Summary
Vi præsenterer her, protokoller for at opdage forbindelser aktive på GABA-A receptorer, fra bindingen til fysiologi og farmakologi.
Abstract
Dette manuskript præsenterer en trinvis protokol for screening forbindelser på gamma-aminobutyric syre skrive en (GABAA) receptorer og dens anvendelse til identifikation af nye molekyler aktive i prækliniske assays fra en i vitro rekombinante receptor deres farmakologiske virkninger på native receptorer i gnavere hjernen skiver. For forbindelser bindende på webstedet benzodiazepin af receptoren, er det første skridt at oprette en primær skærm, der består af udvikle radioligand bindende assays på cellemembraner at udtrykke de store GABAA -undertyper. Derefter, drage fordel af den Heterolog ekspression af gnavere og menneskelige GABA-A receptorer i Xenopus oocyter eller HEK 293 celler, det er muligt at udforske de fysiologiske egenskaber af forskellige receptor i elektrofysiologiske assays, undertyper og de farmakologiske egenskaber af de identificerede stoffer. Xenopus oocyt system vil blive præsenteret her, startende med isolering af oocyter og deres mikroinjektion med forskellige mRNAs, op til de farmakologiske karakterisering ved hjælp af to-elektrode spænding klemmer. Endelig vil optagelser foretaget i gnavere hjernen skiver blive beskrevet, der bruges som en sekundær fysiologiske test til at vurdere aktiviteten af molekyler i deres native receptorer i et veldefineret neuronal kredsløb. Ekstracellulære optagelser ved hjælp af befolkningen svar af flere neuroner er vist sammen med stof-ansøgning.
Introduction
Vi præsenterer her, protokoller for opdagelsen af forbindelser aktive på GABA-A receptorer, fra bindingen til fysiologi og farmakologi. I søgen efter nye molekyler specifikke for GABA-A receptorer, er det afgørende at definere, så præcist som muligt, undertype af interesse og vurdering af den særlige karakter af de nyligt identificerede stoffer (f.eks.for en gennemgang Se Rudolph og Knoflach1eller Sieghart2). En typisk sti i drug discovery og de skridt, der skal opnås er illustreret i figur 1.
Bindende assays har været og er stadig i vid udstrækning bruges som det første skridt i drug discovery. I tilfælde af GABA-A receptorer, er de optimeret til at identificere stoffer, der binder til benzodiazepin bindingssted af receptor hvor terapeutisk nyttig og sikker narkotika binde. Andre teknikker, ved hjælp af fluorometriske imaging plade læser (FLIPR) membran potentielle røde farvestofbaseret assays3, registrere forbindelser som barbiturater, der bindes til flere websteder, der er mindre ønskeligt på grund af deres uønskede bivirkning profil. Derudover kan de udnyttede farvestoffer direkte aktivere GABA-A receptorer, således spørgsmålstegn ved nytten af disse assays for drug discovery4. Bindende assays kan kun give de beviser for, at et givet stof kan binde til en bestemt receptor klasse. In vitro assays med cellemembraner bruges til at identificere selektiv menneskelige GABAA α5β3γ2 receptor ligander. Forbigående transfekteret HEK293 celler udtrykker menneskelige GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 og α3β3γ2 receptorer der bruges til at forberede disse assays membraner. Effekten af ligander er fundet ved at måle scintillation af [3H] flumazenil bundet til membranreceptorer (en hæmning af [3H] flumazenil bindende). Den største fordel ved denne teknik er, at en hurtig og effektiv bestemmelse af sammensatte-bindende affinitet til receptoren af interesse er fastsat på receptor af interesse.
Funktionelle studier er væsentligt at evaluere de funktionelle aktivitet af forbindelser og foreslå en fysiologiske og farmakologiske forklaring af de mekanismer, der er forårsaget af bindingen af forbindelser til receptorer. I dag, er det velkendt, at funktionelle GABAA receptorer skyldes samling af fem underenheder omkring en akse af pseudosymmetry dannet af Ioniske pore og resultatet fra forsamlingen af fem identiske underenheder. De fleste af GABA-A receptorer er sammensat af to eller flere forskellige underenheder. Den store hjerne GABAA receptor, for eksempel, er sammensat af en1, β2 og γ2 underenheder i en støkiometrisk af 2, 2 og 1 henholdsvis5,6. En rekonstituering i et host system som Xenopus oocyter eller HEK293 celler giver mulighed for hurtigt at udforske de farmakologiske egenskaber af receptorer.
De farmakologiske egenskaber af forbindelser udforskes derefter med ekstracellulære optagelser i hjernen skiver7. Denne metode giver mulighed for en udforskning af virkningen af forbindelser på neurotransmission og giver en effektiv måde at bekræfte de funktionelle virkninger af forbindelser, der fastsat i Heterolog ekspression systemer på niveau med indfødte receptorer i samlet neuronal miljø. GABAergic neurotransmission kan også vurderes på det molekylære niveau ved at måle virkningerne af stofferne på hæmmende postsynaptiske strømme (IPSCs)8. Men protokollen bruges her og baseret på hele-celle patch klemme optagelser i hjernen skiver er mere omfattende og giver en lavere overførselshastighed.
Endelig er styrker og svagheder i vitro screening cascade bruges til identifikation af α5β3γ2-selektiv ligander drøftet i lyset af de forskellige teknikker og deres iboende begrænsninger. Dette arbejde bør give eksperter og ikke-eksperter inden for GABA-A receptorer en nyttig gennemgang af kombinationen af forskellige in vitro- metoder anvendes til at tackle opdagelsen af nye modulatorer af disse ligand-gated Ionkanaler.
Protocol
Xenopus laevis er opstaldet og håndteres ifølge Genève Canton dyr retningslinjer.
1. Radioligand bindende
-
Forberedelse af assay plade
- Forberede 1,5 L i analysebuffer med 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl og 15 mM Tris; justere pH med HCl til 7,4.
- Forberede forbindelser skal testes på 50.76 µM (fx, en 5 µL sammensatte på 10 mM i en 980 µL analysebuffer i et microcentrifuge rør). Bland dem godt bruge en vortex maskine med høj hastighed til 2 – 5 s.
- Forberede en pre fortynding af reference sammensatte flumazenil af pipettering 1 µL af sammensat (10 mM) til 1,970 µL af analysebuffer. Bland dem godt bruge en vortex maskine med høj hastighed til 2 – 5 s.
- Fortynde en [3H] flumazenil stamopløsning med analysebuffer ved 4 ° C til 4 nM i en 50 mL polypropylen tube.
- Med pipette overfoeres 50 µL/brønd af analysebuffer til kolonne 1 og 3-11 af en 96-brønd mikrotiterplade som vist i den plade layout repræsenteret i figur 2.
- Afpipetteres 73.2 µL af de forbindelser, fortyndet på 50.76 µM (Se trin 1.1.2) i kolonne 12 på pladen.
