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Biology

Determinación de la membrana plasmática particionado en proteínas asociadas periféricamente

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57837
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

ERRATUM NOTICE

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un análisis cuantitativo del nivel de Asociación de la membrana plasmática para fluorescencia etiquetada periférica asociada a proteina. El método se basa en la descomposición computacional de membrana y citoplasmático componente de señal observado en células con marcador fluorescente membrana plasmática.

Abstract

Este método proporciona un enfoque rápido para la determinación de la membrana plasmática repartir de cualquier etiquetado fluorescente periféricamente proteína usando los perfiles de intensidad de la fluorescencia a través de la membrana plasmática. Perfiles de fluorescencia medidos están equipados por un modelo de distribución de fluorescencia de membrana y el citoplasma a lo largo de una línea aplicada perpendicularmente a la periferia celular. Este modelo se construye desde los valores de intensidad de fluorescencia en las células de referencia expresan un marcador etiquetado fluorescente de citoplasma y membrana plasmática 4-64-labeled de FM. El método puede aplicarse a diferentes tipos de células y organismos; sin embargo, sólo las membranas de plasma de las células vecinas no puede ser evaluadas. Este método rápido basado en la microscopía es conveniente para los experimentos, donde se esperan cambios sutiles y dinámicos de marcadores asociados a membrana del plasma y necesidad de ser cuantificada, por ejemplo, en el análisis de las versiones mutantes de proteínas, tratamientos de inhibidor, y observaciones de la transducción de la señal. El método está implementado en un paquete de R multiplataforma que se junta con una macro ImageJ que sirve como una interfaz fácil de usar.

Introduction

Proteínas de membrana plasmática periférica asociada son los componentes principales de vías de señalización celular. Uno de sus papeles fundamentales es su membrana plasmática transitoria asociación y disociación, que es importante para la transducción de la señal entre la membrana plasmática y citoplasma. Proteínas de membrana plasmática periférica asociada pueden fijarse en la membrana plasmática por anclajes de lípidos (N-myristoylation S-acilación y Prenilación) o dominios de unión a lípidos (interactuando con fosfatos de fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, etc.).

Vinculante de membrana plasmática de estas proteínas puede ser examinado en vivo, por ejemplo, cuando una proteína fluorescente etiquetado es modificada por una mutagénesis sitio-dirigida de los aminoácidos claves, o cuando se trata con diferentes inhibidores que afectan a lipídica de señalización. La distribución de las proteínas periféricas de membrana plasmática es principalmente evaluando cualitativamente, especialmente en los casos, cuando la redistribución de proteína es obvia. El método presentado es óptimo para las situaciones cuando redistribución de proteína sólo es parcial y evaluación cuantitativa es necesario. Un enfoque frecuente de cuando la Asociación de la membrana plasmática se estima de confocal laser escaneo imágenes de microscopia como una relación de intensidades de fluorescencia en la membrana plasmática y el citoplasma1,2, es sencilla, pero no exacto. Intensidades de fluorescencia en la membrana plasmática reflejan una superposición de la señal de membrana plasmática y el citoplasma debido a la característica de la luz difracción para la técnica de microscopía de fluorescencia particular y elementos ópticos3. En consecuencia, la señal citoplasmática está incluida también en la región de la membrana. Por esta razón, patrón de coloración de FM 4-64 no puede utilizarse como una máscara para una membrana señal selección4. Por otra parte, simples mediciones de señal de la membrana en la posición definida por el FM 4-64 coloración máximo siempre sistemáticamente sobrestiman la señal real de membrana plasmática de la proteína de la membrana plasmática periférica asociada debido a la superposición de la membrana y citoplasmático compuesto. El máximo observados señales de fluorescencia etiquetada periférica asociada a proteínas también co no localizar con la máxima del marcador de membrana del plasma (es decir, FM 4-64 styryl tinte), pero se cambia de puesto hacia el citoplasma. Otra limitación es que el pico de emisión de 4-64 es más amplia en comparación con los picos de emisión para las proteínas fluorescentes verdes como GFP debido a la dependencia de longitud de onda de la luz difracción3.

