Summary
El objetivo de este protocolo es realizar la hibridación en situ en adultos muestras de corales que han sido incrustadas en parafina y seccionadas en portaobjetos de vidrio. Se trata de un método cualitativo utilizado para visualizar la expresión espacial de una sonda de RNA anti sentida en tejidos embebidos en parafina.
Abstract
Los corales son invertebrados océano importantes que son críticos para la salud general de los océanos y salud humana. Sin embargo, debido a los impactos humanos tales como el aumento de las temperaturas de océano y la acidificación del océano, los corales son cada vez más bajo amenaza. Para abordar estos desafíos, los avances en biología celular y molecular han demostrado para ser crucial para diagnosticar la salud de los corales. Modificar algunas de las técnicas utilizadas en medicina humana podría mejorar grandemente capacidad de los investigadores para tratar y salvar a los corales. Para hacer frente a esto, un protocolo para en situ hibridación utilizado principalmente en medicina humana y Biología del desarrollo evolutiva ha sido adaptado para su uso en adultos corales bajo estrés.
El propósito de este método es visualizar la expresión espacial de una sonda de RNA en tejido coral adulto que ha sido incluida en parafina y seccionadas en portaobjetos de vidrio. Este método se centra en la eliminación de la parafina y rehidratación de la muestra, tratamiento previo de la muestra para asegurar la permeabilidad de la muestra, pre-hibridación incubación, hibridación de la sonda de RNA y la visualización de la sonda de RNA. Este es un método eficaz al utilizar organismos no-modelo para descubrir donde se expresan genes específicos, y el protocolo puede ser fácilmente adaptado para otros organismos no-modelo. Sin embargo, el método es limitado en tanto que es principalmente cualitativo, porque la intensidad de la expresión puede variar dependiendo de la cantidad de tiempo utilizado durante la etapa de visualización y la concentración de la sonda. Además, la paciencia es necesaria, ya que este protocolo puede tomar hasta 5 días (y en muchos casos, más) dependiendo de la sonda se utiliza. Finalmente, la tinción de fondo inespecífica es común, pero esta limitación puede ser superada.
Introduction
Los corales son ecosistemas críticos e importantes para la biodiversidad en el océano y salud humana1,2,3. Están bajo amenaza debido al cambio climático y otros estresores antropogénicos, y muchas especies de coral se consideran en peligro crítico. Así, hay una necesidad importante de herramientas celulares y moleculares para diagnosticar los corales bajo estrés. Además, allí es poco entendido sobre que genes se expresan en el tejido adulto de coral y por lo tanto poca comprensión de las funciones de estos genes. Para solucionar este problema, nos hemos adaptado en situ hibridación (ISH) protocolo, comúnmente utilizado en medicina humana y Biología del desarrollo evolutiva, para uso en muestras de tejido parafina-encajado de corales adultos. Esta técnica es más poderosa cuando se utiliza en los corales de adultos que han sufrido un evento estresante como la exposición a estrés por calor. Sin embargo, esta técnica puede utilizarse en una amplia gama de tejidos y etapas de la vida en los corales y no se limita a sólo corales subrayó calor4,6,7. Además, esta técnica puede utilizarse en tejidos o células de cualquier metazoarios, siempre y cuando se dispone de información de la secuencia de cDNA.
El propósito de este método es visualizar sondas de RNA en tejido coral adulto que ha sido preservado y embebido en parafina y seccionadas en diapositivas. Este método es una poderosa herramienta de diagnóstico que permite la visualización de los ácidos nucleicos dentro de tejido adulto de coral. Este método fue desarrollado inicialmente para diagnóstico médico, y desde entonces se ha convertido en una herramienta popular en campos como la biología del desarrollo y biología de desarrollo evolutiva8,9,10. ISH es también un método crítico, particularmente en los sistemas de modelo no, cuando genómicos y transcriptómicos secuencia datos están disponibles pero patrones de expresión génica espacial son desconocidos. Para el trabajo de diagnóstico en sistemas no modelo, esta técnica es poderosa porque puede indicar que las células y los tejidos expresan un gen de interés y pueden conducir a enfoques terapéuticos dirigidos más de8,9,10, 11,12. Por último, esta técnica es cualitativa y más potente cuando se combina con la expresión de genes cuantitativos datos11.