- Fortynd hver sammensatte, ved hjælp af en geometrisk progression over 9 trin (1E-10 -1E-06 M), med en 23.12 µL overførsel volumen og fylde kolonner 3-11. Bland fortyndingen grundigt. Ændre spidsen efter hver fortynding.
-
Fortynd cellemembraner
- Tø cellemembraner tidligere isoleret fra en HEK293 overexpressing menneskelige GABAA receptor (0,025-0,15 mg/mL) at opnå 80 mL ved stuetemperatur (RT) og overføre suspension til analysebuffer ved 4 ° C.
- Resuspend membran løsning stadig ved 4 ° C med en væv homogeniseringsapparat for 30 – 40 s på 10.000-12.000 rpm.
-
Fortyndet diazepam for kontrolelementet ikke-specifik binding (NSB)
- Fortynde en 4 mM diazepam stamopløsning med analysebuffer til en koncentration af 40 µM i 5 mL.
-
Start reaktionen
- Afpipetteres 50 µL af 4 nM [3H] flumazenil i hvert hul i 96-brønd pladen og holde det i en beholder, isvand.
- Tilsæt 100 µL af GABAA receptor subtype membraner præparat, som har en proteinkoncentration på 0,5 mg/mL.
- Der afpipetteres 50 µL af 40 µM diazepam i kolonne 2.
- Inkuber plade i 1 time på køl.
- Tilsæt 50 µL af analysebuffer i hver brønd med en 96-brønd filterplade til efterfølgende membran adskillelse og radioaktivitet måling og stoppe reaktionen bagefter.
-
Reaktionen standses
- Udarbejde en vask buffer med 50 mM Tris-HCl, pH 7,4.
- Filtrer løsning ved hjælp af en 96-brønd celle mejetærsker. Vaske plade 3 x med 300 µL af iskold vask buffer pr. hul.
- Forsegle bunden af pladen med en plastfolie og tilføje 40 µL af scintillation cocktail for flydende scintillation tælle i hvert godt og tørre det med ethanol 70%.
- Ryst forsigtigt plade i mindst 1 time på RT. Lad det stå i mindst en time ved RT.
- Måle radioaktivitet (i CPM) ved at placere pladen på en scintillation counter. Giver mulighed for en måling i 3 min. pr. brønd.
-
Dataanalyse
- Bestemme, betyde for 8 replikater af ikke-specifik binding (NSB) og den samlede bindende (TB) såvel som for dubletter eller tre af prøverne. Beregne % specifikke bindende (SB) for gennemsnit af hver prøve efter følgende ligning:
Her
samlede SB = det gennemsnitlige TB minus den betyde NSB. - Plot i abscissen % SB versus i ordinat hæmmer koncentrationer. Passe til dataene ved hjælp af enkelt websted konkurrence analyse ligning:
Her
y = % af SB,
A = minimum af y,
B = y, maksimalt
C = IC-50,
X = log10 af koncentrationen af de konkurrerende sammensatte,
D = hældningen af kurven (en Hill koefficient). - Beregne bindende affinitet (Ki) ved hjælp af den halve maksimal hæmmende koncentration (IC50), dissociationskonstant (Kd) af [3H] flumazenil på de respektive membraner9, og koncentrationen af [3H] Flumazenil i analysen efter følgende data ved hjælp af ligningen:
- Bestemme, betyde for 8 replikater af ikke-specifik binding (NSB) og den samlede bindende (TB) såvel som for dubletter eller tre af prøverne. Beregne % specifikke bindende (SB) for gennemsnit af hver prøve efter følgende ligning:
2. receptor udtryk og optagelser i Xenopus oocyter
- Æggestokkene høst og oocyt forberedelse
- Forberede den sterile Barth løsning med 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (3)2.4h2O og 0,41 mM CaCl2.6H2O, ved pH 7,4 , suppleret med 100 enhed/mL af penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 0,25 µg/mL af amphotericin B.
- Forberede den 1 x OR2 medium (ingen CaCl2) med 88.5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, pH-værdi på 7,4.
- Offer en Xenopus Laevis kvindelige af dyb anæstesi i 20 min. i afkølede Tricaine methanesulfonate (i en koncentration på 150 mg/L, justeret på pH 7,4) og natriumhydrogencarbonat (300 mg/L) efterfulgt af halshugning.
- Høste æggestokkene hurtigt med ren saks og pincet og placere dem i 2 petriskåle (10 cm) fyldt med 40 mL 1 x Barth løsning og antibiotika/antimykotikum.
- Gemme æggestokkene ikke adskilles i op til 2 uger i Barth løsning ved 4 ° C.
- For dissociation, skære æggestokkene med en ren barberblad i små fraktioner (1 – 2 cm3) og inkuberes dem i 50 mL af OR2 medium uden CaCl2 (OR2-noCaCl2) indeholdende 0,2% collagenase (Type I) på 17-19 ° C i en 100 mL spinner kolben med en langsom agitation for 4-5 h. Bekræft, at den magnetiske bar er placeret ca 3-5 cm over bunden af spinner kolben at undgå knusning af oocytter.
- Efter 4-5 h, kontrollere, at de fleste af oocyter er frigjort fra deres follikel (dvs., de svømmer rundt individuelt). Vaske dem 5 x med 200 mL af OR2 suppleret med 1,8 mM CaCl2.
- Overfør defolliculated oocyter til petriskåle (10 cm) fyldt med Barth løsning og antibiotika/antimykotika og holde dem mindst natten over ved 17 ° C før cDNA eller mRNA injektionen.
- Den næste dag, vælge, under en kikkert, en sund oocyt præsentere en klar og tydelig animalsk kontra en vegetal pole (mørk brun til dyr pole versus lys gul for vegetal pole). Bruge ren Pasteur pipetter og afhænde oocyter én efter én i en steril konisk 96-injektion godt plade.
Bemærk: Ingen særlig pleje er nødvendig i placeringen af oocytter til mRNA injektioner; for cDNA injektioner er det uundværligt at orientere oocyter med den dyre stang opad.
- mRNA eller cDNA automatiske injection
- Syntetisere mRNAs ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit til anbefalede instruktionerne. Rengør instrumenterne og tabellen med RNase og de passende beskyttelse handsker.
Bemærk: Kvaliteten af mRNA er afgørende at give en god udtryk, og det er nødvendigt at forhindre mRNA forringelse under proceduren injektion. - Forberede cDNAs ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit og opløse den ønskede mængde i bidistilled vand ved en koncentration på 0,2 µg/µL.
- Injicér 10 – 50 nL af mRNA løsning ved en koncentration på 0,2 µg/µL, eller 10 nL af cDNA løsning i en koncentration på lige fra 0,02-0,2 µg/µL, helst i partier af 95 oocyter.
- For membran proteiner der kræver flere underenheder (dvs., heteromeric α1β2γ2 GABA-A receptorer), bland tilsvarende mRNAs eller cDNAs i det ønskede forhold (dvs.1:1:1 eller 1:10:1).
