Summary
여기, 선물이 생리학 및 약리학 바인딩에서 GABAA 수용 체에 활성 화합물을 발견 하는 프로토콜.
Abstract
심사에 대 한 단계별 프로토콜 감마 aminobutyric에서 화합물이 원고 선물 산 입력 (GABAA) 수용 체와 소설 분자 생체 외에서 재조합에서 전 임상 분석 실험에서 활성의 id로 사용 설치류 두뇌 조각에서 네이티브 수용 체에 그들의 약리 효과 수용 체 화합물은 수용 체의 다이아 사이트에서 바인딩에 대 한 첫 단계는 주요 GABAA 하위를 표현 하는 세포 막에 radioligand 바인딩 분석 실험 개발으로 구성 된 기본 화면 설정입니다. 다음, Xenopus oocytes 또는 HEK 293 세포에서 설치류와 인간의 GABAA 수용 체의 분리 식의 이용, 그것 가능 하다 electrophysiological 분석에 다른 수용 체의 생리 적인 속성을 탐구 하 하위 및 확인 된 화합물의 약리 속성. Xenopus oocyte 시스템이 나타납니다 여기는 oocytes 그리고 2 전극 전압 클램프를 사용 하 여 약리 특성까지 다른 mRNAs와 그들의 microinjection의 격리로 시작. 마지막으로, 설치류 두뇌 조각에서 실시 하는 녹음 설명 합니다 보조 생리 테스트로 잘 정의 된 신경 회로에 그들의 네이티브 수용 체에 분자의 활동을 평가 하기 위해 사용 되는. 여러 뉴런의 인구 응답을 사용 하 여 세포 외 녹음 가지 약물 응용 프로그램 함께 보여 줍니다.
Introduction
여기, 우리 생리학과 약리학을 바인딩에서 GABAA 수용 체에 활성 화합물의 발견에 대 한 프로토콜 제시. GABAA 수용 체에 대 한 특정 비 발한 분자에 대 한 검색, 그것은 정의에 중요 한, 가능한 한 정확히, 관심과 새로 확인된 된 화합물의 특이성의 평가의 하위 유형 (예, 검토를 위해 루돌프를 참조 및 Knoflach1또는 Sieghart2). 약물 발견 및 달성 하는 데 필요한 단계는 일반적인 경로 그림 1에 설명 됩니다.
바인딩 분석 실험 이었고 여전히 크게 약물 발견의 첫 번째 단계로 사용 됩니다. GABAA 수용 체의 경우 그들은 다이아 바인딩 사이트에 수용 체의 치료로 유용 하 고 안전한 약물 바인딩할 바인딩 하는 화합물을 식별 하기 위해 최적화 되어 있다. Fluorometric 이미징 플레이트 리더 (FLIPR) 막 잠재적인 붉은 염료 기반 분석3를 사용 하 여 다른 기술을 추가 하는 사이트를 보다 적게 바람직한 그들의 원치 않는 부작용 단면도 때문에 바인딩되는 바비 같은 화합물을 감지 합니다. 또한, 사용된 염료 직접 GABAA 수용 체, 따라서 약물 발견4에 대 한 이러한 분석의 유틸리티 질문을 활성화할 수 있습니다. 바인딩 분석만 주어진된 화합물은 특정 수용 체 클래스를 바인딩할 수 있는 증거를 제공할 수 있습니다. 생체 외에서 세포 막과 분석 선택적 인간의 GABAA α5β3γ2 수용 체 ligands를 식별 하기 위해 사용 됩니다. 인간의 GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2, 및 α3β3γ2 수용 체를 표현 하는 정도 transfected HEK293 세포는 이러한 분석에 대 한 막 준비 하는 데 사용 됩니다. ligands의 효과 [3H] flumazenil 막 수용 체 [3H] flumazenil 바인딩 (억제)에 바인딩된의 섬광을 측정 하 여 검출 된다. 이 기술의 주요 장점은 관심의 수용 체에서 화합물 바인딩 선호도의 신속 하 고 효율적인 결정 관심의 수용 체에서 제공 됩니다.
기능 연구는 화합물의 기능 활동을 평가 하 고 수용 체 화합물의 바인딩에 의해 발생 메커니즘의 생리 및 약리 설명을 제안 필수적입니다. 오늘, 그것은 잘 인식 기능 GABAA 수용 체 이온 기 공 및 5 개의 동일한 소 단위의 어셈블리에서 결과 의해 형성 하는 pseudosymmetry의 한 축을 5 subunits의 어셈블리에서 유래. GABAA 수용 체의 대부분 두 개 이상의 다른 소 단위 구성 됩니다. 주요 뇌 GABAA 수용 체, 예를 들어, 구성 된다 2, 2, 1의 산출할에서 α1, β2, 및 γ2 소 단위 각각5,6. Xenopus oocytes 또는 HEK293 세포 같은 호스트 시스템에 재구성 빠르게 수용 체의 약리학 적인 속성을 탐구의 가능성을 제공 합니다.
화합물의 약리 속성 다음 뇌 조각7에 extracellular 녹음으로 탐구 된다. 이 방법은 neurotransmission에 화합물의 효과의 탐사를 허용 하며 전체에서 네이티브 수용 체의 수준에서 분리 식 시스템에서 결정 하는 화합물의 기능 효과 확인 하는 효과적인 방법 신경 환경입니다. GABAergic neurotransmission 금지 postsynaptic 전류 (Ipsc)8에 화합물의 효과 측정 하 여 분자 수준에서 평가 될 수 있습니다. 그러나 여기에 사용 되 고 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 기록에 따라 프로토콜 더 정교 하 고 낮은 처리량 생성.
마지막으로, 강점과 약점은 생체 외에서 α5β3γ2 선택 ligands의 식별을 위해 사용 하는 캐스케이드 차단의 다른 기술 그리고 그들의 본질적인 한계의 관점에서 설명 되어 있습니다. 이 작품은 전문가 비-전문가 도움이 검토 다른 시험관에 접근의 조합의 태 클이 ligand 문을 단 이온 채널의 새로운 변조기의 발견 하는 데 사용 하는 GABAA 수용 체의 분야에서 제공 해야 합니다.
Protocol
Xenopus laevis 보관 되어 있으며 제네바 구획 동물 지침에 따라 처리 됩니다.
1. Radioligand 바인딩
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분석 결과 접시의 준비
- 5mm KCl, 1.25 m m CaCl2, 1.25 m m MgCl2, 120 mM NaCl, 그리고 15 mM Tris; 분석 결과 버퍼의 1.5 L를 준비 HCl로 pH 7.4에 조정 합니다.
- (예를 들어, microcentrifuge 튜브에 980 µ L 분석 결과 버퍼에 10 mM에서 복합 5 µ L) 50.76 µ M에서 테스트할 화합물을 준비 합니다. 잘 사용 하 여 그들 소용돌이 기계 고속 2-5에 대 한 믹스.
- 화합물 (10 mM)의 pipetting 1 µ L에 의해 분석 결과 버퍼의 1970 µ L 참조 복합 flumazenil의 사전 희석을 준비 합니다. 잘 사용 하 여 그들 소용돌이 기계 고속 2-5에 대 한 믹스.
- 4 4 ° C에서 분석 결과 버퍼 [3H] flumazenil 재고 솔루션을 희석 50ml 폴 리 프로필 렌 튜브에 nM.
- 피펫으로 50 µ L/1, 3-11의 96-잘 microplate 접시 레이아웃 그림 2에서 같이 열으로 분석 결과 버퍼의 음.