En el método descrito aquí, la señal de la proteína etiquetado está equipada por dos funciones empíricas que describen una distribución hipotética de la membrana plasmática y citoplasma, respectivamente. Esta descomposición de la señal se aplica a perfiles de fluorescencia lineal que se aplican a la superficie de la célula perpendicular a la membrana del plasma en imágenes de la fuente, que son secciones confocales regulares, dos canales de expresión de la proteína fluorescente etiquetado células etiquetadas con tinte de FM 4-64.

La primera función que se utiliza para el montaje describe una difracción de una señal de citoplasma en el borde de la célula. Se obtiene de perfiles previamente adquiridos de la fluorescencia que se midieron en las células que expresan un marcador de proteína del citoplasma etiquetado por el mismo cromóforo como la membrana plasmática periférica proteína de interés. La segunda función que describa una difracción de una señal de la membrana plasmática se deriva de la fluorescencia de FM 4-64. Esta señal se aproxima en primer lugar por una función Gaussiana que se utiliza para un modelado aproximado de difracción de la luz de una fuente puntual. En segundo lugar, este modelo, válido para la emisión de FM 4-64 rojo, se transforma matemáticamente en la forma que sea relevante para una longitud de onda de emisión del cromóforo utilizado para el marcado de proteínas asociadas periférica de interés en la membrana plasmática. Ambas funciones se normalizan por la intensidad máxima y la media de un 10% de los valores más altos para la señal de FM 4-64 y la señal de la proteína citoplásmica, respectivamente. De esta descomposición de la señal (método no lineal de ajuste cuadrados menos), la relación de la membrana plasmática y la fracción del citoplasma de la proteína examinada se pueden estimar fácilmente y con precisión. La dimensión física real del coeficiente de partición computada está en la gama del micrómetro, porque concentración volumen citoplásmico se compara con la concentración superficial en la membrana plasmática. Define la distancia entre la membrana plasmática y el citoplasma, dentro de los cuales la misma cantidad de proteínas se localiza en el área adyacente de la membrana plasmática. Este valor es equivalente a repartir coeficiente K2 introducido anteriormente5. El método es muy rápido, requiriendo solos secciones confocales adquiridas mediante rutina láser confocal de barrido microscopio, y no es exigente computacionalmente. El núcleo de análisis ha sido implementado en un paquete portátil de R y una macro ImageJ adicional fue escrita para proporcionar la interfaz gráfica de usuario para ejecutar el análisis de los cuadros de diálogo intuitivos. Software y descripción más detallada del método (publicado anteriormente6) puede encontrarse en http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

El método es adecuado para células aisladas, protoplastos y tejidos, donde la membrana plasmática de las células individuales es claramente distinguible, expresando una construcción con etiqueta fluorescente de examinado proteína periférica asociada. Un cromóforo compatible con FM 4-64 la coloración debe ser utilizado. FM 4-64 emite fluorescencia roja; por lo tanto, proteína examinada puede ser etiquetada por una proteína de la fluorescencia con emisión azul, verde o amarillo (p. ej., GFP, PPC, YFP). Transformación estable de material biológico es recomendable porque permite observaciones menos artificiales y más reproducibles de la distribución de la proteína. Es necesario que la proteína examinada tiene una distribución relativamente homogénea citoplásmica. La localización de una proteína en el retículo endoplásmico o en otro compartimiento intracelular de la membrana puede producir resultados artificiales.

Además, debe utilizarse el mismo material biológico expresan un marcador citoplásmico para la comparación. Las células pueden ser transformadas por un chomophore libre (la misma utilizada para la proteína periférica etiquetado, por ejemplo, GFP gratis) o etiquetada proteína de interés con capacidad de unión de membrana suprimido. Capacidad de unión de membrana puede ser suprimido, por ejemplo, recortando el dominio de unión a membrana o por mutagénesis dirigida de residuos de aminoácido clave (por ejemplo, sitios de N-myristoylation, S-acilación, o Prenilación, etc.).

