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Biology

Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57837
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

ERRATUM NOTICE

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un'analisi quantitativa del livello di associazione di membrana plasmatica per etichetta fluorescente marginalmente-collegata della proteina. Il metodo si basa sulla decomposizione computazionale della membrana e citoplasmatico componente del segnale osservato in cellule identificate con marcatore fluorescente della membrana plasmatica.

Abstract

Questo metodo fornisce un approccio veloce per la determinazione della membrana plasmatica di partizionamento di qualsiasi proteina fluorescente contrassegnati perifericamente associata utilizzando i profili di intensità di fluorescenza attraverso la membrana plasmatica. Profili di fluorescenza misurata sono dotati di un modello per la distribuzione di fluorescenza di membrana e citoplasma lungo una linea applicata perpendicolarmente alla periferia delle cellule. Questo modello è costruito dai valori di intensità di fluorescenza in celle di riferimento che esprime un indicatore fluorescente contrassegnati per citoplasma e con FM 4-64-labeled membrana plasmatica. Il metodo può essere applicato a vari tipi di cellule e organismi; Tuttavia, solo il plasma membrane delle cellule vicine non possono essere valutate. Questo metodo veloce basata su microscopia è adatto per esperimenti, dove sono attesi cambiamenti sottili e dinamici dei marcatori di membrana-collegato e necessità di essere quantificati, per esempio, nell'analisi delle versioni mutanti delle proteine, trattamenti inibitore, e osservazioni di trasduzione del segnale. Il metodo viene implementato in un pacchetto di R multi-piattaforma che è accoppiato con una macro di ImageJ che funge da un'interfaccia user-friendly.

Introduction

Proteine di membrana plasmatica perifericamente associata sono i componenti chiave delle vie di segnalazione delle cellule. Uno dei loro ruoli fondamentali è la loro membrana plasmatica transitoria associazione e dissociazione, che è importante per la trasduzione del segnale tra membrana e citoplasma. Proteine della membrana di plasma perifericamente associata possono essere attaccati sulla membrana plasmatica dagli ancoraggi del lipido (N-miristoilazione, S-acilazione o prenilazione) o dai domini di legame dei lipidi (interagendo con fosfatidilinositolo fosfati, acido fosfatidico, ecc).

Associazione di membrana plasmatica le proprietà di queste proteine possono essere esaminati in vivo, per esempio, quando una proteina fluorescente-tag viene modificata da una mutagenesi sito-diretta di aminoacidi chiave, o quando è trattata con vari inibitori che interessano segnalazione del lipido. Le distribuzioni delle proteine di membrana plasmatica periferici vengono per lo più valutate qualitativamente, soprattutto nei casi, quando re-distribuzione della proteina è ovvio. Il metodo proposto è ottimo per situazioni quando re-distribuzione della proteina è solo parziale e valutazione quantitativa è necessario. Un approccio utilizzato con frequenza di quando associazione della membrana del plasma è stimato da confocale laser scansione immagini di microscopia, come un rapporto di intensità di fluorescenza alla membrana del plasma e nel citoplasma1,2, è semplice, ma non accurata. Intensità di fluorescenza alla membrana del plasma riflettono una sovrapposizione del segnale al plasma-membrana e citoplasma dovuto la caratteristica di diffrazione della luce per la tecnica di microscopia di fluorescenza particolare ed elementi ottici utilizzati3. Di conseguenza, il segnale citoplasmatico è incluso anche nella regione della membrana. Per questo motivo, modello di macchiatura FM 4-64 non può essere utilizzato come maschera per una membrana segnale selezione4. Inoltre, semplici misurazioni del segnale di membrana nella posizione definita da FM 4-64 colorazione massima sempre sistematicamente sopravvalutano il segnale reale-membrana plasmatica della proteina di membrana plasmatica perifericamente associata a causa della sovrapposizione della membrana e citoplasmatico composto. Il numero massimo di segnali osservati per etichetta fluorescente proteine marginalmente associate anche non co-localizza con il massimo del marcatore di membrana plasmatica (cioè, FM 4-64 styryl tintura), ma è spostato verso il citoplasma. Un'altra limitazione è basata sul fatto che la FM 4-64 picco di emissione è più ampia in confronto con i picchi di emissione per proteine verdi fluorescenti come GFP a causa della lunghezza d'onda-dipendenza di diffrazione della luce3.