- 플라스틱 50.76 µ M에서 희석 하는 화합물의 73.2 µ L (단계 1.1.2 참조) 접시의 열 12에.
- 9 단계를 통해 기하학적 진행을 사용 하 여 각 화합물을 희석 (1E-10 -1E-06 M), 23.12 µ L 전송 볼륨 및 채우기 열 3-11. 철저 하 게 혼합 희석. 모든 희석 후 끝을 변경 합니다.
-
세포 막 희석
- 이전는 HEK293 overexpressing 인간의 GABAA 수용 체에서 분리 된 세포 막을 녹여 (0.025-0.15 mg/mL) 실 온 (RT)에서 80 mL 4 ° c.에 분석 결과 버퍼에 정지를 전송 하
- 10000-12000 rpm에서 30-40 s 조직 균질 화기와 4 ° C에서 여전히 막 솔루션을 resuspend.
-
다이아 제 팜 비 특정 바인딩 (NSB) 제어에 대 한 희석
- 4 m m 다이아 제 팜 5 ml에서 40 µ M의 농도를 분석 결과 버퍼 재고 솔루션을 희석.
-
반응 시작
- 4 nM [3H] flumazenil의 50 µ L 96 잘 접시의 각 음에 플라스틱 하 고 얼음 물 용기에 그것을 유지.
- GABAA 수용 체 하위 막 준비 0.5 mg/mL의 단백질 농도를 100 µ L를 추가 합니다.
- 50 µ L 40 µ M 다이아 제 팜의 열 2에 플라스틱.
- 얼음에 1 시간을 위한 접시를 품 어.
- 이후 막 분리 및 방사능 측정을 위한 96-잘 필터 플레이트의 각 잘에서 분석 결과 버퍼의 50 µ L을 추가 하 고 나중에 반응을 중지.
-
반응을 중지합니다
- 50 mM Tris HCl, pH 7.4와 세척 버퍼를 준비 합니다.
- 96-잘 셀 수확기를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. 3 접시를 씻고 잘 당 차가운 세척 버퍼의 300 µ L x.
- 플라스틱 필름으로 접시의 바닥을 밀봉 하 고 섬광 액체에 대 한 칵테일의 40 µ L 추가 섬광 각 계산 잘 하 고 70% 에탄올으로 그것을 닦아.
- 실시간에서 적어도 1 시간에 대 한 접시를 부드럽게 흔들어 그것은 실시간에 적어도 다른 시간 동안 서 보자
- 섬광 카운터에 접시를 두어서 (CPM)에서 방사능을 측정 합니다. 잘 당 3 분에 대 한 측정을 허용 합니다.
-
데이터 분석
- 8에 대 한 평균 비 특정 바인딩 (NSB)과 총 바인딩 (TB) 또한 중복 또는 샘플의 triplicates의 복제를 확인 합니다. 다음 식에 따라 각 샘플의 평균에 대 한 % 특정 바인딩 (SB)을 계산.
여기,
총 SB NSB 의미뺀 평균 TB =. - 억제제 농도 abscissa %SB 대 누진에 플롯 합니다. 단일 사이트 경쟁 분석 방정식을 사용 하 여 데이터를 맞춤:
여기,
y = SB, %
A = y, 최소
B = y, 최대
C = IC50
X = 경쟁 화합물의 농도의 로그10
D = (힐 계수) 곡선의 기울기. - 계산 절반 최대한 억제 농도 (IC50)를 사용 하 여 바인딩 선호도 (기)의 각 막9, 및 [3H]의 농도 [3H] flumazenil 분리 상수 (Kd) 다음 데이터를 사용 하 여 방정식에 따라 분석 결과에서 flumazenil:
- 8에 대 한 평균 비 특정 바인딩 (NSB)과 총 바인딩 (TB) 또한 중복 또는 샘플의 triplicates의 복제를 확인 합니다. 다음 식에 따라 각 샘플의 평균에 대 한 % 특정 바인딩 (SB)을 계산.
2. 수용 체 표현과 Xenopus Oocytes에서 레코딩
- 수확 하는 난소와 oocyte 준비
- 준비와 88 mM NaCl, 1 m KCl m, 2.4 m m NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.82 m m MgSO4.7H2O, 0.33 m m Ca (3)2.4H2O, 0.41 m m CaCl2.6H2O, pH 7.4에 살 균 바르트 솔루션 페니실린, 100 µ g/mL 스 고 암포 b 0.25 µ g/mL의 100 단위/mL으로 보충
- 88.5 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, pH 7.4에서 1 x OR2 매체 (없음 CaCl2)를 준비 합니다.
- 냉각 (150 mg/L, pH 7.4에 조정의 농도)에서 Tricaine methanesulfonate 및 나트륨 중 탄산염 (300 mg/L)에 20 분에 대 한 깊은 마 취에 의해 여성 Xenopus Laevis 잘린 뒤 희생.
- 깨끗 한가 위, 집게와 빠르게 난소를 수확 하 고 배치 2-접시 (10 cm)에 바스 솔루션 및 항생제/antimycotic x 1의 40 mL로 가득.
- 4 ° c.에 바스 솔루션에서 최대 2 주 동안 비 해리 난소를 저장
- 분리, 작은 분수 (1-2 cm3)에 깨끗 한 면도날으로 난소를 잘라 고 CaCl2 (OR2-noCaCl2) 없이 OR2 매체의 50 mL에 0.2% 콜라를 포함 하는 그들을 품 어 (유형 I) 100 mL 회전자에 17-19 ° c 4-5 헤 마그네틱 바는 확인에 대 한 느린 동요와 플라스 크는 oocytes 분쇄 피하기 위해 회전자 술병의 바닥 위에 약 3-5 cm 배치.
- Oocytes는의 대부분이 그들의 뿌리에서 해제 확인 후 4-5 h (즉, 그들은 주위에 수영 개별적으로). 그들을 세척 5 x 1.8 m m CaCl2보충 OR2의 200 mL와 함께.
- 전송 defolliculated-접시 (10 cm)에 oocytes 바르트 솔루션 및 항생제/antimycotics 채워지고 적어도 하룻밤 cDNA 또는 mRNA 주입 전에 17 ° C에서 그들을 유지.
- 다음 하루 선택, 쌍안경, 건강 oocyte는 명확 하 고 뚜렷한 동물 대 식물성 극 (식물성 극에 대 한 밝은 노란색 대 동물 극에 대 한 짙은 갈색) 제시 아래. 깨끗 한 파스퇴르 펫을 사용 하 고 살 균 원뿔 주입 96 잘 접시에 하나 하나 oocytes를 처분.
참고: mRNA 주사; oocytes의 배치에 특별 한 관심 필요 반면, cDNA 주사는 oocytes 위 동물 극 방향에 없어서는 아니다.
- mRNA 또는 cDNA 자동 주입
- 권장된 지침에 따라 상용 키트를 사용 하 여 mRNAs를 음성 합성. 악기와 RNase와 테이블을 청소 하 고 적절 한 보호 장갑을 착용.
참고:는 mRNA의 품질 좋은 식 수익률 결정 이며 주입 절차 동안 mRNA 저하를 방지 하기 위해 불가결 이다. - CDNAs 상용 키트를 사용 하 여 준비 하 고 0.2 µ g / µ L의 농도에서 bidistilled 물에 원하는 금액을 디졸브.