El enfoque esbozado en este trabajo será de interés para los investigadores que ya han diseñado un digoxigenina (DIG)-etiquetados RNA sonda (puntas de prueba el sentido y antisentido) y está ahora listo para realizar en situ el hibridación de las puntas de prueba a una muestra. Para realizar este método, se necesitarán dos secciones seriadas del tejido parafina coral para cada sonda ensayada. Se utilizará una sección de la sonda de sentido y el otro para la sonda antisentida. La sonda sentido será un control para indicar la fijación no específica. Si la coloración se observa en la punta de prueba de sentido, la punta de prueba antisentido no es específico del ARN de interés. Las sondas se pueden diseñar para cualquier gen expresado. En este protocolo, se utilizan varios ejemplos que previamente fueron encontrados para ser expresado durante el estrés por calor en los corales: FBJ osteosarcoma murino homólogo del oncogene virales B (Fos-B), proteína activadora (AP1) y Tumor necrosis factor receptor 41 (TNFR 41)11. ISH con sondas de RNA marcados con DIG es preferible usar sondas radioactivas porque su manejo es mucho más seguro10. Además, esta técnica es altamente sensible y puede realizarse en una amplia gama de tejidos y embriones más allá de corales adultos destacó por el calor13,14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. eliminación de la parafina
PRECAUCIÓN: Realice los siguientes pasos bajo una campana de humos.
- Dewax seccionado fino parafina-encajado diapositivas con xileno 100% bajo el capó en frascos Coplin durante 10 minutos. No use plástico Coplin, como xileno derrite el plástico. Esterilizar los frascos Coplin en autoclave antes de su uso.
- Preparar cuatro frascos de Coplin de vidrio estéril con lo siguiente: 100% etanol, etanol al 80%, etanol al 70% y etanol al 60%. Diluir el etanol con agua libre de ARNasa.
- Transfiera los portaobjetos a la jarra de Coplin de vidrio estéril con 100% de etanol y remojar durante 10 minutos. Después de 10 minutos, vacíe la jarra de Coplin de vidrio y sustituir con etanol 100% nuevo. Poner en remojo las diapositivas nuevamente por 10 minutos.
- Transfiera los portaobjetos a la jarra de Coplin de vidrio estéril con etanol al 80% durante 1 minuto.
- Transfiera los portaobjetos a la jarra de Coplin de vidrio estéril con etanol al 70% durante 1 minuto.
- Transfiera los portaobjetos a la jarra de Coplin de vidrio estéril con etanol al 60% durante 1 minuto.
2. tratamiento previo de diapositivas para la preparación de la hibridación de la sonda de RNA
- Realizar los lavados siguientes a temperatura ambiente, a menos que se especifique lo contrario. Realizar lavados de la temperatura ambiente en un agitador orbital a una velocidad lenta. Utilice sobres estériles diapositiva con espacio para hasta cinco diapositivas para el lavado de los portaobjetos.
- Transfiera los portaobjetos a un envío de diapositivas estéril con 18 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS). Lavar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Retirar el PBS 1 x y tratar inmediatamente el tejido en las diapositivas con proteinasa K para permitir la penetración de la sonda del tejido. Añadir aproximadamente 18 mL de solución de proteinasa K para el envío de diapositivas (ver tabla 1 para la concentración de la solución de trabajo). Incubar a 37 ° C durante 15 minutos. No se mueva.
- Mientras que las diapositivas están incubando, preparar el buffer prehybridization (tampón de Prehybe). Coloque el Prehybe Buffer en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos, luego enfríe en un baño de hielo durante 5 minutos. Para una receta de Prehybe Buffer, vea la tabla 1.
- Detener la digestión de la reacción de proteinasa K por verter la solución de proteinasa K y añadir 18 mL de solución de PBS glicina 0.2% para el envío de diapositivas. Que el envío de diapositivas reposar 5 min a temperatura ambiente.
