Summary
פרוטוקול זה מראה כיצד להגדיר שיטה אמינה מערכת קבצים הירארכית בעכברים. נוירונים ברחבי הכישור משוננת בהיפוקמפוס הם גירוי חשמלית על-ידי מערכת קבצים הירארכית ישירות ובעקיפין בתוך vivo. פעילות. עצבית והאיתות מולקולרית נבדקים על ידי c-פוס Notch1 immunofluorescent מכתים, בהתאמה; נוירוג'נסיס לכמת על-ידי bromodeoxyuridine תיוג וזמינותו.
Abstract
גירוי בתדירות גבוהה חשמלי (מערכת קבצים הירארכית), באמצעות אלקטרודות מושתל מיקוד אזורים שונים במוח, הוכח כטיפול יעיל עבור נוירולוגיות שונות והפרעות פסיכיאטריות. מערכת קבצים הירארכית באזור עמוק של המוח, גם בשם גירוי עמוק-מוחי (DBS), הופך להיות חשוב יותר ויותר בניסויים קליניים. התקדמות אחרונים בתחום ניתוח DBS (HF-DBS) בתדירות גבוהה החלה להפיץ את האפשרות של טכניקה פולשנית זו במצבים אחרים, כגון טיפול הפרעת דיכאון (MDD), הפרעה אובססיבית-כפייתית (OCD), וכך ב.
למרות אלה אינדיקציות מתרחבת, המנגנון הבסיסי של ההשפעות המיטיבות של HF-DBS נשארים חידתי. כדי להתייחס לשאלה זו, גישה אחת היא להשתמש אלקטרודות מושתל שמפעילים בדלילות subpopulations מבוזרת של נוירונים על-ידי מערכת קבצים הירארכית. דווח כי מערכת קבצים הירארכית בגרעין הקדמי של התלמוס יכול לשמש לטיפול של אפילפסיה עקשן במרפאה. המנגנונים שבבסיס קשורות נוירוג'נסיס מוגברת ואין לשנותן פעילות. עצבית. לכן, אנו מעוניינים לגלות שינויים פיזיולוגיים על ידי זיהוי פעילות. עצבית, כמו גם נוירוג'נסיס ב הכישור משוננת העכבר (ג'י) לפני ואחרי טיפול מערכת קבצים הירארכית.
כתב יד זה, אנו מתארים מתודולוגיות עבור מערכת קבצים הירארכית למקד את הפעלת די. ג'י בעכברים, ישירות או בעקיפין, באופן אקוטי או כרוני. בנוסף, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט להכנת פרוסות המוח c-פוס Notch1 immunofluorescent מכתים כדי לפקח על הפעילות העצבית והאיתות ההפעלה וכן עבור bromodeoxyuridine (BrdU) תיוג כדי לקבוע נוירוג'נסיס לאחר אינדוקציה HF-DBS. ההפעלה של פעילות. עצבית ו נוירוג'נסיס לאחר הטיפול HF-DBS מספק ראיות ישירות הנוירוביולוגי ויתרונות טיפוליים פוטנציאליים. במיוחד, מתודולוגיה זו יכולה להיות שונה ומוחלים כדי להתמקד באזורים אחרים במוח מעוניין כגון the הגרעינים הבזליים ואזורים subthalamic עבור הפרעות מוח ספציפיים במרפאה.
Introduction
HF-DBS הוא טכנולוגיה נוירוכירורגיים סטימולציה חשמלית במוח, אשר פותחה מאז המאה ה-1. בשנות ה-80 המאוחרות, מערכת קבצים הירארכית שימש תחילה התערבות טיפולית פוטנציאל מחלת פרקינסון, הפרעות תנועה אחרת2. ב העשורים האחרונים, HF-DBS כבר יותר בשימוש נרחב לטיפול הפרעות במוח אשר נמצאים כיום חשוכת על ידי אסטרטגיה טיפולית מסורתיים. במיוחד, עקב השיפור דיוק של האלקטרודה מערכת קבצים הירארכית, תוצאות יעילות מאוד, תופעות לוואי מינימליות, מספר הפרעות מוח מטופלים על ידי HF-DBS באופן משמעותי גדל במהלך עשרות שנים3,4, 5. לדוגמה, HF-DBS אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לטיפול של מחלת פרקינסון (PD), סוג אלצהיימר של, רעד חיוני וסוגים אחרים של התנועה הפרעות2,6, 7. חולי PD, התרופה וכולינרגיים מצטמצם עד 50% במהלך HF-DBS8. בנוסף לטיפול מוצלח של הפרעות תנועה, HF-DBS הוכיחה גם השפעותיו רב עוצמה לטיפול במחלות פסיכיאטריות במרפאה, ועל הגדלת קוגניטיביים כמו גם2,9, 10 , 11. יצוין כי המחקר של מערכת קבצים הירארכית לטיפול של הפרעות פסיכיאטריות אחרות נמצאות בשלבים שונים, המציעים מבטיח הרבה חולים12.
