Summary
هذا البروتوكول يوضح كيفية إعداد طريقة أسر موثوقة في الفئران. يتم تحفيز الخلايا العصبية في جميع أنحاء المغزلي المسنن هيبوكامبال كهربائياً بأسر مباشرة وغير مباشرة في فيفو. نشاط الخلايا العصبية والإشارات الجزيئية هي دراسة ج-المنحدر وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت Notch1، على التوالي؛ هو كمية الخلايا من بروموديوكسيوريديني وسم المقايسة.
Abstract
وقد ثبت التحفيز عالية التردد الكهربائي (أسر)، استخدام أقطاب مزروع استهداف مناطق مختلفة في الدماغ، كعلاج فعال للاضطرابات العصبية والنفسية المختلفة. أسر في المنطقة العميقة من الدماغ، وتسمى أيضا تحفيز الدماغ العميق (DBS)، تزداد أهمية في التجارب السريرية. وقد بدأ التقدم الذي أحرز مؤخرا في مجال عالية التردد (HF-DBS) DBS الجراحة انتشار إمكانية الاستفادة من هذا الأسلوب الغازية في حالات أخرى، مثل العلاج لاضطراب الاكتئاب الكبرى (MDD)، الوسواس القهري (OCD)، وما إلى ذلك في.
وعلى الرغم من هذه المؤشرات الآخذة في التوسع، تظل الآليات الكامنة من الآثار المفيدة للتردد DBS ملغز. ولمعالجة هذه المسألة، هو نهج واحد استخدام أقطاب مزروع بتنشيط الفئات السكانية الفرعية الموزعة من الخلايا العصبية من أسر قليلة. وأفيد أن أسر في نواة المهاد الأمامي يمكن أن تستخدم لعلاج الصرع المقاوم للحرارة في العيادة. قد تكون مرتبطة بالخلايا زيادة الآليات الكامنة وتغيير نشاط الخلايا العصبية. ولذلك، نحن مهتمون باستكشاف التغيرات الفسيولوجية بالكشف عن نشاط الخلايا العصبية، فضلا عن الخلايا في الماوس المغزلي المسنن (DG) قبل وبعد العلاج أسر.
في هذه المخطوطة، يصف لنا منهجيات لأسر لاستهداف التنشيط للمدير العام في الفئران، مباشرة أو غير مباشرة وعلى نحو حاد أو مزمن. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة لإعداد شرائح المخ ج-المنحدر و Notch1 إيممونوفلوريسسينت تلطيخ لمراقبة نشاط الخلايا العصبية والإشارات التنشيط وبروموديوكسيوريديني (بردو) وضع العلامات لتحديد الخلايا بعد التعريفي DBS التردد. تفعيل نشاط الخلايا العصبية والخلايا بعد العلاج HF DBS توفر دليل مباشر على العصبية الحيوية والفوائد العلاجية. وخاصة هذه المنهجية يمكن تعديلها وتطبيقها لاستهداف المناطق الدماغ المهتمة الأخرى مثل ganglia القاعدية والمناطق سوبثالاميك لاضطرابات الدماغ محددة في العيادة.
Introduction
DBS التردد هو تقنية الجراحة العصبية للتحفيز الكهربائي في الدماغ، والتي وضعت منذ 1870s1. في أواخر الثمانينات، أولاً كأسر تدخل علاجي محتمل لمرض باركنسون واضطرابات الحركة الأخرى2. في العقود القليلة الماضية، استخدمت HF DBS أكثر وأكثر على نطاق واسع في علاج اضطرابات الدماغ التي حاليا غير قابل للعلاج باستراتيجية علاجية تقليدية. خاصة، نظراً لتحسين دقة مسرى أسر ونتائج فعالة للغاية، والحد الأدنى من الآثار الجانبية، اضطرابات الدماغ يعالجها DBS التردد إلى حد كبير زاد العدد على مدى عقود3،4، 5. على سبيل المثال، وافقت DBS التردد "لنا الغذاء" والدواء (FDA) لعلاج مرض باركنسون (PD) ونوع الخرف مرض الزهايمر والهزة الأساسية وأنواع أخرى من حركة اضطرابات2،6، 7. في المرضى PD، يخفض الدواء تتميز تصل إلى 50% خلال DBS التردد8. بالإضافة إلى نجاح العلاج من اضطرابات الحركة، أثبت DBS التردد أيضا لها آثار قوية في علاج الأمراض النفسية في العيادة، والتعزيز المعرفي ك9جيدا2،، 10 , 11-تجدر الإشارة إلى أن البحوث المتعلقة بأمن الأسرة المعيشية الغذائي لعلاج الاضطرابات النفسية الأخرى في مراحل مختلفة، تقدم الكثير من الوعود للمرضى12.
على الرغم من أن العديد من الدراسات أظهرت أن أسر المحورية قد الآثار البعيدة والمحلية في جميع أنحاء الدماغ13، تظل الآليات العصبية والجزيئية للآثار بعيدة المنال2،14. تطبق DBS HF العلاجية في العيادة، عادة بطريقة طويلة الأجل للعلاج مرض باركنسون، والألم المزمن، إلخ وتطرح العديد من الآراء لشرح تحسين تولدها معاملة DBS التردد، بين فيه إمكانية واحدة أن أمن الأسرة المعيشية الغذائي الحالي ينظم نشاط شبكة الخلايا العصبية، ربما قبل ديبولاريزيشن متكررة من محاور عصبية محيط القطب أسر مزروع. أو DBS التردد قد يتغير معدل أداء الخلايا العصبية النواتج والأهداف المتوقعة. أيضا، قد يؤدي التردد DBS التغييرات متشابك طويلة الأجل، بما في ذلك التقوية الطويلة الأجل (الكمونية) والاكتئاب الطويل الأجل (المحدودة)، والتي قد تسهم في حدوث تحسن أعراض. وحتى الآن، أنها مازال من غير الواضح ما إذا كانت عمليات أسر influences الأحداث الرئيسية الجزيئية التي تنظم الخلوية مثل كالكبار الخلايا في الجسم الحي. وقد أظهرت عدة أسطر من الدراسات أن أسر في القوارض يمكن أن تحاكي مماثلة الاستجابات العصبية سريرياً التطبيقية DBS15،16. لفهم الآليات الخلوية الكامنة من التردد-DBS، في هذه الدراسة، نحن أولاً إعداد في فيفو أسر المنهجية في الفئران في الحادة (يوم واحد) أو طريقة المزمن (خمسة أيام). ثانيا، نحن إعداد منهجية تحليل التنشيط لتحديد تغيير نشاط الخلايا العصبية والخلايا بعد تسليم DBS التردد.