Nel metodo descritto qui, il segnale di proteine con tag viene montato con due funzioni empiriche che descrivono un'ipotetica distribuzione della membrana plasmatica e segnale di citoplasma, rispettivamente. Questa decomposizione del segnale viene applicata ai profili di fluorescenza lineare che vengono applicati alla superficie delle cellule perpendicolarmente alla membrana plasmatica in immagini sorgente, che sono regolari, due canali sezioni confocale di esprimere la proteina fluorescente-Tag cellule identificate con la tintura di FM 4-64.

La prima funzione di fissaggio descrive una diffrazione di un segnale di citoplasma sul bordo delle cellule. È ottenuto da profili di fluorescenza acquisiti in precedenza che sono stati misurati in cellule esprimenti un citoplasma proteina marker contrassegnati dal cromoforo stesso come la membrana plasmatica marginalmente-collegata della proteina di interesse. La seconda funzione che descrive una diffrazione di un segnale di membrana plasmatica è derivata dalla fluorescenza di FM 4-64. Questo segnale è in primo luogo approssimato di una funzione gaussiana che viene utilizzata per una modellazione approssimativa di diffrazione della luce di una sorgente puntiforme. In secondo luogo, questo modello, valido per l'emissione FM 4-64 rosso, matematicamente è trasformato la forma che è rilevante per una lunghezza d'onda di emissione del cromoforo utilizzato per la codifica delle proteine marginalmente-collegate di interesse alla membrana del plasma. Entrambe le funzioni sono normalizzate di intensità massima e dalla media dal 10% dei valori più alti per segnale FM 4-64 e segnale proteina citoplasmatica, rispettivamente. Da questa decomposizione del segnale (metodo di montaggio quadrato almeno non lineare), il rapporto della membrana plasmatica e la frazione di citoplasma della proteina esaminata può essere stimati con facilità e precisione. La dimensione fisica reale del coefficiente di partizionamento computata è nella gamma di micrometro, poiché concentrazione citoplasmatica volume viene confrontati con superficie concentrazione sulla membrana plasmatica. Definisce la distanza tra la membrana plasmatica e citoplasma, all'interno del quale la stessa quantità di proteine è localizzata come nella zona adiacente della membrana del plasma. Questo valore è equivalente alla divisione coefficiente K2 introdotto precedentemente5. Il metodo è molto veloce, che richiede solo singole sezioni confocale acquisite utilizzando routine laser confocale scansione microscopio, e non è computazionalmente impegnativo. Il nucleo di analisi è stato implementato in un pacchetto portatile R e una macro aggiuntiva di ImageJ è stato scritto per fornire l'interfaccia utente grafica per eseguire l'analisi dalle finestre di dialogo intuitivi. Software e descrizione più dettagliata del metodo (precedentemente pubblicato6) può essere trovato alla http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

Il metodo è adatto a cellule isolate, protoplasti e tessuti, dove la membrana plasmatica delle cellule individuali è chiaramente distinguibile, esprimendo un costrutto etichetta fluorescente di esaminato proteina perifericamente associata. Un cromoforo compatibile con FM 4-64 colorazione deve essere utilizzato. FM 4-64 emette fluorescenza rossa; di conseguenza, proteina esaminata possa essere contrassegnata da una proteina di fluorescenza con emissione di blu, verde o giallo (ad es., GFP, PCP, YFP). Trasformazione stabile di materiale biologico è raccomandato perché consente osservazioni meno artificiale e più riproducibile della distribuzione della proteina. È necessario che la proteina esaminata ha una distribuzione relativamente omogenea citoplasmatica. La localizzazione di una proteina nel reticolo endoplasmatico o un altro compartimento intracellulare membrana può produrre risultati artificiali.

Inoltre, lo stesso materiale biologico esprimenti un marker citoplasmatico deve essere utilizzato per il confronto. Le cellule possono essere trasformate da un chomophore gratuito (lo stesso utilizzato per la proteina periferica tagging, per esempio, GFP gratuito) o da tagged proteina di interesse con capacità legante membrana abolita. Capacità di legame di membrana può essere abolita, ad esempio, dal taglio del dominio legante membrana o da mutagenesi sito-diretta di residui dell'aminoacido chiave (ad esempio, siti per N-miristoilazione, S-acilazione, o prenilazione, ecc.).

