Summary
Målet med detta protokoll är att utföra i situ hybridisering på vuxen korall prover som har bäddats in i paraffin och sektioneras på objektglas. Detta är en kvalitativ metod som används för att visualisera det rumsliga uttrycket för en RNA anti känsla probe i paraffin-inbäddat vävnader.
Abstract
Koraller är viktigt ocean ryggradslösa djur som är kritiska för ocean hälsa samt människors hälsa. Dock på grund av mänsklig påverkan såsom stigande hav temperaturer och havsförsurning är koraller alltmer hotade. För att tackla dessa utmaningar, har framstegen inom cell- och molekylärbiologi visat sig vara avgörande för att diagnostisera hälsa av koraller. Ändra några av de tekniker som ofta används inom humanmedicinen kunde förbättra forskarnas förmåga att behandla och spara koraller. För att åtgärda detta, har ett protokoll för i situ hybridisering används främst inom humanmedicinen och evolutionär utvecklingsbiologi anpassats för användning i vuxen koraller under stress.
Syftet med denna metod är att visualisera det rumsliga uttrycket för en RNA-probe i vuxen korall vävnad som har bäddats in i paraffin och sektioneras på objektglas. Denna metod fokuserar på avlägsnande av paraffin och rehydrering av provet, förbehandling av provet att säkerställa permeabilitet av prov, före hybridisering inkubation, hybridisering av RNA sonden och visualisering av RNA sonden. Detta är en kraftfull metod när du använder icke-modellorganismer för att upptäcka där specifika gener uttrycks, och protokollet kan enkelt anpassas för andra icke-modellorganismer. Metoden är dock begränsad eftersom det är främst kvalitativ, eftersom uttrycket intensitet kan variera beroende på mängden tid som används under steget visualisering och koncentrationen av sonden. Dessutom krävs tålamod, eftersom detta protokoll kan ta upp till 5 dagar (och i många fall längre) beroende på sonden används. Slutligen, icke-specifik bakgrundsfärgning är vanligt, men denna begränsning kan övervinnas.
Introduction
Koraller är kritiska ekosystem byggare och viktig för den biologiska mångfalden i havet och människors hälsa1,2,3. De är hotade på grund av klimatförändringar och andra antropogena stressfaktorer och många korallarter betraktas som akut hotad. Det finns således ett betydande behov av cellulära och molekylära verktyg för att diagnostisera koraller under stress. Också, det är lite förstås om där generna uttrycks inom vuxen korall vävnad och därför lite förståelse för funktionerna av dessa gener. Om du vill åtgärda det här problemet har vi anpassat i situ hybridisering (ISH) protokollet, vanligen används i humanmedicin och evolutionär utvecklingsbiologi, för användning på paraffin-inbäddat vävnadsprover på vuxen koraller. Denna teknik är mest kraftfulla när de används på vuxna koraller som har genomgått en stressande händelse såsom exponering för värmestress. Men denna teknik kan användas på ett brett utbud av vävnader och levnadsstadier i koraller och är inte begränsad till endast värme-stressade koraller4,6,7. Dessutom kan denna teknik användas på vävnader eller celler av någon metazoan så länge det finns cDNA sekvensinformation.
Syftet med denna metod är att visualisera RNA sonder i vuxen korall vävnad som har bevarat och inbäddade i paraffin och sektioneras på bilder. Denna metod är ett kraftfullt diagnostiska verktyg som möjliggör visualisering av nukleinsyror inom vuxen korall vävnad. Utvecklades inledningsvis denna metod för medicinsk diagnostik, och det har sedan dess blivit ett populärt verktyg inom utvecklingsbiologi och evolutionär utvecklingsbiologi8,9,10. ISH är också en kritisk metod, särskilt i icke-modellsystem, när genomisk och transcriptomic sekvens uppgifter finns tillgängliga men rumsliga gen uttrycksmönster är okänd. För diagnostiska arbetet i icke-modellsystem är denna teknik kraftfulla eftersom det kan indikera vilka celler och vävnader express en gen av intresse och kan leda till mer riktade behandlingsmetoder8,9,10, 11,12. Slutligen, denna teknik är kvalitativa och mer kraftfull när den är ihopparad med kvantitativ gen uttryck data11.