نظراً لأن إنتاج الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية العصبية وفيرة أثناء التطور الجنيني ولكن يستمر طوال حياة الكبار، منطقة سوبجرانولار هيبوكامبال هي واحدة من المجالات الرئيسية التي تحدث فيها الخلايا. عملية الخلايا يتأثر بالعديد من العوامل الفسيولوجية والمرضية. وفي بعض الحالات الصرع، هو الخلايا هيبوكامبال انخفاض كبير17،18. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن علاج اليكتروكونفولسيفي واحد إلى زيادة كبيرة في إنتاج الخلايا العصبية في المغزلي المسنن19. هذه الملاحظات تشير إلى أن النشاط الكهربية يلعب دوراً حاسما في تنظيم الخلايا الكبار واللدونه متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال. ولذلك، زيادة توضيح آثار DBS التردد على نشاط الخلايا العصبية والخلايا، أولاً نقوم بتنفيذ مقايسة immunostaining من فوري مطلع الجينات (IEG) ج-المنحدر الذي علامة معروفة لنشاط الخلايا العصبية القصيرة الأجل الناجمة عن تجربة20. أيضا يتم الكشف عن الإشارات Notch1 لمراقبة تفعيل إشارات بعد21،التسليم أسر22. وعلاوة على ذلك، نحن أيضا الكشف عن إنتاج الخلايا العصبية قبل بردو وسم التحليل بعد التعريفي DBS التردد بطرق مختلفة، على الرغم من تلطيخ بردو يمكن أن يكون أيضا علامة على جليوجينيسيس.
في هذه الدراسة، منهجيتين أسر يتم تكييفها لاستهداف تفعيل هيبوكامبال المدير العام مباشرة وغير مباشرة. مسرى مزروع إلى المدير العام مباشرة أو مزروع في المسار بيرفورانت الآنسي (PP) الذي يرسل إسقاطات لتنشيط الخلايا العصبية المديرية العامة. لتحريض DBS التردد، يرد مشجعا لبرمجة لتحفيز مستمر عبر مسرى الثابتة إلى رأس الماوس. لتحديد آثار أسر على تنشيط الخلايا العصبية، والخلايا، يمكننا الكشف عن التعبير عن ج-المنحدر و Notch1 بصبغة إيمونوفلوريسسينت وعدد بردو إدراج الخلايا العصبية الإيجابية في منطقة المديرية العامة هيبوكامبال، على التوالي، بعد علاج أسر. خاصة، هي مقارنة آثار التردد-DBS على الخلايا في المدير العام بين الحادة وطريقة تحفيز مزمنة، أو بين مباشر وطريقة تحفيز غير مباشر، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الإجراءات التجريبية الحيوانية المبادئ التوجيهية المؤسسية في "بكين معهد للعلوم الطبية الأساسية" (بيجين، الصين) واللوائح الحكومية الصينية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. الفئران (26 من الذكور، الكبار ~ 30 جرام) تم إيواء وتحفظ في درجة حرارة ثابتة من 23 درجة مئوية، مع الماء والغذاء إعلانية libitum، تحت 12-ح دورة الظلام الضوء/12-ح (الأنوار في الساعة 07:00 ص). وأجريت جميع الإجراءات التجريبية خلال دورة خفيفة.
1-إعداد الجراحية
ملاحظة: قطب كهربائي مخصص كانت محلية الصنع باستخدام الأسلوب تعديل من هالبيرن للتقرير23.
- استخدام 2 مايكرو-الأسلاك النحاسية (مع قطر خارجي من 200 ميكرومتر) كمسري القطبين موازية. التفاف الأقطاب حول بعضها البعض لتشكل أقطاب أسطواني للتحفيز.
ملاحظة: هنا، قد تباينت طول قطب كهربائي داخل PP أو المديرية العامة حسب عمق النواة التشريحية. - تعقيم أقطاب كهربائية باستخدام وزراء تطهير أكسيد الإيثيلين. معالجة وتخزين أقطاب كهربائية صغيرة من الأسلاك 2-قناة محلية الصنع دون أي تلوث. ينبغي أن تكون الأقطاب دقة تعقيمها قبل أي زرع جراحية.
- اﻷوتوكﻻف الأدوات الجراحية.
- قبل الجراحة، حقن الماوس مع بينتوباربيتال (20-50 مغ/كغ) إينترابيريتونيلي، لتحقيق طائرة جراحية التخدير.
- حقن الماوس مع تعليق والبروكايين عقيمة بنسلين G (75,000 يو، الدردشة) وعامل مسكن لتقليل خطر الإصابة بالالتهابات والألم، على التوالي24(والايبوبروفين، 0.05-1 مغ/كغ، اتفاقية استكهولم).
- بعد التخدير الحيوانية، تطبق تشحيم عين لكلتا العينين لمنع جفاف العين. ضمان إدخال التخدير وعمق التخدير بردود الفعل للحيوان في الاستجابة أخمص القدمين معسر، والمضي قدما في هذه العملية فقط عند حدوث أي استجابة.
ملاحظة: مرهم الطبيب البيطري خيار آخر لمنع جفاف العين. - حلق معظم الفراء على قمة رأسه الماوس مع مقص الشعر كهربائية أو شفرة حلاقة وتعقيم منطقة حلق مع ثلاثة يدعك متناوبة من محلول الكحول وتدين 70% والمضي قدما في العملية بعد تدين قد جفت على الجلد.
2-عالية التردد التحفيز جراحة25،26
ملاحظة: في هذه الخطوة، قطب مزروع من جانب واحد إلى المديرية العامة الظهرية أو الآنسي PP منطقة أو جزء من الحصين بأدوار حاسمة في العرضية التعلم والذاكرة.