Para microscopía confocal, las células deben etiquetarse con un marcador de membrana como tinte de FM 4-64. Si FM 4-64 la coloración no es adecuado para el material estudiado (debido a la interferencia autofluorescencia, penetración de tinte pobre, etc.), la membrana plasmática pueden ser etiquetada, por ejemplo, por proteína integral de membrana plasmática con la etiqueta a una correspondiente chomophore ( mCherry, RFP, etc.). Es esencial que el marcador tiene localización insignificante en los compartimentos de membrana intracelular (endomembranas).

Si trabaja con los anticuerpos y las muestras fijas, puede utilizarse fijable analógica FM 4-64FX o membrana plasmática etiquetado por el anticuerpo contra un objetivo apropiado. En este caso, es esencial para evaluar los resultados con mucho cuidado porque procedimientos de fijación pueden conducir a la pérdida selectiva de proteínas desde el citoplasma y la membrana plasmática.

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Protocol

1. preparación de Material biológico

  1. Preparar el material biológico, expresando la proteína fluorescente etiquetada de interés, así como un marcador citoplásmico. Siga los procedimientos mencionados en la introducción.

2. confocal láser de barrido microscopía

  1. Mancha el material preparado en la sección 1 con FM 4-64 tinte7.
    1. Aplicar un protocolo de tinción que es apropiado para el material estudiado. Para las células del tabaco BY-2, la mancha 200 μL de suspensión celular con 0,2 μL de 10 mM FM solución 4-64 en dimetilsulfóxido.
      Nota: La típica concentración tinción de FM 4-64 tinte es sobre 10 μM utilizando solución stock de 10 mM en dimetilsulfóxido. Utilizar la menor concentración posible de FM 4-64 para la tinción adecuada y no incubar las células en hielo (FM 4-64 y baja temperatura puede afectar las propiedades de la membrana plasmática). Continuar con la observación mediante microscopía confocal inmediatamente. El intervalo entre la coloración y la adquisición de la imagen no debe tener más de 10 minutos; de lo contrario, endocitosis del tinte afectará la FM 4-64 la coloración.
    2. Procesar varias muestras consecutivas y no manchan todas las muestras al principio del experimento.
  2. Capturar una sección confocal Ecuatorial por una célula.
    1. Establecer una exploración secuencial de dos canales para el cromóforo utilizado como etiqueta de la proteína (debe estar en el primer canal) y FM 4-64 (debe estar en el segundo canal). Establecer una mayor resolución óptica (10 – 20 px/μm). Una configuración de ejemplo: 63 X aceite de inmersión tamaño de imagen objetivo, NA 1.3, 1.024 x 1.024 px. Asegúrese de que el plano de la membrana plasmática es perpendicular al plano de sección confocal en las imágenes adquiridas.
    2. Al menos 20 células por muestra para tener suficientes datos para la evaluación estadística de captura (depende de la variabilidad de la señal en el material procesado).

3. requiere instalación

  1. Instalar Fiji ImageJ distribución8y la macro requiere periférica.
    1. Descargar software desde el sitio https://fiji.sc/#download e instalarlos por desembalar.
    2. Empezar a Fiji haciendo doble clic en el archivo "ImageJ(.exe)" en el directorio descomprimido de "Fiji.app".
    3. Descargar una macro "periférica" desde el siguiente sitio:
      http://kfrserver.Natur.CuNi.cz/Lide/vosolsob/Peripheral/Source/Peripheral_.IJM.
    4. En Fiji, seleccione Plugins | Las macros | Instalar... en el menú principal y especifique la ruta al archivo descargado "Peripheral_.ijm".
      Nota: Dos nuevas herramientas de la macro instalada "periférico" aparecerá en la barra de herramientas de Fiji: "Tomar perfil herramienta" y "Menú de proteína periférica."
  2. Instalar los paquetes necesarios y R-project software9.
    1. Siga las instrucciones en el sitio https://cloud.r-project.org/ para la instalación de R-project.
      Nota: Se realizará el análisis general en Fiji. El software R se llamará sólo internamente por la macro de Fiji "periférica" durante el cómputo.
    2. Ejecute R GUI, seleccione paquetes de | Instalar paquetes... en el menú principal y especificar el repositorio más cercano y el paquete "ggplot2" para la instalación.
      Nota: Como alternativa, escriba a la R de línea de comandos: install.packages("ggplot2").
    3. Descargar un paquete de R periférico del lugar de destino: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Instalar seleccionando paquetes | Instalar paquetes desde archivos locales....
      Nota: Como alternativa, escriba a la R de línea de comandos este comando sólo:
      install.packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo = NULL, tipo = "fuente").

