Summary
Цель настоящего Протокола заключается в выполнить в situ гибридизация на взрослых коралловые образцы, которые заливали в парафин и секционного на стеклянных вставках. Это качественный метод, используемый для визуализации пространственное выражение смысл борьбы с зонд РНК в парафин врезанных тканей.
Abstract
Кораллы являются важные Морские беспозвоночные, которые имеют решающее значение для общего здоровья океана, а также здоровья человека. Однако из-за воздействия человека, таких, как повышение температуры океана и окисление океана, кораллы все чаще оказываются под угрозой. Для решения этих проблем, прогресс в клеточной и молекулярной биологии доказали исключительно важное значение для диагностики здоровья кораллов. Изменив некоторые из методов, обычно используемых в человеческой медицине может значительно улучшить исследователей возможности лечения и сохранения кораллов. Для решения этой проблемы, протокол в situ гибридизация используется главным образом в человеческой медицине и эволюционной биологии развития был адаптирован для использования в взрослых кораллы стрессу.
Этот метод предназначен для визуализации пространственное выражение РНК зонда в взрослых коралловые ткани, заливали в парафин и секционного на стеклянных вставках. Этот метод фокусируется на удаление парафина и регидратации образца, подготовка образца для обеспечения проницаемость образца, предварительно гибридизации инкубации, гибридизация зонда РНК и визуализация РНК зонда. Это мощный метод при использовании не модельные организмы обнаружить конкретные гены выражены, где протокол может быть легко адаптирована для других организмов-модель. Однако метод является ограниченным в том, что это прежде всего качественные, потому что выражения интенсивности может варьироваться в зависимости от количества времени, во время этапа визуализации и концентрация зонда. Кроме того требуется терпение, как этот протокол может занять до 5 дней (и во многих случаях дольше) в зависимости от используемого зонда. Наконец фон неспецифичный пятнать является общим, но это ограничение можно преодолеть.
Introduction
Кораллы являются строители критических экосистем и важное значение для биоразнообразия в океане и здоровья человека1,2,3. Они находятся под угрозой из-за изменения климата и других антропогенных факторов стресса, и многих видов кораллов, считаются в критическом состоянии. Таким образом существует значительная потребность в клеточном и молекулярном инструменты для диагностики кораллов в состоянии стресса. Кроме того существует мало понято о где гены выражены в взрослых коралловые ткани и поэтому мало понимания функции этих генов. Для решения этой проблемы, мы адаптировали в situ гибридизация (ISH) протокол, широко используется в медицине и эволюционной биологии развития, для использования на образцах парафин врезанных тканей взрослого кораллов. Этот метод является наиболее мощным средством, когда используются на взрослых кораллов, которые пережили стрессовые события, например воздействия теплового стресса. Однако этот метод может быть использован на широкий спектр тканей и этапов жизни в кораллов и не ограничивается только тепло подчеркнул кораллы4,6,7. Кроме того этот метод может использоваться на ткани или клетки любого многоклеточные, пока существует cDNA последовательности информации.
Этот метод предназначен для визуализации РНК зондов в взрослых коралловые ткани, которая была сохранена и заливали в парафин и секционного на слайды. Этот метод является мощный диагностический инструмент, который позволяет для визуализации нуклеиновых кислот в взрослых коралловые ткани. Первоначально этот метод был разработан для медицинской диагностики, и с тех пор она стала популярным инструментом в таких областях, как биология развития и эволюционной биологии развития8,9,10. ISH также критического метода, особенно в системах-модель, когда геномных и транскриптомики последовательность данных доступны но картин выражения гена пространственных неизвестны. Для диагностики работы в системах-модели этот метод является мощным, поскольку он может указать, какие клетки и ткани Экспресс ген интереса и может привести к более целенаправленной терапевтические подходы8,9,10, 11,12. Наконец этот метод качественных и более мощным, когда в паре с количественный ген выражение данных11.