למרות מחקרים רבים הוכיחו כי מערכת קבצים הירארכית מוקד יש השפעות הן מקומי והן מרוחק ברחבי המוח13, המנגנונים נוירולוגיות ומולקולרית של ההשפעות יישארו חמקמק2,14. במרפאה, HF טיפולית-DBS מיושם בדרך כלל באופן ארוך טווח לטיפול של מחלת פרקינסון, כאב כרוני, ועוד שהרבה דעות מגודלים להסביר את השיפור שנוצר על ידי טיפול HF-DBS, בין אילו אפשרות אחת כי הזרם מערכת קבצים הירארכית שמחליש את פעילות הרשת העצבית, כנראה על ידי דפולריזציה חוזרות של האקסונים באזור האלקטרודה מערכת קבצים הירארכית מושתל. לחלופין, HF-DBS עלול לשנות את קצב פריקה של הנוירונים פלט ואת המטרות המוקרנת. בנוסף, HF-DBS עלולה לגרום לשינויים סינפטית לטווח ארוך, לרבות הויסעגט (LTP) ודיכאון לטווח ארוך (בע מ), אשר עשויים לתרום שיפור סימפטומטי. עד כה, זה עדיין לא ברור אם מערכת קבצים הירארכית influences האירועים המולקולריים מפתח לווסת את הסלולרי תהליכים כאלה כמו למבוגרים נוירוג'נסיס בתוך vivo. מספר שורות של מחקרים הוכיחו כי מערכת קבצים הירארכית בחולדות עשויה לחקות דומה תגובות עצביות DBS קלינית יישומית15,16. כדי להבין את המנגנונים הסלולר הבסיסית של HF-DBS, במחקר זה, תחילה הקמנו של ויוו מערכת קבצים הירארכית מתודולוגיה בעכברים חריפה (יום אחד) או באופן כרוני (חמישה ימים). שנית, הקמנו מתודולוגיה הפעלה ניתוח כדי לקבוע את שינוי פעילות. עצבית ו נוירוג'נסיס לאחר הלידה HF-DBS.
בהתחשב בכך הייצור עצביים מתאי גזע עצביים הוא שופע במהלך התפתחות עובריים אך ממשיכה לאורך כל חיי הבוגרים, אזור subgranular בהיפוקמפוס הוא אחד האזורים העיקריים בו נוירוג'נסיס מתרחשת. התהליך של נוירוג'נסיס מושפע על ידי גורמים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים. במקרים מסויימים אפילפטי, נוירוג'נסיס בהיפוקמפוס הוא ירד באופן דרמטי17,18. בנוסף, נזעי חשמל יחיד יכול להגדיל באופן משמעותי את ייצור עצביים הפיתול משוננת19. מקרים אלה מצביעים על הפעילות אלקטרופיזיולוגיות שמשחק תפקיד מרכזי בויסות נוירוג'נסיס למבוגרים ופלסטיות סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס. לכן, להפגין עוד יותר את ההשפעות של HF-DBS על פעילות. עצבית ו נוירוג'נסיס, אנחנו קודם לבצע את וזמינותו של immunostaining של מיידית מוקדם ג'ין (הרגל) c-פוס אשר מהווה סמן ידועים של הפעילות העצבית לטווח קצר הנובע ניסיון20. Notch1 איתות מזוהה גם לעקוב אחר הפעלת איתות לאחר מערכת קבצים הירארכית משלוח21,22. יתר על כן, אנו גם לזהות ההפקה עצביים מאת BrdU תיוג ניתוח לאחר אינדוקציה HF-DBS בצורות שונות, למרות BrdU מכתים ניתן גם סמן gliogenesis.
במחקר הנוכחי, שתי מתודולוגיות מערכת קבצים הירארכית מותאמים כדי למקד את ההפעלה של די. ג'י בהיפוקמפוס במישרין ובעקיפין. האלקטרודה הוא מושתל לתוך DG ישירות או מושתל לתוך הנתיב perforant המדיאלי (PP) אשר שולח הקרנות כדי להפעיל את הנוירונים די. ג'י. עבור אינדוקציה HF-DBS, ממריץ לתכנות מוצג עבור גירוי מתמשך דרך האלקטרודה קבוע על גבי הראש העכבר. כדי לקבוע את ההשפעות של מערכת קבצים הירארכית על הפעלת עצביים, נוירוג'נסיס, אנו מזהים את הביטוי של c-פוס , Notch1 על ידי צביעת immunofluorescent ואת המספר של שילב-BrdU נוירונים חיובי באזור DG בהיפוקמפוס, בהתאמה, לאחר הטיפול מערכת קבצים הירארכית. במיוחד, ההשפעות של HF-DBS על נוירוג'נסיס בדי. ג'י משווים בין חריפה באופן גירוי כרוני, או בין ישיר ובין באופן עקיף גירוי, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בעלי חיים בצרות בעקבות ההנחיות המוסדי של בייג'ינג המכון של יסוד מדעי הרפואה (בייג'ינג, סין), תקנות ממשלתיות הסינית על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. העכברים (26, זכר למבוגרים ~ 30 g) היו שוכנו, נשמרים בטמפרטורה קבועה של 23 ° C, עם מים ומזון ad libitum, תחת 12-h אור/12-h כהה מחזור (אורות ב- 7:00 בבוקר). כל ההליכים ניסיוני בוצעו במהלך מחזור אור.
1. הכנה כירורגית
הערה: אלקטרודה מותאם אישית היה ביתי באמצעות השיטה שונה של הלפרן ח23.
- השתמש 2 מיקרו-חוטי נחושת (עם הקוטר החיצוני של 200 מיקרומטר) האלקטרודה דו-קוטבי מקבילים. לעטוף את האלקטרודות סביב אחד את השני כדי ליצור אלקטרודות גליליות הגירוי.
הערה: כאן, האורך אלקטרודה בתוך ' עמודים ' או ' DG היו מגוונים לפי עומק הגרעין אנטומיים. - לעקר את האלקטרודות באמצעות ארון חיטוי של אתילן אוקסיד. לטפל ולאחסן האלקטרודות תיל מיקרו-ערוץ 2-תוצרת בית ללא כל זיהום. האלקטרודות צריך להיות מעוקר לחלוטין לפני כל ניתוח ההשתלה.
- אוטוקלב מכשירי הניתוח.
- לפני הניתוח, להחדיר את העכבר פנטוברביטל (20-50 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally, כדי להשיג מטוס כירורגי של הרדמה.