4. imagen análisis en Fiji

  1. Procesar las imágenes confocales del marcador citoplásmico.
    1. Importar las imágenes a Fiji con Plugins | Bio-formatos | Importador de bio-formatos en el menú de Fiji con la configuración predeterminada.
    2. Compruebe si el importador Bio-formatos reconocidos correctamente la calibración de la imagen. La dimensión de la imagen que se muestra en la ventana de la imagen superior izquierda información campo debe ser igual a las dimensiones originales de la imagen.
    3. Tratar calibrado adecuadamente imágenes con la incorrecta dimensiones individualmente, por ejemplo, estableciendo los parámetros correctos en la ventana de diálogo analizar | Establecer escala... en el menú de Fiji: llenar el ancho de la imagen en píxeles en el campo de la distancia en píxeles y el ancho real en la unidad de longitud adecuada en el campo conoce a distancia ).
      Nota: Si los archivos Leica LCS LEI están mal calibrados, siga el paso 4.2.1.
  2. Ejecute la macro de opciones de importación para una configuración de análisis. Una de tres maneras diferentes para activar la macro: seleccione Plugins | Las macros | Importar opciones [f1] en el menú principal de Fiji, seleccione el mismo artículo después de hacer clic en la herramienta de menú Menú de proteínas periféricas, o presione el teclado atajos F1. Establezca el parámetro en la ventana de diálogo macro invocado.
    1. En el caso del formato Leica LCS LEI, resolver calibración incorrecta al activar la casilla de verificación de imágenes Leica.lei . Esta opción importa correctamente las dimensiones de la imagen desde el archivo con la extensión "lei".
    2. Definir el valor apropiado en el campo de Gaussian blur radio (px). Esto influye en la reducción de suavizado y el ruido de imagen. Un valor bajo (1 px) es suficiente y no causa ninguna pérdida de información de imagen.
    3. Establecer un valor en el campo ancho de la línea de perfil (px). Una línea más gruesa produce mayor suavizado de las curvas de perfil. Un valor por defecto 10 px se recomienda.
    4. Establecer un título de imagen, análisis de la definición de "Delimitadores de muestra" y "Exportado elementos."
      Nota: Un imagen título (nombre del archivo sin extensión, por ejemplo: "Experimento-1_line-02_cell-11") se dividirá en todos los caracteres enumerados en el campo "Delimitadores de muestra" (p. ej.: "-_") en un conjunto de elementos ("Experimento", "1"," la línea","02","celular"y"11") que puede ser utilizado como agrupación de factores (ejemplo, celulares, línea o tratamiento identidad) en el siguiente análisis. Definir qué elementos se utilizarán escribiendo su número de secuencia ("0" para el primer elemento) en el campo "Exportan artículos." Utilizar formato delimitado, por ejemplo, '5 de la 3.' En este ejemplo, "02" y "11" se denominará agrupación de factores llamados "Fac_0" y "Fac_1." Además, la identidad de cada medición se referirán como factor de "i".
    5. Alternativamente, mantener los delimitadores muestra vacío e introduzca 0 en los artículos exportados si puede conservarse el título de la imagen completa.
    6. En el sistema de operación Windows, compruebe si la ruta de acceso al software de R será correctamente detectada automáticamente en el campo ruta de acceso a R.exe. De lo contrario, especifique la ruta completa al archivo R.exe en el sistema (por ejemplo, "C:\Program Files\R\bin\R.exe").
    7. Haga clic en Aceptar. Revise el título de análisis en la siguiente ventana de diálogo y haga clic en Aceptar o volver a restablecer.
      Nota: Todas las imágenes serán automáticamente alisadas y eventualmente recalibrar. Una lista de factores de agrupamiento todo exportado se mostrará en la ventana resultados.
  3. Realizar una selección linear en toda la región de la membrana plasmática en las imágenes procesadas y medir los perfiles de fluorescencia.
    1. Seleccione la herramienta de Fiji línea recta de la barra de herramientas de Fiji. Haga clic en la imagen y arrastre una línea en toda la región de la membrana plasmática. La línea debe comenzar en el espacio extracelular y debe ser perpendicular a la membrana plasmática. Elija las regiones con una capa de citoplasma cortical más gruesa y más homogénea. La duración óptima de la selección lineal es 5-10 μm.