- Vierta la solución de glicina-PBS de 0.2% y añadir 18 mL de solución de citrato de sodio solución salina (SSC) de x 2 para cada envío de diapositivas. Lavar los portaobjetos en los 2 x SSC por 10 min a temperatura ambiente, con agitación a 100-150 rpm.
3. prehybridization de diapositivas en preparación para la hibridación de la sonda de RNA
- Mientras que las diapositivas se está lavando con 2 x SSC, obtener un nuevo envío de portaobjetos estériles y aproximadamente 18 mL de tampón de Prehybe en el envío de diapositivas. Coloque el correo de la diapositiva en el horno de hibridación a la temperatura de hibridación.
Nota: Dependerá de la temperatura de hibridación de la sonda está usada, pero generalmente oscila entre 50-60 ° C. - Una vez terminado el lavado x SSC 2, verter 2 x SSC y lugar de las diapositivas en el correo de diapositiva en el Prehybe Buffer en el horno de hibridación durante 1 hora.
4. hibridación de la sonda de RNA
- Mientras que las diapositivas se incuban con el tampón de Prehybe en el horno de hibridación, preparar la solución de hibridación-sonda.
- Diluir cada sonda en tampón de hibridación (0,5 μl de sonda con 24.5 μl de tampón de hibridación).
Nota: La receta del tampón de hibridación se encuentra en la tabla 1. Un ejemplo de preparación de la sonda y concentraciones puede encontrarse en Traylor-Knowles et al. 11. - Coloque la sonda diluida en un bloque de calor de 86-90 ° C durante 12 minutos, luego enfríe durante 1 min en hielo.
- Diluir cada sonda en tampón de hibridación (0,5 μl de sonda con 24.5 μl de tampón de hibridación).
- Saque del horno de hibridación el envío de diapositivas y bien quitar diapositivas del envío de diapositivas utilizando pinzas estériles. Poner los portaobjetos sobre una toalla de papel y limpie cuidadosamente el exceso de Prehybe de tampón alrededor de las muestras de tejido. Tenga cuidado de no tocar las muestras y trabajar rápidamente para prevenir la desecación de las muestras de tejido.
- Rodean el tejido con una pluma PAP. Aplique 25 μl de solución diluida de la sonda con una pipeta y cubrir la muestra con un cubreobjetos de plástico.
- Coloque las muestras en la cámara de humedad diapositiva 4 x SSC + 50% formamida solución en la parte inferior de la cámara.
- Una vez que las sondas se han añadido a todas las diapositivas, coloque la cámara de humedad de la diapositiva en el horno de hibridación durante al menos 24 h a una temperatura de hibridación de 50-60 ° C. El tiempo de incubación puede variar dependiendo de la concentración de la sonda pero debe ser por un mínimo de 24 horas.
- Después de la incubación durante la noche con las sondas diluidas, saque la cámara de humedad deslizante del horno de hibridación.
- Quite el cubreobjetos de cada una de las diapositivas, teniendo cuidado de no desplazar los tejidos. En una pipeta de 1000 μl, añadir 1000 μl de solución de x SSC 2 y lavar suavemente el portaobjetos.
- Colocar el portaobjetos en un correo de portaobjetos estériles con 18 mL de solución de x SSC 2 por 5 min a temperatura ambiente. Vierta la solución y reemplazarla con 18 mL de dulce 2 x SSC. Repetir la incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.
- Vierta la solución de x SSC 2. Agregar 18 mL de 1 x SSC solución y lavar por 5 min a temperatura ambiente. Vierta la solución de x SSC 1 y reemplazarlo con 18 mL de fresco 1 x SSC. Repita la incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.
- Verter el 1 x SSC. Agregar 18 mL de 0,5 x SSC y lavado durante 10 min a 42 ° C sin agitación. Derramar el 0,5 x SSC y reemplazar él con 18 mL de 0.5 fresco x SSC. Lave nuevamente durante 10 minutos a 42 ° C sin agitación.
5. visualización de la sonda de RNA
Nota: Para la visualización de la sonda, púrpura de BM se utilizará durante el proceso de desarrollo. Sin embargo, antes de este paso, muchos lavados se necesitan para preparar las muestras para tinción.
