Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है कि तेल में एंबेड किया गया है और कांच स्लाइड पर खोदी वयस्क मूंगा नमूनों पर सीटू संकरण में प्रदर्शन करने के लिए है । यह एक गुणात्मक-आयल-एंबेडेड ऊतकों में एक आरएनए विरोधी भावना जांच की स्थानिक अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया विधि है ।
Abstract
कोरल महत्वपूर्ण महासागर अकशेरूकीय है कि समग्र महासागर स्वास्थ्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मानव स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण हैं । हालांकि, इस तरह के महासागर तापमान और महासागर अंलीकरण बढ़ती के रूप में मानव प्रभावों के कारण, कोरल तेजी से खतरे में हैं । इन चुनौतियों से निपटने के लिए, सेल में अग्रिम और आणविक जीवविज्ञान कोरल के स्वास्थ्य के निदान के लिए महत्वपूर्ण साबित हो गया है । आमतौर पर मानव चिकित्सा में इस्तेमाल किया तकनीकों में से कुछ को संशोधित बहुत शोधकर्ताओं के इलाज और कोरल को बचाने की क्षमता में सुधार कर सकता है । इस पते के लिए, सीटू संकरण में मानव चिकित्सा और विकासवादी विकास जीव विज्ञान में मुख्य रूप से इस्तेमाल के लिए एक प्रोटोकॉल तनाव के तहत वयस्क कोरल में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है ।
इस विधि का उद्देश्य है कि तेल में एंबेड किया गया है और कांच स्लाइड पर खोदी वयस्क मूंगा ऊतक में एक आरएनए जांच की स्थानिक अभिव्यक्ति कल्पना है । इस विधि नमूना के तेल और निर्जलीकरण के हटाने पर केंद्रित है, नमूने की पारगम्यता सुनिश्चित करने के लिए उपचार, पूर्व संकरण की मशीन, आरएनए जांच के संकरण, और आरएनए की जांच के दृश्य है । यह एक शक्तिशाली तरीका है जब गैर मॉडल जीवों का उपयोग करने की खोज जहां विशिष्ट जीन व्यक्त कर रहे हैं, और प्रोटोकॉल आसानी से अंय गैर मॉडल जीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हालांकि, विधि में सीमित है कि यह मुख्य रूप से गुणात्मक है, क्योंकि अभिव्यक्ति तीव्रता दृश्यावलोकन चरण और जांच की एकाग्रता के दौरान उपयोग किए गए समय की मात्रा के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । इसके अलावा, धैर्य की आवश्यकता है, के रूप में इस प्रोटोकॉल को 5 दिनों तक ले जा सकते है (और कई मामलों में, अब) जांच के आधार पर इस्तेमाल किया जा रहा है । अंत में, गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला आम है, लेकिन इस सीमा को दूर किया जा सकता है ।
Introduction
कोरल महत्वपूर्ण पारिस्थितिकी तंत्र बिल्डरों और महासागर और मानव स्वास्थ्य1,2,3में जैव विविधता के लिए महत्वपूर्ण हैं । वे जलवायु परिवर्तन और अंय anthropogenic तनाव के कारण खतरे में हैं, और कई कोरल प्रजातियों गंभीर खतरे में माना जाता है । इस प्रकार, तनाव के तहत कोरल का निदान करने के लिए सेलुलर और आणविक उपकरणों के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है । इसके अलावा, वहां थोड़ा के बारे में समझ में जहां जीन वयस्क कोरल ऊतक के भीतर व्यक्त कर रहे हैं, और इसलिए इन जीनों के कार्यों की थोड़ी समझ है । इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, हम में अनुकूलित है सीटू संकरण (ISH) प्रोटोकॉल, आमतौर पर मानव चिकित्सा और विकासवादी विकासात्मक जीवविज्ञान में इस्तेमाल किया, वयस्क मूंगों के तेल-एम्बेडेड ऊतक के नमूनों पर उपयोग के लिए. यह तकनीक सबसे शक्तिशाली है जब वयस्क मूंगों कि गर्मी तनाव के लिए जोखिम के रूप में एक तनावपूर्ण घटना आया है पर इस्तेमाल किया । हालांकि, इस तकनीक के ऊतकों और कोरल में जीवन चरणों की एक विस्तृत श्रृंखला पर इस्तेमाल किया जा सकता है और केवल गर्मी बल दिया मूंगों4,6,7तक ही सीमित नहीं है । इसके अतिरिक्त, इस तकनीक के ऊतकों या किसी भी metazoan कोशिकाओं के रूप में जब तक वहां सीडीएनए अनुक्रम जानकारी उपलब्ध है पर इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इस विधि के प्रयोजन के लिए वयस्क कोरल ऊतक है कि संरक्षित और तेल में एंबेडेड और स्लाइड पर खोदी गई है के भीतर आरएनए जांच कल्पना है । इस विधि एक शक्तिशाली नैदानिक उपकरण है कि वयस्क कोरल ऊतक के भीतर न्यूक्लिक एसिड के दृश्य के लिए अनुमति देता है । शुरू में इस विधि चिकित्सा निदान के लिए विकसित किया गया था, और इसके बाद से इस तरह के विकास जीवविज्ञान और विकासवादी विकास जीवविज्ञान8,9,10के