    2. Ejecutar la toma macro perfil método analógico como en el paso 4.2 (atajo "x") o haciendo clic en tomar perfil herramienta en la barra de herramientas de Fiji. Se realizará la medición automática de perfiles de fluorescencia en ambos canales y los datos se mostrarán en la ventana de resultados.
    3. Si con la tecla "x" se considera user-unfriendly, abra el archivo de origen de la macro Peripheral_.ijm en el editor de texto, vuelva a colocar el símbolo "x" en la línea ' macro "Tomar perfil [x]" {' con un símbolo más favorable (que no se utiliza en el entorno de Fiji como un atajo de teclado activo) y guarde el archivo. Vuelva a instalar la macro (paso 3.1.4) y comenzar el análisis de la importación de la imagen.
    4. Según la variabilidad de la señal individual, tomar los números representativos de los perfiles para cada celda.
    5. Guardar los datos via archivo | Guardar como.... Utilice siempre la extensión "csv"; es necesario para el formato de datos adecuado.
  4. Ejecute la macro de datos de Perfil de terreno (atajo F5) para la visualización gráfica de los perfiles medidos. Establezca el parámetro en la ventana de diálogo macro invocado.
    1. Mantener la casilla de verificación uso para el filtrado de datos de entrada? no seleccionados.
    2. Especificar si se debe crear la trama de datos recientes en la ventana de resultado, de un solo archivo CSV o de todos los archivos CSV en un directorio específico haciendo clic en el botón de radio adecuado.
      Nota: Si la trama es creada a partir de los resultados recientes, los datos se guardarán en primer lugar (cuadro de diálogoGuardar como... se activará automáticamente).
    3. Especificar los factores de agrupación se utilizarán para trazar seleccionando las casillas de verificación apropiadas. Seleccionar el factor "i" si todos los perfiles deben mostrarse en parcelas únicas. Mantenga las casillas desmarcadas, si todos los datos deben de trazar en una sola parcela.
      PRECAUCIÓN: La selección de un factor de agrupación no existe en el error de causas de resultados procesados durante la creación de la trama.
    4. Especificar el nombre del archivo al guardar una parcela en el campo Prefijo de archivo de salida y definir la trama de la dimensiones de la imagen en archivos de terreno alto y ancho de la parcela.
      Nota: El diagrama resultante se guardará en un directorio de datos de la fuente como un archivo PNG.
    5. Seleccione el salida Pdf? la casilla de verificación si un PDF adicional de salida se puede producir.
    6. Haga clic en Aceptar. Especifique la ruta para guardar los resultados o eventualmente para datos de importación en la siguiente ventana de diálogo. Confirmar el análisis haciendo clic en Aceptar en las ventanas de diálogo que muestra el código R realizado.
      Nota: La parcela se abrirá en una nueva ventana de imagen y el resultado del análisis de R se mostrará en la ventana de texto.
  5. Ejecute el perfil filtrado macro configuración (atajo F2) si algunos perfiles trazadas tienen excesivas señales en el espacio extracelular (para la proteína etiquetado) o en el espacio intracelular (para la señal de FM 4-64). Siga colocando los parámetros en la ventana de diálogo macro invocado.
    Nota: Filtro permite la eliminación de perfiles pobres según el umbral de máxima intensidad permitida en coordenadas x especificadas.
    1. Para cada canal, ajuste el umbral de intensidad adecuada en el archivo eliminar mediciones con una exceso extracelular señal (intracelular). Especificar la región donde se aplicará el umbral de intensidad en el campo en coordenadas x menor (mayor).
    2. Vuelva a ejecutar la macro de datos de Perfil de terreno (paso 4.4) con la casilla de verificación uso para el filtrado de datos de entrada? seleccionado; Asegúrese de que todos los perfiles aberrantes fueron quitados con éxito. De lo contrario, mejorar los parámetros de filtración (paso 4.5.1).
  6. Ejecute la macro de crear modelo (atajo F3) para crear un modelo de la membrana plasmática y citoplasma fluorescencia distribución basado en los datos de calibración. Siga colocando los parámetros en la ventana de diálogo macro invocado.