Per microscopia a scansione confocale, le cellule devono essere etichettate da un marcatore di membrana come tintura FM 4-64. Se FM 4-64 colorazione non è adatta al materiale studiato (a causa di autofluorescenza interferente, colorante scarsa penetrazione, ecc.), la membrana plasmatica può essere etichettata, ad esempio, dalla proteina integrale di membrana del plasma etichettata per un appropriato chomophore ( mCherry, RFP, ecc.). È essenziale che il marcatore è trascurabile localizzazione nei compartimenti intracellulari membrana (livello delle endomembrane).

Se si lavora con campioni fissati e gli anticorpi, risolvibile analogica FM 4-64FX o membrana plasmatica etichettatura di anticorpo contro una destinazione appropriata può essere utilizzato. In questo caso, è essenziale per valutare i risultati con molta attenzione perché le procedure di fissaggio possono condurre alla perdita selettiva delle proteine dal citoplasma e membrana plasmatica.

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Protocol

1. preparazione del materiale biologico

  1. Preparare il materiale biologico che esprimono la proteina fluorescente contrassegnata di interesse, come pure un marker citoplasmatico. Seguire le procedure menzionate nell'introduzione.

2. confocale a scansione Laser

  1. Macchiare il materiale preparato in sezione 1 con FM 4-64 tintura7.
    1. Applicare un protocollo di colorazione che è appropriato per il materiale studiato. Per le celle di tabacco BY-2, macchia 200 µ l di sospensione cellulare con 0,2 μL di 10 mM FM 4-64 soluzione in dimetilsulfossido.
      Nota: La concentrazione di colorazione tipica di FM 4-64 colorante è circa 10 μM utilizzando soluzione stock di 10 mM in dimetilsulfossido. Utilizzare la più bassa concentrazione possibile di FM 4-64 per la macchiatura corretta e non Incubare le cellule sul ghiaccio (FM 4-64 e bassa temperatura può incidere sulle caratteristiche di membrana plasmatica). Continuare con l'osservazione immediatamente l'uso di microscopia confocale. L'intervallo tra la colorazione e l'acquisizione di immagini non dovrebbe essere più di 10 min; in caso contrario, endocitosi della tintura influenzerà la FM 4-64 macchiatura.
    2. Processare i campioni più consecutivamente e non si colorano tutti i campioni all'inizio dell'esperimento.
  2. Catturare una sezione equatoriale confocale per una cella.
    1. Impostare una scansione sequenziale di due canali per il cromoforo utilizzato come il tag di proteina (deve essere nel primo canale) e FM 4-64 (deve essere nel secondo canale). Impostare una risoluzione ottica superiore (10 – 20 px/μm). Una configurazione di esempio: 63 X olio dimensioni di immersione obiettivo, NA 1.3, immagine 1.024 x 1.024 px. Assicurarsi che il piano della membrana plasmatica è perpendicolare al piano di confocal-sezione nelle immagini acquisite.
    2. Cattura almeno 20 cellule per campione di avere abbastanza dati per la valutazione statistica (dipende la variabilità del segnale nel materiale lavorato).

3. installazione del Software richiesto

  1. Installare Fiji ImageJ distribuzione8e la macro richiesta periferica.
    1. Scaricare il software da https://fiji.sc/#download il sito e installarli da disfare.
    2. Avviare Fiji facendo doppio clic sul file "ImageJ(.exe)" nella directory "Fiji.app" spacchettato.
    3. Scarica una macro "periferica" dal seguente sito:
      http://kfrserver.Natur.cuni.cz/LiDE/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.IJM.
    4. Nelle Isole Figi, selezionare plugin | Le macro | Installare... nel menu principale e specificare il percorso per il file scaricato "Peripheral_.ijm."
      Nota: Due nuovi strumenti della macro installata "periferico" apparirà nella barra degli strumenti di Fiji: "Prendere il profilo Tool" e "Menu di proteina periferica".
  2. Installare i pacchetti necessari e R-progetto software9.
    1. Seguire le istruzioni del sito https://cloud.r-project.org/ per installazione R-project.
      Nota: L'analisi complessiva viene eseguita in Fiji. Il software R verrà chiamato solo internamente dalla macro Fiji "periferica" durante il calcolo.
    2. Eseguire R GUI, selezionare pacchetti | Installare pacchetti... nel menu principale e specificare il repository più vicina e il pacchetto "ggplot2" per l'installazione.
      Nota: In alternativa, digitare alla riga di comando R: install.packages("ggplot2").
    3. Scaricare un pacchetto di R periferico dalla destinazione: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Installarli selezionando pacchetti | Installare pacchetti da file locali....
      Nota: In alternativa, digitare alla riga di comando R solo questo comando:
      Install.Packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo = NULL, tipo = "sorgente").