रूप में खेतों में एक लोकप्रिय उपकरण बन गया है । ISH भी एक महत्वपूर्ण तरीका है, विशेष रूप से गैर में मॉडल सिस्टम, जब जीनोमिक और transcriptomic अनुक्रम डेटा उपलब्ध हैं, लेकिन स्थानिक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न अज्ञात हैं । गैर में नैदानिक काम के लिए मॉडल सिस्टम, इस तकनीक शक्तिशाली है क्योंकि यह संकेत कर सकते है जो कोशिकाओं और ऊतकों ब्याज की जीन व्यक्त और अधिक लक्षित चिकित्सकीय दृष्टिकोण8,9,10के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, 11,12. अंत में, इस तकनीक गुणात्मक और अधिक शक्तिशाली है जब मात्रात्मक जीन अभिव्यक्ति डेटा11के साथ युग्मित ।
इस पत्र में उल्लिखित दृष्टिकोण उन शोधकर्ताओं के हित का होगा जिन्होंने पहले से ही एक digoxigenin (डीआईजी)-लेबल आरएनए जांच (दोनों नब्ज और antisense जांच) तैयार कर ली है और अब जांच के एक नमूने को लेकर सीटू संकरण में प्रदर्शन करने के लिए तैयार है । इस विधि को करने के लिए, एक तेल मूंगा ऊतक के दो धारावाहिक वर्गों प्रत्येक जांच के लिए आवश्यक हो जाएगा परीक्षण किया जा रहा है । एक सेक्शन का इस्तेमाल नब्ज जांच के लिए और दूसरे को antisense जांच के लिए किया जाएगा । भाव जांच पर नियंत्रण रहेगा न कि गैर विशिष्ट बंधन का संकेत । अगर धुंधला भाव जांच में मनाया जाता है, तो antisense जांच हित की आरएनए के लिए विशिष्ट नहीं है । जांच के किसी भी जीन व्यक्त के लिए डिजाइन किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, कई उदाहरण पहले कोरल में गर्मी तनाव के दौरान व्यक्त किया जा पाया गया है कि इस्तेमाल किया जाता है: FBJ murine ऑस्टियो वायरल oncogene homolog बी (फोस-बी), उत्प्रेरक प्रोटीन (AP1), और ट्यूमर परिगलन कारक रिसेप्टर ४१ (TNFR ४१)11. ISH खुदाई का उपयोग-लेबल आरएनए जांच के रेडियोधर्मी जांच का उपयोग कर अधिक पसंद है क्योंकि उनके हैंडलिंग ज्यादा10सुरक्षित है । इसके अलावा, इस तकनीक अत्यधिक संवेदनशील है और गर्मी से परे ऊतकों और भ्रूण की एक विस्तृत श्रृंखला पर किया जा सकता है, वयस्क मूंगों13,14,15,16।
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Protocol
1. आयल का निष्कासन
चेतावनी: एक धुएं डाकू के तहत निंनलिखित चरणों का पालन करें ।
- Dewax १००% xylene के साथ पतली खोदी गई आयल-एंबेडेड स्लाइडों को 10 मिनट के लिए ग्लास Coplin जार में हुड के नीचे रखें । प्लास्टिक Coplin जार का उपयोग न करें, क्योंकि xylene प्लास्टिक को पिघला देता है । एक आटोक्लेव में Coplin जार का उपयोग करने से पहले निष्फल ।
- निंनलिखित के साथ चार बाँझ ग्लास Coplin जार तैयार: १००% इथेनॉल, ८०% इथेनॉल, ७०% इथेनॉल और ६०% इथेनॉल । RNase-मुक्त पानी के साथ इथेनॉल पतला ।
- १००% इथेनॉल के साथ बाँझ ग्लास Coplin जार करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए उन्हें सोख. 10 मिनट के बाद, गिलास Coplin जार खाली और नए १००% इथेनॉल के साथ की जगह । 10 मिनट के लिए स्लाइड्स को फिर से सोख लें ।
- 1 मिनट के लिए ८०% इथेनॉल के साथ बाँझ ग्लास Coplin जार करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण ।
- 1 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल के साथ बाँझ ग्लास Coplin जार करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण ।
- 1 मिनट के लिए ६०% इथेनॉल के साथ बाँझ ग्लास Coplin जार करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण ।
2. आरएनए जांच संकरण की तैयारी के लिए स्लाइड का उपचार
- अंयथा निर्दिष्ट जब तक कमरे के तापमान पर निंनलिखित बहाकर प्रदर्शन करते हैं । एक धीमी गति से एक कक्षीय शेखर पर कमरे का तापमान बहाकर प्रदर्शन । स्लाइड की धुलाई के लिए पांच स्लाइड के लिए कमरे के साथ बाँझ स्लाइड मेलर का उपयोग करें ।
- 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 18 मिलीलीटर के साथ एक बाँझ स्लाइड मेलर करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए धो लें ।
- 1x पंजाबियों बंद डालो, और तुरंत proteinase कश्मीर के साथ स्लाइड पर ऊतक के इलाज के ऊतकों की जांच प्रवेश सक्षम करने के लिए । स्लाइड मेलर के लिए proteinase K समाधान के लगभग 18 मिलीलीटर जोड़ें (समाधान एकाग्रता काम करने के लिए तालिका 1 देखें) । 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन । मत घे.