    1. Especificar si los datos de entrada deben ser filtrado (paso 4.5) seleccionando el uso para el filtrado de datos de entrada? casilla de verificación.
    2. Especificar los datos de origen analógicamente como en el paso 4.4.2.
    3. Especifique un intervalo en el cual el modelo se puede predecir por la definición de "Inicio", "extremo", y "paso" valores en μm.
      Nota: Todas las mediciones del perfil deben ser más largas que el intervalo especificado.
    4. Especificar los máximos de excitación y emisión de longitudes de onda de fluorescencia de cromóforos utilizados, en los campos correspondientes. Establecer los valores predeterminados para la GFP y FM combinación 4-64.
      Nota: "GFP" indica el cromóforo utilizado para la proteína de etiquetado (GFP, PPC, YFP, etc.), y "FM4" indica el cromóforo utilizado para membrana plasmática tinción (típicamente FM 4-64).
    5. Especificar el campo Prefijo de archivo de salida . El prefijo se utilizará para guardar un modelo resultante como el archivo de RData en un directorio de datos de origen.
    6. Seleccione la casilla de verificación parcela modelo? Si se necesita la salida gráfica. La trama se guardará como el PNG y también como el archivo PDF si el salida Pdf? la casilla de verificación está seleccionada.
    7. Haga clic en Aceptar. Especificar la entrada o salida de caminos en las siguientes ventanas de diálogo y confirmar el análisis haciendo clic en OK en la ventana de diálogo que muestra el código R realizado.
      Nota: La parcela del modelado citoplasmática y membrana compuesto de la fluorescencia de la proteína periférica asociada aparecerá en la nueva ventana de imagen, y la salida del análisis de R se mostrará en la ventana de texto.
  7. Procesar las imágenes de las células expresando la proteína de interés.
    1. Importar las imágenes análogamente como en el paso 4.1.
    2. Configurar el análisis análogamente como en el paso 4.2. El alisado y línea anchura debe ser idéntica.
    3. Medir los perfiles analógicamente como en el paso 4.3.
    4. Comprobar la precisión de los perfiles mediante la representación (paso 4.4) y establecer el filtrado si se desea (paso 4.5).
  8. Ejecute la macro distribución de calcular (atajo F4) para el cálculo de una partición de proteínas entre la membrana plasmática y el citoplasma. Siga el valor del parámetro en la ventana de diálogo macro invocado.
    1. Analógicamente con el paso anterior (paso 4.4), especificar el origen de datos, filtrado y prefijo de nombre de archivo.
    2. Especificar si el modelo para el cálculo de distribución de la proteína se cargará desde el último cálculo de modelo en el reciente caso de la macro "Periférico" en Fiji (seleccione la casilla de verificación reciente resultados), o desde el ( RData file Seleccione la casilla de verificación "desde archivo").
    3. Mantenga la casilla de verificación eliminar resultados con variabilidad residual mayor que se activa si se desea un resultado filtrado. Especificar el umbral de la máxima variabilidad residual permitido que puede ser no explicada por la descomposición de la señal de la medida del perfil individual. Por ejemplo: un valor de 0.200 indica que todas las mediciones con inexplicable variabilidad superior al 20% de la variabilidad total de la intensidad de fluorescencia en el perfil se descartarán.
    4. Seleccionar factores de agrupación de la muestra, que puede ser utilizado para el gráfico de cajas crear (paso 4.4).
    5. Activar la casilla de verificación salida Pdf? para guardar el diagrama de caja como el archivo PDF.
    6. Haga clic en Aceptar, especificar la entrada de rutas de salida y confirmar el análisis haciendo clic en OK en la ventana de diálogo que muestra el código R realizado.
      Nota: El diagrama de caja de proteína periférica asociada a repartir entre la membrana plasmática y el citoplasma se mostrará en una nueva ventana de imagen, y la salida del análisis de R se mostrará en la ventana de texto.
    7. Para procesamiento externo, guardar los resultados en la ventana de resultados a través de archivo | Guardar como... en el menú ventana.