- Holde oocyt på 17 ° C at forhindre udtryk for heat shock proteiner af oocytter; gemme mikrotiterplade i en thermo-kontrollerede lagerområde.
- Opløse prøven forbindelser, som blev testet positive i den bindende assay i OR2 på 0,1-1.000 µM for elektrofysiologiske optagelser og afhænde dem ud i en 96-godt flad bund polypropylen plade.
- Syntetisere mRNAs ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit til anbefalede instruktionerne. Rengør instrumenterne og tabellen med RNase og de passende beskyttelse handsker.
- Plasmids til udtryk
- Følg betjeningsvejledninger af kommercielt tilgængelige kits til mRNA-syntese med bakteriel T7 eller T6 evalueringsudvalget og gøre 20 µL af en løsning på 0,2 µg/µL i RNase-fri vand.
- Forbered mindst 20 µL af en oploesning indeholdende en eukaryote udtryk vektor for cDNA, typisk på 0,2 µg/µL opløst i bidistilled vand.
- Mikroinjektion i oocyt og visualisering af dets kvalitet
- Injicér 10 – 50 nL af den løsning, der indeholder plasmid (Se trin 2.3.1 eller 2.3.2) ved hjælp af et glas mikroinjektion nål med en spids diameter lige op til 100 µm monteret på en micromanipulator udstyret med et pres udslyngning system eller med en automatiseret indsprøjtningssystem.
Bemærk: I eksemplet drøftede her oocyter injiceres af partier af 95 med et automatiseret system egner sig til brug med cDNA eller mRNA. - Fyld injektion nålen med 1 µL af et farvestof som methylenblåt på 1% og injicere oocyter ved hjælp af standardproceduren, (enten i nucleus for cDNA eller i cytoplasma til mRNA).
- Bortskaf de injicerede oocyter i ca 1 minut i kogende vand. Skær oocyter i halvdelen med et barberblad under en kikkert.
Bemærk: Farvestoffet forbliver lokaliseret som vist i figur 3E, tillader en præcis observation af injektion.
- Injicér 10 – 50 nL af den løsning, der indeholder plasmid (Se trin 2.3.1 eller 2.3.2) ved hjælp af et glas mikroinjektion nål med en spids diameter lige op til 100 µm monteret på en micromanipulator udstyret med et pres udslyngning system eller med en automatiseret indsprøjtningssystem.
- To-elektrode spænding klemme optagelser
- Sted godt pladen som indeholder oocyter på den automatiseret system, der anvender princippet illustreret i figur 4.
Bemærk: I modsætning til den patch klemme system illustreret i figur 5, ægte membran potentiale af cellen læses af spænding elektrode. - Programmere den automatiske optagelse system ved hjælp af den ikon-baseret interface med, for eksempel ordningen illustreret i figur 6 til bestemmelse af koncentrationen aktivitets-relationer.
- Sted godt pladen som indeholder oocyter på den automatiseret system, der anvender princippet illustreret i figur 4.
- Kurven montering
- Analysere resultaterne ved hjælp af passende software, ved hjælp af illustrerede koncentration aktivering kurve, afbilde den nuværende amplitude som en funktion af logaritmen af agonist koncentration.
- Observere sigmoide kurven, der efterfølgende kan monteres med empiriske Hill ligningen i formen:
Her
Y= brøkdel af evoked nuværende,
EF 50 = koncentration til 50% aktivering,
x = er koncentrationen af sammensat,
nH = Hill koefficient eller tilsyneladende cooperativity. - Normalisere strømninger til en enhed ved at dividere amplitude af hvert svar versus værdien registreres med den højeste koncentration til at analysere oplysninger indhentet fra en række celler.
- Bestemme gennemsnit og standardafvigelser og indse kurve montering ved hjælp af standardly tilgængelig software.
3. elektrofysiologiske optagelser i hjernen skiver
Bemærk: Hippocampus rotte skiver er udarbejdet i overensstemmelse med de nationale og institutionelle retningslinjer.
-
Forberedelse af hippocampus skiver
- Forberede dissektion kunstige cerebro-spinale væske (dACSF) med 124 mM NaCl 124, 2,5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glukose og 4 mM sakkarose gasset i flaske med en blanding af 95% O2 og 5% CO2.
- Forberede optagelse kunstige cerebro-spinale væske (rACSF) med 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3og 10 mM glukose gasset i flaske med en blanding af 95% O2 og 5% CO2.
- Bedøver rotter ved hjælp af en blanding af 2,5% isofluran og ren ilt og Hug hovedet af dem.
- Skære hovedbunden efter midterlinjen med et fin saks. Skære kraniet langs midterlinjen uden at beskadige det underliggende væv. Fjerne kraniet med pincet og bruge en fine spatel til at øse ud af hjernen.
- Læg hjernen i gasset dACSF løsning på RT og dissekere den venstre hippocampus dannelse med et fint spatel.
- Skær tværgående skiver (400 µm tykt) fra den mellemstore del af hippocampus med et væv chopper og overføre dem til optagelse kammer med brug af en maling børste. Vedligeholde skiver på RT for 45 min.
- Perfuse skiver med den gasset rACSF ved 35 ° C og med en hastighed på 1,5 mL/min. boble løsning med en blanding af 95% O2 og 5% CO2.
Bemærk: Efter dette trin, skiver er klar til de elektrofysiologiske eksperimenter.
-
Enkelt befolkning spike optagelse
- Placer en hjerne skive ind i mikroskop-monteret kammeret.
- Perfuse skive med en hastighed på 3 mL/min med rACSF.
- Trække en borsilikatglas mikropipette med pipette puller har en modstand af ~ 2 MΩ.
Bemærk: Denne mikropipette bruges som en optagelse elektrode og er elektrisk tilsluttet forstærkeren. - Fylde mikropipette med en oploesning indeholdende 2 M NaCl og læg det i pipette indehaveren af forstærkeren.
- Placer optagelse mikropipette i stratum pyramidale i regionen CA1 hippocampus udsnittets ved hjælp af den rigtige micromanipulator.
Bemærk: Placeringen repræsenteret skematisk i figur 7. - Placer en isoleret bipolar platinum/iridium elektrode i holderen på den venstre micromanipulator.
Bemærk: Denne elektrode bruges som stimulation elektrode og er elektrisk tilsluttet stimulus generator. - Placer stimulation elektrode i Schaffer soeskende i regionen CA1 hippocampus udsnittets ved hjælp af den rigtige micromanipulator.
Bemærk: Placeringen repræsenteret skematisk i figur 7. - Levere en nuværende puls til stimulation elektroden ved hjælp af stimulus generator hver 30 s (100 µs varigheder, startende fra 10 µA) og gradvist øge stimulation styrke indtil en befolkning spike (PS) vises.
- Justere stimulus styrke for at fremkalde en PS svarende til 45% af den maksimale amplitude, der kan opnås. PSs er filtreret på 2,4 KHz og digitaliseret på 20 KHz ved hjælp af signalforstærkeren.