- להזריק את העכבר עם השעיה procaine סטרילי פניצילין G (75,000 U, I.M.), סוכן מאלחש (carprofen, 0.05 - 1 מ"ג/ק"ג, SC) כדי להקטין את הסיכון של דלקות וכאבים, בהתאמה24.
- לאחר ההרדמה בעלי חיים, חלות סיכה העין בשתי העיניים למניעת יובש בעין. להבטיח את תנאי הגיוס של הרגעה ואת העומק של ההרדמה על-ידי רפלקסים החיה בתגובה טו צובט ולהמשיך הפעולה רק כאשר אין תגובה.
הערה: משחה הוטרינר הוא אפשרות נוספת למניעת יובש בעין. - לגלח רוב פרווה בתקרת הראש העכבר עם קוצץ שיער חשמלי או סכין גילוח, לחטא את האזור מגולח עם שלושה מתחלפים קרצוף של אלכוהול 70% פתרון betadine, להמשיך בפעולה לאחר הבטאדין יבש על העור.
2. בתדירות גבוהה גירוי ניתוח25,26
הערה: בשלב זה, אלקטרודה היא באורח חד-צדדי מושתל לתוך את DG הגבי או אזור PP המדיאלי, חלק ההיפוקמפוס עם תפקידים חיוניים אפיזודי בלמידה ובזיכרון.
- הנח את העכבר anesthetized אל מסגרת סטיאוטטי. לשמור את הראש של העכבר משותק, ליישר את הסורגים האוזן כהלכה והתקן אותם במהירות. הדק בפסי האוזן בעדינות כך הם לתמוך בראש ממורכז ולאבטח את העכבר מעט.
- להשתמש בפתקים תרמוסטטי כדי לשמור על טמפרטורת גוף של החיה ב 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס.
- להשתמש מלקחיים כדי לתפוס את העור והשתרשה עמוק בלבה אוזני העכבר. ולהפסיק עם מספריים סטיריליים להסיר על 1 ס"מ2 אזור של העור בראש הגולגולת של העכבר.
הערה: כמות קטנה של הדימום יכול להיות שנצפו לאורך שולי של חיתוך העור. - הסר את השריר וקובץ מצורף אחרים המכסים את הגולגולת באמצעות מקלון צמר גפן כדי לחשוף את פני השטח של הגולגולת. השתמש ניקוי אוזניים עם מפסלת ויבתר כדי לנקות כל קרום העצם, גידים ורקמות מן השטח לחלוטין כדי לזהות את הווריד וקווים התפרים למדא, הגולגולת.
- לזהות את bregma ואת נקודת למדא. צומת הרחובות את התפר הפרונטליים ו התפר המשונן על החלק האמצעי סופריור calvaria הוא שם bregma ממוקם. החיתוך של התפר lambdoid על ידי התפר המשונן. שם נמצא למדא גלוי להשתמש bregma את הנקודה המקורית כדי להגדיר את המיקום גרעין אחרים.
- לאחר זיהוי המיקום bregma, למדה את הגולגולת, להתאים את אלה שתי נקודות במישור האופקי. ודא כי הגובה של שתי נקודות אלה הוא כמעט זהה לכיוון הגבי הגחוני / (שגיאות צריך להיות < 0.05 מ"מ). כמו כן, ודא כי הגולגולת הוא רמת לכיוון הצד המדיאלי ב26באותה דרך.
- ניתוח חד צדדית, הר של תוצרת בית 2-ערוץ נחושת מיקרו-אלקטרודות לתוך מחזיק האלקטרודה מסתובב על המסגרת כירורגי סטיאוטטי.
- מקם את האלקטרודה אנכית מעל לנקודת bregma בהתחלה ולאחר להגדירו כאתר המקורי. שימוש הדיגיטלי מוצגים סטיאוטטי מסגרת ניתוח כדי לציין הקדמי-האחורי (AP), המדיאלי-לרוחב (ML), ומיקום dorso-הגחוני / (DV).
הערה: כדי למנוע קבלת רכנה האלקטרודה, אין לגעת בקצה אלקטרודה לתוך הגולגולת במהלך המבצע. - להעביר את האלקטרודה בעדינות המיקום הנכון (איור 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 עבור DG ו- AP-3.8/ML ± 3.0 עבור עמודים, בהתאמה)27 לעיל הגולגולת ללא כל מגע. כאשר האתר הרצוי זוהה להכנסה אלקטרודה, להשתמש ההתאמות סטיאוטטי dorsoventral כדי גבוה בעל אלקטרודות, לסמן את המיקום עם סמן שחור.
הערה: המיקום המדויק התייחסות לנקודות הציון stereotaxic עשויים להשתנות על ידי העכבר זן, משקל, סקס. עכברים בוגרים מאותו המין אמור לשמש כדי למזער את כל וריאציה במיקום. במידת האפשר, סריקות אנטומיות pre-operational אמור לשמש לזהות את מיקומו בסיס הנושא בודדים27. - השתמש תרגיל בסיוע micromanipulator כף יד (קידוחים גודל = 0.5 מ מ) לעשות חור בגולגולת במיקום בולט דווקא. לחטא את קצה בר עם אתנול 70% לפני הקידוח. לעלות את המקדחה מיני דרך הגולגולת לאורך ציר z 0.8 - 1.0 מ מ ללא שינוי מיקומו X-Y. להשתמש כותנה סטרילי כדי לעצור דימום במהלך המבצע.
הערה: כדי למנוע דור חום יתר קידוח, מופרז במהלך קידוח, להבטיח מהירות קידוח היא 15,000-18,000 סיבובים לדקה (סל ד), לעתים קרובות למשוך המקדחה burr החור s כל 8-10. - לשמור על קידוח עד השכבה הקשה של המוח חשוף. השתמש מחט כפוף כדי להסיר כל חתיכה העצם נוצרים במהלך קידוח וגורמים הקדמוניות על השכבה הקשה של המוח ללא גרימת נזק לרקמת המוח רך המשמש כבסיס.