- जबकि स्लाइडिंग, prehybridization बफ़र (Prehybe बफ़र) तैयार कर रहे हैं । 10 मिनट के लिए एक उबलते पानी स्नान में Prehybe बफर प्लेस, तो 5 मिनट के लिए एक बर्फ स्नान पर ठंडा । Prehybe बफ़र की एक विधि के लिए, तालिका 1देखें ।
- बंद proteinase कश्मीर समाधान घनघोर द्वारा proteinase कश्मीर प्रतिक्रिया के पाचन को रोकने के लिए, और तुरंत स्लाइड मेलर के लिए ०.२% glycine-पंजाबियों समाधान के 18 मिलीलीटर जोड़ें । स्लाइड मेलर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं ।
- ०.२% glycine-पंजाबियों समाधान बाहर डालो और प्रत्येक स्लाइड मेलर के लिए 2x खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) समाधान के 18 मिलीलीटर जोड़ें । 100-150 rpm पर झटकों के साथ, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2x एसएससी में स्लाइड धो लो ।
3. आरएनए जांच संकरण के लिए तैयार करने में स्लाइड की Prehybridization
- जबकि स्लाइड 2x एसएससी के साथ धोया जा रहा है, एक नया बाँझ स्लाइड मेलर प्राप्त करने और स्लाइड मेलर में Prehybe बफर के लगभग 18 मिलीलीटर डाल दिया । स्लाइड मेलर को संकरण तापमान पर संकरण ओवन में रखें ।
नोट: संकरण तापमान जांच पर निर्भर करेगा इस्तेमाल किया जा रहा है, लेकिन आम तौर पर 50-60 डिग्री सेल्सियस से पर्वतमाला । - एक बार 2x एसएससी धोने पूरा हो गया है, बाहर 2x एसएससी डालो, और स्लाइड मेलर में Prehybe बफर में संकरण ओवन 1 एच के भीतर स्लाइड जगह है ।
4. आरएनए जांच के संकरण
- जबकि स्लाइड संकरण ओवन में Prehybe बफर के साथ मशीन कर रहे हैं, संकरण जांच समाधान तैयार करते हैं ।
- संकरण बफर में प्रत्येक जांच पतला (संकरण बफर के २४.५ µ एल के साथ जांच के ०.५ µ एल) ।
नोट: संकरण बफ़र के लिए नुस्खा 1 तालिकामें पाया जाता है । जांच की तैयारी और सांद्रता का एक उदाहरण Traylor-नोल्स एट अल में पाया जा सकता है । 11. - 12 मिनट के लिए एक 86-90 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर पतला जांच प्लेस, तो बर्फ पर 1 मिनट के लिए शांत ।
- संकरण बफर में प्रत्येक जांच पतला (संकरण बफर के २४.५ µ एल के साथ जांच के ०.५ µ एल) ।
- संकरण ओवन से स्लाइड मेलर निकालें और व्यक्तिगत रूप से बाँझ चिमटी का उपयोग स्लाइड मेलर से स्लाइड हटा दें । एक कागज तौलिया पर फ्लैट स्लाइड रखना, और ध्यान से ऊतक के नमूनों के आसपास अतिरिक्त Prehybe बफर पोंछ । नमूने को छूने के लिए नहीं सावधान रहें, और ऊतक के नमूनों के सूखने को रोकने के लिए जल्दी से काम करते हैं ।
- एक पीएपी पेन के साथ ऊतक घेरना । एक पिपेट के साथ पतला जांच समाधान के 25 µ एल लागू करें और एक प्लास्टिक coverslip के साथ नमूना कवर ।
- कक्ष के तल में 4x SSC + ५०% formamide समाधान के साथ स्लाइड नमी चैंबर में नमूने प्लेस ।
- एक बार जांच सभी स्लाइड में जोड़ा गया है, संकरण ओवन में स्लाइड नमी चैंबर 50-60 डिग्री सेल्सियस के एक संकरण तापमान पर कम से कम 24 घंटे के लिए जगह है । मशीन समय की जांच की एकाग्रता के आधार पर भिंन हो सकते हैं, लेकिन 24 घंटे की एक ंयूनतम के लिए होना चाहिए ।
- पतला जांच के साथ रातोंरात गर्मी के बाद, संकरण ओवन से स्लाइड नमी चैंबर निकालें ।
- प्रत्येक स्लाइड से coverslips निकालें, ऊतक विस्थापित करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा. एक १००० µ एल पिपेट में, 2x एसएससी समाधान के १००० µ एल जोड़ें और धीरे से स्लाइड धो ।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2x एसएससी समाधान के 18 मिलीलीटर के साथ एक बाँझ स्लाइड मेलर में स्लाइड प्लेस । बाहर समाधान डालो और यह ताजा 2x एसएससी के 18 मिलीलीटर के साथ बदलें । दोहराएं कोमल मिलाते के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए फिर से गर्मी ।