- ضع الماوس أنيسثيتيزيد على الإطار المناظير باستخدام الأشعة. للاحتفاظ برأس الماوس غير متحرك، محاذاة أشرطة الإذن بشكل صحيح وتثبيتها بسرعة. تشديد القضبان الإذن بلطف حيث أن دعم رئيس مركزة وتأمين الماوس قليلاً.
- استخدم وسادة ترموستاتي للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في 37 ± 0.5 درجة مئوية.
- استخدام الملقط لفهم الجلد عرفت آذان الفأر وقطع عليه مع مقص معقم لإزالة حول منطقة 1 سم2 من الجلد على رأس الجمجمة الماوس.
ملاحظة: يمكن ملاحظة كمية صغيرة من النزيف على طول حواف قطع الجلد. - إزالة العضلات والمرفقات الأخرى تعلوها الجمجمة مع مسحه القطن تعريض سطح الجمجمة. استخدام مسحه القطن وازميل تشريح لتنظيف جميع السمحاق والاوتار والأنسجة الضامة من السطح تماما للتعرف السهمي في الجمجمة وخطوط خيوط لامدا.
- تحديد بريجما ونقطة لامدا. تقاطع خياطة كرونال وخياطة السهمي في الجزء الأوسط متفوقة كالفاريا حيث يقع بريجما. تقاطع خياطة لامبدويد بخياطة السهمي حيث مرئياً لامدا. استخدم في بريجما كنقطة الأصل لتعيين الموضع نواة أخرى.
- بعد تحديد موقف بريجما وامدا في الجمجمة، ضبط هاتين النقطتين في المستوى الأفقي. تأكد من أن ارتفاع هاتين النقطتين هو نفسه تقريبا في الاتجاه الظهري البطني (أي أخطاء ينبغي < 0.05 مم). أيضا، تأكد من أن الجمجمة مستوى في الاتجاه الجانبي الآنسي ب الطريقة ذاتها26.
- لعملية جراحية في جانب واحد، جبل قطب 2-قناة نحاس أسلاك صغيرة محلية صنع في حامل القطب التناوب على الإطار جراحي المناظير باستخدام الأشعة.
- ضع مسرى رأسياً أعلى نقطة بريجما في البداية، ووضعه في الموقع الأصلي. استخدام الرقمية عرض الإطار جراحي المناظير باستخدام الأشعة للإشارة إلى الأمامي الخلفي (AP)، الآنسي الجانبي (حركة التحرير)، ومواقع دورسو البطني (DV).
ملاحظة: لمنع الحصول على بنت مسرى، لا تلمس طرف القطب على الجمجمة أثناء العملية. - نقل مسرى بلطف إلى الموضع الصحيح (الشكل 1A، AP-2.1/ML ± 1.0 للمديرية العامة ووكالة اسوشييتد برس-3.8/ML ± 3.0 لمؤتمر المندوبين المفوضين، على التوالي)27 أعلاه الجمجمة دون أي اتصال. عندما تم تحديد الموقع المطلوب للإدراج القطب، استخدام التعديلات المناظير باستخدام الأشعة دورسوفينترال إلى أعلى حامل الأقطاب، ووضع علامة على موضع علامة سوداء.
ملاحظة: قد تختلف الموقع الدقيق إشارة إلى إحداثيات ستيريوتاكسيك بضغط الماوس، والوزن، والجنس. وينبغي استخدام الفئران البالغين من نفس الجنس التقليل إلى أدنى حد من أي تباين في الموقع. إذا كان ذلك ممكناً، ينبغي أن تستخدم الأشعة التشريحية السابقة للتشغيل لتحديد موقع أساس موضوع فردية27. - استخدام حفر ميكرومانيبولاتور ساعد اليد (لدغ الحجم = 0.5 مم) لجعل الثقوب لدغ في موقف واضح التحديد. تعقيم غيض لدغ مع الإيثانول 70% قبل الحفر. تحريك لأعلى مثقاب مصغرة من خلال الجمجمة على طول محور ع 0.8-1.0 مم دون تغيير موقفها س-ص. استخدم من القطن معقم لوقف أي نزيف أثناء العملية.
ملاحظة: لتجنب توليد الحرارة المفرطة والإفراط الحفر أثناء الحفر، ضمان سرعة الحفر 15,000-18,000 الثورات في الدقيقة الواحدة (لفة في الدقيقة)، وكثيراً ما تسحب مثقاب من ثقب لدغ كل s 8-10. - الاحتفاظ بالحفر حتى يتم كشفها في بلده دوراً. استخدام إبرة عازمة على إزالة أي قصاصات العظام التي يتم إنشاؤها أثناء الحفر وجعل ثقب في بلده دوراً دون إلحاق الضرر بالانسجة الناعمة الدماغ الكامنة.
ملاحظة: لتجنب إتلاف أنسجة المخ، الإبرة كليلة بنت يمكن أيضا الاستعاضة ملقط حادة غرامة. - للتأكد من أن الثقوب لدغ بذلت بشكل صحيح عند الموضع المطلوب، الحد من ارتفاع القطب بتعديل الإطار جراحة المناظير باستخدام الأشعة والتأكد من أنه يمكن إدراج مسرى بسلاسة من خلال ثقب لدغ دون لمس أي عقبات. إذا كان الأمر كذلك، ببطء إدراج الأقطاب بعمق 1.8 مم للمدير العام (أو 3.0 ملم ل PP) من سطح الجمجمة يقع في PP الآنسي إلى المدير العام (PP-المديرية العامة).
ملاحظة: تمحو أي النخاعي أو الدم إلى الخارج من الثقوب لدغ مع القطن المعقمة أثناء عملية زرع قطب كهربائي. - بعد إدراج الصغرى-السلك الكهربائي في ثقب الجمجمة، الاحتفاظ بها في مكان مع الأسمنت الأسنان الكافية باستخدام ملعقة صغيرة. كما يمسك الأسمنت، العفن حول القطب المدرج ومسامير شكل قبعة ناعمة لطيفة. ديبريدي وتطهير حواف الجرح.
- فك الارتباط من صاحب القطب الكهربائي. إزالة الماوس من الإطار المناظير باستخدام الأشعة وإعادته إلى قفص حارة.
