påvirker billede gulvafslibning og støj reduktion. En lav værdi (1 px) er tilstrækkelig og forårsager ikke nogen billede information tab.
   3. Angiv en værdi i feltet profil stregbredden (px). En tykkere line forårsager større udjævning af profil kurver. En standardværdi 10 px anbefales.
   4. Angive et billede titel fortolkning af definitionen af "Prøve afgrænsere" og "Eksporteret varer."
      Bemærk: Et billede titel (filnavn uden filtypenavnet, f.eks.: "Eksperiment-1_line-02_cell-11") vil blive delt rundt om alle de tegn, der er angivet i feltet "Prøve afgrænsere" (f.eks.: "-_") til et sæt af elementer ("Eksperiment", "1"," Line","02","celle", og"11"), kan bruges som gruppering faktorer (prøve, celle, linje eller behandling identitet) i den følgende analyse. Angive hvilke varer der skal bruges ved at skrive deres sekvensnummer ("0" for det første element) i den gemt "Eksporteret emner." Bruge mellemrumssepareret format, f.eks., "3 5." I dette eksempel vil elementer "02" og "11" blive henvist til som gruppering faktorer ved navn "Fac_0" og "Fac_1." Derudover vil identitet for den enkelte måling blive henvist til som "jeg" faktor.
   5. Alternativt, holde prøve afgrænsere Tom og indgå de eksporterede varer 0, hvis det fulde billede titel kan bevares.
   6. På Windows operativsystem, kontrollere hvis stien til R software, vil være korrekt bil-opdaget i feltet sti til R.exe. Ellers, angive den fulde sti til filen R.exe i systemet (f.eks."C:\Program Files\R\bin\R.exe").
   7. Klik på OK. Tjekke titlen parsing i den næste dialogvindue, og klik på OK eller tilbage til at nulstille.
      Bemærk: Alle billeder bliver automatisk glattes og til sidst justeret. En liste over alle eksporterede gruppering faktorer vises i resultatvinduet.
3. Udføre en lineær udvalg på tværs af regionen plasma membran i de behandlede billeder og måle fluorescens profiler.
   1. Vælg værktøjet Fiji lige linje fra værktøjslinjen Fiji. Klik på billedet og trække en linje på tværs af regionen plasma membran. Linjen skal starte i det ekstracellulære rum og bør være vinkelret på plasmamembran. Vælg regioner med en tykkere og mere homogen lag af kortikale cytoplasma. Den optimale længde af den lineære udvalg er 5-10 μm.
   2. Kør den tage profil makro ved analogisk metode som i trin 4.2 (genvej "x") eller klikke på tage profil værktøj i værktøjslinjen Fiji. Automatisk måling af fluorescens profiler i begge kanaler vil blive udført og data vises i resultatvinduet.
   3. Ved hjælp af "x"-tasten anses user-unfriendly, åbne makro kildefil Peripheral_.ijm i teksteditoren, erstatte symbolet "x" i linje "makro"Tage profil [x]"{' med en mere gunstig symbol (, der ikke bruges i Fiji miljø som en aktive tastatur genvej), og Gem filen. Geninstaller makroen (trin 3.1.4) og begynde analysen fra billede import.
   4. Ifølge enkelte signal variabilitet, tage et repræsentativt antal profiler for hver celle.
   5. Gemme data via fil | Gem som.... Altid bruge filtypenavnet "csv"; Det er nødvendigt for korrekt dataformat.
4. Opstille de afbilde profil datamakro (genvej F5) for grafisk visualisering af de målte profiler. Indstil parameteren i dialogboksen startes makrovinduet.
   1. Holde afkrydsningsfeltet Brug filtrering til input data? umarkerede.
   2. Angiv, hvis handlingen skal oprettes fra de seneste data i vinduet resultatet fra en enkelt CSV-fil eller fra alle CSV-filer i en bestemt mappe ved at klikke på den relevante alternativknap.
      Bemærk: Hvis plot er skabt ud fra de seneste resultater, data vil blive gemt først (Gem som... dialog vil være automatisk aktiveret).
   3. Angiv, hvilke gruppering faktorer vil blive brugt til angivelse af grafik ved at markere de relevante afkrydsningsfelter. Vælg faktoren "i." Hvis alle profiler skal vises i unikke parceller. Holde afkrydsningsfelterne unselected, hvis alle data bør af afbildet i en enkelt plot.
      Forsigtig: Valg af en gruppering faktor, der ikke findes i forarbejdede resultater årsager fejl under oprettelsen af plot.
   4. Angiv filnavn , når du gemmer et plot i feltet Output filen præfiks og definere plot billedets dimensioner i filer Plot høj og Plot bredde.
      Bemærk: Den resulterende plot vil blive gemt i en kilde data bibliotek som en PNG-fil.
   5. Vælg den PDF-output? afkrydsningsfeltet, hvis en yderligere PDF output kan fremstilles.
   6. Klik på OK. Angiv stien til lagring af resultaterne eller i sidste ende for data import i den næste dialogvindue. Bekræfte analyse ved at klikke på OK i dialogboksen windows viser koden udføres Rasmussen.
      Bemærk: Plottet vil blive åbnet i et nyt billedvinduet og R analyse output vil blive vist i tekstvinduet.