- बाहर 2x एसएससी समाधान डालो । 1x एसएससी समाधान के 18 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए धो लो । 1x एसएससी समाधान बाहर डालो और ताजा 1x एसएससी के 18 मिलीलीटर के साथ यह जगह । कोमल मिलाते के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन को दोहराएँ ।
- 1x एसएससी बाहर डालो । मिलाते हुए बिना ४२ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 0.5 x एसएससी और धोने के 18 मिलीलीटर जोड़ें । 0.5 x एसएससी बाहर डालो और ताजा 0.5 एक्स एसएससी की 18 मिलीलीटर के साथ यह जगह । मिलाते हुए बिना ४२ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए फिर से धो लें ।
5. आरएनए जांच का दृश्य
नोट: जांच visualizing के लिए, बीएम बैंगनी विकास की प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा । हालांकि, इस कदम से पहले, कई बहाकर दाग के लिए नमूने तैयार करने के लिए आवश्यक हैं ।
- 1 मिनट के लिए MgCl2 के बिना alkaline फॉस्फेट बफर (एपी बफर) के 18 मिलीलीटर के साथ स्लाइड धो लो ।2MgCl के बिना एपी बफर बाहर डालो, और 1x Boehringer-मैनहेम के 18 मिलीलीटर जोड़ने के लिए पुरुष एसिड बफर के साथ पतला बफर । कोमल मिलाते के साथ एक स्लाइड मेलर में कमरे के तापमान पर कम से 1 घंटे के लिए मशीन ।
नोट: Boehringer-मैनहेम अवरुद्ध बफर और पुरुष एसिड बफर का इस्तेमाल किया और खुदाई धोने और ब्लॉक बफर सेट (उपलब्ध व्यावसायिक रूप से) में खरीदे गए थे ।- वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में गर्मी प्रदर्शन किया जा सकता है । एक लंबा ब्लॉकिंग पीरियड गैर-विशिष्ट बाइंडिंग की दिखावट को कम करेगा ।
- पतला के 20 मिलीलीटर खुदाई की तैयारी विरोधी digoxigenin-एपी फैब टुकड़े (विरोधी खोदो एंटीबॉडी = 2 विरोधी के µ एल-खुदाई एंटीबॉडी + 20 एमएल 1x Boehringer-मैनहेम अवरुद्ध बफर) । यह 1 प्लास्टिक स्लाइड मेलर में उपयोग के लिए पर्याप्त है । अधिक से अधिक एक स्लाइड मेलर का उपयोग किया जा करने के लिए है, तो यह समाधान तैयार होना चाहिए ।
- एंटी-डीआईजी एंटीबॉडी एक नया बाँझ स्लाइड मेलर करने के लिए जोड़ें, और स्लाइड मेलर करने के लिए स्लाइड्स को एंटी-डीआईजी एंटीबॉडी समाधान के साथ स्थानांतरित करें । कोमल मिलाते के साथ 3 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
- मशीन के बाद, बाहर विरोधी खुदाई एंटीबॉडी डालो और एपी के 18 मिलीलीटर के साथ स्लाइड मेलर में स्लाइड धो-2 MgCl बिना कोमल मिलाते के साथ 5 मिनट के लिए बफर ।
- 2 MgCl बिना एपी बफर डालो, और एपी बफर के 18 मिलीलीटर जोड़ें । 5 मिनट के लिए कोमल मिलाते के साथ धो लो । 5 मिनट की मशीन के बाद, एपी बफर डालना, यह ताजा एपी बफर के 18 मिलीलीटर के साथ बदलें, और कोमल मिलाते के साथ 5 मिनट के लिए धो लो ।
- अंधेरे में, बाहर एपी बफर डालो और बीएम बैंगनी के स्लाइड मेलर के लिए 18 मिलीलीटर जोड़ें । अंधेरे में कमरे के तापमान पर स्लाइड गर्मी, बैंगनी रंग विकास के लिए जाँच हर ½ h. विज़ुअलाइज़ेशन के लिए प्रतिक्रिया समय विकसित किया जा रहा है जो जांच के आधार पर भिन्न होगा ।
नोट: बीएम बैंगनी दृश्य के बजाय, विकास समाधान 5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-फॉस्फेट (BCIP) और नाइट्रो ब्लू tetrazolium (एनबीटी) का उपयोग किया जा सकता है । निर्देशों के लिए तालिका 1 देखें । - Tris-EDTA के 18 मिलीलीटर के साथ एक नया बाँझ स्लाइड मेलर को स्लाइड स्थानांतरित करके रंग विकास रोकें (ते) कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए बफर, अंधेरे में.