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Representative Results

DREPP10 es una proteína de membrana de plasma periférico asociados específicos de planta que se asocia con la membrana plasmática por medio de un N-myristoylation y una interacción electrostática con el phosphatidylinositol fosfatos11, 12. DREPP fue descrito como un componente de la maquinaria de señalización de calcio en la célula de la planta y también interactúa con el citoesqueleto13,14. En el experimento presentado, el tabaco de tipo DREPP2 y su versión mutante no myristoylated (Gly2 sustituido por Ala) fueron etiquetadas de GFP6 y expresan en tabaco BY-2 suspensión células15 bajo promotor CaMV 35S16. El repartir de la membrana plasmática de estas proteínas se midieron en 3 días de edad (3 días después de la dilusión), FM 4-64-labeled (8 μm) célula culturas6 con (figura 1A) y sin (figura 1B) la adición de Fosfoinositol 3-quinasa Wortmannin (10 μm)17, según el protocolo descrito inhibidor. La versión recortada DREPP2(Δ1-23) carecer de la membrana plasmática vinculante dominio6 fue utilizada como un marcador del citoplasma para la construcción de modelo de distribución de la fluorescencia (figura 1).

Calcula los datos fueron transformado de raíz cuadrada (el valor positivo corresponde con el valor negativo más bajo fue agregado a todos los datos para recuperar sólo los datos positivos), y los datos se analizaron por ANOVA de dos vías en el R9. Los efectos de la mutación e inhibidor de tratamiento fueron altamente significativos (p < 2.2 x 10-16 ***). Todos los grupos se compararon por prueba Tukey HSD; todos los grupos difieren significativamente con la excepción de DREPP2 tratado por Wortmannin y DREPP2(G2A) no tratadas (figura 1).

Estos resultados muestran claramente que la Asociación de la membrana plasmática de tabaco DREPP2 proteína es el resultado de un N-myristoylation y la interacción electrostática, que están funcionando de forma cooperativa. Sólo el efecto mutuo de la mutación del sitio N-myristoylation y Wortmannin tratamiento causó una disociación completa de la proteína DREPP2 de la membrana plasmática. Estos resultados están de acuerdo con datos previamente publicados6.