5. Kør profil filtrering opsætningen makro (genvej F2) hvis nogle plottet profiler har overdreven signaler i det ekstracellulære rum (for mærket protein) eller i den intracellulære rum (til FM 4-64-signal). Følg ved at angive parametre i dialogboksen startes makrovinduet.
   Bemærk: Filtrering giver mulighed for fjernelse af dårlig profiler i henhold til den maksimale tilladte støtteintensitet tærskel på angivne x-koordinater.
   1. For hver kanal, skal du angive den passende intensitet tærskel i filen fjerne målinger med en overdreven ekstracellulære (intracellulære) signal. Angiv den region, hvor intensiteten tærskel vil blive anvendt i felt på x-koordinaterne lavere (større) end.
   2. Kør den Plot profil datamakro (trin 4.4) igen med afkrydsningsfeltet Brug filtrering til input data? valgt; sikre, at alle afvigende profiler blev fjernet. Ellers, forbedre filterparametre (trin 4.5.1).
6. Køre Opret model makro (genvej F3) for at oprette en model af plasma membran og cytoplasma fluorescens distribution baseret på kalibreringsdata. Følg ved at angive parametre i dialogboksen startes makrovinduet.
   1. Angiv, hvis input-data skal være filtreret (trin 4.5) ved at vælge den Brug filtrering til input data? afkrydsningsfelt.
   2. Angive kildedataene analogt som i trin 4.4.2.
   3. Angiv et interval som model vil blive forudsagt af definitionen af "start," "ende," og "skridt" værdier i μm.
      Bemærk: Alle profil målinger skal være længere end det angivne interval.
   4. Angive bølgelængder af fluorescens excitations- og maxima af lysopfangende anvendt i de relevante felter. Angive standardværdier for normal god landbrugspraksis og FM 4-64 kombination.
      Bemærk: "Normal god landbrugspraksis" angiver farvelegeme anvendes til protein tagging (normal god landbrugspraksis, fælles fiskeripolitik, YFP, etc.), og "FM4" angiver farvelegeme anvendes til en plasma membran farvning (typisk FM 4-64).
   5. Angiv feltet Output filen præfiks . Præfikset skal bruges til at gemme en resulterende model som RData fil hen til en kilde-datamappen.
   6. Marker afkrydsningsfeltet- Plot model? Hvis den grafiske output er påkrævet. Plottet gemmes som PNG og også som PDF-fil, hvis den PDF-output? afkrydsningsfeltet er markeret.
   7. Klik på OK. Angiv input eller output stier i de næste dialogboks windows og bekræfte analysen ved at klikke på OK i dialogboksvinduet viser koden udføres Rasmussen.
      Bemærk: Plot af de modellerede cytoplasmatisk og membran sammensatte af perifert forbundet protein fluorescens bliver vist i billedvinduet ny, og R analyse output vil blive vist i tekstvinduet.
7. Behandle billeder af de celler, der udtrykker protein af interesse.
   1. Importere billeder analogt som i trin 4.1.
   2. Oprette analyse analogt som i trin 4.2. Gulvafslibning og linie bredde skal være identiske.
   3. Måle profiler analogt som i trin 4.3.
   4. Tjekke nøjagtigheden af profiler af plotte (trin 4.4) og angive filtrering hvis det ønskes (trin 4.5).
8. Kør Beregn distribution makro (genvej F4) til beregning af en protein opdeling mellem plasma membran og i cytoplasmaet. Følg parameterindstilling i dialogboksen startes makrovinduet.
   1. Analogt med forrige trin (trin 4.4), angive datakilden, filtrering og Filnavn præfiks.
   2. Angiv, hvis model for protein fordeling beregning vil blive indlæst fra sidste model beregning i den seneste forekomst af makroen "Perifer" på Fiji (Vælg afkrydsningsfelt for seneste resultater), eller fra RData fil ( Vælg afkrydsningsfeltet "fra fil").
   3. Holde afkrydsningsfeltet Fjern resultater med resterende variation større end aktiveres, hvis en resultatet filtrering ønskes. Angiv grænsen for den maksimale tilladte resterende variation, der kan være uforklarlige af signal nedbrydning af den enkelte profil måling. For eksempel: værdien af 0.200 angiver, at alle måling med uforklarlige variabilitet højere end 20% af den samlede variation af fluorescens-intensiteten i profilen slettes.
   4. Vælg prøve gruppering faktorer, som kan anvendes til box-plottet oprettelse (trin 4.4).
   5. Aktivere afkrydsningsfeltet PDF-output? til at gemme box-plottet som PDF-fil.
   6. Klik på OK, angive input eller output stier og bekræfte analysen ved at klikke på OK i dialogboksvinduet viser koden udføres Rasmussen.
      Bemærk: Box-plottet af perifert forbundet protein opdeling mellem plasma membran og cytoplasmaet bliver vist i et nyt billedvindue,, og R analyse output vil blive vist i tekstvinduet.
   7. For ekstern forarbejdning, gemmes de resultater, der vises i resultatvinduet via fil | Gem som... i vinduesmenuen.