-
Parret-puls hæmning
- Forberede hjernen skiver (trin 3.1) og Fortsæt som tidligere beskrevet (trin 3.2.1–3.2.7).
- Levere to aktuelle pulser (100 µs varigheder et interval på 20 ms) til stimulation elektrode hver 30 s ved hjælp af stimulus generator. Indstille stimulus styrken til at fremmane en PS svarende til 45% af den maksimale amplitude.
-
Sammensatte test
- Fortyndinger af forbindelser, der skal testes i gasset ACSF så den endelige koncentration af DMSO ikke højere end 0,1%.
- Tilføje DMSO til styringsløsning i den samme koncentration end i den sammensatte løsning.
- Optage en enkelt (trin 3.2) eller et parret-pulse (trin 3.3) PS fremkaldt af Schaffer sikkerhedsstillelse stimulering hver 30 s i mindst 30 min. Figuren PS skal være stabil i denne oprindelige periode.
- Forberede et bægerglas med gasset rACSF der indeholder en fast koncentration af stoffet testes.
- Perfuse hippocampus skive med denne løsning, mens du stadig optager den enkelte eller parret puls PS.
- Evaluere opsving fra den sammensatte effekt af perfusing skive med gasset rACSF uden sammensat.
Bemærk: For reversible effekter, PS vender tilbage til sin oprindelige form observeret i baseline perioden før det sammensatte program.
-
Dataanalyse
- Gennemsnitlige PS spor registreret under eksperimentet i blokke af 4 bruger data analyse software.
- Måle PS amplituder af gennemsnit spor.
- Normalisere amplituder som en procentdel af baseline værdierne registreres 10 min før perfusing en sammensat.
- Udtrykke data, som betyder ± SEM.
Representative Results
Bindende:
I vitro assay med cellemembraner bruges til at identificere selektiv menneskelige GABAA α5β3γ2 receptor ligander bindende på BZD allosteriske site af γ2 indeholdende receptorer. Forbigående transfekteret HEK293 celler udtrykker menneskelige GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 og α3β3γ2 receptorer der bruges til at forberede dette assay membraner. Effekten af de potentielle ligander er fundet ved at måle scintillation af [3H] flumazenil bundet til membranreceptorer (en hæmning af [3H] flumazenil bindende). Forskydning bindende kurver genereres derefter for at vurdere selektivitet af forbindelser til en specifik GABAA receptor som i eksemplet med RO4938581 (figur 8). Figur 9 opsummerer profil af flere referencestoffer herunder α5 selektiv GABAA receptor negative allosteriske modulatoren, RO49385819, som blev genereret ved hjælp af bindende assay.
Optagelser i Xenopus oocyter:
Udtryk af GABA-A receptorer som α5β3γ2 heteromer giver robust strømninger i reaktion på GABA eksponering. Typiske spænding klemme optagelser er fremstillet i en oocyt at udtrykke den menneskelige α5β3γ2 som svar på korte GABA pulser (30 s) lige op til 300 µM er vist i figur 6. I dette eksperiment de forskellige koncentrationer af GABA blev afhændet i 96-brønd plade og svarene var fremkaldt ved at flytte cellen i en særlig godt. GABA var grundigt vasket ved returnerer cellen til centrale perfusion kammer og anvende en perfusion af kontrol løsning ved at aktivere den tilsvarende peristaltisk pumpe. Programmet sekvens anvendes til bestemmelse af koncentrationen aktivering kurve er illustreret i figur 6A. Udført helt automatisk, disse data illustrerer både kvaliteten af de optagelser, der kan opnås i Xenopus oocyter og det høje niveau af receptor udtryk opnået et par dage efter mRNA injektion. Eksperimenter, udført på forskellige receptor kombinationer, give en række EF50s, hvilket er koncentrationen af GABA nødvendigt at aktivere halvdelen af receptorer. Et plot af EF50værdier på en edderkop diagram, giver som illustreret i figur 10, en hurtig sammenligning af receptor egenskaber og indflydelse af subunit sammensætning.
For at undersøge effekten af en negativ eller positiv allosteriske modulator (NAM eller PAM), er det nødvendigt at sammenligne reaktion fremkaldt af en agonist (GABA) test puls, først i kontrolelementet og derefter modulatoren. En effektiv forsøgsplan til at gennemføre sådan et eksperiment er illustreret i Figur 11. Svar af cellen til en reference koncentrationen af GABA bestemmes først og sekvensen gentages ved at anvende de samme GABA koncentration og derefter af en fælles anvendelse af GABA plus modulatoren. Et plot af de to overlejrede svar afslører i dette eksempel en markant hæmning forårsaget af tilstedeværelsen af modulatoren. En kvantificering af modulator effekt opnås let ved at beregne forholdet mellem reaktionen fremkaldt i overværelse af modulator versus kontrol og resultaterne kan være afbildet i form af en varme plot. De data, der er vist i figur 12 illustrere den varme plot svarende til optagelser af tre datasæt til 96 forbindelser.
Efter identificering af forbindelser, der er tilstrækkelig aktiv, er det ofte nødvendigt at vurdere, om disse molekyler er aktive på andre receptor kombinationer. I tilfælde af GABAA receptor, 19 gener kodning for forskellige underenheder er blevet identificeret, og det er kendt, at en funktionelle receptor kan skyldes en multimeriske samling af forskellige underenheder (Se Knoflach, Hernandez og Bertrand10 for en anmeldelse). Selv om flere underenheder og kombinationer udbyttet et stort repertoire af receptor subtypes der kan kræve et stort antal counter screening skal udføres, er det ofte muligt at fokus først på den mest rigelige subtype som, i tilfælde af GABAA receptorer, er α1β2γ2 sammensætning. Eksperimenter udført hoved til hoved med udtryk for, for eksempel, α5β3γ2 og α1β2γ2 i det samme parti af oocyt udbytte en god sammenligning af de respektive virkninger af en given molekyle. De typiske resultater, der opnås i tre celler til α5β3γ2 og α1β2γ2 er vist i Figur 13, som illustrerer de præferentielle positive graduering af et molekyle på α5β3γ2.
Forsøgsplan illustreret i Figur 11 er velegnet til karakterisering af en PAM aktivitet. I denne protokol er det stof, der er testet Co anvendt med agonist på gradvis stigende koncentrationer. For at undgå eventuelle kumulative virkninger forårsaget af flere programmer på den samme celle, måles en ny og naive celle for hvert datapunkt. En måling af amplituden af svaret registreres med agonist alene og derefter under programmet sammensatte udbytter nøgletal, der kvantificerer PAM eller NAM effekten. Typiske resultater opnået ved α1β2γ2 og α5β3γ2 for diazepam er vist i Figur 14, afslører en tilsyneladende følsomheden af de α5β3γ2, der er cirka 10-fold højere på denne receptor kombination. Disse værdier er i god korrelation med offentliggjorte data11. Som det menes, at webstedet benzodiazepin består af grænsefladen mellem γ2 og dens tilstødende α-underenhed12-14, tyder følsomheden af α5β3γ2 en præferentiel diazepam affinitet for γ2-α5 over γ2-en1. Mulighed for at udtrykke forskellige receptor kombinationer kombineret med en effektiv funktionelle karakterisering åbner op for flere måder at udforske determinanter for PAM egenskaber og deres konsekvenser for fysiologiske og farmakologiske virkninger.