Det synsätt som beskrivs i detta dokument kommer att vara av intresse för forskare som redan har utformat en digoxigenin (DIG)-märkt RNA sonden (både känsla och antisense sonder) och är nu redo att utföra i situ hybridisering av sonderna till ett urval. För att utföra denna metod, kommer två seriella sektioner av en paraffin korall vävnad att behövas för varje sond som testas. En del kommer att användas för sonden avkänningen och den andra för antisense sonden. Sonden avkänningen blir en kontroll för att ange icke-specifik bindning. Om missfärgning observeras i sonden avkänningen, då är antisense sonden inte specifika för RNA av intresse. Sonderna kan utformas för någon gen uttryckt. I detta protokoll, flera exempel används som befanns tidigare uttryckas under värmestress i koraller: FBJ murina osteosarkom virala onkogen homolog B (Fos-B), Activator protein (AP1), och tumörnekrosfaktor receptor 41 (TNFR 41)11. ISH använder gräva-märkt RNA sonder är att föredra framför med radioaktiva sonder eftersom deras hantering är mycket säkrare10. Dessutom, denna teknik är mycket känsliga och kan utföras på ett brett utbud av vävnader och embryon utöver värme-stressad vuxen koraller13,14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. borttagning av Paraffin
Försiktighet: Utför följande steg under ett dragskåp.
- Dewax tunn-sektioneras paraffin-inbäddat bilder med 100% xylen under huven i Coplin glasburkar i 10 min. Använd inte Coplin plastburkar, som xylen smälter plast. Sterilisera Coplin burkarna i en autoklav före användning.
- Förbereda fyra sterila Coplin glasburkar med följande: 100% etanol, 80% etanol, 70% etanol och 60% etanol. Späd etanolen med RNase-gratis vatten.
- Överföra bilder till sterila glasburken Coplin med 100% etanol och blötlägg dem i 10 min. Efter 10 min, Töm Coplin glasburken och ersätta med nya 100% etanol. Njut av bilderna igen i 10 min.
- Överföra bilder till sterila glasburken Coplin med 80% etanol för 1 min.
- Överföra bilder till sterila glasburken Coplin med 70% etanol för 1 min.
- Överföra bilder till sterila glasburken Coplin med 60% etanol för 1 min.
2. förbehandling av diabilder för beredning av RNA sonden hybridisering
- Utföra de följande tvättarna vid rumstemperatur, om inte annat anges. Utföra rumstemperatur tvättar i orbitalskak på en långsam hastighet. Använd sterila bild utskick med plats för upp till fem bilder för tvättning av bilderna.
- Överföra bilder till en steril bild mailer med 18 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tvätta under 5 minuter i rumstemperatur.
- Häll av 1 x PBS och omedelbart behandla vävnaden i bilderna med proteinas K att aktivera sonden penetration av vävnad. Tillsätt cirka 18 mL proteinas K lösning till bild mailer (se tabell 1 för att arbeta lösning koncentration). Inkubera vid 37 ° C i 15 min. Skaka inte.
- Medan bilderna ruvning, förbereda prehybridization buffert (Prehybe buffert). Placera Prehybe bufferten i kokande vattenbad i ca 10 min, sedan svalna på ett isbad för 5 min. För ett recept på Prehybe buffert, se tabell 1.
- Stoppa nedbrytning av proteinas K reaktionen genom att utgjuta proteinas K lösningen, och omedelbart lägga till 18 mL 0,2% glycin-PBS lösning till bild mailer. Låt bilden mailer stå i rumstemperatur i 5 min.
- Häll ut 0,2% glycin-PBS lösningen och tillsätt 18 mL 2 x saltlösning natriumcitrat (SSC) lösning till varje bild mailer. Tvätta bilderna i 2 x SSC för 10 min vid rumstemperatur, med skakningar vid 100-150 rpm.