- 0.02-0.2에서 배열 하는 농도에서 cDNA 솔루션의 0.2 µ g / µ L, 또는 10 nL의 농도에 mRNA 솔루션의 10-50 nL 주사 µ g / µ L, 95 oocytes의 일괄 처리에 좋습니다.
- 막에 대 한 여러 소 단위 (즉, heteromeric α1β2γ2 GABAA 수용 체), 필요한 단백질 혼합 해당 mRNAs 또는 cDNAs 원하는 비율에 (즉, 1:1:1 또는 1시 10분: 1).
- oocyte oocytes;에 의해 열 충격 단백질의 표현을 방지 하 17 ° C에서 유지 미 판 온도 제어 저장 영역에 저장 합니다.
- OR2 바인딩 분석 결과 0.1-1000에 긍정적인 테스트는 테스트 화합물 분해 electrophysiological 녹음을 위한 µ M 96 잘 플랫 바닥 폴 리 프로필 렌 플레이트에 떨어져 그들을 처분.
- 권장된 지침에 따라 상용 키트를 사용 하 여 mRNAs를 음성 합성. 악기와 RNase와 테이블을 청소 하 고 적절 한 보호 장갑을 착용.
- 식에 대 한 플라스 미드
- 세균성 T7 또는 T6 promotors와 mRNA 합성에 대 한 상용 키트의 사용 설명서에 따라 고 솔루션의 20 µ L에서 0.2 µ g / µ L RNase 무료 물에.
- 20 µ L 일반적으로 0.2 µ g / µ L bidistilled 물에 용 해에 cDNA 식에 대 한 진핵생물 식 벡터를 포함 하는 솔루션의 준비.
- Oocyte의 품질의 시각화에 microinjection
- 플라스 미드를 포함 하는 솔루션의 10-50 nL 주사 (단계 2.3.1 또는 2.3.2 참조) micromanipulator 압력 방출 시스템 또는 자동된 주입 시스템을 장비에 장착 팁 직경 최대 100 µ m에 이르는 유리 마이크로 주입 바늘을 사용 하 여.
참고: 여기서 설명 하는 예제에 oocytes 95 cDNA 또는 mRNA와 함께 사용 하기 위해 적합 한 자동화 시스템의 배치에 의해 주입 됩니다. - 1% 메 틸 렌 블루 등 염료의 1 µ L로 주입 바늘을 oocytes (cDNA에 대 한 핵 또는 세포질 mRNA에 대 한) 표준 절차를 사용 하 여 주입.
- 끓는 물에 약 1 분 동안 주입 된 oocytes를 삭제 합니다. oocytes는 눈 아래 면도날으로 반으로 잘라.
참고: 염료 그림 3E, 주사의 정확한 관찰을 수 있도록 지역화 된 남아 있습니다.
- 플라스 미드를 포함 하는 솔루션의 10-50 nL 주사 (단계 2.3.1 또는 2.3.2 참조) micromanipulator 압력 방출 시스템 또는 자동된 주입 시스템을 장비에 장착 팁 직경 최대 100 µ m에 이르는 유리 마이크로 주입 바늘을 사용 하 여.
- 2 전극 전압 클램프 녹음
- 그림 4에 나와 있는 원칙을 사용 하 여 자동화 시스템에 oocytes를 포함 하는 잘 접시를 놓습니다.
참고: 그림 5에 나와 있는 패치 클램프 시스템 달리 셀의 진정한 막 잠재력은 읽을 전압 전극. - 예를 들어 그림 6 에 나와 있는 농도 활동 관계의 결정에 대 한 체계와 아이콘 기반 인터페이스를 사용 하 여 자동된 기록 시스템 프로그램.
- 그림 4에 나와 있는 원칙을 사용 하 여 자동화 시스템에 oocytes를 포함 하는 잘 접시를 놓습니다.
- 커브 피팅
- 그림된 농도 활성화 곡선을 사용 하 여 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석, 주 작동 근 농도의 로그값의 기능으로 현재 진폭을 플롯 합니다.
- 장착 하실 수 있습니다 이후에 경험적 힐 방정식 형태로 자형 곡선 관찰:
여기,
Y= 갖는 전류, 분수
EC 50 = 50% 정품 인증에 대 한 농도
x 는 화합물의 농도 =
nH = 힐 계수 또는 명백한 cooperativity. - 각 응답 대 값 셀의 시리즈에서 얻은 데이터를 분석 하는 가장 높은 농도에서 기록의 진폭을 분할 하 여 화합에 전류를 정상화.
- 평균 및 표준 오류를 확인 하 고 실현 standardly 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 커브 피팅.
3. electrophysiological 녹음 뇌 조각
참고: Hippocampal 쥐 조각 국가 및 기관 지침에 따라 준비가 되어있습니다.
-
해 마 조각의 준비
- 준비와 124 m NaCl 124 m, 2.5 m m KCl, 1.25 m m KH2포4, 2mm MgSO4.7H2O, 2.5 m m CaCl2 2 H2O, 26mm NaHCO3, 포도 당 10 m m, 4 m m 절 개 인공 세리 척추 유체 (dACSF) 자당 95% O2 , 5% CO2의 혼합물과 병에 기름.
- 준비와 124 mM NaCl, 5mm KCl, 1.25 m m KH2포4, 2mm MgSO4.7H2O, 2.5 m m CaCl2 2 H2O, 25mm NaHCO3, 10 mM 포도 당 기록 인공 세리 척추 유체 (rACSF) 95% O2 , 5% CO2의 혼합물과 병에 기름.
- 2.5 %isoflurane 순수한 산소의 혼합물을 사용 하 여 쥐를 anesthetize 하 고 그들을 목을 벨.
- 가 위의 좋은 쌍 중간 선 다음 두 피를 잘라. 기본 조직 손상 없이 중간 선 따라 두개골을 잘라. 핀셋으로 두개골을 제거 하 고 정밀한 주걱을 사용 하 여 푸 두뇌 다.
- RT에 기름된 dACSF 솔루션에 두뇌를 놓고 잘 주걱으로 왼쪽된 hippocampal 형성을 해 부 합니다.
- 조직 헬기와 해 마의 중간 부분에서 가로 분할 영역 (400 µ m 두께)을 잘라내어 그림 브러시를 사용 하 여 녹음 실로 그들을 전송. 45 분에 대 한 실시간에 슬라이스를 유지 합니다.
- 35 ° C에서 기름된 rACSF와 조각 perfuse 그리고 1.5 mL/분의 속도로 거품 95% O2 , 5% CO2의 혼합물으로 솔루션.
참고:이 단계를 후 슬라이스 electrophysiological 실험 준비 되어 있다.
-
단일 인구 스파이크 녹음
- 현미경 실장 챔버로 두뇌 슬라이스를 놓습니다.
- RACSF와 3 mL/min의 속도로 조각 perfuse
- ~ 2 m ω의 저항을 데 피 펫 끌어당기는 사람와 붕 규 산 유리 제 micropipette를 당겨.
참고:이 micropipette 기록 전극으로 사용 되 고 전기적으로 증폭기에 연결. - 2 M NaCl을 포함 하는 솔루션으로는 micropipette와 앰프의 피 펫 홀더에 놓습니다.
- 위치 기록 micropipette 지층 pyramidale CA1 지역에서 사용 하 여 오른쪽 micromanipulator hippocampal 조각의.
참고: 위치 개요로 그림 7에 표시 됩니다. - 절연된 바이 폴라 백 금/이리듐 전극을 홀더 왼쪽된 micromanipulator에 넣으십시오.