Hippocampus hjernen skiver:
Eksperimenter med rotte hippocampus hjernen skiver er udført for at validere den farmakologiske profil af de forbindelser, der er identificeret i in vitro- assays i en native receptor model. Fremherskende GABAA receptor subtype udtrykt i hippocampus pyramideformet celler er α1β2/3γ2, α2β2/3γ2 og α5β2/3γ2, som er alle moduleres af benzodiazepin (BDZs)15. Parret-puls hæmning er et paradigme, der kan afsløre hippocampus kredsløb ophidselse ved at teste ændringen i svar af andet af to parrede elektriske stimuli leveret 20 ms apart. Ændringen af den anden reaktion er på grund af GABAergic feedback af interneurons innerverer den pyramideformede celle lag16-18. Som vist i figur 7, i kontrolsituationen, er det andet svar af to parrede stimuli hæmmet på grund af en GABAergic hæmning. Når denne hæmning er reduceret med perfusing skive med β-CCM, hæmmes en non-selektive NAM, den anden reaktion fra de to parrede stimuli i langt mindre grad. Denne eksperimentelle paradigme er følsomme over for forbindelser selektiv for en GABAA receptor indeholdende α5-underenhed.
Figur 1 : Screening strategi. Et typisk stof screening pathway begynder med high throughput screening, hvor store biblioteker af forbindelser er screenet for et bestemt mål. Efter identifikation af bly kandidat, medicinalkemi arbejde begynder. I denne fase kemikere vil studere og forfine molekylerne ved at udføre en strukturel ændring for at opfylde de ønskede kriterier, såsom target selektivitet, hjernen penetrans, stabilitet, nedbrydning etc. i denne afgørende fase, det er vigtigt at vurdere, om de kemiske ændringer ikke har ændret egenskaberne molekyle og at justere til den bedste kandidat. De følgende trin er at identificere et par lovende forbindelser og bringe dem til de næste skridt, som omfatter sikkerhed, tolerance, etc. Bemærk at Elektrofysiologi er angivet som den funktionelle assay men at andre metoder, herunder calcium fluorescens assays eller spænding følsomme farvestoffer, kan bruges som alternativer. Disse sidstnævnte metoder er også brugt i høj overførselshastighed assays som en substitution for bindende assays. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Layout af en 96-brønd forgyldt udnyttet for bindende eksperimenter. Kolonne 1 bruges til samlede bindende målinger og kolonne 2 for ikke-specifik binding målinger. Rækker A-H er fyldt med 4 forskellige forbindelser i stigende koncentrationer (kolonne 3-12), hver sammensatte i dubletter (dvs. sammensat 1 i rækker A og E, sammensatte 2 i rækker B og F, etc.) repræsenteret i layoutet med forskellige farver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Mikroinjektion ved hjælp af en automatiseret system. (A) A præcise XYZ system, hvor et glas injektion nål fyldt med væske som indeholder plasmid af interesse, er automatisk stukket ind i oocytter. (B) dette panel viser 96-brønd konisk-bundplade i hvilke (C) oocyter automatisk injiceres. (D) dette panel illustrerer princippet injektion. Injektionsvæske nukleare trænger nålen oocyt lidt dybere end kernen, som er vist i panelet B. Så nålen er trukket tilbage fra kernen (se panelet C) før injektion (se panelet D). (E) for at vurdere kvaliteten af injektion, nålen kan være fyldt med et farvestof og "kogt" oocyter kan skæres i halve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Automatiseret to spænding-clamp elektrode princippet. Princippet er baseret på flytte forberedelsen mellem brønde i stedet for at anvende væsken i perfusion. (A) i venstre side af panelet repræsenterer arrangement at tillade optagelsen i en Xenopus oocyt med to elektroder og den lille kurv, der vil bevare en flydende droplet omkring forberedelsen under bevægelsen fra den ene stikprøve til en anden. Et billede af oocyt placeret i kurven med de to elektroder er vist til højre. (B) dette panel viser en skematisk gengivelse af den "hovedet" Elektrofysiologi optagelse princippet. (C) dette panel viser disposition af oocyt, sammensatte plade og håndvask station på tabellen optagelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : To-elektrode spænding klemme optagelse versus patch clamp. En typisk to-elektrode spænding klemme optagelse for oocyter (venstre panel) er i forhold til patch klemme konfiguration anvendes til en cellelinje (højre panel). Bemærk forskellen i størrelse mellem de oocytter, som er ca 1 mm i diameter versus de celler, som er omkring 20 µm. I den to-elektrode spænding klemme, membran potentiale af oocyt er i forhold til den ønskede bedrift spænding og signal forskellen er injiceres i den nuværende elektrode. I en programrettelse klemme optagelse antages det, at modstanden i patch klemme elektrode er ubetydelig versus membran modstand, og derfor, at spændingen, der pålægges af forstærkeren er trofast fodret til cellemembranen19. Billedet illustrerer en flydende glødetrådens perfusion, hvor de to kanaler af en theta tube () er fyldt med, dels en kontrol løsning og på den anden side med den løsning, der indeholder stof20,21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Koncentration aktivering forhold på de menneskelige α5β3γ2 receptorer. (A) sekvensen kontrollerer den automatiseret system består af en række ikoner og sæt forsøgsplan til bestemmelse af koncentrationen aktivering forholdet. I trin 1-3, som vist i dette panel, indlæser systemet oocyt fra pladen i den måling kurv. Lækage strøm måles i trin 2, og hvis denne værdi overstiger de ønskede kriterier, cellen automatisk ændres (trin 3). Efter en stabiliseringsperiode (trin 4) er oocyt svar på en reference GABA koncentration målt (trin 5-8). Oocytter visning strøm større end 1 µA holdes for efterfølgende måling. I trin 11-13, cellen er udfordret af forskellige koncentrationer af GABAA og processen gentages til det ønskede antal koncentrationer (trin 14) og celler (trin 15). (B) dette panel viser de typiske strømninger fremkaldt af en serie af korte GABA applikationer (30 s) anvendes i stigende rækkefølge. Timingen af det sammensatte program angives af barer. (C) en plot af de indadgående spidsværdien af strømmen som funktion af logaritmen af GABA koncentration udbytter koncentration aktivering kurven, der monteres umiddelbart ved empiriske Hill ligning, med en sammenhængende kurve, en EF50 på omkring 11 µM og en bakke koefficient af 1.3. Strømninger i 8 celler var normaliseret til en enhed for maksimal evoked response. Søjlerne angiver standardafvigelsen på middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Β-CCM, en GABAA NAM reducerer parret puls hæmning i hippocampus