3. prehybridization för Slides i förberedelse för RNA sonden hybridisering
- Medan bilderna är spolas med 2 x SSC, skaffa en ny steril slide-mailer och sätta cirka 18 mL Prehybe buffert i bild mailer. Placera bilden mailer i hybridisering ugnen vid hybridiseringstemperatur.
Obs: Hybridisering temperaturen beror på sonden används men vanligtvis varierar från 50-60 ° C. - När 2 x SSC tvätten är klar, Häll ut 2 x SSC och plats bilderna inom bild mailer i Prehybe bufferten i hybridisering ugnen i 1 h.
4. hybridisering av RNA sonden
- Medan bilderna inkubation med Prehybe bufferten i hybridisering ugnen, Bered hybridisering-probe.
- Späd varje sond i hybridisering buffert (0,5 µL av sonden med 24,5 µL av hybridisering buffert).
Obs: Receptet för hybridisering buffert finns i tabell 1. Ett exempel på sonden förberedelse och koncentrationer kan hittas i Traylor-Knowles o.a. 11. - Utspädda sonden på en 86-90 ° C värme block i 12 min, sedan svalna i 1 min på is.
- Späd varje sond i hybridisering buffert (0,5 µL av sonden med 24,5 µL av hybridisering buffert).
- Ta bort bild mailer från hybridisering ugnen och individuellt diabilder från slide mailer med steril pincett. Lägg bilderna platt på en pappershandduk och noggrant torka bort överflödig Prehybe buffert runt vävnadsproverna. Vara noga med att inte vidröra proverna, och arbeta snabbt för att förhindra uttorkning av vävnadsproverna.
- Omringa vävnaden med en PAP-penna. Gäller 25 µL utspädda sonden lösning med en pipett och täck över provet med ett plast täckglas.
- Placera proverna i bild fukt kammaren med 4 x SSC + 50% formamid lösning i botten av kammaren.
- När sonder har lagts till alla bilder, placera bilden fukt kammaren i hybridisering ugnen i minst 24 h vid en hybridiseringstemperatur på 50-60 ° C. Inkubationstiden kan variera beroende på koncentrationen av sonden men bör vara i minst 24 timmar.
- Efter natten inkubation med utspädda sonderna, ta bort bild fukt kammaren från hybridisering ugnen.
- Ta bort coverslips från var och en av bilderna, var noga med att inte förskjuta vävnaden. I 1000 µL pipett, lägga till 1000 µL 2 x SSC lösning och tvätta försiktigt i bilden.
- Placera bilden i en steril bild mailer med 18 mL 2 x SSC för 5 min i rumstemperatur. Häll ut lösningen och ersätta det med 18 mL färsk 2 x SSC. Upprepa ruvning igen för 5 min i rumstemperatur med milda skakningar.
- Häll ut 2 x SSC lösningen. Lägg till 18 mL av 1 x SSC lösningen och tvätta för 5 min i rumstemperatur. Häll ut 1 x SSC lösningen och ersätta det med 18 mL färsk 1 x SSC. Upprepa inkubering under 5 minuter i rumstemperatur med milda skakningar.
- Häll ut 1 x SSC. Tillsätt 18 mL 0,5 x SSC och tvätt för 10 min vid 42 ° C utan att skaka. Häll ut 0,5 x SSC och Ersätt det med 18 mL färsk 0,5 x SSC. Tvätta igen för 10 min vid 42 ° C utan att skaka.
5. visualisering av RNA sonden
Obs: För att visualisera sonden, BM lila kommer att användas under utvecklingsprocessen. Innan detta steg krävs flera tvättar dock att bereda proverna för färgning.
- Tvätta i bilderna med 18 mL alkalisk fosfatas buffert (AP-buffert) utan MgCl2 för 1 min. Häll ut AP-bufferten utan MgCl2, och lägga till 18 mL 1 x Boehringer-Mannheim blockerande buffert utspädd med maleinsyra buffert. Inkubera i minst 1 tim i rumstemperatur i en bild mailer med milda skakningar.