הערה: כדי למנוע נזק לרקמת המוח, המחט בוטה כפוף גם ניתן להחליף עם מלקחיים בוטה בסדר. - כדי לוודא כי נקבים נעשו כראוי במיקום הרצוי, להפחית את גובה אלקטרודה על ידי התאמת המסגרת ניתוח סטיאוטטי ולהבטיח כי האלקטרודה יכול להיות מוכנס בצורה חלקה דרך החור burr בלי לגעת כל המכשולים. אם כך, לאט להוסיף האלקטרודות עד לעומק של 1.8 מ מ די. ג'י (או 3.0 מ מ עבור PP) מפני השטח של הגולגולת הממוקמת ב PP המדיאלי די. ג'י (PP-DG).
הערה: נגב את כל הנוזל השדרתי או דם outflows מכל החורים burr עם צמר גפן סטרילי במהלך תהליך ההשתלה אלקטרודה. - לאחר הוספת של מיקרו-האלקטרודות לתוך החור בגולגולת, מחזיק אותו במקום עם מלט שיניים נאותה באמצעות מרית קטנה. כמו המלט מסתבכת, לעצב את זה סביב אלקטרודה שנוספו ברגים כדי ליצור חלקה כובע נחמד. הרקמה המתה ולחטא קצוות הפצעים.
- שמעת אותי האלקטרודה ממחזיק אלקטרודה. להסיר את העכבר מהמסגרת סטיאוטטי ולהחזיר את כלוב חמים.
הערה: לאחר הניתוח, לחכות עם החזרת החיות לכלובים שלהם עד הם התאוששו לגמרי מההרדמה עם התודעה מספיק. - תן את העכבר לנוע בחופשיות ולאפשר לו להתאושש במשך יומיים בכלוב. לאחר מכן, חבר את האלקטרודה מושתל העכבר למוח ממריץ לתכנות באמצעות מוביל. להגדיר את ממשק התוכנה כפי שהוצג באיור2. קבע את הפרמטרים מערכת קבצים הירארכית כסידרה 6 6 רכבות של פולסים 6 ב 400 הרץ (איור 1B, ms 100 בין הרכבות, 20 s בין הסדרות)28. קבע את עוצמת גירוי 200 μA.
- לספק מערכת קבצים הירארכית עבור תקופת הזמן כפי שנקבע הרצוי. לספק גירוי 2 x יום בשעה 8 בבוקר, בשעה 8 בערב...
- עבור קבוצת בקרה, משתילים אלקטרודות בעכברים, אל תבצע של גירוי.
- עבור ההכתמה c-פוס , לעורר את העכברים ניסיוני בחריפות (2x ליום). עבור תיוג BrdU, לחלק את העכברים ניסיוני קבוצת גירוי אקוטי (החלת 2x ליום) וקבוצת גירוי כרוני (החלת x 10 תוך 5 ימים, 2x ליום). במהלך של הגירוי, ודא שהעכבר הוא ער. זכור להבטיח שההפניות לא מעוותים.
הערה: ביום האחרון של ההליך, העכברים בקבוצה גירוי אקוטי היו מגורה בו-זמנית. - כאשר הגירוי נעשה, נתק בזהירות את הסיכה אלקטרודה של המחזיק אלקטרודה, המחבר של מערכת הקלטה.
3. immunofluorescence מכתים, Bromodeoxyuridine תיוג29
- כדי להפוך את c-פוס Notch1 מכתים, כ-3 שעות לאחר הגירוי HF-DBS האחרון, עזים ומתנגד העכברים באמצעות הזרקת פנטוברביטל (20-50 מ"ג/ק"ג, I.P.) כדי להשיג מטוס כירורגי של הרדמה.
- עבור תיוג BrdU, כ- 12 שעות לאחר הגירוי HF-DBS האחרון, תן 6 זריקות של BrdU את הפקד ואת העכברים מגורה במרווחים של 2-h (50 מ"ג/ק"ג ב- saline 0.9%, I.P.). 36 שעות לאחר הזריקה האחרונה, עזים ומתנגד העכברים באמצעות הזרקת פנטוברביטל (20-50 מ"ג/ק"ג, I.P.) כדי להשיג מטוס כירורגי.
- לעשות חתכים באמצעות אזמל בתוך קשת הצלעות כדי לחשוף את הלב ולאחר מכן להעביר מחט קליבר 22 בוטה זלוף אל החדר השמאלי. עושים חתך קטן באטריום ימין. Transcardially perfuse זה עם 50 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS) ואחריו 50 מ של paraformaldehyde 4% קר (PFA) ב 1 x PBS (pH 7.4).
הערה: לעבור את PBS מחברים כאשר העכבר דם ויוו מוחלף הנוזל רץ ברורה. זלוף טוב יכולה להישפט על ידי קרחת היער של הכבד. יש להפסיק את זלוף לאחר קיבוע רעידות נצפו30. - לערוף את העכבר עם מספריים אופטלמולוגיות, אעשה חתך על העור ולחשוף את הגולגולת. באמצעות מלקחיים, שבב את הגולגולת מעט ומנתחים בקפידה את המוח כל עכבר. פוסט-fix המוח ב- 4% paraformaldehyde 2 ימים נוספים, להעביר אותו פתרון 30% סוכרוז ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- שימוש של cryostat, לחתוך את המוח למקטעים הילתית 20-מיקרומטר. העברת הר הסעיפים לשקופית זכוכית עם מברשת ואחסן אותם ב-20 ° C.