4. image Analysis in Fiji

  1. Elaborare le immagini confocale del marcatore citoplasmico.
    1. Importare le immagini di Figi utilizzando plugin | Bio-Formats | Bio-Formats importatore dal menu Fiji con impostazioni predefinite.
    2. Controllare se l'importatore di Bio-formati riconosciuti correttamente la calibrazione delle immagini. La dimensione della foto mostrata nella finestra dell'immagine di campo superiore sinistro informazioni deve essere uguale per le dimensioni dell'immagine originale.
    3. Delizia calibrato correttamente immagini con l'errato dimensioni singolarmente, ad esempio, impostando i parametri corretti nella finestra di dialogo Analyze | Impostare la scala... dal menu di Fiji: riempire la larghezza dell'immagine in pixel nel campo distanza in pixel e la larghezza reale nell'unità di lunghezza appropriata nel campo conosciuto distanza ).
      Nota: Se i file di Leica LCS LEI sono stati calibrati correttamente, seguire passo 4.2.1.
  2. Eseguire la macro di opzioni di importazione per un set-up di analisi. Attivare la macro da uno dei tre modi diversi: selezionare plugin | Le macro | Importare le opzioni [f1] nel menu principale di Fiji, selezionare lo stesso articolo dopo aver cliccato lo strumento menu Periferica proteina Menuo premere il tasto tastiera corta F1. Impostare il parametro nella finestra di dialogo macro richiamata.
    1. In caso il formato Leica LCS LEI, risolvere calibrazione errata attivando la casella di controllo Leica.lei immagini . Questa opzione consente di importare correttamente le dimensioni dell'immagine da file con l'estensione "lei".
    2. Definire il valore appropriato nel campo raggio (px) di sfocatura gaussiana. Questo influenza foto levigante e riduzione del rumore. Un valore basso (1 px) è sufficiente e non causa alcuna perdita di informazioni di immagine.
    3. Impostare un valore nel campo larghezza di profilo linea (px). Una linea più spessa provoca maggiore lisciatura delle curve di profilo. Un valore predefinito 10 px è raccomandato.
    4. Impostare un'immagine titolo l'analisi tramite la definizione di "Campione delimitatori" e "Elementi esportati".
      Nota: Un'immagine titolo (nome file senza estensione, ad esempio: "Esperimento-1_line-02_cell-11") sarà diviso intorno tutti i caratteri elencati nel campo "Delimitatori del campione" (per esempio: "-_") in un insieme di elementi ("Esperimento", "1"," linea","02","cella"e"11") che può essere utilizzato come fattori di raggruppamento (identità del campione, cella, riga o trattamento) nell'analisi che segue. Definire gli elementi che verranno utilizzati da digitando il loro numero di sequenza ("0" per il primo elemento) archiviato "Esportato gli elementi". Utilizzare il formato delimitato da spazi, ad esempio, "3 5." In questo esempio, "02" e "11" verranno essere indicati come raggruppamento di fattori che si chiamano "Fac_0" e "Fac_1." Inoltre, l'identità di ogni misurazione verrà essere indicato come "io" fattore.
    5. In alternativa, tenere i delimitatori campione vuota e inserire gli elementi esportati 0 se il titolo dell'immagine completa può essere mantenuto.
    6. Sul sistema operativo Windows, verifica se il percorso del software R sarà correttamente rilevata automaticamente nel campo percorso di R.exe. In caso contrario, specificare il percorso completo al file R.exe nel sistema (ad esempio, "C:\Program Files\R\bin\R.exe").
    7. Fare clic su OK. Controllare il titolo l'analisi nella finestra di dialogo successiva e fare clic su OK o su indietro per ripristinare.
      Nota: Tutte le immagini saranno automaticamente levigate e alla fine ricalibrate. Un elenco di fattori tutti esportati raggruppamento verrà visualizzato nella finestra risultati.
  3. Eseguire una selezione lineare in tutta la regione della membrana plasmatica nelle immagini elaborate e misurare i profili di fluorescenza.
    1. Selezionare lo strumento di Fiji linea retta dalla barra di Fiji. Clicca l'immagine e trascinare una linea in tutta la regione della membrana plasmatica. La riga deve iniziare nello spazio extracellulare e dovrebbe essere perpendicolare alla membrana plasmatica. Scegliere le regioni con uno strato più spesso e più omogenea di citoplasma corticale. La lunghezza ottimale della selezione lineare è 5-10 μm.