- Lave los portaobjetos con 18 mL de fosfatasa alcalina tampón (tampón de AP) sin vaciar el búfer de AP sin MgCl2MgCl2 durante 1 minuto y añadir 18 mL de amortiguador de bloqueo del Boehringer-Mannheim de 1 x diluido con ácido maleic amortiguamiento. Incubar durante al menos 1 h a temperatura ambiente en un correo la diapositiva con agitación suave.
Nota: El amortiguador de bloqueo de Boehringer-Mannheim ácido maleic amortiguamiento utilizado premade y fueron adquiridos en el lavado de Cave y bloque conjunto de búfer (disponibles comercialmente).- Alternativamente, se puede realizar incubación durante la noche a 4 ° C. Un período ya bloqueo disminuirá la aparición de fijación no específica.
- Preparar 20 mL de fragmentos Fab de diluido DIG anti-digoxigenina-AP (anticuerpos anti-DIG = 2 μl de anticuerpo anti-DIG + 20 mL 1 x amortiguador de bloqueo de Boehringer-Mannheim). Esto es suficiente para el uso en correo diapositiva plástica 1. Más de esta solución deben ser preparada si más de un anuncio publicitario de la diapositiva debe ser utilizado.
- Añadir el anticuerpo anti-DIG a un nuevo envío de portaobjetos estériles y transfiera los portaobjetos para el envío de diapositivas con la solución de anticuerpo anti-DIG. Incubar a temperatura ambiente durante 3 h con agitación suave.
- Después de la incubación, derramar el anticuerpo anti-DIG y lave el portaobjetos en el correo de diapositiva con 18 mL de tampón de AP sin MgCl2 por 5 min con agitación suave.
- Vaciar el búfer de AP sin MgCl2 y añadir 18 mL de tampón de AP. Lavar durante 5 minutos con agitación suave. Después de la incubación de 5 minutos, retirar el búfer de AP, reemplazarlo con 18 mL de tampón de AP fresca y lavar por 5 min con agitación suave.
- En la oscuridad, vaciar el búfer de AP y añadir 18 mL de BM púrpura para el envío de diapositivas. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad, para desarrollo de color púrpura que cada ½ h. reacción de visualización variarán basado en la punta de prueba que se está desarrollando.
Nota: En lugar de visualización BM púrpura, solución de desarrollo puede realizarse utilizando 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT). Vea la tabla 1 para obtener instrucciones. - Detener el desarrollo de color mediante la transferencia de las diapositivas a un nuevo envío de portaobjetos estériles con 18 mL de tampón Tris-EDTA (TE) durante 5 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad.
- Quite el buffer TE y añadir 18 mL de agua libre de ARNasa al correo de diapositiva y lavar durante 1 min, en la oscuridad.
- Quitar las diapositivas del agua y seca alrededor de los bordes del tejido. Añadir glicerol medio de montaje y coloque el cubreobjetos. Almacenar las diapositivas a 4 ° C hasta que están listas a tomarse fotos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Después de completar este protocolo, se logrará la identificación de células y tejidos que están expresando la sonda de RNA de interés. Resultados representativos de este protocolo están para AP-1, FosB y TNFR41. Estos resultados, publicados anteriormente por Traylor-Knowles et al. 11, Mostrar expresión espacial del RNA puntas de prueba en corales adultos que fueron expuestos a estrés por calor. Dos ejemplos de diferentes tipos de tinción se presentan en la figura 1. Figura 1A es un ejemplo de tinción difusa del tejido. La mancha se encuentra en el tejido, no sólo en células específicas. Aquí, la expresión de anti-sentido AP-1 se encuentra en la epidermis y la gastrodermis oral11 (figura 1A). La mancha es difusa y no segregada a un tipo de célula específica. Para este tipo de tinción, es particularmente crítica para ejecutar un control de sentido al mismo tiempo, como algunos de los resultados pueden ser debido a la tinción inespecífica.