הערה: חיות עם אלקטרודה misplacements או נזק מכני מופרז ייכללו מניתוח עוקבות. - להעביר את השקופיות PBS נורמלי (0.1 M, pH 7.4) המכילה לא מקבע. לשטוף את הפרוסות עם PBS עבור 3-4 x עבור 5 דקות כל אחד כדי להסיר כל מקבע עודף. עבור קבוצת התווית על-ידי BrdU, דגירה בסעיפים 2-N HCl למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולשטוף אותם במאגר בוראט 0.1-M (pH 8.4; 10 דקות). לאחר מכן לשטוף את פרוסות 2 x עבור 5 דקות ב- PBS.
הערה: Immunostaining ואז מבוצעת. - לטפל פרוסות על ידי דגירה בחסימה פתרון (סרום עז רגיל 1%, 3% אלבומין שור < BSA >, 0.5% טריטון X-100 ו- 0.02% אזיד הנתרן ב- PBS 1 x) h 1 בטמפרטורת החדר (RT).
- דגירה את הפרוסות עם אנטי -c-פוס polyclonal נוגדנים (שבערך; ארנב), נוגדן anti-Notch1 (1:50; עז) או נוגדן anti-BrdU (1:800; חולדה) בפתרון חסימה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף את פרוסות 3 x ב- PBS, ואז דגירה אותם עם אלקסה עבור חיל הים 568 מצומדת אנטי-הארנב (שבערך), אלקסה עבור חיל הים 488-מצומדת נגד עז (1:1, 000), או נוגדנים משניים מצומדת אלקסה עבור חיל הים 488 אנטי חולדה (שבערך) עבור h 1-RT.
- לשטוף את הדגימות 3 x ב- PBS (10 דקות כל פעם). מכסים הסעיפים התווית על-ידי חיסונית המוח באמצעות בינוני הרכבה של ריאגנט לדעוך אנטי המכיל דאפי. . תן את הפרוסות מילה נהדרת ולאחסן אותם מוגן מפני אור ב 4 º C.
- לרכוש תמונות של האזורים בהיפוקמפוס ומהצדדים מגורה, unstimulated של המוח עם ערוץ מרובה ברזולוציה גבוהה (רציף) מיקרוסקופ קונפוקלי סורק. להגדיר את הפרמטרים הדמיה בעקביות בין שליטה לבין קבוצות הניסוי.
- בצע הדמיה של פסיפס באמצעות מטרה גבוהה ההגדלה (20 X אוויר המטרה, נה 0.45) לרכוש תמונות (XYZ) תלת-ממד רציף של המבט של שדות סמוכים, באמצעות השלב ממונע ולנצל את התוכנה המתאימה לתפור אותם יחד כדי להפוך את הפרדות צבע גדול תמונות.
הערה: ריצוף פונקציות כוללים אפשרויות לתמונות חלקה משופרת תפרים והחלקת אמיתי. תמונות בקלות ובמהירות מוכנות תוך שימוש בפונקציה תפרים, כדי ליצור תמונה על פני אזור נרחב. - C-פוס , Notch1 מכתים, לבצע ניתוח כמותי חיובי גרעינים של צפיפות immunofluorescent21 של תמונות התפר. באופן אקראי בחר 3 אזורי rostral, הגבי ו הגחון בהיפוקמפוס DG לאזורי משנה ולמדוד את הצפיפות immunofluorescent באופן פעמיים עיוור באמצעות תמונה J תוכנה (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
- עבור BrdU תיוג, לנתח את הפרוסות מסביב לנקודת קידוח באמצעות ההיפוקמפוס הגבי (-1.7 מ"מ עד מ"מ-2.7 יחסית bregma) באופן פעמיים עיוור.
- לספור רק BrdU-חיוביות נוירונים בריכוזים די. ג'י. כוללים את התאים שוכב בתוך 2-תא קטרים בתא גרגר הרוזן.
הערה: כאן, ספירת בוצעה באמצעות 40 X אוויר המטרה. באופן אקראי, סעיפים 3-5 לכל חיה נספרו, הסעיפים היו בממוצע והביע כאמצעי לכל DG19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות גירוי HF-DBS אכולי DG בהיפוקמפוס ישירות או את אכולי PP כדי להפעיל את DG בעקיפין באמצעות הוספת אלקטרודות באמצעות התאמות סטיאוטטי, המכרסמים היו מרדימים עם פנטוברביטל, שנדגמו 3 h לאחר גירוי HF-DBS האחרון עבור c-פוס ו Notch1 immunostaining. עבור BrdU מכתים, 36 שעות לאחר הזריקה BrdU האחרון לאחר יום 1 או 5 ימים של גירוי HF-DBS, המכרסמים היו מרדימים עם פנטוברביטל עבור הכנת חלקים במוח. איור 3 מראה כי הביטוי של c-פוס היה משמעותי מוגברת מצד חולשת של די. ג'י. בנוסף, הביטוי c-פוס בצד contralateral די. ג'י היה גם upregulated בהשוואה הפקדים גירוי לא-HF-DBS שהראה כמעט שום הבעה של אות ג-פוס . על סמך את Notch1 ספציפי immunofluorescent מכתים פרוסות המוח, כפי שמוצג באיור1 משלים, עוד יותר להדגים כי האיתות Notch1 יכול גם להיות מופעל את DG בהיפוקמפוס למבוגרים לאחר גירוי מערכת קבצים הירארכית מאת אינדוקציה של דפולריזציה של נוירונים ב- PP (עיין גם הנתונים הגולמיים שסופק כמו 1 קובץ משלים).
בנוסף גירוי HF-DBS ישירה באכולי די. ג'י, איור 4א מציג את המיקום והפגינו האתר גירוי HF-DBS של קצה האלקטרודה, אשר הותקנה המדיאלי עמ' איור 4B זה HF-DBS גירוי ב PP לא רק גדל באופן משמעותי את רמת הביטוי c-פוס בצד חולשת די. ג'י, אלא גם הגדילה את הביטוי של c-פוס בצד contralateral של די. ג'י בהשוואה גירוי לא-HF-DBS פקדים.