ملاحظة: بعد الجراحة، وانتظر بإعادة الحيوانات إلى اقفاصها حتى أنهم شفوا تماما من التخدير مع الوعي الكافي. - واسمحوا الماوس تتحرك بحرية والسماح لها باستعادة لمدة يومين في القفص. ثم، الاتصال الكهربائي مزروع في الماوس يؤدي الدماغ إلى مشجعا لبرمجة عن طريق . إعداد واجهة البرنامج كما وردت في الشكل 2. تعيين معلمات أسر كسلسلة 6 قطارات 6 6 نبضات في 400 هرتز (الشكل 1ب، 100 مللي ثانية بين القطارات، 20 ثانية بين السلسلة)28. تعيين كثافة التحفيز 200 μA.
- تسليم أسر للفترة الزمنية المحددة المطلوب. تقديم تحفيز 2 x يوم من الساعة 08:00 ص والساعة 08:00 م
- لمجموعة المراقبة، زرع أقطاب كهربائية في الفئران ولا تقوم تحفيز.
- لتلطيخ ج-المنحدر ، حفز الفئران التجريبية حادة (x 2 في اليوم الواحد). لوسم بردو، تقسيم الفئران التجريبية إلى فريق تحفيز حادة (تطبيق x 2 في اليوم الواحد) ومجموعة تحفيز مزمن (تطبيق x 10 في 5 أيام، x 2 في اليوم الواحد). أثناء التنشيط، تأكد من الفأر مستيقظا. تذكر لضمان لا يتم الملتوية العملاء المتوقعين.
ملاحظة: في اليوم الأخير من الإجراء، الفئران في المجموعة التحفيز الحادة قد حفز في نفس الوقت. - عندما يتم التنشيط، بعناية قطع دبوس القطب صاحب القطب وموصل نظام التسجيل.
3-الفلورة تلطيخ وبروموديوكسيوريديني وسم29
- ج-المنحدر وتلطيخ Notch1، حوالي 3 ح بعد تنشيط DBS التردد الأخير، تخدير الفئران عن طريق حقن بينتوباربيتال (20-50 مغ/كغ، القائمة) لتحقيق طائرة جراحية التخدير.
- لوسم بردو، تعطي حوالي 12 ساعة بعد تنشيط DBS التردد الأخير، 6 حقن بردو لعنصر التحكم وحفز الفئران على فترات 2-ح (50 مغ/كغ في المحلول الملحي 0.9 ٪، القائمة). ح 36 بعد الحقن الماضي، تخدير الفئران عن طريق حقن بينتوباربيتال (20-50 مغ/كغ، القائمة) لتحقيق طائرة جراحية.
- جعل شقوق باستخدام مشرط عن طريق القفص الصدري لفضح القلب وثم تمرير إبرة 22-قياس التروية حادة إلى البطين الأيسر. إجراء شق صغير في الاذين الأيمن. ترانسكارديالي نتخلل أنه مع 50 مل من البرد مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) تليها 50 مل من البرد بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني 1 x (الرقم الهيدروجيني 7.4).
ملاحظة: التبديل في برنامج تلفزيوني لمنهاج عمل بيجين عندما يتم استبداله الماوس الدم في فيفو ويعمل السائل واضحة. يمكن الحكم التروية جيدة بتطهير الكبد. يجب أن تتوقف التروية بمجرد التثبيت الهزات قد لوحظت30. - قطع رأس الماوس مع مقص العيون، وجعل شق في الجلد وفضح الجمجمة. استخدام الملقط، رقاقة قبالة الجمجمة قليلاً وتشريح الدماغ الماوس كله بعناية. الوظيفة-fix الدماغ في بارافورمالدهيد 4% لمدة 2 يوما إضافيا، وأنه نقل إلى حل سكروز 30% في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- استخدام كريوستات، قطع العقول إلى أقسام الاكليلية 20 ميكرومتر. نقل وتحميل المقاطع على الشريحة الزجاجية بواسطة فرشاة وتخزينها في-20 درجة مئوية.
ملاحظة: سيتم استبعاد الحيوانات مع ميسبلاسيمينتس قطب كهربائي أو المفرطة أضرار ميكانيكية من التحليل اللاحق. - نقل الشرائح إلى برنامج تلفزيوني العادي (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على لا مثبت. تغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني ل x 3-4 لمدة 5 دقائق في كل منهما لإزالة أي مثبت الزائدة. المجموعة المسماة بردو، احتضان المقاطع في HCl 2-N لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وشطف لهم في المخزن مؤقت بورات 0.1-M (pH 8.4؛ 10 دقيقة). ثم تغسل شرائح 2 x لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: ثم يتم تنفيذ إيمونوستاينينج. - التعامل مع الشرائح بالحضانة في عرقلة الحل (مصل الماعز العادي 1%، 3% ألبومين المصل البقري < جيش صرب البوسنة >، 0.5% Triton X-100 و 0.02 في المائة الصوديوم أزيد في برنامج تلفزيوني 1 x) ح 1 في درجة حرارة الغرفة (RT).
- احتضان الشرائح مع مكافحة-ج-المنحدر [بولكلونل] جسم (1: 500؛ أرنب) أو الأجسام المضادة Notch1 (01:50؛ والماعز) أو جسم بردو المضادة (1:800؛ فأر) في عرقلة الحل في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- تغسل شرائح 3 x في برنامج تلفزيوني، ثم احتضانها لهم مع أليكسا فلور 568 مترافق الأرنب المضادة (1: 500)، الماعز المضادة مترافق أليكسا فلور 488 (1:1، 000)، أو جسم أليكسا فلور 488 مترافق مكافحة الفئران (1: 500) الثانوية ح 1 في الرايت
- تغسل العينات 3 x في برنامج تلفزيوني (10 دقيقة في كل مرة). وتغطي الأجزاء الدماغ المسمى المناعية استخدام وسيلة تصاعد كاشف تتلاشى المضادة التي تحتوي على DAPI. واسمحوا شرائح أيردري وتخزينها في محمية من الضوء في 4 درجات مئوية.
- الحصول على صور للمناطق هيبوكامبال من الجانبين unstimulated وحفز الدماغ مع قناة متعددة عالية الدقة (متسلسلة) المسح مجهر [كنفوكل]. تعيين معلمات التصوير دائماً بين السيطرة والمجموعات التجريبية.