skiver. (A) dette panel viser en skematisk fremstilling af en rotte hippocampus skive. Schaffer soeskende (Sch C), med oprindelse fra CA3 pyramideformet celle axoner projekt på den dendritiske arborization CA1 pyramideformet neuroner. Mikropipetter blev placeret i stratum pyramidale (str pyramidale) til at registrere befolkning pigge (PS) og i stratum radiatum (str radiatum) for dendritiske optagelser af feltet excitatoriske postsynaptiske potentialer (epsp). Stimulation elektrode var placeret inden for Schaffer soeskende. (B) dette panel viser PSs fremkaldt af parret stimuli anvendes gennem samme stimulere elektroden på et 20 ms interval. Befolkningens reaktion på den anden stimulus (PS2) er af mindre amplitude end i svaret på det første stimulus (PS1). (C) PSs blev registreret i fravær (sorte bjælke) og tilstedeværelsen af β-CCM, en ikke-selektiv GABAA receptor NAM (grøn linje). Β-CCM forbedret amplituden af den anden PS2 ved delvis blokere enhver feed-forward GABAergic hæmning. Søjlerne angiver standardafvigelsen på middelværdien og *** at data er meget signifikant med en p < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: typisk bindende resultater opnået i en konkurrencedygtig (hæmning eller fortrængning) assay. Forskydning bindende kurver er genereret fra som IC50 og Ki kan bestemmes. IC50 er koncentrationen af en konkurrerende ligand, som fortrænger 50% af den specifikke bindingen af radioligand, og Ki (hæmning konstant for et lægemiddel) er koncentrationen af en konkurrerende ligand, som ville besætte 50% af receptorer, hvis ingen radioligand var til stede. Ki beregnes fra IC50 ved hjælp af Cheng-Prusoff ligningen:
Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 : Konkurrencedygtige forskydning bindende blev udført med ligander bindende på store GABAA receptor subtype. Tilhørsforhold (nM) blev målt ved hjælp af et [3H] flumazenil-bindende assay og membraner fra HEK293 celler transfekteret forbigående med forskellige menneskelige GABAA receptor subunit kombinationer. Histogram repræsentation illustrerer klart differentieret følsomhed observeret for de sammensatte RO493851 med den laveste Ki på α5β3γ2 receptorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10 : Differential GABA følsomhed af receptorer. Et plot af receptor GABA EF50 på en edderkop plot og en repræsentation af den formodede subunit sammensætning giver effektive måder at sammenligne de forskellige underenheder rolle. Bemærk, at indførelsen af γ2 underenheder er forbundet med en reduktion i receptor følsomhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11 : Sondering effekten af en modulator. (A) dette panel viser ikonet sekvens anvendes til at kontrollere den automatiseret system. Bemærk at de to (A/D) ikoner svarer til optagelse i kontrolelementet (grøn) og under modulator eksponering (rød). (B) dette panel viser typiske strømninger registreres i en celle, der udtrykker GABAA receptoren under sådan en sekvens. For at evaluere virkningerne af en modulator, blev en sekvens af måling første reaktion fremkaldt af udsættelse for en fast koncentrationen af GABA (grønne spor), efterfulgt af eksponering først til GABA og derefter til GABA plus modulator (røde spor), gennemført. Positionering trådkors markører (cyan og blå) afgrænser målingerne, og den blå kors angiver maksimal forskellen mellem de to optagelse betingelser. Forholdet mellem kontrol og modulator betingelsen beregnes automatisk i analyse software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12 : Varme plot med tre replikater. Dette panel viser en varme plot svarende til tre replikater af modulator effekter opnås for 96 forbindelser på de menneskelige α5β3γ2 GABA-A receptorer. Nøgletal for test svar over kontrolelementet spænder mellem 0,5 og 1.2 blev anset for ikke signifikant forskellig fra kontrollen og er repræsenteret ved en grøn prik. Nøgletal under 0,5 blev betragtet som repræsenterer en hæmmende effekt og er repræsenteret af blå prikker. Nøgletal over 1.2 blev betragtet som styrke svaret og repræsenteres af røde prikker. Bemærk ligheden i mønster mellem de tre uafhængige optagelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 13 : Counter screening ved α1β2γ2. (A) dette panel viser en repræsentation af en formodet subunit organisation. De følgende paneler viser (B-D) en evaluering af virkningerne af en positiv allosteriske modulator på den menneskelige α5β3γ2 og (F-H) på α1β2γ2, ved hjælp af sammenlignelige koncentrationer af GABA og lignende koncentrationer (100 µM) af den modulator, som understreger specificiteten af sammensat testet i disse eksperimenter. (E) dette panel viser også en repræsentation af en formodet subunit organisation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 14 : PAM følsomhed og receptor sammensætning. Bestemmelse af virkningerne af en række koncentrationer af diazepam effekter (A-D) på α1β2γ2 og (E-H) α5β3γ2 receptorer afslører næsten en 10-fold forskel i tilsyneladende affinitet. Bemærk også indflydelse af subunit sammensætning på response tid kurset med en hurtigere desensibilisering på α1β2γ2 receptorer (Se for eksempel, bedømmelseskomite D og H). Bemærk, at som α1β2γ2 og α5β3γ2 receptorer display forskellige tilhørsforhold til GABA (Se også figur 10), koncentration af agonist blev justeret mellem de to receptorer til at være i et område som sammenlignelige aktivering. (I) denne panel repræsenterer et plot af fold stigning i en nuværende amplitude normaliseret til enhed versus kontrol tilstand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 15 : Udtryk plasmid herunder T7 og CMV promotor. Disse paneler viser plasmid for udtrykket i en Xenopus oocyt (øverste højre panel) og i en cellelinje. Nederste højre panel viser en typisk HEK-293 celle transfekteret med et plasmid som indeholder også genet for en grøn fluorescerende proteiner (NGL) med patch-clamp optagelse elektrode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Udviklingen af nye forbindelser aktive på en ligand-gated ion-kanal som GABA-A receptorer kræver brug af flere metoder. Typisk, det første skridt er ofte udført ved hjælp af bindende assays; men sådanne målinger er utilstrækkelig til at karakterisere den fysiologiske aktivitet af stoffet eller dets præcise farmakologi. Især et stof, der binder sig til en receptor kan forbedre eller hæmme dets funktion eller selv producere ingen funktionel indflydelse (tie) (dvs., binder sig til receptoren uden at ændre dets funktion). Således er en funktionel test nødvendige for en fuld sammensatte karakterisering.