Подход, изложенный в настоящем документе будет представлять интерес для исследователей, которые уже разработали digoxigenin (DIG)-помечены РНК зонд (смысл и antisense зонды) и являются теперь готовы выполнить в situ Гибридизация зондов для образца. Для выполнения этого метода, два последовательных секций коралловые парафин ткани будет необходимо для каждого зонда тестируется. Одна секция будет использоваться для чувство зонд и другой для антисмысловых зонд. Зонд смысле будет элемент управления для указания привязки неспецифические. Если окрашивание наблюдается в смысле зонд, антисмысловых зонд не специфичные для РНК интерес. Датчики могут быть разработаны для любого гена выразил. В настоящем Протоколе, которые были ранее признаны будут выражены в ходе тепловой стресс в кораллы используются несколько примеров: FBJ мышиных остеосаркома вирусного онкогена гомолога (Fos-Б), протеин активатор (ДП-1) и фактор некроза опухоли рецепторов 41 (TNFR 41)11. ИШ, с использованием зондов DIG-меченых РНК является предпочтительным по сравнению с использованием радиоактивных зонды, потому что их обработка гораздо безопаснее10. Кроме того этот метод очень чувствительна и может быть выполнена на широкий спектр тканей и эмбрионов за тепло подчеркнул взрослых кораллы13,14,,1516.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Удаление парафина
Предупреждение: Выполните следующие действия под вытяжного шкафа.
- DEWAX слайды тонкий секционного парафин врезанных с 100% ксилола под капот в стеклянных банках Coplin за 10 мин. Не используйте пластиковые баночки Coplin, как Ксилол расплавов пластика. Стерилизуйте банки Coplin в автоклаве перед использованием.
- Подготовка четырех стерильные стеклянные банки Coplin следующим: 100% этанола, 80% этанола, этанол 70% и 60% этанола. Разбавьте этанола с РНКазы свободной воды.
- Перенести слайды в стерильную стеклянную банку Coplin с 100% этанола и замочить их на 10 мин. После 10 минут пустые опарник Coplin стекла и заменить на новые 100% этанола. Замочите слайды снова за 10 мин.
- Перенести слайды опарник Coplin стерильных стеклянных с 80% этанола за 1 мин.
- Перенести слайды в стерильную колбу Coplin с 70% этанола за 1 мин.
- Перенести слайды опарник Coplin стерильных стеклянных с 60% этанола за 1 мин.
2. Подготовка слайдов для подготовки РНК зонд гибридизации
- Выполните следующие смывки при комнатной температуре, если не указано иное. Выполните комнатной температуре моет на орбитальный шейкер на медленной скорости. Используйте стерильные слайд конверты с комнатой для до пяти слайды для мытья слайды.
- Передавать слайды стерильных слайд Мейлер с 18 мл 1 x-фосфатный буфер (PBS). Мыть в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Слить ПБС и немедленно лечить ткани на слайдах с протеиназы K чтобы зонд проникновения ткани. Добавить примерно 18 мл раствора протеиназы K слайд Мейлер (см. таблицу 1 для работы концентрация раствора). Инкубируйте при 37 ° C 15 мин. Не трясите.
- В то время как инкубировать слайды, подготовьте prehybridization буферу (Prehybe). Место Prehybe буфер в кипящей водяной бане 10 минут, а затем охладить на ледяной бане на 5 мин. Рецепт Prehybe буфера см. таблицу 1.
- Остановить пищеварение протеиназы K реакции, наливая раствор протеиназы K и сразу же добавить 18 мл 0,2% раствора глицина PBS в почтовой программе слайд. Пусть слайд Мейлер постоять 5 мин при комнатной температуре.
- Вылейте 0,2% раствор глицина PBS и добавьте 18 мл раствора соли натрия цитрат (SSC) 2 x каждый слайд mailer. Вымойте слайды в 2 x SSC 10 мин при комнатной температуре, с встряхивания на 100-150 об/мин.