בהתבסס על BrdU תיוג ניתוח של הפרוסות המוח, כפי שמוצג דמויות 5A - 5 C, אנחנו עוד יותר הפגינו שנוירוג'נסיס הזה יכול גם להיות מופעל את DG בהיפוקמפוס למבוגרים לאחר גירוי HF-DBS כרוני (5 ימים) בדי. ג'י ישירות. גירוי כרוני HF-DBS בדי. ג'י לא רק באופן משמעותי upregulated נוירוג'נסיס ב חולשת צד אך גדל גם את נוירוג'נסיס בצד contralateral בהשוואה הפקדים גירוי לא-HF-DBS. עם זאת, גירוי אקוטי (יום 1) נכשל לזירוז קולטנים של upregulation של נוירוג'נסיס חולשת צד או בצד contralateral של די. ג'י. כמוצג באיור 5D, בקבוצה גירוי אקוטי או בקבוצה גירוי כרוני, HF עקיף-DBS ב PP לא היתה אפשרות לשנות רמת נוירוג'נסיס DG בהיפוקמפוס.
איור 1 . ייצוג סכמטי של המטרות המוח של קצה האלקטרודה ופרמטרים של מערכת קבצים הירארכית. (A) התחזית עצביים המדיאלי נתיב perforant לתוך להב נחות של הפיתול משוננת מסומן. מיקום האלקטרודות שנוספו (בסגול) כדי לעורר את די. ג'י ישירות או את אכולי PP מסומנים. (B) הפרמטר מערכת קבצים הירארכית מסומן בתור סדרה 6 של 6 רכבות של פולסים 6 ב 400 הרץ, עם 100 ms בין הרכבות 20 s בין הסדרות. CA = Ammonis Cornu; DG = הכישור משוננת; PP = את הנתיב perforant. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . ממשק ופרמטרים של multistimulator. ממריץ היה מחובר ממיר אנלוגי-דיגיטלי, מופעל על ידי תוכנה קניינית. סוג הגירוי מערכת קבצים הירארכית היה monophasic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . הפעלת עצביים ב די. ג'י בתגובה לטיפול HF-DBS ישירות. (א) הטיפ אלקטרודה (תיבת לבן ללא מילוי) הוצב מעל האזור די. ג'י ישירות (AP-2.1/ML ±1.0 / DV +1.8) עם או בלי את מערכת קבצים הירארכית. לוח זה מציג את immunostaining של המקטע הילתית פרוסות המוח עם נוגדןc-פוס את הפקד ואת הקבוצות מערכת קבצים הירארכית. דאפי כחול מכתים נעשה שימוש כדי לציין את המיקום של גרעינים בהיפוקמפוס. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) לוח זה מציג ניתוח כמותי של צפיפות אות immunofluorescence. בצד חולשת של די. ג'י, הנוירונים הופעלו באופן משמעותי עם ביטוי גבוהה של c-פוס, ואת הביטוי c-פוס בצד contralateral של DG גם יחסית גדל בהשוואה ל- c-פוס התבטאות בקרת עכברים ללא טיפול מערכת קבצים הירארכית. אומר ± SEM, חד-כיווני אנובה, F2,24 = 216, P < 0.0001, בדיקת פוסט הוק Bonferroni, * * *P < 0.001, nלא-sti = 9 (3 פרוסות 3 עכברים), nמערכת קבצים הירארכית קונטרה = 9 (3 פרוסות/עכבר מ 3 עכברים), nמערכת קבצים הירארכית IPS = 9 (3 פרוסות/עכבר מ 3 עכברים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . הפעלת עצביים ב די. ג'י בתגובה מערכת קבצים הירארכית ב אכולי PP. (א) הטיפ אלקטרודה (תיבת לבן ללא מילוי) הוצב ב PP המדיאלי במיקום של AP-3.8, ±3.0 מ ל ו DV +3.0, עם או בלי את מערכת קבצים הירארכית. (B) לוח זה מציג את immunostaining של המקטע הילתית פרוסות המוח עם נוגדןc-פוס את הפקד ואת הקבוצות מערכת קבצים הירארכית. דאפי כחול מכתים נעשה שימוש כדי לציין את המיקום של גרעינים בהיפוקמפוס. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ג) לוח זה מציג ניתוח כמותי של צפיפות immunofluorescent. הטיפול מערכת קבצים הירארכית ב PP באופן משמעותי יכול להפעיל את חולשת נוירונים בריכוזים די. ג'י עם ביטוי גבוהה של c-פוס. הביטוי של c-פוס בדי. ג'י contralateral גם יחסית גדל בהשוואה הביטוי c-פוס של העכברים שליטה ללא טיפול מערכת קבצים הירארכית. אומר ± SEM, חד-כיווני אנובה, F2,24 = 189.3, P < 0.0001, בדיקת פוסט הוק Bonferroni, * * *P < 0.001, nלא-sti = 9 (3 פרוסות 3 עכברים), nמערכת קבצים הירארכית קונטרה = 9 (3 פרוסות/עכבר מ 3 עכברים), nמערכת קבצים הירארכית IPS = 9 (3 פרוסות/עכבר מ 3 עכברים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . הפעלה נפרדות של נוירוג'נסיס ב די. ג'י בתגובה מערכת קבצים הירארכית ב DG ו- PP בהתאמה. (א) לוח זה מציג פרדיגמה נסיונית הטיפול מערכת קבצים הירארכית, הדור של התווית על-ידי BrdU נוירונים מתרבים די. ג'י. החיות היו מחולקת חריפה של קבוצת כרונית. בקבוצה חריפה, העכברים היו נתונים טיפול מערכת קבצים הירארכית 2 x ביום 5. בקבוצה כרונית, העכברים היו נתונים טיפול מערכת קבצים הירארכית במשך 5 ימים (מיום 1 ליום 5, 2x ליום). לאחר מכן, החיות בשתי הקבוצות הוזרקו BrdU (50 מ"ג/ק"ג, x 6 על ידי מרווחי 2-h) ביום 6. יום 8, החיות היו מרדימים, perfused על פי סעיפים cryostat. (B) לוח זה מציג ההכתמה immunofluorescent של BrdU (בירוק) פוסט-HF-DBS, די. ג'י. (ג) A ניתוח כמותי של היצור עצביים עולה כי חריפה (2 x ביום 1) גירוי, די. ג'י לא יכול לשפר נוירוג'נסיס, בעוד הכרוני גירוי (10 x בתוך 5 ימים) בדי. ג'י upregulated באופן משמעותי נוירוג'נסיס. לעומת קבוצת הביקורת, מספר BrdU תיוג תאים עלה באופן משמעותי ב הכרוני לקבץ שתיהן בחצי הכדור חולשת ו contralateral. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אמצעים ± SEM, ANOVA דו-כיווני, גירוי סוג אפקט F2, 14 = 97.09, P < 0.0001, האונה אפקט F1, 14 = 1.137, P = 0.3044, Bonferroni פוסט הוק מבחן, * * *P < 0.001, n שליטה = 3 (3 פרוסות 3 עכברים), nיום 1 = 4 (4 פרוסות 3 עכברים), n5 ימים = 3 (3 פרוסות 3 עכברים). (ד) לוח זה מציג ההכתמה immunofluorescence של BrdU (בירוק) פוסט-HF-DBS ב אכולי PP. (E) של ניתוח כמותי של היצור עצביים עולה כי חריפה (פעמיים ביום אחד) או כרוני (10 x תוך 5 ימים) גירוי ב PP לא יכול לשפר את נוירוג'נסיס באופן משמעותי. מספר BrdU תיוג תאים היה יחסית יציב עם או בלי הטיפול מערכת קבצים הירארכית. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אמצעים ± SEM, ANOVA דו-כיווני, גירוי סוג אפקט F2, 16 = 0.9025, P = 0.4252, האונה אפקט F1, 16 = 1.402, P = 0.2537, Bonferroni פוסט הוק מבחן, P > 0.05, n שליטה = 3 (3 פרוסות 3 עכברים), nיום 1 = 3 (3 פרוסות 3 עכברים), n5 ימים = 5 (5 פרוסות 3 עכברים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1. הביטוי של Notch1, די. ג'י בתגובה לטיפול HF-DBS. (א) לוח זה מציג את ההכתמה immunofluorescent של Notch1 (בירוק) h 3 לאחר HF-DBS, די. ג'י. הדמות הזאת ציטט, שונה של פאנג ח21. (B) A ניתוח כמותי של זריחה יצוין כי מערכת קבצים הירארכית ב DG יכולה לשפר את הביטוי של Notch1. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אמצעים ± SEM, סטודנט t-מבחן t = 12 * * *P < 0.001, nלא-sti = 9 (3 פרוסות/עכבר מ 3 עכברים), nמערכת קבצים הירארכית = 9 (3 פרוסות/עכבר מ 3 עכברים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
קובץ משלים 1. הנתונים הגולמיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכניקה HF-DBS כבר בשימוש נרחב לטיפול בהפרעות נוירולוגיות רבות מאז שנות ה-90 ככלי רב עוצמה. עד כה, הוא ציון דרך עבודתו של HF-DBS לטיפול של מחלת פרקינסון, רעד חיוני, אשר משכה הרבה תשומת לב ועניין הן את המרפאה והן הקהילה המדעית. ישנם סוגים שונים של לימודי מתמשך HF-DBS על ידי קבוצות רבות עבור יישום טיפולי של HF-DBS ב32,מסוימים נוירולוגיות והפרעות פסיכיאטריות33. כמה מחקרים אלו הם כיום בשלבים שונים של ניסויים קליניים2,34... למרות HF-DBS להביא תועלת משמעותית, תופעות לוואי גירוי יכול להתרחש גם עם מיקום מושלם במוח, כגון שינויים שליליים מצב רוח, חשיבה, וכדומה, אשר הם הפיכים, ניתן למנוע עם שינויים של הגדרות גירוי.
בנוסף להתקדמות משמעותית של הטכנולוגיה HF-DBS שנצבר מניסויים קליניים במהלך העשורים האחרונים, המחקרים של HF-DBS בבעלי חיים גם מציג את ההזדמנות להבין את השינויים הפיזיולוגיים ואת הנוירוביולוגי מנגנונים המושרה על ידי גירוי חשמלי. כתב יד זה, תארנו מתודולוגיה HF-DBS ששונה שבוצעה בעכברים כדי לגרות את אכולי DG בהיפוקמפוס עם מערכת קבצים הירארכית במישרין או בעקיפין. אף על פי הפרוטוקול המתואר מתבצע על מכרסמים, מערכת קבצים הירארכית התגובה מחקרים גם בהצלחה נערכו בדגם אורגניזמים אחרים, לרבות חזירים35. טכניקה זו, ניתוח סטיאוטטי יכול לשמש גם לגירוי פוטנציאליים, ממוקדות גרעין כדי לבדוק היעילות של מערכת קבצים הירארכית באמצעות מודלים בעלי חיים מסוימים עם נוירולוגיות והפרעות פסיכיאטריות. מסקנות ממחקרים כאלה צריך לתרגם בקלות למרפאה, במיוחד עבור עידון מערכת קבצים הירארכית במטרות הקיים. שים לב כי בניגוד סדרת חשיפות מרובות של HF-DBS במרפאה, במחקר זה מתודולוגי, בחרנו יחיד וחשיפת לטווח קצר של מערכת קבצים הירארכית לעורר, זירוז הפעילות העצבית של DG בהיפוקמפוס, פרמטר חלק הפרדיגמה של מערכת קבצים הירארכית שדווח בעבר לזירוז LTP ההיפוקמפוס פרוסות21,28.