Representative Results

DREPP¹⁰ er en plante-specifikke perifert forbundet plasmamembran protein, der er knyttet til plasma-membran via en N-myristoylation og elektrostatiske interaktion med phosphatidylinositol fosfater^{11, 12}. DREPP blev beskrevet som en komponent af calcium-signalering maskiner i cellen fabrikken og også interagerer med cytoskeleton^13,14. I præsenteret eksperimentet, wild-type tobak DREPP2 og ikke-myristoylated mutant version (Gly2 erstattes af Ala) var normal god landbrugspraksis-mærket⁶ og udtrykt i tobak BY-2 suspension celler¹⁵ under CaMV 35S promotor¹⁶. Plasma membran partitionering af disse proteiner blev målt i 3 dage gamle (3 dage efter fortynding), FM 4-64-mærket (8 µM) celle kulturer⁶ med (figur 1A) og uden (figur 1B) tilsætning af phosphoinositide 3-kinase hæmmer Wortmannin (10 µM)¹⁷, efter den protokol, der er beskrevet ovenfor. Den klippede version DREPP2(Δ1-23) mangler plasmamembran bindende domæne⁶ blev brugt som cytoplasma markør for fluorescens distribution model konstruktion (figur 1 c).

Beregnede data blev kvadratroden omdannet (den positive værdi svarer til den laveste negative værdi blev tilføjet til alle data til at hente kun positive data), og dataene blev testet af to-vejs ANOVA i R⁹. Virkningerne af mutation og hæmmer behandlingen var meget signifikante (p < 2.2 x 10^-16 ***). Alle grupper blev sammenlignet ved Tukey HSD test; alle grupper afveg betydeligt med undtagelse af DREPP2 behandles af Wortmannin og ubehandlede DREPP2(G2A) (figur 1 d).