3. prehybridization слайдов в рамках подготовки к РНК зонд гибридизации
- В то время как слайды промывают 2 x SSC, получить новую стерильную слайд почтовой и положить примерно 18 мл Prehybe буфера в почтовой программе слайд. Поместите слайд Мейлер в печь гибридизации Гибридизация температуре.
Примечание: Гибридизации температура будет зависеть от зонда используется но обычно колеблется от 50-60 ° C. - После завершения 2 x SSC вымыть, залить 2 x SSC и место слайды в рамках почтовой слайда в буфер Prehybe в печь гибридизации за 1 ч.
4. гибридизация зонда РНК
- В то время как слайды инкубации с Prehybe буфер в печь гибридизации, приготовляют раствор гибридизация зонда.
- Разбавьте каждый зонд гибридизации буфера (0.5 мкл с 24,5 мкл буфера гибридизации зонда).
Примечание: Рецепт для гибридизации буфера содержится в таблице 1. Пример подготовка зонда и концентрации можно найти в Traylor-Ноулз и др. 11. - Место разреженных зонд на блок тепла 86-90 ° C для 12 мин, а затем охладить в течение 1 мин на льду.
- Разбавьте каждый зонд гибридизации буфера (0.5 мкл с 24,5 мкл буфера гибридизации зонда).
- Удалить слайд mailer из духовки гибридизации и индивидуально удалять слайды от mailer слайд, с использованием стерильных пинцетов. Положите слайды плашмя на бумажное полотенце и тщательно вытрите избыток Prehybe буфера вокруг образцы тканей. Будьте осторожны, чтобы не коснуться образцы и работать быстро, чтобы предотвратить высыхание образцов ткани.
- Окружить ткани с ручкой PAP. Применить 25 мкл разбавленного зонд раствора с пипеткой и охватывают образца с пластиковой coverslip.
- Поместите образцы в зале влаги слайд с 4 x SSC + 50% формамида раствора в нижней части камеры.
- После того, как датчики были добавлены ко всем слайдам, место в камеру влаги слайд в печь гибридизации для по крайней мере 24 часа при температуре гибридизации 50-60 ° C. Время инкубации может варьироваться в зависимости от концентрации зонда, но должен быть минимум 24 часа.
- После ночи инкубации с разбавленным зонды снимите камеру влаги слайд из духовки гибридизации.
- Удалите coverslips из каждого из слайдов, соблюдая осторожность, чтобы не вытеснять в ткани. В 1000 мкл пипетки 1000 мкл раствора 2 x SSC и аккуратно смойте слайд.
- Место слайда в стерильных слайд почтовой с 18 мл раствора 2 x SSC 5 минут при комнатной температуре. Вылейте раствор и заменить его с 18 мл свежего 2 x SSC. Повторите инкубации за 5 мин при комнатной температуре с нежным встряхивания.
- Слить 2 раствор x SSC. Добавьте 18 мл 1 x SSC раствора и мыть за 5 мин при комнатной температуре. Слить раствор 1 x SSC и заменить ее с 18 мл свежего 1 x SSC. Повторите инкубации за 5 мин при комнатной температуре с нежным встряхивания.
- Вылейте 1 x SSC. Добавьте 18 мл 0,5 x SSC и мыть за 10 мин при 42 ° C без встряхивания. Залить 0,5 x SSC и заменить его с 18 мл свежего 0,5 x SSC. Снова вымыть за 10 мин при 42 ° C без встряхивания.
5. Визуализация РНК зонд
Примечание: Для визуализации зонд, BM фиолетовый будет использоваться в процессе разработки. Однако прежде чем этот шаг, несколько моек обязаны подготовить образцы для окрашивания.
- Вымойте слайды с 18 мл щелочной фосфатазы (AP-буферу) без MgCl2 за 1 мин излить AP-буфера без MgCl2и добавить 18 мл 1 x блокировки буфера Boehringer-Мангейм разбавляют буфером малеиновой кислоты. Инкубируйте по крайней мере 1 ч при комнатной температуре в почтовой слайд с нежным встряхивания.