- القيام تصوير فسيفساء استخدام هدفا عالية التكبير (X 20 الهواء الهدف، نا 0.45) للحصول على الصور (XYZ) 3D المستمر من الحقول المتاخمة للعرض باستخدام مرحلة يجهز والاستفادة من البرامج المناسبة لغرزة معا لجعل مركب كبير الصور.
ملاحظة: تشمل وظائف التبليط خياطة صحيحاً وتجانس الخيارات لتحسين الصور سلس. مركب الصور بسرعة وسهولة تعد باستخدام الدالة خياطة، لتشكل صورة على امتداد منطقة واسعة. - ج-المنحدر وتلطيخ Notch1، القيام بتحليل كمي نوى إيجابية ل الكثافة إيمونوفلوريسسينت21 من الصور مخيط. عشوائياً تحديد 3 مناطق في المناطق الفرعية DG هيبوكامبال روسترال والظهري والبطني وقياس كثافة إيمونوفلوريسسينت بطريقة مزدوجة أعمى استخدام ي الصورة البرمجيات (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
- بردو وضع العلامات، تحليل الشرائح حول نقطة الحفر عن طريق الحصين الظهرية (مم-1.70 مم-2.70 بالنسبة بريجما) بطريقة مزدوجة أعمى.
- عد فقط بردو-إيجابية الخلايا العصبية في المدير العام. وتشمل الخلايا الواقعة داخل أقطار 2-خلية من الخلايا الحبيبية في العد.
ملاحظة: هنا، عد أجرى استخدام 40 × الهدف الجوي. عشوائياً، أحصى أبواب 3-5 للحيوان الواحد، وبلغ متوسط التهم والتعبير عنها كوسيلة للمديرية العامة19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد تنشيط DBS التردد إلى منطقة هيبوكامبال المديرية العامة مباشرة أو PP المنطقة دون الإقليمية تفعيل المديرية العامة شكل غير مباشر عن طريق إدراج أقطاب استخدام التعديلات المناظير باستخدام الأشعة، القوارض تم تخديره مع بينتوباربيتال وأخذت منها عينات ح 3 بعد تنشيط DBS التردد الماضي ج-المنحدر و Notch1 immunostaining. لتلطيخ بردو، ح 36 بعد حقن بردو الماضي بعد يوم 1 أو 5 أيام من التحفيز DBS التردد، وتم تخديره القوارض مع بينتوباربيتال للتحضير لأقسام الدماغ. ويبين الشكل 3 أن التعبير عن ج-المنحدر قد زادت كثيرا في الجانب عن من المدير العام. وباﻹضافة إلى ذلك، تعبير ج-المنحدر في الجانب كونترالاتيرال من المدير العام كان أيضا upregulated مقارنة بعناصر التحكم لا-HF-DBS التحفيز الذي أظهر تقريبا أي تعبير عن إشارة ج-المنحدر . استناداً إلى تلطيخ شرائح المخ، إيمونوفلوريسسينت Notch1-المحددة كما هو موضح في تكميلية الشكل 1، أثبتنا كذلك أن الإشارات Notch1 يمكن أيضا تنشيط في DG هيبوكامبال الكبار بعد تنشيط أسر بالحث من ديبولاريزيشن من الخلايا العصبية في PP (أيضا الرجوع إلى البيانات الخام الموردة التكميلية ملف 1).
بالإضافة إلى تحفيز DBS التردد مباشرة في منطقة المديرية العامة، يبين الشكل 4ألف الموقف وموقع التحفيز DBS التردد من طرف القطب، الذي تم تثبيته في الصفحات الآنسي الشكل 4ب أثبت أن التردد-DBS التحفيز في PP ليس فقط زيادة كبيرة في مستوى التعبير ج-المنحدر في الجانب عن عن المدير العام، ولكن أيضا زيادة التعبير عن ج-المنحدر في الجانب كونترالاتيرال من المديرية العامة مقارنة بتحفيز لا-HF-DBS عناصر التحكم.
استناداً بردو وسم تحليل الشرائح الدماغ، كما هو مبين في الأرقام 5A-ج 5، نحن كذلك أظهرت أن الخلايا يمكن أيضا تنشيط في DG هيبوكامبال الكبار بعد حفز DBS التردد مزمن (5 أيام) في المدير العام مباشرة. حفز DBS التردد مزمن في المدير العام ليس فقط إلى حد كبير أوبريجولاتيد الخلايا في عن الجانب لكن أيضا زيادة الخلايا في الجانب كونترالاتيرال مقارنة بعناصر التحكم لا-HF-DBS التحفيز. ومع ذلك، فشل تحفيز الحادة (يوم واحد) للحث upregulation من الخلايا عن الجانب أو في الجانب كونترالاتيرال من المدير العام. كما هو موضح في الشكل 5د، في مجموعة التحفيز الحادة أو في مجموعة التحفيز المزمنة، تعذر تغيير غير مباشرة التردد دي بي إس في PP على مستوى الخلايا في المديرية العامة هيبوكامبال.