참고:이 전극 자극 전극으로 사용 되 고 전기 자극 발생기에 연결 된. - 자극 전극 CA1 영역의 Schaffer 민간인에의 위치 사용 하 여 오른쪽 micromanipulator hippocampal 슬라이스입니다.
참고: 위치 개요로 그림 7에 표시 됩니다. - 모든 30 자극 발생기를 사용 하 여 자극 전극에 전류 펄스를 전달 s (100 µs 기간, 10 µ A에서 시작) 인구 스파이크 (PS)이 나타날 때까지 자극 강도 점차적으로 증가 하 고.
- 얻을 수 있는 최대 진폭의 45%에 해당 하는 PS를 보여주고 자극 강도 조정 합니다. PSs는 2.4 KHz에서 필터링 및 신호 증폭기를 사용 하 여 20 KHz에서 디지털화.
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짝 펄스 억제
- 뇌 조각 (3.1 단계)를 준비 하 고 앞에서 설명한 진행 (단계 3.2.1–3.2.7).
- 모든 30 자극 전극에 2 개의 전류 펄스 (100 µs 기간 20 ms 간격) 전달 자극 발생기를 사용 하 여 s. 최대 진폭의 45%에 해당 하는 PS를 연상을 자극 강도 설정 합니다.
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테스트 컴파운드
- 기름된 실제에서 테스트 하는 화합물의 희석 하 게 되도록 하지 0.1% 보다 높은 DMSO의 최종 농도.
- 복합 솔루션에서 보다 동일한 농도에서 제어 솔루션에 DMSO를 추가 합니다.
- (3.2 단계) 단일 기록 또는 쌍 펄스 (단계 3.3) PS Schaffer 부수적인 stimulations에 의해 갖는 모든 30 적어도 30 분에 대 한 s. PS 모양이 기준 기간 동안 안정 되어야 합니다.
- 기름된 rACSF 포함 테스트할 화합물의 농도 고정된으로 비 커를 준비 합니다.
- 여전히 단일 또는 펄스 쌍 추를 기록 하는 동안이 솔루션으로 hippocampal 조각 perfuse
- Perfusing 화합물 없이 기름된 rACSF와 슬라이스 하 여 복합 효과에서 복구를 평가 합니다.
참고: 가역 효과, PS 복합 응용 프로그램 전에 초기 기간 동안 관찰의 초기 모양에 되돌립니다.
-
데이터 분석
- 평균 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 4의 블록에 실험 동안 PS 추적 기록.
- 평균된 추적의 PS 진폭을 측정 합니다.
- 화합물을 perfusing 하기 전에 10 분을 기록 하는 초기 계획 값의 백분율은 진폭을 정상화.
- ± SEM. 의미는 데이터를 표현
Representative Results
바인딩:
세포 막과 생체 외에서 분석 결과 선택적 인간의 GABAA α5β3γ2 수용 체 ligands BZD allosteric 사이트는 γ2의 포함 하는 수용 체에 바인딩를 식별 하는 데 사용 됩니다. 인간의 GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2, 및 α3β3γ2 수용 체를 표현 하는 정도 transfected HEK293 세포는 세포 막이 분석이 결과 대 한 준비 하는 데 사용 됩니다. 잠재적인 ligands의 효과 [3H] flumazenil 막 수용 체 [3H] flumazenil 바인딩 (억제)에 바인딩된의 섬광을 측정 하 여 검출 된다. 변위 바인딩 곡선 다음 RO4938581와 같이 특정 GABAA 수용 체에 대 한 화합물의 선택도 평가 하기 위해 생성 됩니다 (그림 8). 그림 9 는 바인딩 분석 결과 사용 하 여 생성 된 α5 선택적인 GABAA 수용 체 부정적인 allosteric 변조기, RO49385819, 등 여러 가지 기준 화합물의 프로필을 요약 합니다.
에 녹음 Xenopus oocytes:
GABAA 수용 체 α5β3γ2 heteromer 등의 식 GABA 노출에 대 한 응답에 강력한 전류를 생성합니다. 일반 전압 클램프 녹음 간단한 GABA 펄스 응답에 인간 α5β3γ2를 표현 하는 oocyte에서 얻은 (30 s) 최대 300 µ M에 이르는 그림 6에 표시 됩니다. 이 실험에서 GABA의 다른 농도 96 잘 접시에 삭제 했다 고 응답 했다 특정 우물에서 셀을 이동 하 여 불러 일으켰다. GABA는 중앙 관류 챔버에 셀을 반환 하 고 해당 연동 펌프를 활성화 하 여 제어 솔루션의 관류를 적용 하 여 철저 하 게 세척 된다. 농도 활성화 곡선의 결심을 위해 사용 하는 프로그램 순서는 그림 6에나와 있습니다. 이러한 데이터 Xenopus oocytes에서 얻을 수 있는 녹음의 품질을 모두 설명 완전 자동으로 실시, 그리고 수용 체 식의 높은 수준의 mRNA 주입 후 몇 일. 다른 수용 체 조합에서 실시 한 실험 EC50s, GABA 수용 체의 절반을 활성화 하는 데 필요한 농도의 일련을 얻을. 거미 그래프에 EC50의 값의 그림 10에서 같은 제공 한다 수용 체 속성의 빠른 비교 및 소 단위 구성의 영향.
음수 또는 양수 allosteric 변조기 (남 또는 PAM)의 효과 검사 하는 주 작동 근 (GABA) 테스트 펄스, 컨트롤에 처음 및 변조기의 존재에 의해 되 살려 진 응답을 비교할 필요가 있다. 이러한 실험을 수행 하는 효율적인 실험 프로토콜은 그림 11에 나와 있습니다. GABA의 농도 참조 하는 셀의 응답 먼저 결정 하 고 시퀀스 같은 GABA 농도 적용 하 여 그리고 GABA 변조기의 공동 응용 프로그램에서 반복 됩니다. 두 겹쳐 응답의 표시 금지를 변조기의 존재에 의해 발생이 예제에서 보여준다. 변조기 효과의 정량화는 쉽게 응답의 비율 갖는 대 변조기의 존재는 컨트롤 및 결과 열 음모의 형태로 그릴 수 있습니다 계산 함으로써 얻어진 다. 그림 12 에 표시 된 데이터 96 화합물에 대 한 취득 세 데이터 세트의 녹음에 해당 하는 열 줄거리 설명.
충분히 활성 화합물의 식별에 따라 그것은 종종 이러한 분자는 다른 수용 체 조합에 활성화 하는 경우 평가에 불가결. GABAA 수용 체의 경우 다른 소 단위에 대 한 인코딩 19 유전자 확인 되었습니다, 그리고 기능 수용 체의 다른 소 단위 (Knoflach, 에르난데스, 그리고 베르트 랑10 에 대 한 참조는 multimeric 어셈블리에서 발생할 수 있습니다 알려져 있다 검토)입니다. 여러 소 단위 및 조합 수익률 수용 체의 광대 한 레 퍼 토리 subtypes을 비록 많은 카운터 심사를 수행 해야 할 수도 있습니다, 그것은 종종 초점 수 처음에 GABAA의 경우 가장 풍부한 subtype, 수용 체, α1β2γ2 구성입니다. 머리에의 식을 실시 하는 실험을 예를 들어 α5β3γ2 및 α1β2γ2 oocyte의 동일한 배치에서 얻이 주어진된 분자의 각 효과의 좋은 비교. Α5β3γ2 및 α1β2γ2에 대 한 세 개의 셀에 얻은 전형적인 결과 그림 13, α5β3γ2에서 1 분자의 우선 긍정적인 변조를 설명에 표시 됩니다.