Примечание: Boehringer-Мангейм блокирующий буфер малеиновой кислоты буфер, используемый преждевременный и были приобретены в DIG мыть и набора блоков буфера (имеющиеся коммерчески).- Кроме того инкубации на ночь при 4 ° C может быть выполнена. Больше блокирующий период будет уменьшить проявления неспецифической привязки.
- Подготовка 20 мл разбавленной DIG анти digoxigenin-AP Fab фрагментов (антитела анти КОПАТЬ = 2 мкл антител анти КОПАТЬ + 20 мл 1 x Boehringer-Мангейм блокирующий буфер). Это достаточно для использования в 1 почтовой пластиковых слайдов. Больше этого решения должны быть готовы, если более чем один слайд почтовая программа будет использоваться.
- Добавление новой почтовой стерильные слайд антитела анти КОПАТЬ и передавать слайды слайд Мейлер с раствор антител анти КОПАТЬ. Инкубации при комнатной температуре 3 h с нежным встряхивания.
- После инкубации слейте антитела анти КОПАТЬ и мыть слайды в почтовой слайд с 18 мл AP-буфера без MgCl2 для 5 мин с нежным встряхивания.
- Вылейте в AP-буфер без MgCl2 и добавить 18 мл AP-буфера. Мыть за 5 мин с нежным встряхивания. После 5 минут инкубации слить AP-буфер, заменить его с 18 мл свежего AP-буфера и мыть за 5 мин с нежным встряхивания.
- В темноте вылейте AP-буфера и добавьте 18 мл BM фиолетовый слайд mailer. Инкубируйте слайды при комнатной температуре в темноте, проверка для развития фиолетовый цвет, который будет меняться каждые ½ ч. время реакции для визуализации на основе зонд, который в настоящее время разрабатывается.
Примечание: Вместо визуализация BM фиолетовый, разработка решения можно с помощью 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (ПКВП) и нитро синий tetrazolium (НБТ). Инструкции смотрите в таблице 1 . - Остановите развитие цвета путем передачи слайдов на новой почтовой стерильные слайд с 18 мл буфера Tris-ЭДТА (TE) за 5 мин при комнатной температуре, в темноте.
- Слейте буфер TE и добавьте 18 мл РНКазы свободной воды слайд почтовой и мыть за 1 мин., в темноте.
- Удалите слайды из воды и высушите их вокруг краев ткани. Добавьте глицерин монтажа средних и место coverslips. Храните слайды при температуре 4 ° C, пока не готовы принимать фотографии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После завершения этого протокола, будет достигаться идентификации клеток и тканей, которые выражают РНК зонд интерес. Представитель результаты для этого протокола являются для AP-1, FosB и TNFR41. Эти результаты, ранее опубликованные Traylor-Ноулз и др. 11, показывают пространственное выражение РНК зонды на взрослых кораллов, которые подверглись воздействию теплового стресса. На рисунке 1представлены два примера различных типов окраски. Рисунок 1A является примером диффузных ткани окрашивания. Пятно встречается по всей ткани, не только в конкретных клеток. Здесь выражение анти чувство AP-1 находится на протяжении эпидермиса и устные gastrodermis11 (рис. 1A). Окрашивание диффузных и не сегрегации в одной из ячеек типа. Для этого типа окрашивания это особенно важно для запуска управления смысле в то же время, как некоторые из результатов может объясняться неспецифичный пятнать.
Второй тип окрашивания зависит от ячейки, в котором пятно можно найти только в типах конкретных клеток. FosB (рис. 1B) и TNFR41 (рис. 1 c) Показать этот тип окрашивания. Оба эти зонды были использованы на образцы тканей взрослого кораллов, которые подверглись воздействию теплового стресса11. В панели анти смысле наблюдается фиолетового окрашивания. TNFR41 была выражена в различных типах cnidocytes, семейство типов клеток, можно найти только в пределах книдарий (рис. 1). В частности он витражи, nematocytes, которые производят microbasic mastigophore органеллы (нематоцист) и spirocytes, которые производят spirocysts, все найденные в пределах эпидермиса коралловых ткани. Nematocytes также находятся в другие слои ткани кораллов, например calicodermis; Однако из-за на этом конкретном примере секционирование, не может быть собрана эта информация. FosB также витражи cnidocytes и был к spirocytes и nematocytes. Для обоих этих преобразователей смысл управления показал, не окрашивание, указывающее, что действительно конкретный пятнать для смысл борьбы с зонд. Это лишь два типа представительных результатов (диффузный ткани окрашивание и окрашивания клеток конкретных) пятная методов, которые могут быть представлены с различными типами датчиков. Благодаря этой изменчивости важно использовать элемент управления смысле определить неспецифичный пятнать.