Obs: Den Boehringer-Mannheim blockerande buffert maleinsyra Musbufferten premade och var köpt i gräva Wash och Block buffert inställd (tillgängliga kommersiellt).- Alternativt, inkubation övernattning på 4 ° C kan utföras. En längre blockeringsperioden kommer att minska uppkomsten av icke-specifik bindning.
- Förbereda den 20 mL utspädd gräva anti-digoxigenin-AP Fab fragment (anti gräva antikropp = 2 µL anti gräva antikropp + 20 mL 1 x Boehringer-Mannheim blockerande buffert). Detta är tillräckligt för användning i 1 plast slide mailer. Mer av denna lösning måste beredas om mer än en bild mailer ska användas.
- Lägg anti gräva antikroppen till en ny steril slide-mailer, och överföra bilder till bildspel mailer med anti gräva antikropp lösningen. Odla i rumstemperatur för 3 h med milda skakningar.
- Efter inkubation, Häll ut anti gräva antikroppen och tvätta bilderna i bildspel mailer med 18 mL AP-buffert utan MgCl2 för 5 min med milda skakningar.
- Häll ut AP-bufferten utan MgCl2, och tillsätt 18 mL AP-buffert. Tvätta för 5 min med milda skakningar. Efter 5 min ruvning, Häll av AP-bufferten, ersätta den med 18 mL färsk AP-buffert och tvätta för 5 min med milda skakningar.
- I mörkret, Häll ut AP-bufferten och tillsätt 18 mL BM lila till bild mailer. Inkubera i bilderna vid rumstemperatur i mörkret, kontroll för lila färgutveckling varje ½ h. reaktionstider för visualisering varierar baserat på sonden som utvecklas.
Obs: I stället för BM lila visualisering, utvecklingslösning kan göras med 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (Beneluxkonventionen) och nitro blue tetrazolium (NBT). Se tabell 1 för instruktioner. - Stoppa färgutvecklingen genom att överföra bilderna till en ny steril bild mailer med 18 mL Tris-EDTA (TE) buffert för 5 min i rumstemperatur, i mörkret.
- Häll av TE bufferten och lägga till 18 mL RNase-fritt vatten i bild mailer och tvätt för 1 min, i mörkret.
- Ta bort bilderna från vattnet och torka dem runt kanterna av vävnaden. Lägg till glycerol montering medium och placera coverslips. Lagra bilder vid 4 ° C tills bilderna ska tas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter att ha avslutat detta protokoll, kommer identifiering av celler och vävnader som uttrycker RNA sonden av intresse att uppnås. De representativa resultat för detta protokoll är för AP-1, FosB och TNFR41. Dessa resultat, tidigare utgiven av Traylor-Knowles o.a. 11, Visa rumsliga uttryck av RNA sonder på vuxen koraller som utsattes för värmestress. Två exempel på olika färgning typer presenteras i figur 1. Figur 1A är ett exempel på diffusa vävnad färgning. Fläcken finns hela vävnaden, inte bara i specifika celler. Här finns uttrycket av anti känsla AP-1 i hela epidermis och muntliga gastrodermis11 (figur 1A). Färgningen är diffus och inte segregerade till en viss celltyp. För denna typ av färgning är det särskilt viktigt att köra en känsla kontroll samtidigt, som några av resultaten kan bero på icke-specifik färgning.