El segundo tipo de manchas es célula-específico, en el que la mancha se encuentra solamente en tipos celulares específicos. FosB (figura 1B) y TNFR41 (figura 1) muestra este tipo de tinción. Dos de estas puntas de prueba fueron utilizados en muestras de tejido de los corales de adultos que habían sido expuestos a un estrés de calor11. En el panel contra sentido, se observa coloración púrpura. TNFR41 se expresó en diferentes tipos de cnidocytes, una familia de tipos de células que sólo se encuentra en cnidarios (figura 1). Específicamente, había manchado nematocytes que producen el microbasic mastigophore organelo (nematocistos) y spirocytes que producen spirocysts, encontrados dentro de la epidermis del tejido del coral. Nematocytes también se encuentran en otras capas de tejido de los corales, como el calicodermis; sin embargo, debido al seccionamiento realizado en esta muestra particular, esa información podría no ser reunida. FosB también tiñen cnidocytes y fue específico para spirocytes y nematocytes. Tanto de estas puntas de prueba, para el control de sentido no demostró ninguna coloración, indicando que la tinción para la sonda de anti-sentido fue hecho específica. Estas son sólo dos tipos de resultados representativos (tinción difusa del tejido y célula-específico manchas) de las técnicas de tinción que se pueden presentar con diferentes tipos de sondas. Debido a esta variabilidad, es fundamental utilizar un control de sentido para determinar la tinción inespecífica.
Figura 1: resultado representativo de ISH que células específicas. (A) en el primer panel, control de sentido para el sondeo de AP-1 muestra que la coloración poco presente dentro de la diapositiva. En el segundo panel, la sonda anti-sentido de AP-1 muestra que la coloración con esta sonda es difusa en el tejido. La mancha es específica al epidermis y gastrodermis oral. Con este tipo de coloración, es fundamental para ejecutar un control de sentido para asegurarse de que la tinción observada es específica. (B) control de sentido de la sonda FosB en el primer panel muestra coloración poco presente. En el segundo panel, la sonda de anti-sentido de FosB muestra coloración específica a la spirocytes y nematocytes, con coloración difusa a lo largo de la gastrodermis epidermis y oral. (C) en el primer panel, el control de sentido para la sonda TNFR 41 muestra que poco la coloración presente en la diapositiva. En el segundo panel, la sonda de anti-sentido de TNFR 41 muestra específica coloración dentro de la spirocytes, nematocytes y microblastic mastigophores. Abreviaturas: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocyte (NE), microbasic mastigophores (MM), que contiene el simbionte células gastrodermal (SU). Esta figura fue reproducida con permiso11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nota: Todas las diluciones deben hacerse con agua estéril, libre de ARNasas en vidrio esterilizado. | |||
| Prehybe tampón (50 mL) | AÑADIR | ||
| Formamida | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12,5 mL | ||
| heparina 20 mg/mL | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20% Tween-20 | 0, 5 mL | ||
| SDS 20% | 0, 5 mL | ||
| 10 mg/mL de ADN de esperma de salmón (desnaturalizar antes de añadir) | 2 mL | ||
| Agua libre de ARNasa | 4,4 mL | ||
| Nota: Solución es posible en un tubo de 50 mL desechables. Esperma de salmón debe se desnaturaliza por ebullición en un bloque de calor durante 5 minutos antes de agregar a solución. | |||
| Tampón de hibridación (47 mL) | AÑADIR | ||
| Formamida | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12,5 mL | ||
| heparina 20 mg/mL | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20% Tween-20 | 0, 5 mL | ||
| SDS 20% | 0, 5 mL | ||
| 10 mg/mL de ADN de esperma de salmón (desnaturalizar antes de añadir) | 2 mL | ||
| Agua libre de ARNasa | 1 mL | ||
| Nota: Solución es posible en un tubo de 50 mL desechables. Esperma de salmón debe se desnaturaliza por ebullición en un bloque de calor durante 5 minutos antes de agregar a solución. | |||