    2. Eseguire la macro di profilo di prendere metodo analogico come il passo 4.2 (scorciatoia "x") oppure facendo prendere profilo strumento nella barra degli strumenti di Fiji. Verrà eseguita la misurazione automatica dei profili di fluorescenza in entrambi i canali e i dati verranno visualizzati nella finestra risultati.
    3. Se utilizzando il tasto "x" è considerato poco intuitivo, aprire il file di origine Peripheral_.ijm di macro nell'editor di testo, sostituire il simbolo "x" nella riga ' macro "Prendere profilo [x]" {' con un simbolo più favorevole (che non viene utilizzato nell'ambiente di Fiji come un scorciatoia di tastiera attivo) e salvare il file. Reinstallare la macro (punto 3.1.4) e avviare l'analisi dall'importazione immagine.
    4. Secondo la variabilità individuale segnale, prendere i numeri rappresentativi dei profili per ogni cella.
    5. Salvare i dati tramite File | Salva con nome. Sempre utilizzare l'estensione ". csv"; è necessario per il formato di dati corretto.
  4. Eseguire la macro di dati di profilo di Plot (scorciatoia F5) per la visualizzazione grafica dei profili misurati. Impostare il parametro nella finestra di dialogo macro richiamata.
    1. La casella di controllo Mantieni uso filtro per dati di input? non selezionati.
    2. Specificare se la trama deve essere creata da dati recenti nella finestra del risultato, da un singolo file CSV o da tutti i file CSV in una directory specificata facendo clic sul pulsante di opzione appropriato.
      Nota: Se la trama viene creata dai recenti risultati, dati verranno salvati in primo luogo (finestra di dialogoSalva con nome verrà attivato automaticamente).
    3. Specificare quali fattori di raggruppamento verrà utilizzato per il tracciato selezionando le caselle di controllo appropriate. Selezionare il fattore "i." se tutti i profili devono essere visualizzati nei grafici unici. Mantenere le caselle di controllo non è selezionate, tutti i dati in caso di tracciati in un unico appezzamento.
      Attenzione: La selezione di un fattore di raggruppamento che non esiste l'errore di cause di risultati elaborati durante la creazione della trama.
    4. Specificare il nome del file quando si salva un terreno nel campo prefisso del file di Output e definire le dimensioni di trama in file trama alta e la larghezza di trama.
      Nota: La trama risultante verrà salvata in una directory di dati di origine come un file PNG.
    5. Selezionare il output Pdf? casella di controllo se un PDF ulteriori output può essere prodotta.
    6. Fare clic su OK. Specificare il percorso per salvare i risultati o alla fine per i dati di importazione nella finestra di dialogo successiva. Confermare analisi facendo clic su OK nella finestra di dialogo Mostra il codice R eseguito.
      Nota: La trama verrà aperto in una nuova finestra di immagine e l'output di analisi R sarà elencato nella finestra di testo.
  5. Eseguire il profilo filtro macro di installazione (scorciatoia F2) se alcuni profili tracciati hanno segnali eccessivi nello spazio extracellulare (per la proteina taggato) o nello spazio intracellulare (per il segnale FM 4-64). Seguire impostando i parametri nella finestra di dialogo macro richiamata.
    Nota: Il filtro consente la rimozione di poveri profili in base alla soglia di intensità massima consentita alle coordinate x specificate.
    1. Per ogni canale, è possibile impostare la soglia di intensità appropriata nel file rimuovere misurazioni con un eccessivo segnale extracellulare (intracellulare). Specificare l'area dove verrà applicata la soglia di intensità nel campo alle coordinate x abbassare (maggiore).
    2. Eseguire la macro di dati di profilo di Plot (punto 4.4) nuovamente con la casella di controllo uso filtro per dati di input? selezionato; garantire che tutti i profili aberranti sono stati rimossi con successo. In caso contrario, migliorare i parametri di filtraggio (punto 4.5.1).