Рисунок 1: представитель итоги ISH, что окрашенные конкретных ячеек. (A) в первой группы чувство контроля для зонда AP-1 показывает, что мало пятнать присутствует в слайд. На второй панели смысл борьбы с зонд для AP-1 показывает, что окрашивание с этот зонд диффузных всей ткани. Пятно для устной gastrodermis и эпидермиса. С этим типом окрашивания важно для запуска смысл управления, чтобы убедиться, что наблюдается окрашивание конкретных. (B смысле управления для FosB зонд на первой панели показывает, мало пятнать настоящего. На второй панели смысл борьбы с зонд для FosB показывает пятнать специфичные для spirocytes и nematocytes, с диффузных окрашивания на протяжении эпидермиса и оральный gastrodermis. (C) в первой группы смысл управления для TNFR 41 зонд показывает, что мало пятнать присутствует на слайде. На второй панели смысл борьбы с зонд для TNFR 41 показывает конкретный пятнать в spirocytes, nematocytes и microblastic mastigophores. Сокращения: spirocytes (SP), symbiodium (Си), nematocyte (NE), microbasic mastigophores (мм), содержащие Симбионт gastrodermal клеток (SU). Эта цифра была воспроизводится с разрешения11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Примечание: Все разведения должно быть сделано с стерильной, РНКазы свободной воды в газобетона посуда. | |||
| Prehybe буфер (50 мл) | ДОБАВИТЬ | ||
| Формамид | 25 мл | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12,5 мл | ||
| 20 мг/мл гепарина | 0,1 мл | ||
| 50 X Denhardts | 5 мл | ||
| 20% Tween-20 | 0,5 мл | ||
| 20% SDS | 0,5 мл | ||
| 10 мг/мл спермы лосося ДНК (денатурировать перед добавлением) | 2 мл | ||
| РНКазы свободной воды | 4.4 мл | ||
| Примечание: Решения могут быть сделаны в одноразового 50 мл трубки. Лосося спермы следует денатурированный путем кипячения в блоке тепла для 5 минут перед добавлением раствора. | |||
| Гибридизация буфера (47 мл) | ДОБАВИТЬ | ||
| Формамид | 25 мл | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12,5 мл | ||
| 20 мг/мл гепарина | 0,1 мл | ||
| 50 X Denhardts | 5 мл | ||
| 20% Tween-20 | 0,5 мл | ||
| 20% SDS | 0,5 мл | ||
| 10 мг/мл спермы лосося ДНК (денатурировать перед добавлением) | 2 мл | ||
| РНКазы свободной воды | 1 мл | ||
| Примечание: Решения могут быть сделаны в одноразового 50 мл трубки. Лосося спермы следует денатурированный путем кипячения в блоке тепла для 5 минут перед добавлением раствора. | |||
| 10 X PBS (1,0 Л.) | ДОБАВИТЬ | ||
| 18.6 mM NaH2PO4 | 2.56 g | ||
| 84.1 мм Na2HPO4 | 11.94 g | ||
| 1,750 мм NaCl | 102.2 g | ||
| Отмечает: Смесь фосфатов в около 800 мл воды объемом 1,0 Л. Проверьте рН. Она должна быть 7.4 ± 0,4. В противном случае отрегулируйте рН 7,4 с NaOH HCl. Добавить NaCl и остальной части воды. После того, как рН является скорректированной автоклава. | |||
| 20 X SSC (1,0 Л.) | ДОБАВИТЬ | ||
| 3 M NaCl | 175.3 g | ||
| 0,3 М Na цитрат | 88.2 g | ||
| Отмечает: Смешайте в около 800 мл РНКазы свободной воды довести до 1,0 л. Отрегулируйте пэ-аш 4.5 и автоклав. | |||
| Щелочная фосфатаза (АР) буфера MgCl2 (50 мл) | ДОБАВИТЬ | ||
| 1 M NaCl | 5,0 мл | ||
| 1 М трис, рН 9,5 | 5,0 мл | ||
| 20% Tween-20 | 1,25 мл | ||