الشكل 1 . التمثيل التخطيطي لأهداف المخ نصيحة القطب والمعلمات أسر- تتم الإشارة إلى المسار بيرفورانت (A) إسقاط الخلايا العصبية الآنسي إلى شفرة أقل شأنا من المغزلي المسنن. وضع أقطاب كهربائية تم إدراجها (في الأرجواني) يشار إلى حفز المدير العام مباشرة أو المنطقة دون الإقليمية PP. (ب) المعلمة أسر يرد كسلسلة 6 قطارات 6 نبضات 6 في 400 هرتز، مع 100 مللي ثانية بين القطارات و 20 ثانية بين السلسلة. CA = أمونيس قرن؛ DG = المغزلي المسنن؛ PP = المسار بيرفورانت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . واجهة والمعلمات مولتيستيمولاتور. متصل بمحول رقمي-تناظري مشجعا وتفعيلها من خلال البرمجيات المسجلة الملكية. وكان نوع الحافز أسر أحادية الطور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . تنشيط الخلايا العصبية في المدير العام استجابة لعلاج التردد DBS مباشرة- (أ) طرف القطب (مربع أبيض غير معبأ) كان وضعه فوق منطقة المديرية العامة مباشرة (AP-2.1/تيار مل/العنف المنزلي +1.8) مع أو بدون أسر. يظهر هذا الفريق immunostaining الجزء الاكليلية من شرائح المخ مع جسمج-المنحدر في عنصر التحكم والمجموعات أسر. واستخدمت تلطيخ DAPI الأزرق للإشارة إلى موقع نواة هيبوكامبال. شريط المقياس = 100 ميكرومتر-(ب) هذا الفريق ويبين تحليل الكمي لكثافة إشارة الفلورة. في الجانب عن المدير العام، تم تنشيط الخلايا العصبية إلى حد كبير مع تعبير عالية من ج-المنحدر، وهو زيادة التعبير ج-المنحدر في الجانب كونترالاتيرال من المدير العام أيضا نسبيا مقارنة ج-المنحدر في التعبير عن مكافحة الفئران بدون علاج أسر. يعني ± ووزارة شؤون المرأة، ANOVA أحادي الاتجاه، و2,24 = 216، ف < 0.0001، اختبار بونفيروني الوظيفة المخصصة ، * * *ف < 0.001، نلا-الأمراض المنقولة جنسياً = 9 (3 شرائح من الفئران 3)، نكونترا أسر = 9 (3 شرائح/الفأر من 3 الفئران)، نIPS أسر = 9 (3 شرائح/الماوس من الفئران 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . تنشيط الخلايا العصبية في المدير العام ردا على أسر في المنطقة دون الإقليمية PP. (أ) طرف القطب (مربع أبيض غير معبأ) كان المتمركزة في PP الآنسي في موقف AP-3.8، ±3.0 مل، والعنف المنزلي +3.0، مع أو بدون أسر. (ب) هذا الفريق يظهر immunostaining الجزء الاكليلية من شرائح المخ مع جسمج-المنحدر في عنصر التحكم والمجموعات أسر. واستخدمت تلطيخ DAPI الأزرق للإشارة إلى موقع نواة هيبوكامبال. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ج) هذا الفريق ويبين تحليل الكمي لكثافة إيمونوفلوريسسينت. يمكن تنشيط معاملة أسر في PP إلى حد كبير عن الخلايا العصبية في المدير العام مع تعبير عالية من ج-المنحدر. يتم زيادة التعبير عن ج-المنحدر في المديرية العامة كونترالاتيرال أيضا نسبيا مقارنة بتعبير ج-المنحدر من الفئران السيطرة دون علاج أسر. يعني ± ووزارة شؤون المرأة، ANOVA أحادي الاتجاه، و2,24 = 189.3، ف < 0.0001، اختبار بونفيروني الوظيفة المخصصة ، * * *ف < 0.001، نلا-الأمراض المنقولة جنسياً = 9 (3 شرائح من الفئران 3)، نكونترا أسر = 9 (3 شرائح/الماوس من الفئران 3)، نIPS أسر = 9 (3 شرائح/الماوس من الفئران 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . تفعيل متميزة من الخلايا في المدير العام ردا على أسر في المديرية العامة و PP على التوالي- (أ) هذا الفريق يظهر نموذج تجريبي لمعاملة أسر وتوليد المسمى بردو تكاثر الخلايا العصبية في المدير العام. وقسمت الحيوانات إلى الحادة ومزمنة مجموعة. في المجموعة الحادة، تعرض الفئران لهو علاج أسر 2 x 5 في اليوم. في المجموعة المزمنة، تعرض الفئران لهو علاج أسر لمدة 5 أيام (من يوم 1 إلى يوم 5، x 2 في اليوم الواحد). ثم تم حقن الحيوانات في كلتا المجموعتين بردو (50 مغ/كغ، س 6 فواصل 2-ح) في يوم 6. في يوم 8، تم تخديره الحيوانات و perfused لإعداد مقاطع كريوستات. (ب) يظهر هذا الفريق تلطيخ إيممونوفلوريسسينت من بردو (باللون الأخضر) وظيفة-HF-DBS في المدير العام. (ج) التحليل الكمي لإنتاج الخلايا العصبية وأشارت الحادة (x 2 في يوم 1) التحفيز في المدير العام لا يمكن أن تعزز الخلايا، بينما المزمن التحفيز (x 10 في غضون 5 أيام) في المديرية العامة كبير أوبريجولاتيد الخلايا. بالمقارنة مع مجموعة المراقبة، عدد بردو تسمية الخلايا زيادة كبيرة في المزمن المجموعة في نصف الكرة الغربي عن وكونترالاتيرال على حد سواء. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. وسائل ± SEM، ANOVA ثنائي الاتجاه، تحفيز نوع تأثير و2, 14 = 97.09، ف < 0.0001، تأثير و نصف الكرة1، 14 = 1.137، ف = 0.3044، اختبار بونفيروني الوظيفة المخصصة ، * * *ف < 0.001، ن تحكم = 3 (3 شرائح من الفئران 3)، nيوم 1 = 4 (4 شرائح من الفئران 3)، ن5 أيام = 3 (3 شرائح من الفئران 3). (د) يظهر هذا الفريق تلطيخ الفلورة من بردو (باللون الأخضر) وظيفة-HF-DBS في المنطقة دون الإقليمية PP. (ﻫ) تحليل كمي لإنتاج الخلايا العصبية وأشارت الحادة (مرتين في يوم واحد) أو مزمنة (x 10 في 5 أيام) أما التحفيز في PP لا يمكن أن تعزز الخلايا إلى حد كبير. وكان عدد بردو تسمية الخلايا مستقرة نسبيا مع أو بدون علاج أسر. شريط مقياس = 100 ميكرومتر. وسائل ± SEM، ANOVA ثنائي الاتجاه، تحفيز نوع تأثير و2, 16 = 0.9025، ف = 0.4252، تأثير و نصف الكرة1, 16 = 1.402، ف = 0.2537، اختبار بونفيروني وظيفة المخصصة ، ف > 0.05، ن تحكم = 3 (3 شرائح من الفئران 3)، nيوم 1 = 3 (3 شرائح من الفئران 3)، ن5 أيام = 5 (5 شرائح من الفئران 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الرقم 1. التعبير عن Notch1 في المدير العام استجابة للعلاج HF DBS. (أ) يظهر هذا الفريق تلطيخ إيمونوفلوريسسينت من Notch1 (باللون الأخضر) ح 3 بعد التردد-DBS في المدير العام. وكان هذا الرقم المشار إليها وتعديلها من فنغ التقرير21. (ب) التحليل الكمي للأسفار أشارت إلى أن أسر في المديرية العامة يمكن أن تعزز التعبير عن Notch1. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. وسائل ± SEM، طالب t-اختبار t = 12، * * *ف < 0.001، نلا-الأمراض المنقولة جنسياً = 9 (3 شرائح/الماوس من الفئران 3)، نأسر = 9 (3 شرائح/الماوس من الفئران 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الملف 1. البيانات الخام- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قد استخدمت تقنية DBS التردد على نطاق واسع كأداة قوية لعلاج العديد من الاضطرابات العصبية منذ التسعينات. حتى الآن، عمل تاريخي DBS التردد لعلاج مرض باركنسون والهزة الأساسية، التي جذبت الكثير من الاهتمام والمصلحة في العيادة والمجتمع العلمي على حد سواء. وهناك أنواع مختلفة من الدراسات الجارية بالتردد-DBS بالعديد من المجموعات للتطبيق ذات التردد العالي-DBS العلاجية في بعض الاضطرابات العصبية والنفسية32،33. وبعض هذه الدراسات حاليا في مراحل مختلفة من التجارب السريرية2،34. على الرغم من التردد-DBS ينبغي أن تجلب فوائد كبيرة، تحفيز الآثار الجانبية يمكن أن تحدث حتى مع موضع الكمال في الدماغ، مثل التغيرات السلبية في المزاج والتفكير، إلخ، التي يتم عكسها ويمكن تجنبها مع إدخال تعديلات إعدادات التنبيه.