- बंद ते बफर डालो और स्लाइड मेलर को RNase मुक्त पानी की 18 मिलीलीटर जोड़ें और 1 मिनट के लिए धो, अंधेरे में ।
- पानी से स्लाइड निकालें, और उंहें ऊतक के किनारों के आसपास सूखी । ग्लिसरॉल बढ़ते मध्यम जोड़ें और coverslips जगह है । स्लाइडों को 4 ° c पर संग्रहीत करें जब तक चित्र ले जाने के लिए तैयार हों ।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल को पूरा करने के बाद, ब्याज की आरएनए जांच व्यक्त कर रहे हैं कि कोशिकाओं और ऊतकों की पहचान प्राप्त किया जाएगा । इस प्रोटोकॉल के लिए प्रतिनिधि परिणाम एपी 1, FosB, और TNFR41 के लिए कर रहे हैं । इन परिणामों, पहले Traylor द्वारा प्रकाशित-नोल्स एट अल । 11, वयस्क मूंगों कि गर्मी तनाव से अवगत कराया गया पर आरएनए जांच की स्थानिक अभिव्यक्ति दिखाओ । अलग दाग प्रकार के दो उदाहरण चित्रा 1में प्रस्तुत कर रहे हैं । चित्र 1a फैलाना ऊतक धुंधला का एक उदाहरण है । दाग ऊतक भर में पाया जाता है, न केवल विशिष्ट कोशिकाओं में । यहां विरोधी नब्ज एपी-1 की अभिव्यक्ति एपिडर्मिस और ओरल gastrodermis11 (चित्रा 1a) भर में पाया जाता है । धुंधला फैलाना है और एक विशिष्ट कोशिका प्रकार के लिए अलग नहीं है । धुंधला के इस प्रकार के लिए, यह विशेष रूप से एक ही समय में एक भावना नियंत्रण चलाने के लिए महत्वपूर्ण है, परिणाम के कुछ के रूप में गैर विशिष्ट धुंधला के कारण हो सकता है ।
धुंधला का दूसरा प्रकार कोशिका-विशिष्ट होता है, जिसमें दाग केवल विशिष्ट कोशिका प्रकार में पाया जाता है. दोनों FosB (फिगर 1b) और TNFR41 (figure 1C) इस प्रकार के दाग दिखाते हैं । इन जांच के दोनों वयस्क मूंगों कि एक गर्मी तनाव11को उजागर किया गया था के ऊतकों के नमूनों पर इस्तेमाल किया गया । विरोधी भावना पैनल में, बैंगनी धुंधला मनाया जाता है । TNFR41 cnidocytes, सेल प्रकार है कि केवल cnidarians (चित्रा 1) के भीतर पाया जाता है की एक परिवार के विभिंन प्रकार में व्यक्त किया गया था । विशेष रूप से, यह दाग nematocytes है कि microbasic mastigophore organelle (nematocysts) और spirocytes उत्पादन कि spirocysts उत्पादन, सभी कोरल ऊतक के एपिडर्मिस के भीतर पाया । Nematocytes भी कोरल, जैसे calicodermis के अंय ऊतक परतों में पाए जाते हैं; हालांकि, इस विशेष नमूने पर की गई खोदी गई कार्रवाई के कारण, वह जानकारी एकत्रित नहीं की जा सकी । FosB भी दाग cnidocytes और दोनों spirocytes और nematocytes के लिए विशिष्ट था । इन जांचों के दोनों के लिए, नब्ज नियंत्रण कोई दाग नहीं दिखाया, संकेत है कि विरोधी भावना जांच के लिए धुंधला वास्तव में विशिष्ट था । ये सिर्फ दो प्रकार के प्रतिनिधि परिणाम है (फैलाना ऊतक धुंधला और सेल विशेष धुंधला) कि जांच के विभिंन प्रकार के साथ मौजूद हो सकता है धुंधला तकनीकों का । इस परिवर्तनशीलता के कारण, यह गैर विशिष्ट धुंधला निर्धारित करने के लिए एक भावना नियंत्रण का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
चित्रा 1: ISH के प्रतिनिधि परिणाम है कि दाग विशिष्ट कोशिकाओं । (A) पहले पैनल में, एपी-1 जांच के लिए नब्ज नियंत्रण पता चलता है कि थोड़ा धुंधला स्लाइड के भीतर मौजूद है । दूसरे पैनल में एपी के लिए विरोधी भावना जांच-1 से पता चलता है कि इस जांच के साथ धुंधला ऊतक भर में फैलाना है । दाग ओरल gastrodermis और एपिडर्मिस के लिए विशिष्ट है । धुंधला के इस प्रकार के साथ, यह एक भावना नियंत्रण चलाने के लिए सुनिश्चित करें कि मनाया धुंधला विशिष्ट है महत्वपूर्ण है । (ख) पहले पैनल में FosB जांच के लिए एक भावना नियंत्रण थोड़ा धुंधला