| РНКазы свободной воды | 38,75 мл | ||
| Отмечает: Подготовьте только до использования в 50 мл трубки. | |||
| Щелочная фосфатаза (АР) буфера (100 мл) | ДОБАВИТЬ | ||
| 1 M NaCl | 10,0 мл | ||
| 1 М MgCl2 | 5 мл | ||
| 1 М трис, рН 9,5 | 10 мл | ||
| 20% Tween-20 | 2,5 мл | ||
| РНКазы свободной воды | 72.5 мл | ||
| Примечания: подготовить только до использования в 50 мл трубки. Решение станет ясно после нескольких часов и больше не будет работать для ферментативной реакции. | |||
| Раствора субстрата AP | ДОБАВИТЬ | ||
| AP-буфер | 25 мл | ||
| НБТ | 82.5 uL | ||
| ПКВП | 82.5 uL | ||
| Примечания: это может быть использовано вместо BM фиолетовый. Подготовьте только до использования в 50 мл трубки. Держите это решение в темноте, покрывая трубки в фольге и подготовка в условиях низкой освещенности. | |||
| Стоковый раствор протеиназы K (10 мг/мл) | ДОБАВИТЬ | ||
| Протеиназы K | 10 мг | ||
| РНКазы свободной воды | 10 мл | ||
| Отмечает: Алиготе и хранить при температуре от-20 ° C. | |||
| Протеиназы K рабочего раствора | ДОБАВИТЬ | ||
| Стоковый раствор протеиназы K | 90 ul | ||
| ПБС | 18 мл | ||
| Отмечает: Сделайте просто до использовать для достижения наилучших результатов. | |||
| 0,2% раствор глицина PBS | ДОБАВИТЬ | ||
| 10 X PBS | 45 мл | ||
| РНКазы свободной воды | 405 мл | ||
| Глицин | 1 g | ||
| Примечания: подготовить в газобетона стеклотары. Смесь при комнатной температуре на stirer плите до полного растворения глицин. | |||
| Boehringer Мангейм блокирование буфера (30 мл) (частью DIG мыть и блок буфера набора) | ДОБАВИТЬ | ||
| 10 x преграждая разрешение | 3 мл | ||
| 1 x малеиновой кислоты буфера | 27 мл | ||
| Примечания: сделать просто до использовать для достижения наилучших результатов. Стоковый раствор преграждать и малеиновой кислоты буфера были использованы от «DIG мыть и блок-буфера набор». | |||
| 4 X SSC — 50% формамида (30 мл) | ДОБАВИТЬ | ||
| 20 X SSC | 6 мл | ||
| 50% формамида | 24 мл | ||
| Отмечает: Подготовьте только до использования в Тюбик 50 мл. Подготовка под капотом лаборатории. | |||
| Глицерин монтажа СМИ | ДОБАВИТЬ | ||
| 50 мм трис, рН 8,4 | 80 МКЛ | ||
| Глицерин | 20 МКЛ | ||
Таблица 1: Stock решения для выполнения на месте гибридизации. В таблице приведен список различных фондовых решений, необходимых для этого протокола. Суммы рассчитаны на производительность приблизительно 2 слайд конверты. Рекомендуется скорректировать суммы, основанные на количество слайдов, которые в настоящее время обрабатываются.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный в настоящем протоколе был изменен с предыдущей работы в медицинских и эволюционного развития исследований8,9,10,12,17. Этот протокол посвящен нюансы в situ гибридизация с DIG-меченых РНК смысл борьбы с зонд на взрослых кораллов, которые были сохранены и заливали в парафин. Этот метод может быть легко передана образцы организмов за пределами кораллов, которые также были парафин врезанных. Наконец этот метод может быть выполнена во время различных этапах жизни кораллов (например, личинка) или в клеточных культурах, но точный протокол могут отличаться, так как эти типы образцов не всегда парафин врезанных5,6 .