وبالإضافة إلى التقدم الكبير تكنولوجيا التردد DBS المتراكمة من التجارب السريرية على مدى العقود الماضية، يقدم دراسات DBS التردد في الحيوانات الحية أيضا الفرصة لفهم التغيرات الفسيولوجية والعصبية الحيوية الآليات التي يسببها بالتحفيز الكهربائي. في هذه المخطوطة، لقد قمنا بوصف منهجية DBS التردد معدل أداؤها في الفئران حفز DG هيبوكامبال المنطقة دون الإقليمية مع أسر صورة مباشرة أو غير مباشرة. على الرغم من أن يتم تنفيذ البروتوكول هو موضح في القوارض، أسر استجابة أيضا بنجاح أجريت دراسات في الكائنات الأخرى في النموذج، بما فيها الخنازير35. لهذا الأسلوب، يمكن أيضا استخدام جراحة المناظير باستخدام الأشعة لحفز النواة المستهدفة محتملة لاختبار فعالية أسر استخدام نماذج حيوانية معينة مع الاضطرابات العصبية والنفسية. سهولة ينبغي أن تترجم النتائج المستخلصة من هذه الدراسات إلى العيادة، على وجه التحديد لتحسين أمن الأسرة المعيشية الغذائي في الأهداف الحالية. ملاحظة أننا نختار خلافا للسلسلة من التعرض لأخطار متعددة من التردد-DBS في العيادة، في هذه الدراسة المنهجية، تعرض لفترة واحدة وقصيرة الأجل من أسر الحفز والحث على نشاط الخلايا العصبية في المديرية العامة هيبوكامبال والمعلمة وجزء من النموذج من أسر التي أبلغت مسبقاً إلى حمل الكمونية في21،شرائح الحصين28.
القيود العامة من التردد-DBS قد تم على نطاق واسع في أماكن أخرى واستعرض24،25. واحدة من التحديات التي تواجه هذه التجربة هنا هو أيضا الحاجة إلى تقنية جراحية ممتازة واستمرار الرعاية الجراحية موضع تشريحي. بشكل صحيح وعلى وجه التحديد زرع مسرى إلى نواة الهدف للتحفيز، واحدة من العمليات الرئيسية عملية جراحية ناجحة بأحد الفنيين مهرة لتجنب إصابة الأوعية الدموية لا لزوم لها وفقدان القطب. وعلاوة على ذلك، المزيد من التحليل التشريحية والنسيجي للعينة الدماغ ضروري أيضا لتأكيد استهداف الكهربائي السليم بعد أسر. هذا أيضا واحد من مزايا هذا النهج، تبين بوضوح استهداف المصوبة القطب بعد العملية في دماغ حيوان سليمة. العديد من التفاصيل الواردة في هذا البروتوكول يمكن سهولة تكييفها الطويلة الأجل تحفيز عن طريق مشجعا مزروع في الحيوان. تجدر الإشارة إلى أنها أيضا قابلة للمعلمات التحفيز المناوب في أهداف المخ العلاجية المحتملة مع أسر تقديم أنماط مختلفة. ومع ذلك، هذه المادة عن أسر حادة وحدة واحدة تسليم وحدة مشجعا لبرمجة فهم التغيرات الخلوية بعد التحفيز الكهربائي.
HF-DBS يخدم كخيار بديل لعلاج الاضطرابات العصبية والنفسية في العيادة لعدة سنوات، لا تزال الآليات الكامنة فعاليتها غير مفهومة. ونظرا لاستخدام وإدخال تحسينات في المستقبل من التردد-DBS، مطلوب نهجاً أكثر واقعية. كأداة تطوير، يحتاج تقنية أسر إلى مزيد من الابتكار التقني واكتشاف آليا. دراسة الآليات الخلوية والجزيئية للتردد DBS، سيوفر تحليلاً الترنسكربيتوم عالمية استناداً إلى تقنيات التسلسل الفائق معلومات هامة لفهم الأحداث الجزيئية ومما يشير إلى التغييرات بعد تحريض DBS التردد 36-بالإضافة إلى استراتيجية الفرز غير منحازة، استناداً إلى دراستها للمرشحين الجزيئية القائمة التي ثبت للرد على ديبولاريزيشن الخلايا العصبية، من المحتمل أيضا تقديم أدلة هامة لتحديد المستجيبة الرئيسية مسؤولة عن أمن الأسرة المعيشية الغذائي مع. ج-المنحدر upregulated ردا على نشاط الخلايا العصبية الذاتية، حيث يبحث في التعبير عنه على الأقل توفر لنا المناظر الطبيعية من الخلايا العصبية أطلقت مؤخرا37. بيد ج-المنحدر ينبغي أن لا تستعمل فقط تعكس أنشطة فقط نظراً لأنه يبدو أيضا وضع علامة على الخلايا العصبية التي تمر LTP37. الأعمال السابقة، بما في ذلك بلدنا، أثبتت أن Notch1 يقوم بدور حاسم في اللدونة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال ناضجة وضروري للخلايا الكبار في فيفو21،22. فيما يتعلق بهذه الحالة، تعريب الكمية والزمانية المكانية مفصلة الرئيسية ينبغي أن تتسم المرشحين بعناية ووصف ما قبل وتحريض وظيفة-أسر بتحليل المناعي التعبير ج-المنحدر . وستوفر الدراسات مثل هذه الأدلة المباشرة لإظهار تغييرات أنماط التعبير الجيني في مختلف مناطق الدماغ استجابة لأسر21، الذي سيكون أيضا مفيداً للكشف عن التغييرات الخلوية مثل تنشيط الخلايا العصبية، الخلايا، أو نيوروديجينيريشن.