Den andra typen av färgning är cell-specifika, där fläcken finns endast i specifika celltyper. Både FosB (figur 1B) och TNFR41 (figur 1 c) Visa den här typen av färgning. Båda dessa sonder användes på vävnadsprover på vuxen koraller som hade utsatts för en värme stress11. I panelen anti känsla observeras lila missfärgning. TNFR41 uttrycktes i olika typer av cnidocytes, en familj av celltyper som finns inom korallskelett (figur 1). Specifikt, färgade det nematocytes som producerar microbasic mastigophore organell (nematocysts) och spirocytes som producerar spirocysts, alla Funna inom epidermisen av korall vävnad. Nematocytes finns också i andra vävnader lager av koraller, såsom calicodermis; på grund av den snittning utförs på detta särskilda prov, kunde dock att information inte samlas. FosB också målat cnidocytes och var specifik för både spirocytes och nematocytes. För båda dessa sonder visade känsla kontroll ingen färgning, som anger att färgningen för anti känsla sonden var verkligen särskilda. Dessa är bara två typer av representativa resultat (diffus vävnad färgning och cell-specifik färgning) av färgning tekniker som kan förekomma med olika typer av sonder. På grund av denna variation är det viktigt att använda en känsla för att fastställa icke-specifik färgning.
Figur 1: representativa resultatet av ISH som målat specifika celler. (A) i den första panelen visar känsla control för AP-1 sonden att lite färgning är närvarande inom bilden. I den andra panelen visar anti känsla sonden för AP-1 att färgning med denna sond är diffust i hela vävnaden. Fläcken är specifika för den muntliga gastrodermis och epidermis. Med denna typ av färgning är det viktigt att köra en känsla kontroll för att säkerställa att den observerade färgning är specifik. (B) en känsla kontroll för FosB sonden i den första panelen visar lite färgning närvarande. I den andra panelen, anti känsla proben för FosB visar färgning specifika för spirocytes och nematocytes, med diffus färgning hela det epidermis och oral gastrodermis. (C) i den första panelen visar känsla kontrollen för TNFR 41 sonden att lite färgning är närvarande i bilden. I den andra panelen visar anti känsla proben för TNFR 41 specifik färgning inom spirocytes, nematocytes och microblastic mastigophores. Förkortningar: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocyte (NE), microbasic mastigophores (MM), symbiont-innehållande gastrodermal cell (SU). Denna siffra var Reproducerad med tillstånd11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Obs: Alla utspädningar bör göras med steril, RNase gratis vatten i Ånghärdad glasvaror. | |||
| Prehybe buffert (50 mL) | LÄGG TILL | ||
| Formamid | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4,5) | 12,5 mL | ||
| 20 mg/mL heparin | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20% Tween-20 | 0,5 mL | ||
| 20% SDS | 0,5 mL | ||
| 10 mg/mL lax spermier DNA (denaturera innan du lägger till) | 2 mL | ||
| RNase gratis vatten | 4,4 mL | ||
| Obs: Lösningen kan göras i en Upvärmning 50 mL tub. Lax spermier bör denatureras genom kokning på en värme block i 5 minuter innan du lägger till lösningen. | |||
| Hybridisering buffert (47 mL) | LÄGG TILL | ||
| Formamid | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4,5) | 12,5 mL | ||
| 20 mg/mL heparin | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20% Tween-20 | 0,5 mL | ||
| 20% SDS | 0,5 mL | ||
| 10 mg/mL lax spermier DNA (denaturera innan du lägger till) | 2 mL | ||
| RNase gratis vatten | 1 mL | ||
| Obs: Lösningen kan göras i en Upvärmning 50 mL tub. Lax spermier bör denatureras genom kokning på en värme block i 5 minuter innan du lägger till lösningen. | |||
| 10 X PBS (1,0 L) | LÄGG TILL | ||
| 18,6 mM NaH2PO4 | 2.56 g | ||