그림 11 에 나와 있는 실험 프로토콜은 팸 활동 특성에 대 한 적합 합니다. 이 프로토콜에서 테스트 화합물 농도 점차적으로 증가에 주 작동 근으로 공동 적용입니다. 같은 셀에 여러 응용 프로그램에서 발생 가능한 누적 효과 피하기 위해, 새롭고 순 셀은 각 데이터 요소에 대 한 측정 됩니다. 응답의 진폭 측정 혼자 주 작동 근으로 기록 하 고 복합 응용 프로그램 중 팸 또는 남 효과 수량화 하는 비율을 생성 합니다. Α1β2γ2 다이아 제 팜에 대 한 α5β3γ2에서 얻은 전형적인 결과이 수용 체 결합에 약 10 배 높은 α5β3γ2의 명백한 감도 공개 그림 14에 표시 됩니다. 이 값은 게시 된 데이터11좋은 상관 관계입니다. 다이아 사이트는 γ2와 그것의 인접 한 α 소 단위12-14사이의 인터페이스에 의해 구성 되 고 생각으로 α5β3γ2의 감도 γ2 α1 통해 γ2 α5에 대 한 특혜 다이아 제 팜 선호도 제안 합니다. 효율적인 기능 묘사와 결합 하는 다른 수용 체 조합을 표현 가능성 팸 속성 및 생리 및 약리 효과 대 한 그들의 의미의 결정을 탐구 하는 여러 가지 방법으로 열립니다.
Hippocampal 뇌 조각:
실험 쥐 hippocampal 두뇌 분할 영역을 네이티브 수용 체 모델에서 생체 외에서 분석에서 확인 된 화합물의 약리 프로 파일을 확인 하기 위해 수행 됩니다. 해 마의 피라미드 세포에 표현 하는 주된 GABAA 수용 체 하위 α1β2/3γ2, α2β2/3γ2, 및 α5β2/3γ2, 모든 다이아 (BDZs)15에 의해 조절 되는 있습니다. 짝 펄스 저해 hippocampal 회로 흥분 전달 20 ms 떨어져 두 짝된 전기 자극의 두 번째의 응답에는 변화를 테스트 하 여 밝힐 수 있는 패러다임 이다. 두 번째 응답의 변화 수 innervating 피라미드 셀 레이어16-18에 의해 GABAergic 피드백 때문 이다. 컨트롤 상황에 그림 7에서 같이 두 짝된 자극의 두 번째 응답은 GABAergic 저해 때문 저해 됩니다. 이 저해 β-CCM으로 슬라이스를 perfusing에 의해 감소 된다 때 선택적 비 남, 두 짝된 자극의 두 번째 응답은 훨씬 덜 정도로 저해 됩니다. 이 실험적인 패러다임 α5 소 단위를 포함 하는 GABAA 수용 체에 대 한 선택적 화합물에 과민 하다.
그림 1 : 전략 스크리닝. 전형적인 마약 검사 통로 화합물의 대형 라이브러리 특정 대상에 대 한 검사는 높은 처리량 검열으로 시작 합니다. 리드 후보자의 식별에 따라의 약 화학의 작업 시작합니다. 이 단계 동안, 화학자 연구 되며 분자 수정 대상 선택, 뇌 penetrance, 안정성, 저하 등 이 중요 한 단계 중 원하는 조건에 맞게 구조 수정 수행 하 여 그것은 필수 화학 수정 분자 속성을 변경 하지 않은 여부를 평가 하 고 가장 적합 한 후보에 대 한 수정. 다음 단계를 식별 하는 하지만 기능 시험 칼슘 형광을 포함 하 여 다른 방법으로 등 노트는 전기 생리학 표시 됩니다 몇 가지 유망한 화합물 및 안전, 허용 오차, 포함 하는 다음 단계에 그들을 분석 실험 또는 전압 민감한 염료, 대신 사용할 수 있습니다. 이러한 후자 메서드는 또한 바인딩 분석 실험에 대 한 대체로 높은 처리량 분석에 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 96-잘의 레이아웃 도금 실험 바인딩 활용. 열 1은 총 바인딩 측정 및 열 2 비 특정 바인딩 측정에 사용 됩니다. 행 A-H 농도 (열 3-12), 증가에서 4 다른 화합물과 중복에 각 화합물 가득 차 있습니다 (즉, 복합 1 행 A와 E, 복합 2 행 B와 F, 등) 다른 색상으로 레이아웃에 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 자동된 시스템을 사용 하 여 microinjection. (A) A 정확한 XYZ 시스템, 어떤 관심, 플라스 미드를 포함 하는 액체 채워진 유리 주사 바늘은 자동으로 찌 르고는 oocytes에. (B)이이 패널 96 잘 원뿔-바닥판 oocytes는 자동으로 주입 하는 (C)에서 보여줍니다. (D)이이 패널 사출 원리를 보여 줍니다. 핵 주입 바늘 패널 B에서 같이 oocyte는 핵 보다 약간 더 깊은 침투. 다음, 바늘 핵에서 인출 됩니다 (참조 패널 C) 주입 하기 전에 (패널 D참조). (E) 주사, 바늘의 품질을 평가 하는 염료로 채워질 수 있다 그리고 "요리" oocytes 반으로 삭감 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 자동된 두 전압 클램프 전극 원리. 원리는 관류에 액체를 적용 보다는 오히려 우물 사이 이동 하는 준비를 기반으로 합니다. (A) 패널의 왼쪽 두 개의 전극과 하나의 샘플에서 운동 하는 동안 준비 주위 액체 작은 물방울을 유지할 것 이다 작은 바구니 Xenopus oocyte에서 기록 수 있도록 배치를 나타냅니다 다른. 두 개의 전극 가진 바구니에 oocyte의 그림은 오른쪽에 표시 됩니다. (B)이이 패널 표시는 "거꾸로" 전기 생리학 기록 원리 도식 표현 합니다. (C)이이 패널 기록 테이블에 oocyte, 복합 플레이트, 그리고 세척 역의 처리를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 2 전극 전압 클램프 대 패치 클램프 기록. 일반 2 전극 전압 클램프 oocytes (왼쪽된 패널)에 대 한 기록 셀 선 (오른쪽 패널)에 대 한 사용 하는 패치 클램프 구성을 비교 합니다. Oocytes는 약 1 m m 대 직경 약 20 µ m는 세포 크기에서 차이 note 2 전극 전압 클램프는 oocyte의 막 잠재력 원하는 지주 전압에 비해 고 신호 차이 현재 전극에 주입. 패치 클램프 기록에서 패치 클램프 전극의 저항은 무시할 수 대 막 저항 및 그러므로, 전압 증폭기에 의해 부과 된 충실 하 게 먹이로 세포 막19가정. 그림에서는 액체 필 라 멘 트 관류를는 세타 튜브 ()의 두 채널이 가득, 한 손으로, 제어 솔루션와 함께, 다른 한편으로, 약20,21을 포함 하는 솔루션을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 인간 α5β3γ2 수용 체에 농도 활성화 관계. (A) 시퀀스 제어 자동된 시스템은 일련의 아이콘으로 구성 되 고 농도 활성화 관계의 결정에 대 한 실험 프로토콜을 설정 합니다. 1-3 단계에서이 패널에 표시 된 대로 시스템 로드는 oocyte 접시에서 측정 바구니에. 누출 전류는 2 단계에서 측정 되 고,이 값 초과할 수 원하는 조건, 셀은 자동으로 변경 (3 단계). 안정화 기간 (4 단계), oocyte 응답 GABA 농도 기준으로 측정된 (5-8 단계)입니다. Oocytes 전류 1 µ A 보다 큰 표시는 후속 측정에 대 한 유지 됩니다. 단계 11-13에 셀은 GABAA 의 다른 농도 의해 전하고 농도 (14 단계) 원하는 수에 대 한 자체 및 셀 (15 단계)를 반복 하는 과정. (B)이이 패널 표시 간단한 GABA 응용 프로그램의 시리즈에 의해 갖는 전형적인 전류 (30 s) 성장 하는 순서에 적용. 복합 응용 프로그램의 타이밍 막대 표시 됩니다. (C) A 음모의 GABA 농도의 로그값의 기능으로 피크 안쪽으로 전류 생성 농도 활성화 곡선을 경험적 힐 방정식, 연속 곡선, 약 11 µ M에서 EC50 와 언덕으로 쉽게 장착 1.3의 계수입니다. 