  6. Eseguire la macro del modello crea (scorciatoia F3) per creare un modello di membrana plasmatica e la distribuzione di fluorescenza di citoplasma sulla base dei dati di calibrazione. Seguire impostando i parametri nella finestra di dialogo macro richiamata.
    1. Specificare se i dati di input devono essere filtrato (punto 4.5) selezionando il uso filtro per dati di input? casella di controllo.
    2. Specificare i dati di origine analogicamente come al punto 4.4.2.
    3. Specificare un intervallo in cui il modello sarà previsto dalla definizione di "inizio", "fine", e "passaggio" valori in μm.
      Nota: Tutte le misure di profilo devono essere più l'intervallo specificato.
    4. Specificare la maxima di eccitazione e di emissione di lunghezze d'onda di fluorescenza di cromofori utilizzati, nei campi appropriati. Impostare i valori predefiniti per GFP e FM 4-64 combinazione.
      Nota: "GFP" indica il cromoforo utilizzato per la proteina tagging (GFP, PCP, YFP, ecc.), e "FM4" indica il cromoforo utilizzato per una membrana plasmatica colorazione (in genere FM 4-64).
    5. Specificare il campo prefisso del file di Output . Il prefisso sarà utilizzato per il salvataggio di un modello risultante del file RData in una directory di dati di origine.
    6. Selezionare la casella di controllo trama modello? Se l'output grafico è necessaria. La trama verrà salvata come file PNG e anche come file PDF se il output Pdf? casella di controllo è selezionata.
    7. Fare clic su OK. Specificare l'input o output percorsi nella finestra di dialogo successiva e confermare l'analisi facendo clic su OK nella finestra di dialogo che mostra il codice R eseguito.
      Nota: La trama del modellato citoplasmico e membrana composto della fluorescenza della proteina perifericamente associata verrà mostrati nella finestra immagine nuova, e l'output di analisi R verrà elencato nella finestra di testo.
  7. Elaborare le immagini delle cellule esprimenti la proteina di interesse.
    1. Importare le immagini analogicamente come descritto al punto 4.1.
    2. Impostare l'analisi analogicamente come descritto al punto 4.2. La lisciatura e lo spessore deve essere identico.
    3. Misurare i profili analogicamente come al punto 4.3.
    4. Controllare la precisione dei profili tracciando (punto 4.4) e imposta il filtro se lo si desidera (punto 4.5).
  8. Eseguire la macro di distribuzione calcola (scorciatoia F4) per il calcolo di una proteina di partizionamento tra la membrana plasmatica e nel citoplasma. Seguire l'impostazione del parametro nella finestra di dialogo macro richiamata.
    1. Analogicamente con il passaggio precedente (passaggio 4.4), specificare l'origine dati, il filtraggio e il prefisso nome file.
    2. Specificare se il modello per il calcolo di distribuzione proteina verrà caricato dal ultimo calcolo modello nell'istanza di recente della macro "Periferico" in Fiji (Seleziona casella risultati di recente), o dal file RData ( Selezionare la casella di controllo "dal file").
    3. Mantenere la casella di controllo rimuovere risultati con maggiore variabilità residua attivato se non si desidera un risultato di filtraggio. Specificare la soglia della variabilità residua massima consentita che non può essere spiegata la decomposizione del segnale di misura il profilo individuale. Ad esempio: un valore pari a 0,200 indica che verrà eliminate tutte le misurazione con variabilità non spiegata superiore al 20% della variabilità totale dell'intensità di fluorescenza nel profilo.
    4. Selezionare raggruppamento campione fattori, che possono essere utilizzati per casella-creazione (passo grafico 4.4).
    5. Attivare la casella di controllo output Pdf? per salvare la casella-trama come file PDF.
    6. Fare clic su OK, specificare l'input o percorsi di uscita e confermare l'analisi facendo clic su OK nella finestra di dialogo che mostra il codice R eseguito.
      Nota: La casella-trama di proteina perifericamente associata partizionamento tra la membrana plasmatica e citoplasma appare in una nuova finestra di immagine, e l'output di analisi R sarà elencato nella finestra di testo.
    7. Per lavorazioni esterne, salvare i risultati visualizzati nella finestra dei risultati tramite File | Salva con nome... nel menu finestra.