| 10 X PBS (1.0 L) | AÑADIR | ||
| 18,6 mM NaH2PO4 | 2,56 g | ||
| 84,1 mM Na2HPO4 | g 11,94 | ||
| 1.750 mM NaCl | g 102,2 | ||
| Notas: Mezcla de fosfatos en unos 800 mL de agua para un volumen de 1,0 L. Compruebe el pH. Debe ser 7,4 ± 0.4. En caso contrario ajustar el pH a 7,4 con NaOH de HCl. agregar NaCl y resto de agua. Después de que el pH es ajustado de la autoclave. | |||
| 20 X SSC (1.0 L) | AÑADIR | ||
| 3 M NaCl | g 175,3 | ||
| 0,3 M citrato de Na | g 88,2 | ||
| Notas: Mezclar en unos 800 mL de agua libre de ARNasa a llevar a un volumen de 1,0 L. Ajustar el pH a 4.5 y autoclave. | |||
| Buffer de fosfatasa (AP) alcalinas sin MgCl2 (50 mL) | AÑADIR | ||
| NaCl de 1 M | 5,0 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9.5 | 5,0 mL | ||
| 20% Tween-20 | 1.25 mL | ||
| Agua libre de ARNasa | 38,75 mL | ||
| Notas: Preparar justo antes de utilizar un tubo de 50 mL. | |||
| Almacenador intermediario alcalino fosfatasa (AP) (100 mL) | AÑADIR | ||
| NaCl de 1 M | 10,0 mL | ||
| 1 M de MgCl2 | 5 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9.5 | 10 mL | ||
| 20% Tween-20 | 2,5 mL | ||
| Agua libre de ARNasa | 72,5 mL | ||
| Notas: preparar justo antes de utilizar un tubo de 50 mL. La solución se volverán turbia después de unas horas y ya no trabajará para la reacción enzimática. | |||
| Solución de sustrato de AP | AÑADIR | ||
| Buffer de AP | 25 mL | ||
| NBT | uL 82,5 | ||
| BCIP | uL 82,5 | ||
| Notas: se puede usar en lugar de BM púrpura. Preparar justo antes de utilizar un tubo de 50 mL. Mantener esta solución en la oscuridad que cubre el tubo en aluminio, y preparando con poca luz. | |||
| Solución madre de proteinasa K (10 mg/mL) | AÑADIR | ||
| Proteinasa K | 10 mg | ||
| Agua libre de ARNasa | 10 mL | ||
| Notas: Alícuota y almacenar a-20 ° C. | |||
| Proteinasa K solución | AÑADIR | ||
| Solución madre de proteinasa K | 90 ul | ||
| 1 X PBS | 18 mL | ||
| Notas: Hacer justo antes de usar para obtener mejores resultados. | |||
| 0.2 solución de glicina-PBS % | AÑADIR | ||
| 10 X PBS | 45 mL | ||
| Agua libre de ARNasa | 405 mL | ||
| Glicina | 1 g | ||
| Notas: prepararse en envase de vidrio esterilizado. Mezcla a temperatura ambiente en un plato stirer hasta glicina se haya disuelto completamente. | |||
| Tampón de bloqueo de Boehringer-Mannheim (30 mL) (parte de la excavación lavado y bloque Buffer) | AÑADIR | ||
| 10 x solución de bloqueo | 3 mL | ||
| 1 x buffer de ácido maleico | 27 mL | ||
| Notas: hacer justo antes de usar para obtener mejores resultados. Solución madre de bloqueo y tampón de ácido maleico se utilizaron desde el "lavado de Cave y bloque-conjunto de búfer". | |||
| 4 X SSC: formamida 50% (30 mL) | AÑADIR | ||
| 20 X SSC | 6 mL | ||
| formamida 50% | 24 mL | ||
| Notas: Preparar justo antes del uso en tubo de 50 mL. Preparar bajo campana de laboratorio. | |||
| Medios de montaje de glicerol | AÑADIR | ||
| 50 mM Tris, pH 8,4 | 80 ΜL | ||
| Glicerol | 20 ΜL | ||
Tabla 1: Banco de soluciones para la realización de en situ hibridación. La tabla es una lista de las diferentes soluciones stock para este protocolo. Monto total se estima para un rendimiento de aproximadamente 2 sobres de diapositiva. Se aconseja ajustar el total de las cantidades según la cantidad de diapositivas que están siendo procesados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El método descrito en el presente Protocolo se ha modificado del anterior trabajo de investigación médica y evolutiva del desarrollo8,9,10,12,17. Este protocolo se centra en los matices de un hibridación en situ con sonda marcada con DIG RNA anti-sentido en corales adultos, que han sido preservados y embebidos en parafina. Este método se puede transferir fácilmente a las muestras de organismos más allá de los corales que han sido incluidas en parafina. Por último, este método puede realizarse en diferentes estadios de los corales (por ejemplo, la larva) o en cultivos celulares, pero el protocolo exacto puede variar ya que los tipos de muestras no son siempre de parafina5,6 .