8 셀에 기록 된 전류 최대한 갖는 응답에 대 한 통일을 정규화 되었다. 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : Β-CCM, GABAA 남 hippocampal 조각에서 쌍 펄스 억제 감소. (A)이이 패널 쥐 hippocampal 슬라이스 표시 도식. CA1 피라미드 뉴런의 수지상 arborization에 CA3 피라미드 셀 axons 프로젝트에서 발생 하는 Schaffer 민간인 (Sch C). Micropipettes 필드 흥분 성의 postsynaptic 전위 (epsp)의 수지상 녹음에 대 한 지층 radiatum (str radiatum)와 인구 스파이크 (PS)을 기록 하는 지층 pyramidale (str pyramidale)에 배치 했다. 자극 전극 Schaffer 민간인에 배치 했다. (B)이이 패널 PSs 20ms 간격에 동일한 자극 전극을 통해 적용 하는 쌍된 자극에 의해 evoked 보여줍니다. 첫 번째 자극 (PS1)에 대 한 응답의 그것 보다 작은 진폭의 두 번째 자극 (PS2)에 인구 응답이입니다. (C) PSs 부재 (검은 막대)와 β-CCM, 비 선택적인 GABAA 수용 체 남 (녹색 막대)의 존재에 기록 되었다. Β-CCM 어떤 피드 포워드 GABAergic 저해를 부분적으로 차단 하 여 두 번째 p s 2의 진폭을 향상. 막대 뜻의 표준 오류를 표시 하 고 * * * 데이터는 매우 중요 한 p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 일반적인 바인딩 결과 경쟁 저해 (변위) 분석 결과 얻은. 변위 바인딩 커브는 IC50 여 기 수를 확인할 수에서 생성 됩니다. 배 수량 radioligand의 특정 바인딩의 50%는 경쟁 ligand의 농도 IC50 기 (약물에 대 한 저해 상수) 이며 어떤 경우 아무 radioligand 수용 체의 50%를 차지할 것이 경쟁 ligand의 농도 참석 했다입니다. 기 IC50 쳉-Prusoff 방정식을 사용 하 여 계산 됩니다.
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그림 9 : 경쟁 변위 바인딩 ligands 주요 GABAA 수용 체 하위에 바인딩 수행 했다. HEK293 세포에서 세포 막 뚜렷이 다른 인간의 GABAA 수용 체 소 단위 조합으로 페 및 선호도 (nM) [3H] flumazenil 바인딩 분석 결과 사용 하 여 측정 했다. 히스토그램 표시는 명확 하 게 α5β3γ2 수용 체에 최저 기와 복합 RO493851에 대 한 관찰 차동 감도를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10 : 차동 GABA 수용 체의 감도. 상 상속 소 단위 구성의 표현 및 수용 체는 GABA EC50 거미에의 다른 소 단위의 역할을 비교 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 참고 γ2 subunits의 소개는 수용 체 민감도 감소와 관련 된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11 : 프로브는 변조기의 효과. (A)이이 패널은 자동화 시스템을 제어 하기 위한 사용 하는 아이콘 순서를 보여 줍니다. 2 개의 (A/D) 아이콘 (녹색) 제어 및 변조기 노출 (레드) 동안 기록에 해당 note. (B)이이 패널 같은 시퀀스 동안 GABAA 수용 체를 표현 하는 셀에 기록 하는 전형적인 전류를 표시 합니다. 변조기의 효과 평가 하려면 먼저 다음 GABA를 변조기 (빨간 추적), GABA를 먼저 노출 뒤 GABA (녹색 추적)의 고정된 농도에 노출에 의해 evoked 응답 측정의 순서 실시 했다. 측정, 구분 (하늘색과 파란색) 십자형 커서를 위치 하 고 블루 크로스 두 녹음 조건 최대한 차이 나타냅니다. 제어 및 변조기 조건 사이의 비율 분석 소프트웨어에서 자동으로 계산 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 12 : 3 개의 복제 된 열 작. 이 패널은 인간 α5β3γ2 GABAA 수용 체에 96 화합물에 대 한 얻은 변조기 효과의 3 개의 복제를 해당 열 음모를 보여줍니다. 0.5와 1.2 까지인 컨트롤 테스트 응답의 비율 크게 다르지 않은 컨트롤으로 여겨졌다 고 녹색 점이 표시 됩니다. 0.5 아래 비율 억제 효과 나타내는으로 여겨졌다 고 파란색 점으로 표시 됩니다. 1.2 위 비율 응답 향상으로 여겨졌다 고 빨간색 점으로 표시 됩니다. 3 개의 독립적인 기록 사이 패턴의 외모 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 13 : Α1β2γ2에서 심사 카운터. (A)이이 패널 상 상속 소 단위 조직의 표시를 표시 합니다. 다음 패널의 GABA의 유사한 농도 유사한 농도 (100 µ M)를 사용 하 여 α1β2γ2에 인간 α5β3γ2 (F-H)에 긍정적인 allosteric 변조기의 효과의 평가 (B-D)를 표시 합니다 변조기, 화합물의 특이성을 강조 이러한 실험에서 테스트. (E)이이 패널은 또한 상 상속 소 단위 조직에 대 한 표현을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 14 : 팸 감도 및 수용 체 구성. 다이아 제 팜 효과 (A-D) α1β2γ2 및 (전자-H)에서 농도의 일련의 효과 결정 α5β3γ2 수용 체 명백한 선호도에 거의 10 차이 보여준다. Note 또한 α1β2γ2 수용 체에 빠른 둔감과 응답 시간 과정에 소 단위 구성의 영향 (참조, 예를 들어 패널 D 와 H). α1β2γ2로 유의 및 α5β3γ2 GABA 수용 체 디스플레이 다른 선호도 (또한 그림 10참조), 사이 비교 활성화 범위에 있을 두 수용 체 주 작동 근의 농도 조정 되었습니다. (I)이이 패널 음모를 나타냅니다 배의 현재 진폭에 증가 정규화 화합 대 제어 상태. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 15 : T 7과 CMV promotor를 포함 한 식 플라스 미드. 이러한 패널 표시 식 플라스 미드 Xenopus oocyte (오른쪽 위 패널)에 셀 라인에서. 하단 오른쪽 패널 패치 클램프 기록 전극과 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대 한 유전자를 또한 포함 하는 플라스 미드와 페 전형적인 HEK 293 세포를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
소설 화합물 등 GABAA 수용 체 ligand 문을 단 이온 채널 활성의 개발 여러 방법 사용을 해야합니다. 일반적으로, 첫 번째 단계는 종종 사용 하 여 실시 바인딩 분석; 그러나, 이러한 측정 화합물 또는 그것의 정확한 약리학의 생리 적인 활동을 특성화 하기 위해 충분 하지 않습니다. 특히, 수용 체에 묶는 화합물 수 있습니다 강화의 기능을 억제 또는 아무 기능 효과 (자동 수)를 생산 (즉, 해당 기능을 수정 하지 않고 수용 체에 바인딩). 따라서, 기능 테스트는 전체 복합 특성화에 대 한 필요 합니다.