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Representative Results

DREPP10 è una proteina specifica pianta perifericamente associata-membrana plasmatica che è associata con la membrana plasmatica tramite un N-miristoilazione e un'interazione elettrostatica con fosfatidilinositolo fosfati11, 12. DREPP è stato descritto come un componente del macchinario di segnalazione del calcio nella cellula vegetale e interagisce anche con il citoscheletro13,14. Nell'esperimento presentato, il tabacco selvaggio-tipo DREPP2 e la sua versione di mutante non-miristoilate (Gly2 sostituito da Ala) erano GFP-etichettato6 ed espresso nel tabacco BY-2 sospensione cellule15 sotto il CaMV 35S promotor16. Il partizionamento di membrana del plasma di queste proteine sono stati misurati in 3-day-old (3 giorni dopo la diluizione), FM 4-64-labeled (8 µM) cell culture6 con (Figura 1A) e senza (Figura 1B), l'aggiunta della fosfoinositide 3-chinasi inibitore (10 µM) Wortmannin17, secondo il protocollo descritto in precedenza. La versione tagliata DREPP2(Δ1-23) manca la membrana plasmatica associazione dominio6 è stata utilizzata come un indicatore di citoplasma per la costruzione di modello di distribuzione di fluorescenza (Figura 1).

Computata dati erano trasformati di radice quadrata (il valore positivo corrispondente il valore negativo minimo è stato aggiunto a tutti i dati per recuperare solo i dati positivi), e i dati sono stati analizzati mediante ANOVA a due vie in R9. Gli effetti della mutazione e inibitore trattamento erano altamente significativi (p < 2.2 x 10-16 * * *). Tutti i gruppi sono stati confrontati da test di Tukey HSD; tutti i gruppi hanno differito significativamente con l'eccezione di DREPP2 trattata da Wortmannin e DREPP2(G2A) non trattata (Figura 1).

Questi risultati mostrano chiaramente che l'associazione di membrana plasmatica di tabacco DREPP2 proteina è il risultato di un N-miristoilazione e interazione elettrostatica, che funzionino in modo cooperativo. Solo l'effetto reciproco della N-miristoilazione mutazione del luogo e del trattamento Wortmannin causato una dissociazione completa della proteina DREPP2 dalla membrana del plasma. Questi risultati sono in conformità con i dati precedentemente pubblicati6.

Figure 1
Figura 1 : Effetto della mutazione nel sito N-miristoilazione e trattamento Wortmannin sulla membrana plasmatica compartimentazione della proteina di membrana plasmatica perifericamente associata DREPP, che è coinvolto in un calcio via nella cellula vegetale di segnalazione. (A) sezioni confocale mediale delle cellule di tabacco BY-2 che esprimono la forma wild-type DREPP2-GFP e il mutante formano DREPP2 (Gly2Ala)-GFP (canale verde). Le cellule sono state identificate con FM 4-64 tintura (canale magenta), scala bar 10 µm. (B), la stessa linea cellulare è stata trattata da 10 µM Wortmannin (WM). (C) cellule esprimenti citoplasmico marker DREPP2(Δ1-23). (D) la membrana plasmatica stimata di partizionamento per tutti i campioni. Il significato di entrambi gli effetti è stato testato mediante ANOVA a due vie (p < 2.2 x 10-16 * * * in entrambi i casi; i dati originali sono stati trasformati in radice quadrata). Le lettere indicano i gruppi che non sono significativamente diversi tra loro come determinato tramite il test di Tukey HSD. Baffi di casella-piazzole indicano un intervallo di confidenza 95%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il metodo qui descritto genera una stima più accurata della membrana plasmatica di partizionamento per proteine marginalmente associate rispetto ad altri approcci basati sulla misura di intensità di fluorescenza5. Il miglioramento notevole di questo metodo è che prende in considerazione la diffrazione della luce e la sovrapposizione di membrana del plasma e i segnali citoplasmatici. Anche se questi risultati del metodo sono in correlazione con i risultati di un metodo semplice, basato sul confronto tra l'intensità di fluorescenza nella posizione di membrana con la media citoplasmica segnale (come illustrato in precedenza6), il vantaggio principale di questo metodo novello è la determinazione della variabilità residua (inspiegabili dalla decomposizione del segnale) che permette la stima della rilevanza dei risultati, soprattutto dove il segnale di membrana plasmatica è inferiore rispetto al segnale citoplasmatico. Il metodo descritto è anche più robusto per il segnale rumore perché il calcolo di proteina partizionamento non è basato su un solo punto.