| 84,1 mM Na2HPO4 | 11,94 g | ||
| 1 750 mM NaCl | 102,2 g | ||
| Anteckningar: Blanda fosfater i ca 800 mL vatten för en 1,0 L volym. Kontrollera pH-värde. Det bör vara 7,4 ± 0,4. Annars justera pH till 7,4 med NaOH av HCl. Tillsätt NaCl och resten vatten. När pH är justerade autoklav. | |||
| 20 X SSC (1,0 L) | LÄGG TILL | ||
| 3 M NaCl | 175.3 g | ||
| 0,3 M Na citrat | 88,2 g | ||
| Anteckningar: Blanda i ca 800 mL RNase gratis vatten för att få till en 1,0 L volym. Justera pH till 4,5 och autoklav. | |||
| Alkaliskt fosfatas (AP) buffert w/o MgCl2 (50 mL) | LÄGG TILL | ||
| 1 M NaCl | 5,0 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 5,0 mL | ||
| 20% Tween-20 | 1,25 mL | ||
| RNase gratis vatten | 38,75 mL | ||
| Anteckningar: Förbereda bara före användning i en 50 mL tub. | |||
| Alkaliskt fosfatas (AP) buffert (100 mL) | LÄGG TILL | ||
| 1 M NaCl | 10,0 mL | ||
| 1 M MgCl2 | 5 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 10 mL | ||
| 20% Tween-20 | 2,5 mL | ||
| RNase gratis vatten | 72,5 mL | ||
| Anteckningar: förbereda bara före användning i en 50 mL tub. Lösningen blir grumlig efter några timmar och kommer inte längre fungera för den enzymatiska reaktionen. | |||
| AP substratlösning | LÄGG TILL | ||
| AP-buffert | 25 mL | ||
| NBT | 82,5 uL | ||
| BENELUXKONVENTIONEN | 82,5 uL | ||
| Anteckningar: Detta kan användas i stället för BM lila. Förbereda bara före användning i en 50 mL tub. Förvara lösningen i mörkret genom att täcka röret i folie, och förbereder i svagt ljus. | |||
| Proteinas K stamlösning (10 mg/mL) | LÄGG TILL | ||
| Proteinas K | 10 mg | ||
| RNase gratis vatten | 10 mL | ||
| Anteckningar: Delprov och förvaras vid-20 ° C. | |||
| Proteinas K arbetar lösning | LÄGG TILL | ||
| Proteinas K stamlösning | 90 ul | ||
| 1 X PBS | 18 mL | ||
| Anteckningar: Göra precis före användning för bästa resultat. | |||
| 0,2% glycin-PBS lösning | LÄGG TILL | ||
| 10 X PBS | 45 mL | ||
| RNase gratis vatten | 405 mL | ||
| Glycin | 1 g | ||
| Anteckningar: förbereda i Ånghärdad glasbehållare. Blanda i rumstemperatur på en stirer platta tills glycin är helt upplöst. | |||
| Boehringer-Mannheim blockerande buffert (30 mL) (del av gräva Wash och Block buffert Set) | LÄGG TILL | ||
| 10 x blockerar lösning | 3 mL | ||
| 1 x maleinsyra buffert | 27 mL | ||
| Anteckningar: göra precis före användning för bästa resultat. Stamlösning till blockering och maleinsyra buffert användes från den ”gräva Wash och Block-buffert Set”. | |||
| 4 X SSC — 50% formamid (30 mL) | LÄGG TILL | ||
| 20 X SSC | 6 mL | ||
| 50% formamid | 24 mL | ||
| Anteckningar: Förbereda bara före användning i 50 mL tub. Förbered under laboratorium huva. | |||
| Glycerol montering Media | LÄGG TILL | ||
| 50 mM Tris, pH 8,4 | 80 ΜL | ||
| Glycerol | 20 ΜL | ||
Tabell 1: lagerför lösningar för att utföra i situ hybridisering. Tabellen är en lista över de olika lagerföra lösningar som behövs för detta protokoll. Totala belopp beräknas för utförandet av ungefärligt 2 bild utskick. Det rekommenderas att justera totala belopp baserat på mängden bilder som bearbetas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs i detta protokoll har ändrats från tidigare arbete i medicinsk och evolutionära utvecklings forskning8,9,10,12,17. Detta protokoll fokuserar på nyanserna i ett i situ -hybridisering med en gräva-märkt RNA anti känsla sond på vuxen koraller, som har bevarat och inbäddade i paraffin. Denna metod kan lätt överföras till prover av organismer utöver koraller som har också paraffin-inbäddat. Slutligen, denna metod kan utföras under olika stadier av koraller (t.ex., larv) eller inom cellkulturer, men det exakta protokollet kan variera eftersom dessa typer av prover inte är alltid paraffin-inbäddat5,6 .