वर्तमान से पता चलता है । दूसरे पैनल में, विरोधी भावना जांच FosB के लिए spirocytes और nematocytes के लिए विशिष्ट धुंधला से पता चलता है, एपिडर्मिस और मौखिक gastrodermis भर में धुंधला फैलाना के साथ । (ग) पहले पैनल में, TNFR ४१ जांच के लिए नब्ज नियंत्रण से पता चलता है कि थोड़ा धुंधला स्लाइड पर मौजूद है । दूसरे पैनल में, विरोधी भावना जांच ४१ TNFR के लिए spirocytes, nematocytes, और microblastic mastigophores के भीतर विशिष्ट धुंधला दिखाता है । संक्षिप्त: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocyte (NE), microbasic mastigophores (मिमी), symbiont-युक्त gastrodermal कोशिका (सु). यह आंकड़ा11अनुमति के साथ reproduced था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| नोट: सभी कमजोर पड़ने बाँझ के साथ किया जाना चाहिए, autoclaved कांच के RNase में मुफ्त पानी । | |||
| Prehybe बफर (५० मिलीलीटर) | जोड़ें | ||
| Formamide | 25 मिलीलीटर | ||
| 20X एसएससी (पीएच ४.५) | १२.५ एमएल | ||
| 20 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन | ०.१ एमएल | ||
| 50X Denhardts | 5 मिलीलीटर | ||
| 20% के बीच-20 | ०.५ एमएल | ||
| 20% एसडीएस | ०.५ एमएल | ||
| 10 मिलीग्राम/एमएल सामन शुक्राणु डीएनए (जोड़ने से पहले स्वभाव) | 2 मिलीलीटर | ||
| RNase नि: शुल्क पाणी | ४.४ एमएल | ||
| नोट: समाधान एक disposible ५० एमएल ट्यूब में बनाया जा सकता है । सामन शुक्राणु के समाधान के लिए जोड़ने से पहले 5 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक पर उबलते द्वारा विकृत किया जाना चाहिए । | |||
| संकरण बफर (४७ मिलीलीटर) | जोड़ें | ||
| Formamide | 25 मिलीलीटर | ||
| 20X एसएससी (पीएच ४.५) | १२.५ एमएल | ||
| 20 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन | ०.१ एमएल | ||
| 50X Denhardts | 5 मिलीलीटर | ||
| 20% के बीच-20 | ०.५ एमएल | ||
| 20% एसडीएस | ०.५ एमएल | ||
| 10 मिलीग्राम/एमएल सामन शुक्राणु डीएनए (जोड़ने से पहले स्वभाव) | 2 मिलीलीटर | ||
| RNase नि: शुल्क पाणी | 1 मिलीलीटर | ||
| नोट: समाधान एक disposible ५० एमएल ट्यूब में बनाया जा सकता है । सामन शुक्राणु के समाधान के लिए जोड़ने से पहले 5 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक पर उबलते द्वारा विकृत किया जाना चाहिए । | |||
| 10x पंजाबियों (१.० एल) | जोड़ें | ||
| १८.६ मिमी णः2पो4 | २.५६ छ | ||
| ८४.१ मिमी ना2HPO4 | ११.९४ छ | ||
| १,७५० मिमी NaCl | १०२.२ छ | ||
| नोट: एक १.० एल मात्रा के लिए पानी की लगभग ८०० मिलीलीटर में फॉस्फेट मिक्स । पीएच की जांच करें । यह ७.४ ± ०.४ होना चाहिए । अन्यथा एचसीएल के NaOH के साथ ७.४ को पीएच समायोजित करें । NaCl और बाकी पानी डालें । बाद पीएच आटोक्लेव समायोजित किया है । | |||
| 20X एसएससी (१.० एल) | जोड़ें | ||
| ३ मीटर NaCl | १७५.३ छ | ||
| ०.३ M न साइट्रेट | ८८.२ छ | ||
| नोट: एक १.० एल मात्रा में लाने के लिए RNase मुक्त पानी के बारे में ८०० मिलीलीटर में मिश्रण । ४.५ और आटोक्लेव के लिए पीएच समायोजित करें । | |||
| alkaline फॉस्फेट (एपी) बफर w/o MgCl2 (५० मिलीलीटर) | जोड़ें | ||
| १ मी NaCl | ५.० एमएल | ||
| 1 मीटर Tris, पीएच ९.५ | ५.० एमएल | ||
| 20% के बीच-20 | १.२५ एमएल | ||
| RNase नि: शुल्क पाणी | ३८.७५ एमएल | ||
| नोट: सिर्फ एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में उपयोग करने से पहले तैयार करें । | |||
| क्षारीय फॉस्फेट (एपी) बफर (१०० मिलीलीटर) | जोड़ें | ||