Bindende assays:
Den største fordel ved bindende assay er at det effektivt kan gennemføres på et stort antal prøver lige op til flere tusinde og at det giver bindende tilhørsforhold til de aktive molekyler. Som beskrevet heri, består det første skridt for at etablere en metode til vurdering af de ønskede receptor subtype. Nemlig, mens bindende kan udføres på native receptorer fra fraktioner eller hele hjerner, en sådan metode vil forhindre bestemmelse af tilhørsforhold på specifikke receptor subtype. Det er derfor nødvendigt at anvende rekombinante systemer til raster molekylerne på det ønskede mål. I dag er tilbyder en forbigående eller stabil Transfektion af ønskede receptor subunit cDNAs i cellelinjer en effektiv og pålidelig metode til at udtrykke receptor undertyper af interesse (f.eks., GABAA α5β3γ2). Traditionelle bindende assays gøre brug af radioligands, men i dag teknikker er tilgængelige at undgå besværet med håndtering af radioaktivitet (fx, kvantitative fluorescens-baserede ligand-bindende).
Funktionelle udtryk i en værtssystem:
For at udtrykke gener på et værtssystem, sættes den kodende sekvens af interesse i et plasmid, der indeholder de tilstrækkelige evalueringsudvalget. Typisk for in vitro- mRNA syntese, er de bakterielle T7 eller T6 evalueringsudvalget brugt. For en cDNA udtryk, skal transskription af gen af interesse reguleres af en eukaryote promotor f.eks CMV (cytomegalovirus) eller tilsvarende. Flere plasmider, herunder de to evalueringsudvalget (dvs., pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), er i dag tilgængelig så enten en in vitro- syntesen af mRNA eller en cDNA udtryk som vist i Figur 15. Et udtryk af GABA-A receptorer kan opnås trofast, enten i cellelinjer eller Xenopus oocyter. De vigtigste fordele ved sidstnævnte er manglen endogene receptor udtryk, enkelhed af manipulationer og tilgængeligheden af et automatisk system til mikro-injektioner og optagelser. Procedurerne i denne protokol illustrere effektiviteten af den automatiserede system, som tillader injektion af 96 oocyter i ca 7 min og kræver ingen micromanipulation færdigheder. At huske på, at en enkelt æggestokken fra en Xenopus indeholder mellem 10.000-30.000 oocytter, er det klart, at et stort antal celle målinger kan foretages på et enkelt præparat. Desuden, som et udtryk kan gennemføres ved hjælp af cDNA injektioner, de samme plasmider, der indeholder gener af interesse, der er udviklet til bindende eksperimenter kan bruges til en funktionel karakterisering uden behov for yderligere Molekylærbiologi manipulationer.
I betragtning af dens store størrelse og høj overflade udtryk, udbytter en enkelt oocyt en række receptorer, der omtrent svarer til de sammenflydende celler i en 35 mm petriskål. Dog repræsenterer en oocyter forberedelse og injektion en brøkdel af omkostningerne ved en cellelinje, som eksperimenterne, der ikke kræver en specifik næringssubstratet og sterile manipulationer. Aktivering af en enkelt GABAA kanal giver et par picoamperes (10-12) og strømninger spænder op til snesevis af microampere (10-6) optages let i en enkelt oocyt, som bekræfter samtidig aktiviteten af flere millioner af receptorer under en enkelt svar.
Et første skridt i karakterisering af ligand-gated Ionkanaler er ofte bestemmelse af det tilsyneladende affinitet af receptorer. De forsøg, der skal foretages består af anvender en række korte agonist testimpulser og plotte amplitude af den evoked aktuelle eller i visse tilfælde arealet under kurven (AUC) som en funktion af logaritmen af agonist koncentration. Så er det nemt muligt at microinject forskellige plasmid koncentrationer og forhold i den samme batch af oocytter, er dette system af udtryk yderst velegnede til sådan en karakteristik. Desuden viste en batch til batch sammenligning en høj grad af stabilitet for forskellige EF50s. Indflydelse af subunit sammensætning på den receptor tilsyneladende affinitet er let visualiseres ved hjælp af en edderkop plot, som eksemplificeret i figur 10.
Resultaterne af den to-elektrode spænding klemme er fremstillet i Xenopus oocyter sammenlignes ofte med optagelser foretaget ved hjælp af patch klemme elektroder. Der henviser til, at det ville gå ud over anvendelsesområdet for dette arbejde til at gå ind i en detaljeret sammenligning mellem disse to systemer, kan et par punkter undersøges. Mens en patch klemme i celler giver fordele for en Biofysisk karakteristik med en hurtig drug application, er dens krav mere komplekse end de to-elektrode optagelser i Xenopus oocyter. Et første og ikke ubetydelige problem er udtryk for en given protein med nødvendigheden af en cellekultur, en forbigående eller stabil Transfektion og identifikation af de celler, der udtrykker den ønskede konstruktion. Derudover er det nødvendigt at undersøge den endogene udtryk i cellen betragtes som mulige bidrag. Desuden kræver en patch klemme optagelse en kvalificeret person til at foretage micromanipulation under en høj forstørrelse microscope, mens denne person skal også udføre en passende analyse under eksperimentet at vurdere, for eksempel, kvaliteten af sæl, adgang modstand etc. i kontrast, en to-elektrode spænding klemme optagelse, især en ved hjælp af en automatiseret elektrofysiologiske system, kræver ikke nogen særlige færdigheder og kan foretages af laboranter.
Ved erhvervelse af en elektrofysiologiske set-up, er omkostninger betragtning helt sikkert en vigtig faktor, der skal analyseres grundigt. For eksempel, mens omkostningerne ved en automatiseret system er relativt høj, afslører en nærmere sammenligning at installationen af et komplet elektrofysiologiske rig omfatter køber udstyr som god micromanipulators, en kikkert linse, en forstærker, en perfusion system, og et Vibrationsdæmpende bord, mens også erhverve data og udføre en analyse. En pris sammenligning mellem en to-elektrode spænding klemme set-up versus en patch klemme set-up afslører endnu længere uoverensstemmelser. Desuden, den automatiseret system tilbyder fordel af fuldt automatiseret udstyr og kører uden opsyn dag og nat.
De farmakologiske egenskaber af et stof, der bestemmes af dets virkemåde på receptoren. For eksempel, er kompetitive inhibitorer molekyler, der kan angive den samme bindende lomme eller orthosteric websted, som agonist, selv forårsager en konkurrence. Ikke-kompetitive inhibitorer er stoffer, som hæmmer receptorer ved at interagere på et andet websted, og i tilfælde af en ligand-gated ion-kanal, som kan angive og blokere den ioniske pore, f.eks. Det ville gå ud over anvendelsesområdet for dette arbejde at undersøge de forskellige ordninger for interaktion, men yderligere oplysninger kan fås fra et farmakologisk lærebog og/eller fra andre arbejde som Bertrand og Bertrands22.
I tilfælde af allosteriske modulatorer ændrer de sammensatte bindes på et websted, der er adskilt fra orthosteric site, men tilstedeværelsen af molekylet energi barriere mellem de aktive og andre stater. Positive allosteriske modulatorer (PAMs) er forbindelser, reducerer energi barrieren fra hvile til den aktive tilstand, og derfor øge effekten af agonist. For at karakterisere mulige PAM virkninger, er det derfor nødvendigt at afgøre, om en udsættelse til sammensat forbedrer reaktion på agonist og bekræftende fald i hvilken koncentration. Eksperimenterne præsenteret i Figur 11 og Figur 14 illustrere protokoller, der med held kan anvendes til karakterisering af PAMs på GABA-A receptorer.