Det finns flera kritiska steg i detta protokoll, inklusive proteinas K behandling, hybridisering av sonden och färgutveckling av sonden. Under proteinas K behandling är tidpunkten mycket viktig. Om behandling är längre än föreslog, kan vävnader bli degraderad och skadad. Dessutom bör stoppa proteinas K reaktion utföras vid full tidpunkten anges. Det är också viktigt att hålla provet vid en konstant hybridiseringstemperatur, som sänkning av temperaturen kan orsaka icke-specifik bindning av sonden och komplicera resultat. När tvätta bort sonden, är det viktigt att ta varje bild ur hybridisering ugnen en på en tid, i stället för allt på en gång, för att säkerställa att bilderna inte hybridisera med sond vid en låg temperatur. Grundlig tvättning av bilderna efter sonden hybridisering kommer också att förhindra icke-specifik bindning. Slutligen, färgutveckling av sonden är en av de mest kritiska ännu subjektiva stegen i denna process. Färgutvecklingen kan lätt överdrivna eller slutade för tidigt. Detta steg kräver tålamod och vaksamhet för att säkerställa att alltför färgning av bilderna sker inte.
Felsökning av detta protokoll kan vara en skrämmande process på grund av antalet inblandade steg. Om protokollet ger negativa resultat, då är det bäst att börja med att undersöka sonden att se till att det är anti avkänningen (och inte meningen) sond. Dessutom om lösningarna är gammal, är det värt omarbeta eller ersätta dem så de är fräscha när du utför detta protokoll. Ändringar, såsom längder av hybridisering och blockering, kan implementeras för att öka chanserna att sonden hybridisering eller minska mängder bakgrund och icke-specifik färgning. På grund av det höga antalet steg i detta protokoll, kan det vara lätt att tappa; Det är därför viktigt att hålla ordning och spåra vilka delar av protokollet har slutförts. Dessutom är det viktigt att säkerställa att inga steg hoppas över, och då är inte skära ner under inkubationer och tvättar. En bra tumregel är att möjliggöra längre snarare än kortare tvättar att garantera att alla bilder städas noggrant.
Den största begränsningen av denna metod är att resultaten inte är kvantifierbara. Detta är en kvalitativ metod som, tillsammans med andra metoder såsom histologi, transkriptomik och proteomik, är mycket informativ. På grund av variationer i hybridisering gånger samt de subjektiva gånger under visualisering, är kvantifiera intensiteten i färgningen inte lätt åstadkommas. Det är frestande att säga att en sond uttrycks mer högt om det visar större intensitet, men på grund av variationerna i detta protokoll (t.ex. mängden tid som tillåts för färgutvecklingen), gen uttryck belopp inte kan fastställas.
Denna teknik är inte en ny metod i biologi; Det är dock en inte utförs ofta på vuxen koraller. Användningen av denna metod på vuxen koraller är mycket kraftfull eftersom det ankare gen uttryck data till en vävnad eller en cell typ11. Transkriptomik och genomik har blivit populära och kraftfulla verktyg i korall biologi; dessa metoder är dock allmänt gjort på homogenates av hela djuret. Detta gör det svårt att identifiera vilka delar av koraller uttrycker generna av intresse, och därmed svårare att förstå de verkliga mekanismerna. Med hjälp av ISH tillsammans med gene expression data, kan ett mer holistiskt synsätt där och i vilken utsträckning gener uttrycks uppnås. Detta kommer att kraftigt hjälpa i förståelsen av mekanismerna som ansvarar för olika stress svar vägar i vuxen koraller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av award ingen. OCE-1323652 genom den nationella Science Foundation Ocean vetenskap postdoktorsstipendium och award no.1012629 från Burroughs Wellcome fonden postdoktorala berikande Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. , Oxford University Press. (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