바인딩 분석:
바인딩 분석 결과의 주요 장점은 그것 수 효율적으로 실시 몇몇 수천까지 샘플의 많은 수와 활성 분자에 대 한 바인딩 선호도 제공 하. 여기에 설명 된 대로 첫 번째 단계는 원하는 수용 체의 평가 방법 구축 이루어져 있다. 즉, 분수 또는 전체 두뇌에서 네이티브 수용 체에 바인딩을 수행할 수 있습니다, 하는 동안 그러한 방법의 특정 수용 체의 하위에 선호도 결정이 되지 것입니다. 그것은, 따라서, 원하는 대상에 화면 분자 재조합 형 시스템을 사용 하는 데 필요한입니다. 요즘, 셀 라인에서 원하는 수용 체 소 단위 cDNAs의 일시적 또는 안정 되어 있는 transfection 관심(, GABAA α5β3γ2)의 수용 체 하위를 표현 하는 효율적이 고 안정적인 방법을 제공 합니다. 전통적인 바인딩 분석 실험을 사용 하지만 요즘 기술은 radioligands의 사용할 수 있는 방사능 (예를 들어, 양적 형광 기반의 ligand 바인딩) 처리의 불편 방지.
호스트 시스템에서 기능 식:
호스트 시스템에서 유전자를 표현 하기 위해 관심사의 코딩 순서는 적절 한 promotors를 포함 하는 플라스 미드에 삽입 되어야 합니다. 일반적으로 mRNA 합성 체 외에 세균성 T7 또는 T6 promotors 사용 된다. CDNA 표현에 대 한 관심사의 유전자의 전사는 CMV (세포) 또는 이와 동등한 등 진핵생물 promotor에 의해 규제 해야 합니다. 요즘, (즉, pUNIV, pCMV 6AC, psf-CMV/T7, pCI-네오, pcDNA), 2 명의 promotors를 포함 하 여 몇 plasmids mRNA의 생체 외에서 합성 또는 cDNA 식 그림 15와 같이 사용할 수 있습니다. 셀 라인 또는 Xenopus oocytes GABAA 수용 체의 식은 충실히 얻어질 수 있다. 후자의 주요 장점은 생 수용 체 식, 조작, 단순 하 고 마이크로 주사 및 기록에 대 한 자동화 된 시스템의 가용성의 부족입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 절차는 약 7 분에 96 oocytes의 주입을 허용 하며 micromanipulation 기술을 자동화 시스템의 효율성을 보여줍니다. Xenopus 에서 단일 난소 10000-30000 oocytes 사이 포함 기억, 그것은 분명 하나의 준비에 셀 측정의 많은 수를 수행할 수 있습니다. 또한, 식 cDNA 주사를 사용 하 여 실시 될 수, 바인딩 실험을 위해 개발 된 관심사의 유전자를 포함 하는 동일한 플라스 미드 사용할 수 있습니다 더 분자 생물학에 대 한 필요 없이 기능적 특성에 대 한 조작입니다.
그 큰 규모와 높은 표면 식을 감안할 때, 단일 oocyte는 약 35 mm 페 트리 접시에에서 confluent 세포 수용 체의 수를 생성 합니다. 그러나, oocytes 준비와 주입 실험 하지 않아도 특정 배양 및 무 균 조작으로 셀 라인의 비용의 일부만을 나타냅니다. GABAA 채널의 활성화 몇 picoamperes (10-12) 및 전류 되 (10-6)의 최대 수만 쉽게 확인의 몇몇 수백만의 부수적인 활동 단일 oocyte에서 기록 하나의 응답 중 수용 체입니다.
Ligand 문을 단 이온 채널의 특성에 첫 번째 단계는 종종 수용 체의 명백한 선호도의 결정입니다. 간단한 주 작동 근 테스트 펄스의 시리즈를 적용 하 고 진폭에서 evoked의 현재 또는, 특정 경우에 주 작동 근 농도의 로그값의 기능으로 (AUC) 곡선 아래의 영역을 계획 실시 하는 실험에 의하여 이루어져 있다. 그것은 쉽게 다른 플라스 미드 농도 및 비율 oocytes의 동일한 배치에서 microinject 가능한, 식의이 시스템은 특히 같은 특성화에 적합 합니다. 또한, 일괄 배치 비교 다른 EC50s에 대 한 안정성의 높은 학위를 밝혔다. 수용 체의 명백한 선호도에 소 단위 구성의 영향 쉽게 그림10에서 exemplified로 거미 플롯을 사용 하 여 시각 이다.
2 전극 전압 클램프 Xenopus oocytes에서 얻은 결과 패치 클램프 전극을 사용 하 여 만든 녹음 종종 비교 된다. 이러한 두 시스템 간의 자세한 비교로가이 작품의 범위를 넘어 갈 것 이라고, 반면 몇 가지 포인트는 시험 될 수 있다. 패치 클램프 셀에서 생물 특성 빠른 약물 응용 프로그램에 대 한 장점을 제공, 그 요구 사항을 Xenopus oocytes에서 두 전극 레코딩 보다 더 복잡 한 있습니다. 첫 번째 비 사소한 어려움을 세포 배양, 과도 또는 안정 되어 있는 transfection에의 필요와 원하는 구조를 표현 하는 셀의 식별 주어진된 단백질의 표현 이다. 또한, 고려 셀에 생 식의 가능한 기여 검사에 없어서는 아니다. 또한, 패치 클램프 기록 그 사람 또한 필요가 있다, 예를 들어 인감의 품질을 평가 하는 실험 기간 동안 적절 한 분석을 수행 하는 동안 고배율 현미경 micromanipulation를 수행 하는 숙련 된 사람이 필요 합니다. 액세스 저항 반면, 기록, 특히 하나는 자동화 된 electrophysiological 시스템을 사용 하 여 두 전극 전압 클램프 등 특정 능력을 필요로 하지 않습니다 그리고 실험실 기술자에 의해 실시 될 수 있습니다.
Electrophysiological 설정, 취득 하는 경우 비용 고려 사항은 확실히 신중 하 게 분석 되어야 하는 중요 한 요소 이다. 예를 들어 자동된 시스템의 비용이 상대적으로 높은 반면, 가까이 비교 보여 완전 한 electrophysiological 장비 설치는 관류, 증폭기, 눈 렌즈, 좋은 micromanipulators 장비 구매 포함 시스템, 고도 데이터를 수집 하 고 분석을 수행 하는 동안 진동 방지 테이블. 비용 비교는 2 전극 전압 클램프 설정 대 패치 클램프 설정 더욱 차이 보여준다. 또한, 자동화 시스템 완전 자동화 된 장비의 이점을 제공 하 고 주 야 무인 실행 됩니다.
화합물의 약리 속성은 수용 체에 행동의 모드에 의해 결정 됩니다. 예를 들어 경쟁 억제제는 동일한 바인딩 주머니, 또는 orthosteric 사이트를 입력할 수 있는 분자 자체 주 작동 근 발생 경쟁. 비 경쟁 억제제는 입력 하 고 예를 들어 이온 기를 차단 수 있는 ligand 문을 단 이온 채널의 경우, 그리고 다른 사이트에서 상호 작용 하 여 수용 체를 억제 하는 화합물. 그것은 상호 작용의 다른 메커니즘을 검사 하는이 작품의 범위를 넘어 갈 것 이라고 하지만 추가 정보 약리학 교과서에서 또는 베르트 랑과 베르트 랑의22등 다른 직장에서 얻을 수 있습니다.
Allosteric 변조기의 경우는 분자의 존재 하지만 orthosteric 사이트에서 사이트에 복합 바인딩 상태와 다른 상태 사이 에너지 장벽을 수정 합니다. 긍정적인 allosteric 변조기 (PAMs) 화합물을 활성 상태로 휴식에서 에너지 장벽을 줄일 수 있으며, 따라서는 주 작동 근의 효과 향상. PAM 효과 가능 하, 그것은, 따라서, 화합물에 노출 하는 주 작동 근 응답을 향상 시켜 고, 만약 그렇다면, 어떤 농도에서 결정 하는 데 필요한. 그림 11 및 그림 14 에 실험 GABAA 수용 체에 PAMs 특성에 대 한 성공적으로 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다.
경우에 따라 혼자 PAM에 노출 수용 체를 활성화 하는 충분 한 수 있습니다. 이러한 활동은 여기에 제시 된 실험 프로토콜의 약간의 수정에 의해 확인할 수 있습니다. 즉, GABA에 노출 동안 변조기의 공동 응용 프로그램을 사용 하는 대신 프로토콜 수정할 수 있습니다 첫 번째 응용 프로그램에 대 한 혼자 그리고 GABA의 화합물. 직접 주 작동 근 활동의 특성 자체는 화합물에 의해 불러 일으켰다 고 GABA 갖는 전류에 비해 응답의 진폭의 결정에 의해 이루어집니다.
그림 7에 나와 같이 뇌 조각에서 실시 한 실험 동물 모델 및 임상 시험으로 통로 더 진행 하기 전에 명확한 억제 회로에 네이티브 수용 체에 복합 활동을 확인 하는 데 사용 됩니다. 비교적 간단한 데이터 기록 및 분석 프로토콜 PS 진폭에 그들의 차동 modulatory 효력을 평가 하 여 여러 화합물의 순위를 수 있습니다. GABA 시스템에 관련 되지 않는 화합물의 일반적인 효과 검색 (예를 들어, PS 모양에서 변화를 관찰 하는 때) 있을 수 있습니다. 직접, GABAergic neurotransmission 수 부과이 경우 전체 셀 패치 클램프 기술8를 사용 하 여 금지 postsynaptic 현재 (Ipsc)에 화합물의 효과 측정 하 여.
Disclosures
프레데리크 Knoflach와 마리아 Clemencia 에르난데스 저자 F. 호프만-라 로슈 AG, 4070 바젤, 스위스, 제약 회사의 직원은. 저자 다니엘 Bertrand HiQScreen Sàrl 6, rte의 직원은 드 Compois, 1222 Vésenaz 제네바, 스위스, 제약 회사에 상영 시설을 제공.
Acknowledgments
저자 주 디스 Lengyel, 마리아 Karg, 그레고리우스 Friz, 레이첼 Haab, 로슈에서 마리 클레어 Pflimlin Tifany Schaer 그리고 HiQScreen에서 데보라 Paolucci 그들의 우수한 기술 지원에 대 한 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General equipment | |||
| 96 well cell harvester -(Filtermate 196) | Packard | To filter membranes with bound radioligand | |
| Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) | Packard | Microplate Scintillation and Luminescence counter | |
| Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) | Packard | Vial Scintillation and Luminescence counter | |
| Liquid handler (Biomek 2000) | Beckman coulter | To prepare compound dilutions | |
| Vortex (Vortex Genie 2) | Scientific industries Inc. | To mix compound stock solutions | |
| Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) | Kinematica AG | To resuspend the membrane preparations | |
| XLfit5 software | Microsoft Excel add-on by IDBS |
Curve fitting software | |
| Smart Pull | UniPix | - | Electrode Puller |
| RoboInject | MultiChannel Systems | - | Automated Injection (Xenopus Oocytes) |
| HiClamp | MultiChannel Systems | - | Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes) |
| DataMining | MultiChannel Systems | - | Data Analysis Software |
| DataMerger | MultiChannel Systems | - | Data Processing Software |
| Digidata 1550 | Molecular Devices | Low noise data acquisition system | |
| CyberAmp 380 or equivalent | Axon Instruments | Programmable Signal Conditioner | |
| pClamp program suite | Molecular Devices | Software for data acquisition and analysis software | |
| Antivibraton table | TMC | To avoid microelectrode vibrations | |
| Patchstar Micromanipulators | Scientifica | To accurately position microelectrodes in brain slices | |
| Faraday Cage | Sutter Instruments | To isolate recordings from noise | |
| McIlwain Tissue Chopper | Campden Instruments LTD | To prepare brain slices | |
| Borosilicate glass micropipette | Warner Instruments | GC150TF-10 | To record extracellular potentials in brain slices |
| Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode | World Precision Instruments | To stimulate the brain slices with current | |
| Stimulus generator for current and voltage driven stimulation | MultiChannel Systems | STG4000 | Delivers the current to the stimulation electrode |
| Plasticware | |||
| Microtiter plate round bottom | Corning | #3365 | Used for the binding assay |
| GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter | Packard | #6005174 | used for the binding assay |
| 50 mL Tubes | Falcon | #352070 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | #0030 120086 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 2 mL | Eppendorf | #0030 120094 | used for the binding assay |
| Shipping tubes 180 mL | Semadeni Europe AG | #3722 | used for the binding assay |
| Pony vial Polyethylene 6 mL | Perkin Elmer | #6013329 | used for the binding assay |
| Top Seal | Perkin Elmer | #60051859 | used for the binding assay |
| Spinner Flask | Bellco | BELLCO # 1965-00100 | Spinner Flask |
| 96 Well Plate (Conical) | Thermo Scientific Milian | 56368 | Injection plate for the oocytes |
| 96 Well Plate (Flat bottom) | Corning (Vitaris Switzerland) | 3364-cor | Compound Plate for the HiClamp |
| Glass capillary | Hilgenberg (Germany) | - | borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament |
| RNA preparation | |||
| Ambion mMessage mMachine | Thermo Fisher Scientific | for the in vitro synthesis | |
| Chemicals | |||
| Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Diazepam 4 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| [3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 °C | Used for binding assay | ||
| Microscint 40 | Packard | #6013641 | Used for binding assay |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | #6013329 | Used for binding assay |
| MS-222 | Sigma | Sigma # A5040 | MS-222 |
| AB/AM | Sigma | Sigma # A5955 | antibiotics / antimycotics |
| Collagenase | Sigma | Sigma # C1030 | Collagenase Type I |
| Rnase | Sigma | Sigma # R2020-250 mL | RNaseZAP |
| EndoFree Plasmid maxi Kit | Qiagen | Qiagen # 12362 | |
| Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) | Sigma | ||
| Membranes | |||
| Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al. 2009 for detailed methods. | Used for binding assay |
References
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