Figure 1
Figura 1 : Efecto de la mutación en el sitio de N-myristoylation y tratamiento Wortmannin en el repartir de la membrana plasmática de la proteína de la membrana plasmática asociados periféricamente DREPP, que está implicado en un vía en la célula de la planta de señalización de calcio. Las secciones confocales Medial (A) de las células del tabaco BY-2 expresando la forma de tipo salvaje DREPP2-GFP y el mutante de forman DREPP2 (Gly2Ala)-GFP (canal verde). Las células fueron etiquetadas con FM 4-64 tinte (canal magenta), escala de barra 10 μm. (B) la misma línea de la célula fue tratada por 10 μm Wortmannin (WM). (C) células expresan marcadores citoplásmicos DREPP2(Δ1-23). (D) el repartir de la membrana plasmática estimada para todas las muestras. La importancia de ambos efectos se probó por ANOVA de dos vías (p < 2.2 x 10-16 *** en ambos casos; los datos originales fueron transformados a raíz cuadrada). Letras indican los grupos que no son significativamente diferentes entre sí según la prueba de Tukey HSD. Los bigotes de los diagramas de caja indican intervalo de confianza del 95%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El método aquí descrito genera una estimación más precisa de la membrana plasmática particionado en periférico asociadas proteínas comparadas con otros enfoques basados en la medición de intensidades de fluorescencia5. La principal mejora de este método es que toma en cuenta la difracción de la luz y la superposición de la membrana plasmática y las señales citoplasmáticas. Aunque estos resultados método están en correlación con los resultados de un método sencillo basado en la comparación de la intensidad de fluorescencia en la posición de la membrana con el medio citoplásmico señal (como se mostró anteriormente6), el principal beneficio de este novedoso método es la determinación de la variabilidad residual (inexplicada por la descomposición de la señal) que permite la estimación de la relevancia de los resultados, especialmente cuando la señal de la membrana del plasma es menor que la señal citoplásmica. El método descrito es también más robusto al ruido de la señal porque el cómputo de la partición de la proteína no se basa en un único punto.

El análisis requiere sólo dos canales confocales imágenes. En contraste con los enfoques FRAP18 basados en mediciones de la dinámica de difusión de proteínas en las ventanas de tiempo más largo, el método descrito es más aplicable a los enfoques de la dinámica en vivo , cuando la adquisición de imágenes rápido es un requisito crítico ( por ejemplo,, señal transducción exploraciones, ensayos inhibitorios). El método es adecuado para obtener rápidamente grandes cantidades de datos que son suficientes para la evaluación estadística.

El método se limita a sólo una sola membrana. El análisis de las señales de dos membranas estrechamente adyacentes de células vecinas no se admite actualmente. En este caso, la conexión de la señal es más exigente con un riesgo más alto de los artefactos.

Sin embargo, el análisis fue diseñado originalmente para planta suspensión células15, y puede ser aplicado para el análisis de otros tipos de la célula. Tubos de polen y pelos de la raíz representan potencialmente muy buenos objetivos de este método en biología vegetal. Las membranas externas de las células epidérmicas de la planta pueden ser analizadas después de previa verificación que las paredes celulares no están etiquetadas por FM 4-64 y no presentan autofluorescencia que interfieren. Células Protista que son libres de interferencia autofluorescencia, células de levadura, células fúngicas, así como las células animales con membrana lisa pueden analizarse mediante el método descrito; sin embargo, para las células animales no pueden ser posible el análisis de la distribución de proteínas en la vanguardia de las células de fibroblastos o en el borde en cepillo de las células epiteliales. Debido a la configuración de análisis flexible, FM 4-64 la coloración puede ser reemplazado por otros métodos de visualización de membrana del plasma, tales como fluorescencia etiquetada proteínas. Con precaución, el método puede utilizarse para células fijas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este proyecto fue apoyado por el Unp I, LO1417 (Ministerio de educación, juventud y deportes de la República Checa).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FM 4-64 ThermoFisher Scientific T13320 Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D4540 Sigma Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer

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References

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Biología número 136 proteína de membrana plasmática periférica asociada afinidad de la membrana membrana particionado microscopia confocal ImageJ R-project FM 4-64 deconvolución

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Formal Correction: Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins
Posted by JoVE Editors on 11/02/2018. Citeable Link.

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Determinación de la membrana plasmática particionado en proteínas asociadas periféricamente
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Vosolsobě, S.,… More

Vosolsobě, S., Schwarzerová, K., Petrášek, J. Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. J. Vis. Exp. (136), e57837, doi:10.3791/57837 (2018).

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