وينبغي أيضا أن لاحظت أنه على الرغم من مزايا تطبيق DBS التردد في العيادة، يرجع ذلك إلى حقيقة أن نتائج تأثير التحفيز ترتبط محكم مع المعلمات التحفيز واستهداف موقع في الدماغ، والخلوية والجزيئية الآليات الأساسية للآثار لأسر قد تكون معقدة للغاية. في هذه الدراسة، نفذنا كذلك بردو وسم للتحقيق في آثار أمن الأسرة المعيشية الغذائي الحاد والمزمن على الخلايا الكبار. على الرغم من أن تلطيخ بردو يمكن أن يكون علامة للخلايا وجليوجينيسيس على حد سواء، استناداً إلى التقارير السابقة، غالبية بردو زيادة الخلايا العصبية الإيجابية لوحظت في سجز بعد ينبغي أن يكون هو علاج التردد DBS التكاثري المتكفل العصبية البالغين21 , 38 , 39-بغض النظر عن تعقيد الآليات الكامنة وراء معاملة أسر، الأساليب والنتائج التي وصفناها في هذه المخطوطة توفر دليل مباشر على أن التحفيز الكهربائي عالية التردد المتكرر لتنشيط DG هيبوكامبال يمكن إلى حد كبير حمل تفعيل نشاط والخلايا العصبية في الجسم الحي.
وباختصار، أظهرنا أن التردد-DBS يمكن تحسين بنشاط الخلايا العصبية والخلايا من الفئران، مقارنة بنشاط الخلايا العصبية والخلايا لمكافحة الفئران الذين لم تطرأ التردد-DBS. وهذا قد تقدم الفهم العلمي فيما يتعلق بالآثار المعرفية والزخرفة التحفيز لأسر في فيفو. تحديد الخلايا العصبية التنشيط بعد الحاد التردد DBS العلاج مباشرة أو غير مباشرة في فيفو يوضح أنه هو علاج أسر له آثار هامة على انتقال متشابك الاتصالات المحلية والبعيدة المدى. التعريف السريع لتنشيط الخلايا العصبية بعد علاج HF DBS توفر أداة قوية التعامل مع انتقال متشابك البصر أو ديسينتشرونيزيشن في العديد من الاضطرابات العصبية والنفسية مثل MDD. من ناحية أخرى، يوحي تحريض الخلايا بعد علاج DBS التردد المزمن و، لكن لا الحادة مباشرة أو غير مباشرة بكفاءة متميزة وتقلب الوظيفية بين الخلق التحفيز الكهربائي مختلفة. هذه النتائج تقدم أدلة مباشرة للتحوير العصبية والفوائد العلاجية المحتملة لأسر في المستقبل. أخذت معا، سيقدم DBS التردد مزايا كبيرة لعلاج الاضطرابات العصبية والنفسية عن طريق إدماج التقدم التكنولوجي المحرز في العيادة وما أحرزته من تقدم آليا في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بإعلان.
Acknowledgments
وبدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية لمنح الصين 31522029 و 31770929 و 31371149 (إلى وو هايتاو)، برنامج 973 (2014CB542203) من برنامج الدولة الإنمائية الرئيسية للبحوث الأساسية للصين (إلى هايتاو وو)، ومنحة Z161100000216154 من بكين البلدية لجنة العلم والتكنولوجيا (إلى هايتاو وو). يشكر المؤلفون جميع أعضاء المختبر هايتاو وو لتشجيعهم والمناقشات. الكتاب ممتنون جداً جينوي ليو لمساعدته مع التصحيح على جهاز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
References
- Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Kohl, S., et al. Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review. BMC Psychiatry. 14, 214 (2014).
- Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression. Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).
- Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).
- Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).
- Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation for Parkinson's disease and other movement disorders. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).
- Garcia, L., D'Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. High-frequency stimulation in Parkinson's disease: more or less. Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).
- Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats. Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).
- Grubert, C., et al. Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation. The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).
- Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).
- McIntyre, C. C., Hahn, P. J. Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation. Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).
- Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. Sing the mind electric - principles of deep brain stimulation. European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).
- Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).
- Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (97), e52457 (2015).
- Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5 26-41 (2008).
- Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression. Behavioral and Brain Functions. 6, 35 (2010).
- Feng, S., et al. Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment. The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).
- Alberi, L., et al. Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks. Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).
- Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. A step-wise approach to deep brain stimulation in mice. Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).
- Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration. Journal of Visualized Experiments. (107), e53266 (2016).
- Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation. Journal of Visualized Experiments. (104), e53066 (2015).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6 (2007).
- McHugh, T. J., et al. Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network. Science. 317 (5834), 94-99 (2007).
- Gonzalez, C., et al. Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories. Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tse, N., et al. The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (94), e52220 (2014).
- Pizzolato, G., Mandat, T. Deep brain stimulation for movement disorders. Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2 (2012).
- Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).
- Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).
- Min, H. K., et al. Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals. NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).
- Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. 2015 (11), Cold Spring Harbor Protocols. 951-969 (2015).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Frontiers in Neural Circuits. 8, 37 (2014).
- Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).
- Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