| १ मी NaCl | १०.० एमएल | ||
| 1 M MgCl2 | 5 मिलीलीटर | ||
| 1 मीटर Tris, पीएच ९.५ | 10 मिलीलीटर | ||
| 20% के बीच-20 | २.५ एमएल | ||
| RNase नि: शुल्क पाणी | ७२.५ एमएल | ||
| नोट: सिर्फ एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में उपयोग करने से पहले तैयार । समाधान कुछ घंटों के बाद बादल बन जाएगा और एंजाइमी प्रतिक्रिया के लिए काम नहीं करेगा । | |||
| एपी सब्सट्रेट समाधान | जोड़ें | ||
| एपी बफर | 25 मिलीलीटर | ||
| एनबीटी | ८२.५ उल | ||
| BCIP | ८२.५ उल | ||
| नोट: इस के बजाय बीएम बैंगनी इस्तेमाल किया जा सकता है । सिर्फ एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में उपयोग करने से पहले तैयार करें । पंनी में ट्यूब को कवर करके अंधेरे में इस समाधान रखें, और कम रोशनी में तैयारी । | |||
| Proteinase कश्मीर स्टॉक समाधान (10 मिलीग्राम/ | जोड़ें | ||
| Proteinase K | 10 मिलीग्राम | ||
| RNase नि: शुल्क पाणी | 10 मिलीलीटर | ||
| नोट: Aliquot और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । | |||
| Proteinase कश्मीर कार्य समाधान | जोड़ें | ||
| Proteinase कश्मीर स्टॉक समाधान | ९० उल | ||
| 1x पंजाब | 18 मिलीलीटर | ||
| नोट: बस सबसे अच्छा परिणाम के लिए उपयोग करने से पहले बनाओ । | |||
| ०.२% glycine-पंजाबियों समाधान | जोड़ें | ||
| 10x पंजाब | ४५ एमएल | ||
| RNase नि: शुल्क पाणी | ४०५ एमएल | ||
| Glycine | 1 ग्राम | ||
| नोट: autoclaved ग्लास कंटेनर में तैयार करें । glycine पूरी तरह से भंग है जब तक एक हलचल प्लेट पर कमरे के तापमान पर मिश्रण । | |||
| Boehringer-मैनहेम अवरुद्ध बफर (30 एमएल) (खुदाई धोने और ब्लॉक बफर सेट का हिस्सा) | जोड़ें | ||
| 10x अवरुद्ध समाधान | 3 मिलीलीटर | ||
| 1x पुरुष एसिड बफर | 27 मिलीलीटर | ||
| नोट: बस सबसे अच्छा परिणाम के लिए उपयोग करने से पहले बनाओ । स्टॉक अवरुद्ध समाधान और पुरुष एसिड बफर "खुदाई धोने और ब्लॉक-बफर सेट" से इस्तेमाल किया गया । | |||
| 4x एसएससी — 50% formamide (30 एमएल) | जोड़ें | ||
| 20X एसएससी | 6 मिलीलीटर | ||
| ५०% formamide | 24 एमएल | ||
| नोट: सिर्फ ५० मिलीलीटर ट्यूब में उपयोग करने से पहले तैयार करें । प्रयोगशाला हूड के तहत तैयार करें । | |||
| ग्लिसरॉल बढ़ते मीडिया | जोड़ें | ||
| ५० मिमी Tris, पीएच ८.४ | ८० µ l | ||
| ग्लिसरॉल | 20 µ l | ||
तालिका 1: प्रदर्शन के लिए स्टॉक समाधान सीटू में संकरण । तालिका इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक विभिंन स्टॉक समाधानों की एक सूची है । कुल राशि लगभग 2 स्लाइड मेलर के प्रदर्शन के लिए अनुमानित हैं । यह कार्रवाई की जा रही है कि स्लाइड की राशि के आधार पर कुल राशि को समायोजित करने की सलाह दी है ।
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Discussion
विधि इस प्रोटोकॉल में वर्णित चिकित्सा और विकासवादी विकासात्मक अनुसंधान में पिछले काम से संशोधित किया गया है8,9,10,12,17। इस प्रोटोकॉल एक खुदाई के साथ सीटू संकरण में एक की बारीकियों पर केंद्रित है, वयस्क मूंगों, जो संरक्षित और आयल में एंबेडेड है पर आरएनए विरोधी भावना जांच लेबल । इस विधि से कोरल से परे जीवों के नमूनों को आसानी से हस्तांतरित किया जा सकता है जो कि आयल-एंबेडेड भी किया गया है । अंत में, इस विधि कोरल के विभिंन जीवन चरणों के दौरान प्रदर्शन किया जा सकता है (जैसे, लार्वा) या सेल संस्कृतियों के भीतर है, लेकिन सटीक प्रोटोकॉल नमूने के उन प्रकार के बाद से अलग हो सकता है हमेशा नहीं कर रहे है आयल-एंबेडेड5,6 .