L'analisi richiede solo singole immagini confocal due canali. A differenza di FRAP approcci18 , sulla base di misurazioni delle dinamiche di diffusione di proteine in più finestre temporali, il metodo descritto è più applicabile per approcci dinamico in vivo , quando acquisizione rapida delle immagini è un requisito fondamentale ( ad esempio, segnale esplorazioni di trasduzione, saggi inibitori). Il metodo è adatto per ottenere rapidamente grandi quantità di dati che sono sufficienti per la valutazione statistica.

Il metodo è limitato a solo una singola membrana. L'analisi di segnali da due membrane strettamente adiacenti delle cellule vicine non è attualmente supportato. In questo caso, il raccordo di segnale è più esigente con un elevato rischio di artefatti.

Tuttavia, l'analisi è stato originariamente progettato per pianta sospensione cellule15, e può essere applicato per le analisi di altri tipi di cellule pure. Tubetti pollinici e peli radicali rappresentano potenzialmente ottimi obiettivi di questo metodo in biologia vegetale. Le membrane esterne delle cellule epidermiche di pianta possono essere analizzate dopo precedente verifica che le pareti della cellula non sono etichettate da FM 4-64 e non esibiscono autofluorescence interferente. Cellule di Protista che sono liberi di autofluorescenza interferente, cellule di lievito, le cellule fungine, come pure le cellule animali con membrana liscia possono essere analizzate utilizzando il metodo descritto; Tuttavia, per le cellule animali l'analisi della distribuzione della proteina sul bordo delle cellule del fibroblasto o al confine di spazzola delle cellule epiteliali non può essere possibile. A causa delle impostazioni di analisi flessibili, FM 4-64 macchiatura può essere sostituito da altri metodi di visualizzazione della membrana plasmatica, come fluorescente contrassegnati proteine. Con cautela, il metodo può essere utilizzato per le celle fisse.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo progetto è stato supportato da NPU ho, LO1417 (Ministero della pubblica istruzione, gioventù e sport della Repubblica Ceca).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FM 4-64 ThermoFisher Scientific T13320 Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D4540 Sigma Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer

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References

  1. Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
  2. Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer. Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).
  3. Kubitscheck, U. Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , John Wiley & Sons. (2013).
  4. Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts. J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).
  5. Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).
  6. Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins. Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).
  7. Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).
  10. Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development. Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).
  11. Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane. J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).
  12. Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure. J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).
  13. Li, J., et al. MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).
  14. Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments. Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).
  15. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 Cell Line as the "HeLa" Cell in the Cell Biology of Higher Plants. Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).
  16. Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).
  17. Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Jr Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells. Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).
  18. Laňková, M., et al. Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy. Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).

Tags

Biologia problema 136 proteina perifericamente associata di membrana plasmatica affinità di membrana membrana partizionamento microscopia confocale ImageJ R-project FM 4-64 deconvoluzione

Erratum

Formal Correction: Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins
Posted by JoVE Editors on 11/02/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. The Affiliations section was updated.

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Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University

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Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins
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Vosolsobě, S., Schwarzerová, K., Petrášek, J. Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. J. Vis. Exp. (136), e57837, doi:10.3791/57837 (2018).

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