Существует несколько важных шагов в этом протоколе, включая лечение протеиназы K, гибридизация зонда и цвет развития зонда. Во время лечения протеиназы K сроки является очень важным. Если лечение длиннее, чем предложил, тканей может стать деградировавших и повреждены. Кроме того остановка реакции протеиназы K должны выполняться в указанной точке полное время. Важно также, чтобы сохранить образца при температуре постоянных гибридизации, как снижение температуры может вызвать неспецифические привязки зонда и усложнить результаты. После смывания зонд, важно принять каждый слайд из духовки гибридизации, один на один раз, а не все сразу, чтобы обеспечить, что слайды не гибридизируйте с зондом при низкой температуре. Кроме того тщательное мытье слайды после гибридизации зонда поможет предотвратить неспецифической привязки. И наконец цвет развитие зонд является одним из наиболее критических еще субъективные шагов этого процесса. Цвет развития можно легко преувеличено или остановлена слишком скоро. Этот шаг требует терпения и бдительность, чтобы обеспечить, что чрезмерное окрашивание слайды не происходит.
Устранение неполадок Этот протокол может быть непростой процесс из-за количество шагов. Если протокол дает отрицательный результат, то лучше всего начать с изучения зонд, чтобы убедиться, что это анти (и не чувство) зонд. Кроме того если решения являются старые, стоит переделку или их замены, так они свежие, при выполнении настоящего Протокола. Изменения, например длины гибридизации и блокировки, может быть реализован для увеличить шансы гибридизация зонда или сокращения количества фона и неспецифичный пятнать. Из-за высокого числа шагов в этом протоколе может быть легко потерять трек; Таким образом важно, чтобы оставаться организованным и отслеживать, какие части протокола были завершены. Кроме того важно обеспечить что никакие шаги пропускаются, и это время не вырубаются во время инкубаций и моет. Хорошее правило большого пальца является возможность для более чем короче смывки для обеспечения тщательно очистить все слайды.
Крупнейших ограничение этого метода является, что результаты не являются количественно. Это качественный метод, который, в сочетании с другими методами, например, гистология, transcriptomics и протеомики, очень информативный. Из-за различия в гибридизации раз, а также субъективные раз во время визуализации количественная оценка интенсивности окрашивания не выполняется легко. Это соблазн сказать, что зонд выражается более высоко если он показывает большей интенсивностью, но из-за различий в настоящем Протоколе (например, количество времени, допускается для развития цвета), не может быть определен ген выражение суммы.
Этот метод не является новым методом в биологии; Однако это одна не производится очень часто на взрослых кораллов. Использование этого метода на взрослых кораллов является очень мощным, потому что он закрепляет данных выражение гена в ткани или клетки типа11. Transcriptomics и геномика стали популярных и мощных инструментов в коралловых биологии; Однако эти методы обычно делается на гомогенатах всего животного. Это делает его трудно определить, какие части коралловых выражают гены интереса и таким образом более сложной для понимания реальных механизмов. Благодаря использованию иш наряду с данными выражения гена может быть достигнуто более целостный подход к где и в какой степени гены выражены. Это значительно поможет в понимании механизмов, отвечающих за путей реагирования различных стресс в взрослых кораллов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась премии нет. ВВЦ-1323652 через no.1012629 национальной науки фонд океана науки докторской стипендии и премии от Берроуз Уэллком фонда докторской программы обогащения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. , Oxford University Press. (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