Disse resultater viser tydeligt, at plasma-membran sammenslutning af tobak DREPP2 protein er resultatet af en N-myristoylation og elektrostatiske interaktion, som fungerer co-operatively. Kun den gensidige effekt af N-myristoylation site mutation og Wortmannin behandling forårsaget en fuld dissociation af DREPP2 proteinet fra plasmamembran. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere udgivne data⁶.

Figur 1 : Effekten af mutation i N-myristoylation site og Wortmannin behandling på plasma membran partitionering af perifert forbundet plasmamembran protein DREPP, som er involveret i en calcium signalering pathway i cellen fabrikken. (A) mediale Konfokal sektioner af tobak BY-2 celler udtrykker formen vildtype DREPP2-normal god landbrugspraksis og muterede danne DREPP2 (Gly2Ala)-normal god landbrugspraksis (grøn kanal). Celler var mærket med FM 4-64 farvestof (magenta kanal), skala bar 10 µm. (B) den samme cellelinje blev behandlet af 10 µM Wortmannin (WM). (C) celler, der udtrykker cytoplasmatisk markør DREPP2(Δ1-23). (D) den anslåede plasmamembran partitionering for alle prøver. Betydningen af begge virkninger blev testet af to-vejs ANOVA (p < 2.2 x 10^-16 *** de oprindelige data var i begge tilfælde; kvadratroden-omdannet). Bogstaver angiver grupper, der ikke er signifikant forskellige fra hinanden som fastsat af Tukey HSD test. Knurhår af boks-plots angive 95% konfidensinterval. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Metoden beskrevet her skaber en mere nøjagtig vurdering af plasma membran partitionering for perifert tilknyttede proteiner i forhold til andre metoder baseret på måling af fluorescens intensiteter⁵. Den store forbedring af denne metode er, at det tager hensyn til lys diffraktion og superposition af plasma-membran og cytoplasmatisk signaler. Selv om disse metode resultater er i sammenhæng med resultaterne af en simpel metode baseret på sammenligning af fluorescens intensitet på positionen membran med den gennemsnitlige cytoplasmatisk signal (som vist tidligere⁶), den største fordel af denne nye metode er fastsættelsen af den resterende variation (uforklarlig af signal nedbrydning) der giver mulighed for vurdering af relevansen af resultaterne, især hvor plasmamembran signalet er lavere end den cytoplasmatisk signal. Den beskrevne metode er også mere robust signal-støj, fordi beregning af protein opdeling ikke er baseret på kun ét punkt.

Analysen kræver kun enkelt to-kanals Konfokal billeder. I modsætning til FRAP tilgange¹⁸ baseret på målinger af protein diffusion dynamics i længere tid windows, er den beskrevne metode mere relevant for dynamisk i vivo tilgange, når hurtig billede erhvervelse er et afgørende krav ( f.eks., signal transduktion udforskninger, hæmmende assays). Metoden er velegnet til hurtigt at opnå store mængder data, som er tilstrækkelige til statistisk vurdering.

Metoden er begrænset til kun en enkelt membran. Analyse af signaler fra to nært tilgrænsende membraner af naboceller understøttes ikke i øjeblikket. I dette tilfælde er det signal montere mere krævende med en højere risiko for artefakter.

Men analysen var oprindeligt designet til plante suspension celler¹⁵, og det kan anvendes til analyser af andre celletyper. Pollen rør og rodtråde repræsenterer potentielt meget gode mål af denne metode i Plantebiologi. Eksterne membraner af plante epidermale celler kan analyseres efter forrige kontrol at cellevægge ikke er mærket af FM 4-64 og ikke udviser interfererende autofluorescence. Protist celler, som er fri for forstyrrende autofluorescence, gærceller, svampe celler samt animalske celler med glat plasma membran kan analyseres ved hjælp af metoden beskrevet; dog for animalske celler være analyse af protein fordeling på forkanten af fibroblastceller eller pensel kanten af epitelceller ikke muligt. På grund af de fleksible analyseindstillingerne tagged FM 4-64 farvning kan erstattes af andre plasmamembran visualisering tilgange, såsom fluorescently proteiner. Med forsigtighed, kan metoden bruges til faste celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer