Summary
Målet med denne protokol er at udføre i situ hybridisering på voksen koraller prøver, der er indlejret i paraffin og snit på glas dias. Dette er en kvalitativ metode til at visualisere den rumlige udtryk for en RNA anti-sense sonden i paraffin-embedded væv.
Abstract
Koraller er vigtigt ocean hvirvelløse dyr, der er kritiske for generelle ocean sundhed samt menneskers sundhed. Men, menneskelige nedslag som stigende havtemperaturer og ocean forsuring, koraller er i stigende grad truet. For at imødegå disse udfordringer, fremskridt inden for celle- og molekylærbiologi har vist sig for at være afgørende for diagnosticering af koraller sundhed. Ændre nogle af de teknikker, der er almindeligt anvendt i human medicin kunne forbedre forskernes evne til at behandle og gemme koraller. For at løse dette, er en protokol for i situ hybridisering bruges primært i human medicin og evolutionære udviklingsmæssige biologi blevet tilpasset til brug i voksen koraller under stress.
Formålet med denne metode er at visualisere den rumlige udtryk for en RNA sonden i voksen koral væv, der er blevet indlejret i paraffin og snit på glas dias. Denne metode fokuserer på fjernelse af paraffin og rehydrering af prøven, forbehandling af prøven til sikre permeabilitet af prøven, før hybridisering inkubation, hybridisering RNA sondens og visualisering af RNA sonden. Dette er en kraftfuld metode, når du bruger ikke-modelorganismer til at opdage hvor specifikke gener er udtrykt, og protokollen kan være let tilpasses til andre ikke-model organismer. Metoden er dog begrænset, idet det er primært kvalitative, fordi udtrykket intensitet kan variere afhængigt af mængden af tid, der bruges under trinnet visualisering og koncentrationen af sonden. Derudover er tålmodighed påkrævet, som denne protokol kan tage op til 5 dage (og i mange tilfælde, længere) afhængigt af sonden bliver brugt. Endelig, uspecifikke baggrund farvning er fælles, men denne begrænsning kan overvindes.
Introduction
Koraller er kritiske økosystem bygherrer og vigtig for biodiversiteten i havet og menneskers sundhed1,2,3. De er truet på grund af klimaændringer og andre menneskeskabte stressfaktorer, og mange koraller arter betragtes kritisk truede. Således er der et væsentligt behov for cellulære og molekylære værktøjer til at diagnosticere koraller under stress. Også, der er lidt forstået om hvor generne udtrykkes i voksen koral væv og derfor lidt forståelse for funktioner af disse gener. For at løse dette problem, har vi tilpasset i situ hybridisering (ISH) protokollen, almindeligvis anvendes i human medicin og evolutionære udviklingsmæssige biologi, til brug på paraffin-embedded vævsprøver af voksen koraller. Denne teknik er mest effektive, når de anvendes på voksen koraller, der har undergået en stressende begivenhed, såsom eksponering for varmestress. Dog, denne teknik kan anvendes på en bred vifte af væv og stadier af livet i koraller og er ikke begrænset til kun varme-understregede koraller4,6,7. Desuden, kan denne teknik bruges på væv eller celler af enhver metazoan, så længe der findes cDNA sekvens oplysninger.
Formålet med denne metode er at visualisere RNA-sonder inden for voksen koral væv, der er blevet bevaret og indlejret i paraffin og snit på dias. Denne metode er en kraftfuld diagnosticeringsværktøj, der giver mulighed for visualisering af nukleinsyrer inden for voksen koral væv. I første omgang denne metode blev udviklet til medicinsk diagnostik, og siden er det blevet et populært værktøj på områder som udviklingsmæssige biologi og evolutionær udviklingsmæssige biologi8,9,10. ISH er også en kritisk metode, især i ikke-model systemer, når genomisk og transkriptom sekvens data er tilgængelige, men fysisk gene expression mønstre er ukendt. For diagnostisk arbejde i ikke-model systemer er denne teknik stærk, fordi det kan angive hvilke celler og væv udtrykke et gen af interesse og kan føre til mere målrettede terapeutiske tilgange8,9,10, 11,12. Endelig, denne teknik er kvalitativ og kraftigere, når parret med kvantitativ gen expression data11.
Metoden beskrevet i denne hvidbog vil være af interesse for forskere, der har allerede designet en digoxigenin (grave)-mærket RNA sonde (både fornuft og antisensstoffer sonder) og er nu klar til at udføre i situ hybridisering af sonder til en stikprøve. For at udføre denne metode, vil to serielle sektioner af en paraffin koral væv være behov for hver sonde, der testes. Én sektion vil blive brugt til forstand sonden og den anden for antisense sonden. Forstand sonden vil være en kontrol til at angive ikke-specifik binding. Hvis farvningen er observeret i forstand sonden, derefter er antisense sonden ikke specifikke for RNA af interesse. Sonder kan være konstrueret til enhver genet udtrykkes. I denne protokol, flere eksempler bruges der fandtes tidligere skal udtrykkes under heat stress i koraller: FBJ murine osteosarkom viral onkogen homolog B (Fos-B), aktivator protein (AP1), og Tumor nekrose faktor receptor 41 (TNFR 41)11. ISH bruger grave-mærket RNA-sonder foretrækkes frem for brug af radioaktive sonder, fordi deres håndtering er meget sikrere10. Desuden, denne teknik er meget følsomme og kan udføres på en bred vifte af væv og embryoner varme-understregede voksen koraller13,14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fjernelse af Paraffin
Forsigtig: Følg denne fremgangsmåde under et stinkskab.
- Afvoksning de tynd-snit paraffin-embedded dias med 100% xylen under kølerhjelmen i Coplin glas i 10 min. Brug ikke plast Coplin krukker, da xylen smelter plast. Sterilisere Coplin krukker i en autoklave før brug.
- Forberede fire sterilt glas Coplin krukker med følgende: 100% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol og 60% ethanol. Fortyndet ethanol med RNase-fri vand.
- Overføre dias til sterilt glas Coplin krukke med 100% ethanol og sættetid dem i 10 min. Efter 10 min, tømme Coplin glaskrukke og erstatte med ny 100% ethanol. Sættetid dias igen i 10 min.
- Overføre dias til sterilt glas Coplin krukke med 80% ethanol i 1 minut.
- Overføre dias til sterilt glas Coplin krukke med 70% ethanol i 1 minut.
- Overføre dias til sterilt glas Coplin krukke med 60% ethanol i 1 minut.
2. forbehandling af dias til forberedelse af RNA sonde hybridisering
- Udfør de følgende vasker ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Udføre stuetemperatur vasker på en orbitalryster ved en langsom hastighed. Brug steril dias mailere med plads til op til fem dias til vask af dias.
- Overføre dias til en steril dias mailer med 18 mL 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Vask for 5 min ved stuetemperatur.
- Hæld 1 x PBS, og straks behandle vævet på dias med proteinase K at aktivere sonde penetration af væv. Tilsættes ca 18 mL proteinase K til dias mailer (Se tabel 1 for arbejder opløsningens koncentration). Der inkuberes ved 37 ° C i 15 min. Ryst ikke.
- Mens diasene inkubere, forberede de prehybridization buffer (Prehybe Buffer). Placere Prehybe Buffer i et vandbad med kogende i 10 min og derefter afkøles på isbad i 5 min. En opskrift på Prehybe Buffer, se tabel 1.
- Stopper fordøjelsen af proteinase K-reaktion ved at hælde ud af proteinase K-løsning, og straks tilføje 18 mL 0,2% glycin-PBS løsning til dias mailer. Lad dias mailer sidde ved stuetemperatur i 5 min.
- Hæld 0,2% glycin-PBS løsning og tilføje 18 mL af 2 x saltvand natriumcitrat (SSC) løsning til hver dias mailer. Vaske dias i 2 x SSC i 10 min ved stuetemperatur, med rysten på 100-150 rpm.
3. prehybridization af dias i forberedelse til RNA sonde hybridisering
- Mens dias vaskes med 2 x SSC, få en ny steril dias mailer og læg ca. 18 mL Prehybe Buffer i dias mailer. Placer slide mailer til hybridisering ovnen ved hybridisering temperatur.
Bemærk: Hybridisering temperatur vil afhænge af på sonden bliver brugt men sædvanligvis spænder fra 50-60 ° C. - Når de 2 x SSC vask er afsluttet, udøse 2 x SSC og sted dias i dias mailer i Prehybe Buffer i hybridisering ovn i 1 time.
4. hybridisering af RNA-sonden
- Mens diasene inkubere med Prehybe Buffer i hybridisering ovn, forberede hybridisering-sonde løsning.
- Fortynd hver sonden i hybridisering buffer (0,5 µL af sonde med 24,5 µL af hybridisering buffer).
Bemærk: Opskriften på hybridisering buffer findes i tabel 1. Et eksempel på sonden forberedelse og koncentrationer findes i Traylor-Knowles et al. 11. - Placere fortyndet sonden på en 86-90 ° C varme blok for 12 min og derefter afkøles i 1 minut på isen.
- Fortynd hver sonden i hybridisering buffer (0,5 µL af sonde med 24,5 µL af hybridisering buffer).
- Fjern dias mailer fra hybridisering ovn og individuelt fjern dias fra dias mailer ved hjælp af steril pincet. Læg dias fladt på et stykke køkkenrulle, og forsigtigt aftørre overskydende Prehybe Buffer omkring vævsprøver. Pas på ikke at røre prøverne og arbejde hurtigt til at forhindre udtørring af vævsprøver.
- Omringe væv med en PAP pen. Anvende 25 µL fortyndet sonde løsning med en pipette og omfatte stikprøve med en plastik coverslip.
- Placer prøverne i dias fugt kammer med 4 x VSK + 50% formamid løsning i kammerets bund.
- Når sonder har føjet til alle dias, Placer slide fugt kammer i hybridisering ovnen i mindst 24 timer ved en temperatur på hybridisering af 50-60 ° C. I inkubationstiden kan variere afhængigt af koncentrationen af sonden men bør være i mindst 24 timer.
- Efter natten inkubation med de fortyndede sonder, fjerne dias fugt kammer fra hybridisering ovn.
- Fjern coverslips fra hvert af de dias, være omhyggelig med ikke at fortrænge væv. I en 1000 µL pipette, tilføje 1000 µL af 2 x SSC løsning og vaskes forsigtigt diaset.
- Sted diaset i en steril dias mailer med 18 mL af 2 x SSC løsning for 5 min ved stuetemperatur. Hæld løsningen og erstatte det med 18 mL frisk 2 x SSC. Gentage inkubationen i 5 min ved stuetemperatur med blid ryster.
- Hæld 2 x SSC løsningen. Tilføje 18 mL af 1 x SSC løsning og vask i 5 min ved stuetemperatur. Hæld 1 x SSC løsningen og erstatte det med 18 mL frisk 1 x SSC. Gentag inkubationen i 5 min ved stuetemperatur med blid ryster.
- Hæld 1 x SSC. Tilføje 18 mL 0,5 x SSC og vask i 10 min på 42 ° C uden rystelser. Hæld 0,5 x SSC og erstatte det med 18 mL frisk 0,5 x SSC. Vask igen i 10 min på 42 ° C uden rystelser.
5. visualisering af RNA-sonden
Bemærk: Til at visualisere sonden, BM lilla bliver brugt under udvikling oparbejde. Men før dette trin, flere vasker er forpligtet til at forberede prøverne til farvning.
- Vask dias med 18 mL basisk fosfatase buffer (AP-buffer) uden MgCl2 i 1 min. Hæld ud AP-Buffer uden MgCl2, og tilføje 18 mL 1 x Boehringer Mannheim blokerende buffer fortyndet med maleinsyre buffer. Inkuber i mindst 1 time ved stuetemperatur i et dias mailer med blid ryster.
Bemærk: Boehringer Mannheim blokerende buffer og maleinsyre buffer anvendes var premade og købt i grave vask og blok bufferen indstillet (tilgængelige kommercielt).- Alternativt kan inkubering natten over ved 4 ° C udføres. En længere blokeringsperioden vil mindske forekomsten af ikke-specifik binding.
- Forberede 20 mL fortyndet grave anti-digoxigenin-AP Fab fragmenter (anti-grave antistof = 2 µL af anti-grave antistof + 20 mL 1 x Boehringer Mannheim blokerende buffer). Dette er nok til brug i 1 plastik slide mailer. Flere af denne løsning skal forberedes, hvis mere end ét dias mailer der skal bruges.
- Tilføje anti-grave antistof til en ny steril dias mailer, og overføre diasene til dias mailer med anti-grave antistof løsning. Inkuber ved stuetemperatur i 3 timer med blid ryster.
- Efter inkubationen udøse anti-grave antistof og vaske diasene i dias mailer med 18 mL af AP-Buffer uden MgCl2 til 5 min med blid ryster.
- Udøse AP-Buffer uden MgCl2, og tilføje 18 mL af AP-Buffer. Vask for 5 min med blid ryster. Efter 5 min inkubation, hæld AP-Buffer, erstatte det med 18 mL frisk AP-Buffer og vaske for 5 min med blid ryster.
- I mørke, udøse AP-Buffer og tilføje 18 mL af BM lilla til dias mailer. Glassene inkuberes ved stuetemperatur i mørke, kontrol for lilla farve udvikling hver ½ h. reaktionstider for visualisering vil variere baseret på sonden, der er ved at blive udviklet.
Bemærk: I stedet for BM lilla visualisering, udvikling løsning kan gøres ved hjælp af 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) og nitro blå tetrazolium (NBT). Se tabel 1 for instruktioner. - Standse farveudviklingen ved at overføre diasene til en ny steril dias mailer med 18 mL af Tris-EDTA (TE) buffer for 5 min ved stuetemperatur i mørke.
- Hæld TE buffer og tilføje 18 mL af RNase-fri vand dias mailer og vask for 1 min, i mørke.
- Fjern dias fra vandet og tør dem rundt i kanten af væv. Tilføje glycerol montering medium og placere coverslips. Opbevar dias ved 4 ° C indtil billeder er klar til at blive taget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter fuldførelse af denne protokol, opnås identifikation af celler og væv, der udtrykker RNA sonden af interesse. De repræsentative resultater for denne protokol er på AP-1, FosB og TNFR41. Disse resultater, tidligere udgivet af Traylor-Knowles et al. 11, Vis rumlige udtryk for RNA sonder på voksen koraller, der blev udsat for varmestress. To eksempler på forskellige farvning typer præsenteres i figur 1. Figur 1A er et eksempel på diffuse væv farvning. Pletten findes i hele væv, ikke kun i bestemte celler. Her, findes udtryk for anti-sense AP-1 i hele epidermis og mundtlige gastrodermis11 (figur 1A). Farvning er diffus og ikke adskilt til én bestemt celletype. For denne type af farvning er det særligt kritisk til at køre en følelse kontrol på samme tid, som nogle af resultaterne kan skyldes ikke-specifik farvning.
Den anden type af farvning er celle-specifikke, hvor pletten findes kun i bestemte celletyper. Både FosB (figur 1B) og TNFR41 (figur 1 c) Vis denne type af farvning. Begge disse sonder blev brugt på vævsprøver af voksen koraller, der havde været udsat for en varme stress11. I panelet anti-sense er lilla pletter observeret. TNFR41 kom til udtryk i forskellige typer af cnidocytes, en familie af celletyper der findes kun i cnidarians (figur 1). Specifikt, farves det nematocytes, der producerer microbasic mastigophore organelle (nematocysts) og spirocytes, der producerer spirocysts, alle fundet i epidermis af koral væv. Nematocytes findes også i andre væv lag af koraller, som calicodermis; på grund af den skæring, der udføres på dette bestemt prøve finder disse oplysninger kunne ikke indsamles. FosB også farves cnidocytes og var specifikke for både spirocytes og nematocytes. For begge disse sonder viste forstand kontrol ingen pletter, der angiver, at farvning for anti-sense sonde var faktisk specifikt. Disse er blot to typer af repræsentative resultater (diffuse væv farvning og celle-specifikke farvning) af de farvning teknikker, der kan være til stede med forskellige typer af prober. Denne variation er det kritisk at bruge en følelse kontrol for at bestemme uspecifik farvning.
Figur 1: repræsentant resultat af ISH, der farves specifikke celler. (A) i panelet første viser forstand kontrolelement for AP-1 sonde, at lille farvning er til stede i diaset. I det andet panel viser anti-sense sonden for AP-1, farvning med denne sonde er diffuse hele væv. Pletten er specifikke for den mundtlige gastrodermis og epidermis. Med denne type af farvning er det kritisk at køre en følelse kontrol for at sikre, at den observerede farvning er specifikke. (B) en følelse kontrol for FosB sonden i det første panel viser lille farvning stede. I panelet anti-sense sonden for FosB viser farvning bestemt til spirocytes og nematocytes, med diffuse farvning i hele epidermis og oral gastrodermis. (C) i det første panel viser kontrolelementet sans for TNFR 41 sonden, lille farvning er til stede på diaset. I det andet panel viser antisense sonden for TNFR 41 specifik farvning inden for spirocytes, nematocytes og microblastic mastigophores. Forkortelser: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocyte (NE), microbasic mastigophores (MM), symbiont-holdige gastrodermal celle (SU). Dette tal blev gengivet med tilladelse11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Bemærk: Alle fortyndinger bør ske med sterile, RNase gratis vand i autoklaveres glasvarer. | |||
| Prehybe Buffer (50 mL) | TILFØJ | ||
| Formamid | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12,5 mL | ||
| 20 mg/mL heparin | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20% Tween-20 | 0,5 mL | ||
| 20% SDS | 0,5 mL | ||
| 10 mg/mL laks sæd DNA (denaturere før du tilføjer) | 2 mL | ||
| RNase gratis vand | 4.4 mL | ||
| Bemærk: Løsningen kan laves i en disposible 50 mL tube. Laks sæd skal denatureres ved kogning på en varme blok i 5 minutter før du tilføjer til løsning. | |||
| Hybridisering Buffer (47 mL) | TILFØJ | ||
| Formamid | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12,5 mL | ||
| 20 mg/mL heparin | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20% Tween-20 | 0,5 mL | ||
| 20% SDS | 0,5 mL | ||
| 10 mg/mL laks sæd DNA (denaturere før du tilføjer) | 2 mL | ||
| RNase gratis vand | 1 mL | ||
| Bemærk: Løsningen kan laves i en disposible 50 mL tube. Laks sæd skal denatureres ved kogning på en varme blok i 5 minutter før du tilføjer til løsning. | |||
| 10 X PBS (1,0 L) | TILFØJ | ||
| 18.6 mM NaH2PO4 | 2,56 g | ||
| 84.1 mM Na2HPO4 | 11,94 g | ||
| 1.750 mM NaCl | 102.2 g | ||
| Noter: Bland fosfater i ca. 800 mL vand til en 1,0 L volumen. Tjek pH. Det bør være 7,4 ± 0,4. Ellers justere pH til 7.4 med NaOH af HCl. tilføje NaCl og resten af vandet. Når pH er justeret autoklave. | |||
| 20 X SSC (1,0 L) | TILFØJ | ||
| 3 M NaCl | 175.3 g | ||
| 0,3 M Na citrat | 88.2 g | ||
| Noter: Mix i ca. 800 mL RNase gratis vand til at bringe til en 1,0 L volumen. Justere pH 4.5 og autoklave. | |||
| Alkalisk fosfatase (AP) buffer w/o MgCl2 (50 mL) | TILFØJ | ||
| 1 M NaCl | 5,0 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 5,0 mL | ||
| 20% Tween-20 | 1,25 mL | ||
| RNase gratis vand | 38.75 mL | ||
| Noter: Forberede lige før at bruge i en 50 mL tube. | |||
| Alkalisk fosfatase (AP) buffer (100 mL) | TILFØJ | ||
| 1 M NaCl | 10,0 mL | ||
| 1 M MgCl2 | 5 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 10 mL | ||
| 20% Tween-20 | 2,5 mL | ||
| RNase gratis vand | 72,5 mL | ||
| Noter: forberede lige før at bruge i en 50 mL tube. Løsningen vil blive overskyet efter et par timer og vil ikke længere arbejde for enzymatisk reaktion. | |||
| AP substratopløsning | TILFØJ | ||
| AP Buffer | 25 mL | ||
| NBT | 82,5 uL | ||
| BCIP | 82,5 uL | ||
| Noter: det kan bruges i stedet for BM lilla. Forberede lige før at bruge i en 50 mL tube. Holde denne løsning i mørke ved at dække tube i folie, og forbereder i svagt lys. | |||
| Proteinase K stamopløsning (10 mg/mL) | TILFØJ | ||
| Proteinase K | 10 mg | ||
| RNase gratis vand | 10 mL | ||
| Noter: Alikvot og opbevares ved-20 ° C. | |||
| Proteinase K arbejder løsning | TILFØJ | ||
| Proteinase K stamopløsning | 90 ul | ||
| 1 X PBS | 18 mL | ||
| Noter: Gør bare forudgående til brug for de bedste resultater. | |||
| 0,2% glycin-PBS løsning | TILFØJ | ||
| 10 X PBS | 45 mL | ||
| RNase gratis vand | 405 mL | ||
| Glycin | 1 g | ||
| Noter: forberede i autoklaveres glasbeholder. Bland ved stuetemperatur på en stirer plade indtil glycin er helt opløst. | |||
| Boehringer Mannheim blokerende Buffer (30 mL) (en del af den grave vask og blok Buffer sæt) | TILFØJ | ||
| 10 x blokering løsning | 3 mL | ||
| 1 x maleinsyre buffer | 27 mL | ||
| Noter: gøre bare forudgående til brug for de bedste resultater. Blokering stamopløsning og maleinsyre buffer blev brugt fra den "grave vask og blok-Buffer sæt". | |||
| 4 X SSC — 50% formamid (30 mL) | TILFØJ | ||
| 20 X SSC | 6 mL | ||
| 50% formamid | 24 mL | ||
| Noter: Forberede lige før at bruge i 50 mL tube. Forberede under laboratorium hætte. | |||
| Glycerol montering medier | TILFØJ | ||
| 50 mM Tris, pH 8,4 | 80 ΜL | ||
| Glycerol | 20 ΜL | ||
Tabel 1: lager løsninger til at udføre i situ hybridisering. Tabellen er en liste over de forskellige stamopløsninger behov for denne protokol. Samlede beløb anslås for udførelsen af omkring 2 skub afsendere. Det tilrådes at justere samlede beløb baseret på antal dias, der behandles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden i denne protokol er blevet ændret fra tidligere arbejde i medicinske og evolutionære udviklingsmæssige forskning8,9,10,12,17. Denne protokol fokuserer på nuancerne i en i situ hybridisering med en grave-mærket RNA anti-sense sonden på voksen koraller, som er blevet bevaret og indlejret i paraffin. Denne metode kan overføres let til prøver af organismer uden for koraller, der har også været paraffin-embedded. Endelig er denne metode kan udføres under forskellige livsstadier af koraller (fx, larve) eller i cellekulturer, men den nøjagtige protokollen kan varierer, da disse typer af prøver ikke er altid paraffin-embedded5,6 .
Der er flere vigtige skridt i denne protokol, herunder proteinase K behandling, hybridisering af sonden og farve udvikling af sonden. Under proteinase K-behandlingen er timing meget vigtigt. Hvis behandlingen er længere end foreslået, kan væv blive forringet og beskadiget. Derudover bør at standse proteinase K reaktion udføres på fuld tid angivet punkt. Det er også afgørende for at holde prøven ved en konstant hybridisering temperatur, som sænkning af temperaturen kan forårsage ikke-specifik binding af sonden og komplicere resultaterne. Når du vasker off sonden, er det vigtigt at tage enkelte dias ud af hybridisering ovnen, en på en gang, i stedet for alle på en gang, at sikre, at diasene ikke krydse sig med sonden ved lav temperatur. Grundig vask dias efter sonde hybridisering vil også hjælpe med at forhindre ikke-specifik binding. Endelig er farve udvikling af sonden en af de mest kritiske endnu subjektive trin i denne proces. Farve udvikling kan være let overdrevet eller stoppet for tidligt. Dette trin kræver tålmodighed og årvågenhed at sikre at alt farvning af dias forekommer ikke.
Fejlfinding af denne protokol kan være en skræmmende proces på grund af antallet af trin involveret. Hvis protokollen giver negative resultater, så er det bedst at starte med at undersøge sonde for at sikre, at det er anti-mening (og ikke følelsen) sonde. Desuden, hvis løsningerne er gammel, er det værd at genskabe eller erstatte dem så de er friske, når du udfører denne protokol. Ændringer, såsom længder hybridisering og blokering, kan gennemføres for at øge chancerne for sonden hybridisering eller reducere mængder af baggrund og uspecifik farvning. På grund af det høje antal trin i denne protokol, kan det være nemt at miste overblikket; Det er derfor vigtigt at bevare overblikket og holde styr på hvilke dele af protokollen er afsluttet. Desuden er det afgørende at sikre, at ingen skridt er sprunget, og tid er ikke skåret under inkubationer og vasker. En god tommelfingerregel er at give mulighed længere end kortere vasker til at sikre, at alle dias rengøres grundigt.
Den største begrænsning af denne metode er, at resultaterne ikke er kvantificerbare. Dette er en kvalitativ metode, der i forening med andre metoder såsom histologi, transcriptomics og proteomics, er meget informativ. På grund af variationer i hybridisering gange samt de subjektive gange under visualisering opnås kvantificere intensiteten af farvning ikke nemt. Det er fristende at sige, at en sonde udtrykkes mere højt, hvis det viser større intensitet, men på grund af variationer i denne protokol (f.eks. mængden af fristen for farveudviklingen), gene expression beløb ikke kan bestemmes.
Denne teknik er ikke en ny metode i biologi; men det er en ikke udføres meget ofte på voksen koraller. Brug af denne metode på voksen koraller er meget kraftfuld, fordi det forankrer genekspression data til et væv eller en celle type11. Transcriptomics og genomforskning er blevet populær og kraftfulde værktøjer i koral biologi; men disse metoder er generelt gjort på homogeniseret af hele dyret. Dette gør det udfordrende at identificere hvilke dele af koraller er udtryk for gener af interesse, og dermed mere udfordrende at forstå de faktiske mekanismer. Ved hjælp af ISH sammen med genekspression data, kan der opnås en mere holistisk tilgang til hvor og i hvilket omfang gener er udtrykt. Dette vil i høj grad hjælpe i forståelsen af de mekanismer, der er ansvarlige for forskellige stress reaktion veje i voksen koraller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af award ingen. OCE-1323652 gennem National Science Foundation Ocean videnskab postdoc stipendium og tildeling no.1012629 fra Burroughs Wellcome fond postdoc berigelse Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. , Oxford University Press. (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