Hay varios pasos críticos en este protocolo, incluyendo el tratamiento de la proteinasa K, hibridación de la sonda y desarrollo del color de la sonda. Durante el tratamiento de la proteinasa K, la sincronización es muy importante. Si el tratamiento es más largo que el sugerido, los tejidos pueden ser degradados y dañados. Además, se debe realizar la detención de la reacción de proteinasa K en el punto de tiempo completo especificado. También es fundamental para mantener la muestra a una temperatura constante hibridación, como disminución de la temperatura pueden causar fijación inespecífica de la sonda y complicar los resultados. El lavado de la sonda, es importante tener cada diapositiva del horno de hibridación uno una vez, en lugar de todos a la vez, para asegurarse de que las diapositivas no hibridar con la sonda a una temperatura baja. También, lavar bien las diapositivas después de la hibridación de la sonda ayudará a evitar la fijación no específica. Por último, el desarrollo del color de la sonda es uno de los pasos más críticos aún subjetivos de este proceso. El desarrollo del color puede ser exagerado o detenido demasiado pronto. Este paso requiere paciencia y vigilancia para garantizar sobre-coloración de las diapositivas no se produce.
Solución de problemas de este protocolo puede ser un proceso desalentador debido al número de pasos. Si el protocolo produce resultados negativos, entonces es mejor comenzar por examinar la sonda para asegurarse de que es el contra sentido (y no el sentido) sonda. Además, si las soluciones son viejas, vale rehacer o sustituirlos por lo que son frescos cuando se realiza este protocolo. Modificaciones, tales como las longitudes de la hibridación y el bloqueo, se pueden implementar para aumentar las posibilidades de hibridación de la sonda o reducir cantidades de fondo y tinción inespecífica. Debido al elevado número de pasos de este protocolo, puede ser fácil perder la pista; por lo tanto, es importante permanecer organizados y rastrear las partes del Protocolo se han completado. Además, es fundamental para que no se los pasos se omiten, y ese tiempo no se corta durante las incubaciones y lavados. Una buena regla del pulgar es para permitir más tiempo en lugar de lavado más corto para garantizar que todas las diapositivas se limpian bien.
La mayor limitación de este método es que los resultados no son cuantificables. Se trata de un método cualitativo que, en conjunto con otros métodos como la histología, transcriptómica y proteómica, es muy informativo. Debido a variaciones en los tiempos de hibridación, así como los tiempos subjetivos durante la visualización, cuantificación de la intensidad de la tinción no se logra fácilmente. Es tentador decir que una sonda es más altamente expresada si muestra una mayor intensidad, pero debido a las variaciones en este protocolo (por ejemplo, la cantidad de tiempo permitido para desarrollo de color), no se puede determinar cantidades de expresión génica.
Esta técnica no es un nuevo método en biología; sin embargo, es una no realiza muy a menudo en los corales de adultos. El uso de este método en los corales de adultos es muy potente porque anclas datos de expresión genética a un tejido o una célula de tipo11. Genómica y transcriptómica se ha convertido en populares y potentes herramientas en biología coral; sin embargo, estos métodos se realizan generalmente en homogenados del animal entero. Esto hace difícil identificar qué partes de la coral están expresando los genes de interés y por lo tanto más difícil comprender los mecanismos reales. Mediante el uso de ISH junto con datos de expresión genética, se logra un acercamiento más holístico a donde y hasta qué punto los genes se expresan. Esto será de gran ayuda en la comprensión de los mecanismos responsables de las vías de respuesta de estrés diferentes en corales adultos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el premio no. OCE-1323652 a través de la nacional Science Foundation océano ciencia Postdoctoral Fellowship y el premio no.1012629 del programa de enriquecimiento Postdoctoral de Burroughs Wellcome Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. , Oxford University Press. (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