इस प्रोटोकॉल में कई अहम कदम उठाए गए हैं, जिनमें proteinase K treatment, जांच की संकरण, और जांच के रंग का विकास शामिल है । proteinase K उपचार के दौरान, समय बहुत महत्वपूर्ण है । यदि उपचार का सुझाव दिया से अधिक है, ऊतकों नीचा और क्षतिग्रस्त हो सकता है । इसके अतिरिक्त, proteinase कश्मीर प्रतिक्रिया के रोक पूर्ण समय निर्दिष्ट बिंदु पर किया जाना चाहिए । यह भी एक निरंतर संकरण तापमान पर नमूना रखने के लिए महत्वपूर्ण है, तापमान के कम करने के रूप में जांच और जटिल परिणाम के गैर विशिष्ट बाध्यकारी पैदा कर सकता है । जब जांच को दूर करने के लिए, यह एक समय में एक संकरण ओवन से बाहर प्रत्येक स्लाइड लेने के बजाय एक बार में सभी के लिए महत्वपूर्ण है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्लाइड एक कम तापमान पर जांच के साथ संकरण नहीं है । इसके अलावा, जांच संकरण के बाद स्लाइड की पूरी तरह से धुलाई गैर विशिष्ट बाध्यकारी को रोकने में मदद मिलेगी । अंत में, जांच के रंग विकास इस प्रक्रिया के सबसे महत्वपूर्ण अभी तक व्यक्तिपरक कदम में से एक है । रंग का विकास आसानी से किया जा सकता है या overdone भी जल्द ही बंद कर दिया । इस कदम के लिए धैर्य और सतर्कता की आवश्यकता है सुनिश्चित करें कि अधिक से अधिक धुंधला स्लाइड नहीं होती है ।
इस प्रोटोकॉल समस्या निवारण एक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया शामिल कदम की संख्या के कारण हो सकता है । यदि प्रोटोकॉल नकारात्मक परिणाम पैदावार, तो यह सबसे अच्छा है जांच की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि यह विरोधी भावना (और नहीं भावना) जांच से शुरू करते हैं । इसके अतिरिक्त, अगर समाधान पुराने हैं, यह करने लायक है या उंहें जगह तो वे ताजा जब इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन कर रहे हैं । ऐसे संकरण और अवरुद्ध की लंबाई के रूप में संशोधन, जांच संकरण या पृष्ठभूमि और गैर विशिष्ट धुंधला की मात्रा को कम करने की संभावना को बढ़ाने के लिए लागू किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में कदम की उच्च संख्या के कारण, यह ट्रैक खोने के लिए आसान हो सकता है; इसलिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए संगठित रहना और ट्रैक जो प्रोटोकॉल के कुछ हिस्सों को पूरा किया गया है । इसके अतिरिक्त, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कोई कदम छोड़ दिया जाता है, और उस समय नीचे की मशीन और धुल के दौरान कटौती नहीं है । अंगूठे का एक अच्छा नियम है कि सभी स्लाइड अच्छी तरह से साफ कर रहे हैं सुनिश्चित करने के बजाय कम बहाकर के लिए अब अनुमति देने के लिए है ।
इस विधि की सबसे बड़ी सीमा है कि परिणाम quantifiable नहीं कर रहे हैं । यह एक गुणात्मक तरीका है कि, इस तरह के प्रोटोकॉल, transcriptomics, और प्रोटियोमिक् के रूप में अंय तरीकों के साथ संगीत कार्यक्रम में, बहुत जानकारीपूर्ण है । संकरण बार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दृश्य के दौरान व्यक्तिपरक समय में बदलाव के कारण, धुंधला की तीव्रता को बढ़ाता है आसानी से पूरा नहीं है । यह कहना है कि एक जांच अधिक उच्च अगर यह अधिक से अधिक तीव्रता से पता चलता है, लेकिन इस प्रोटोकॉल में बदलाव के कारण (जैसे रंग विकास के लिए अनुमति समय की राशि के रूप में), जीन अभिव्यक्ति राशि निर्धारित नहीं किया जा सकता है मोहक है ।
इस तकनीक जीव विज्ञान में एक नई विधि नहीं है; हालांकि, यह एक वयस्क कोरल पर बहुत बार प्रदर्शन नहीं किया है । वयस्क मूंगों पर इस विधि का उपयोग बहुत शक्तिशाली है क्योंकि यह एक ऊतक या एक सेल प्रकार11के लिए जीन अभिव्यक्ति डेटा लंगर । Transcriptomics और जीनोमिक्स लोकप्रिय और कोरल जीवविज्ञान में शक्तिशाली उपकरण बन गए हैं; हालांकि, इन तरीकों आम तौर पर पूरे जानवर के homogenates पर किया जाता है । यह यह पहचान करने के लिए जो कोरल के कुछ हिस्सों हित के जीन व्यक्त कर रहे है चुनौतीपूर्ण बनाता है, और इस प्रकार और अधिक वास्तविक तंत्र को समझने के लिए चुनौतीपूर्ण । जीन अभिव्यक्ति डेटा के साथ ISH के उपयोग के माध्यम से, एक और अधिक समग्र दृष्टिकोण कहां और किस हद तक जीन व्यक्त कर रहे है प्राप्त किया जा सकता है । यह बहुत वयस्क मूंगों में अलग तनाव प्रतिक्रिया रास्ते के लिए जिंमेदार तंत्र की समझ में मदद मिलेगी ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम के द्वारा वित्त पोषित किया गया पुरस्कार सं. ॉचे-१३२३६५२ के माध्यम से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन महासागर विज्ञान Postdoctoral फैलोशिप और पुरस्कार सं 1012629 बरोज वेलकम फंड Postdoctoral संवर्धन कार्यक्रम से ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
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