I nogle tilfælde, kan udsættelse for PAM alene være tilstrækkeligt til at aktivere receptorer. Sådan aktivitet kan bestemmes ved en mindre ændring af forsøgsplan præsenteres her. Nemlig, stedet for at bruge en fælles anvendelse af modulatoren under eksponering til GABA, protokollen kan ændres ved anvendelsen af første sammensatte alene og derefter i nærværelse af GABA. En Karakteristik af den direkte agonist aktivitet vil blive foretaget ved bestemmelse af amplituden af reaktion fremkaldt af sammensat sig selv og i forhold til den GABA-fremkaldte aktuelle.
Eksperimenter udført i hjernen skiver, som illustreret i figur 7, der anvendes til at bekræfte den sammensatte aktivitet på native receptorer i et konkret hæmmende kredsløb før de går videre i dyremodeller og langs vejen mod kliniske forsøg. Forholdsvis enkle data optagelse og analyse protokollen tillader placering af flere forbindelser ved at evaluere deres differential modulerende effekt på PS amplitude. Ikke-specifikke effekter af forbindelser, som ikke er relateret til GABA-system kan også være registrerede (f.eks., når der observeres ændringer i figuren PS). Direkte, GABAergic neurotransmission kan vurderes i disse tilfælde ved at måle virkningerne af stofferne på hæmmende postsynaptiske strømme (IPSCs) ved hjælp af hele-celle patch klemme teknik8.
Disclosures
Forfatterne Frédéric Knoflach og Maria Clemencia Hernandez er medarbejdere i F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel i Schweiz, en lægemiddelvirksomhed. Forfatteren Daniel Bertrand er ansat af HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Genève, Schweiz, giver screening faciliteter til farmaceutiske virksomheder.
Acknowledgments
Forfatterne takke Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab, og Marie Claire Pflimlin fra Roche og Tifany Schaer og Deborah Paolucci fra HiQScreen for deres fremragende teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General equipment | |||
| 96 well cell harvester -(Filtermate 196) | Packard | To filter membranes with bound radioligand | |
| Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) | Packard | Microplate Scintillation and Luminescence counter | |
| Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) | Packard | Vial Scintillation and Luminescence counter | |
| Liquid handler (Biomek 2000) | Beckman coulter | To prepare compound dilutions | |
| Vortex (Vortex Genie 2) | Scientific industries Inc. | To mix compound stock solutions | |
| Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) | Kinematica AG | To resuspend the membrane preparations | |
| XLfit5 software | Microsoft Excel add-on by IDBS |
Curve fitting software | |
| Smart Pull | UniPix | - | Electrode Puller |
| RoboInject | MultiChannel Systems | - | Automated Injection (Xenopus Oocytes) |
| HiClamp | MultiChannel Systems | - | Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes) |
| DataMining | MultiChannel Systems | - | Data Analysis Software |
| DataMerger | MultiChannel Systems | - | Data Processing Software |
| Digidata 1550 | Molecular Devices | Low noise data acquisition system | |
| CyberAmp 380 or equivalent | Axon Instruments | Programmable Signal Conditioner | |
| pClamp program suite | Molecular Devices | Software for data acquisition and analysis software | |
| Antivibraton table | TMC | To avoid microelectrode vibrations | |
| Patchstar Micromanipulators | Scientifica | To accurately position microelectrodes in brain slices | |
| Faraday Cage | Sutter Instruments | To isolate recordings from noise | |
| McIlwain Tissue Chopper | Campden Instruments LTD | To prepare brain slices | |
| Borosilicate glass micropipette | Warner Instruments | GC150TF-10 | To record extracellular potentials in brain slices |
| Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode | World Precision Instruments | To stimulate the brain slices with current | |
| Stimulus generator for current and voltage driven stimulation | MultiChannel Systems | STG4000 | Delivers the current to the stimulation electrode |
| Plasticware | |||
| Microtiter plate round bottom | Corning | #3365 | Used for the binding assay |
| GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter | Packard | #6005174 | used for the binding assay |
| 50 mL Tubes | Falcon | #352070 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | #0030 120086 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 2 mL | Eppendorf | #0030 120094 | used for the binding assay |
| Shipping tubes 180 mL | Semadeni Europe AG | #3722 | used for the binding assay |
| Pony vial Polyethylene 6 mL | Perkin Elmer | #6013329 | used for the binding assay |
| Top Seal | Perkin Elmer | #60051859 | used for the binding assay |
| Spinner Flask | Bellco | BELLCO # 1965-00100 | Spinner Flask |
| 96 Well Plate (Conical) | Thermo Scientific Milian | 56368 | Injection plate for the oocytes |
| 96 Well Plate (Flat bottom) | Corning (Vitaris Switzerland) | 3364-cor | Compound Plate for the HiClamp |
| Glass capillary | Hilgenberg (Germany) | - | borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament |
| RNA preparation | |||
| Ambion mMessage mMachine | Thermo Fisher Scientific | for the in vitro synthesis | |
| Chemicals | |||
| Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Diazepam 4 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| [3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 °C | Used for binding assay | ||
| Microscint 40 | Packard | #6013641 | Used for binding assay |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | #6013329 | Used for binding assay |
| MS-222 | Sigma | Sigma # A5040 | MS-222 |
| AB/AM | Sigma | Sigma # A5955 | antibiotics / antimycotics |
| Collagenase | Sigma | Sigma # C1030 | Collagenase Type I |
| Rnase | Sigma | Sigma # R2020-250 mL | RNaseZAP |
| EndoFree Plasmid maxi Kit | Qiagen | Qiagen # 12362 | |
| Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) | Sigma | ||
| Membranes | |||
| Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al. 2009 for detailed methods. | Used for binding assay |
References
- Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).
- Sieghart, W. Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes. Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).
- Liu, J., et al. A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).
- Mennerick, S., et al. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).
- Hevers, W., Luddens, H. The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes. Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).
- Macdonald, R. L., Olsen, R. W. GABAA receptor channels. Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).
- Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors. British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).
- Prenosil, G. A., et al. Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).
- Ballard, T. M., et al. RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors. Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).
- Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all. Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).
- Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding. Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).
- Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites. PLoS One. 8, 52323 (2013).
- Richter, L., et al. Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands. Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).
- Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions. Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).
- Wisden, W., Seeburg, P. H. GABAA receptor channels: from subunits to functional entities. Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).
- Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus. The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).
- Karnup, S., Stelzer, A. Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells. The Journal of Physiology. 516, Pt 2 485-504 (1999).
- Turner, D. A. Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).
- Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy. European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).
- Hapfelmeier, G., et al. Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block. Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).
- Bertrand, S., Bertrand, D. Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 11, Unit11 17 (2004).