מגבלות כללי של HF-DBS כבר נרחב שנסקרו במקום אחר24,25. אחד האתגרים לניסוי. כאן הוא גם הצורך עבור טכניקה כירורגית מעולה, מתמשך טיפול כירורגי לוקוס אנטומיים. כראוי ובדיוק להשתיל האלקטרודה לתוך הגרעין המטרה לגירוי, אחד התהליכים מפתח הוא ניתוח מוצלח על-ידי טכנאי מיומן כדי למנוע פגיעה מיותרת כלי דם של מוזרים של האלקטרודה. יתר על כן, ניתוח אנטומי נוסף היסטולוגית של הדגימה המוח נחוץ גם כדי לאשר נכונה כיוון התקפות על האלקטרודה לאחר מערכת קבצים הירארכית. זהו גם אחד היתרונות של גישה זו, להדגים בבירור המתוקן פילוח של האלקטרודה לאחר הניתוח במוח בעלי חיים שלמים. רבים מן הפרטים הניתנים פרוטוקול זה ניתן בקלות להתאים עבור לטווח ארוך גירוי באמצעות ממריץ מושתל לחיה. יצוין, כי זה גם לבצע גירוי חלופי בפרמטרים מטרות אפשריות המוח טיפולית עם דפוסים שונים של משלוח מערכת קבצים הירארכית. עם זאת, במאמר זה דיווחו על יחידה אחת חריפה מערכת קבצים הירארכית נמסר על ידי יחידת ממריץ לתכנות להבין את השינויים הסלולר לאחר גירוי חשמלי.
למרות HF-DBS משמש כאופציה חלופית לטיפול נוירולוגיות והפרעות פסיכיאטריות במרפאה במשך מספר שנים, המנגנונים יעילותו נשארים ממעטים להבין. בהתחשב השימוש ועל שיפורים עתידיים של HF-DBS, נדרשת גישה פרגמטית יותר. ככלי לפיתוח, הטכניקה מערכת קבצים הירארכית צריך עוד חדשנות טכנולוגית, גילוי מכניסטית. ללמוד על מנגנונים תאית ומולקולרית של HF-DBS, ניתוח transcriptome גלובלית המבוססת על טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה יספק מידע חשוב כדי להבין את האירועים המולקולריים המתרחשים ושינויים איתות לאחר אינדוקציה HF-DBS 36. בנוסף האסטרטגיה ההקרנה לא משוחדת, המבוססת על בחינת המועמדים מולקולרית הקיימים שהוכיחו להגיב דפולריזציה עצביים, זה וודאי גם מספקים רמזים חשובים כדי לזהות את effectors מפתח אחראית על מערכת קבצים הירארכית עם. C-פוס upregulated בתגובה מהותי פעילות. עצבית, אז מסתכלים על הביטוי שלה לפחות לספק לנו נוף של הנוירונים נורו לאחרונה37. עם זאת, c-פוס צריך לא רק לשמש רק לשקף פעילויות מאז נראה גם לסמן נוירונים העוברים LTP37. עבודות קודמות, כולל שלנו, הראו כי Notch1 משחק תפקיד קריטי פלסטיות סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בוגרים, חיוני נוירוג'נסיס למבוגרים ויוו21,22. מצב זה, של לוקליזציה כמותית, ייתכן מפורט של המפתח צריכה להיות מאופיין, תיאר מראש בקפידה מועמדים ומעגל פוסט-מערכת קבצים הירארכית על ידי ניתוח immunohistochemical של הביטוי c-פוס . מחקרים כאלה תספק ראיה ישירה כדי להדגים את השינויים דפוסי ביטוי גנים באזורים שונים במוח בתגובה מערכת קבצים הירארכית21, גם יהיה מועיל לחשוף את השינויים הסלולר כגון הפעלת עצביים, נוירוג'נסיס או הקשורים ניוון מוחיים.
זה צריך להיות גם ציין כי למרות היתרונות של יישום HF-DBS במרפאה, בשל העובדה כי התוצאות של השפעת גירוי קשורים באופן הדוק עם הפרמטרים גירוי והקצו במרכז המוח, תאית ומולקולרית המנגנונים שבבסיס האפקטים של מערכת קבצים הירארכית עלול להיות מסובך מאוד במחקר זה, אנחנו בהמשך ביצע BrdU תיוג לחקור את ההשפעות אקוטי וכרוני של מערכת קבצים הירארכית על נוירוג'נסיס למבוגרים. למרות BrdU מכתים יכול להיות סמן נוירוג'נסיס והן gliogenesis, בהתבסס על דוחות קודמים, הרוב המכריע של BrdU מוגברת נוירונים חיובי נצפו על SGZ לאחר טיפול HF-DBS צריך להיות proliferative אבות עצבית למבוגרים21 , 38 , 39. משנה המורכבות של המנגנונים הטיפול מערכת קבצים הירארכית, השיטות ואת התוצאות אנו המתואר בכתב היד לספק ראיות ישירות את גירוי חשמלי בתדירות גבוהה שחוזרת על עצמה כדי להפעיל את DG בהיפוקמפוס יכול לגרום באופן משמעותי את ההפעלה של פעילות, נוירוג'נסיס עצביים vivo בתוך.
לסיכום, אנחנו הראו כי HF-DBS יכול לשפר את פעילות. עצבית נוירוג'נסיס של עכברים, לעומת פעילות. עצבית ו נוירוג'נסיס של עכברים שליטה מי לא עברה של HF-DBS. זה עשוי לקדם את ההבנה המדעית לגבי תופעות קוגניטיביות, גירוי המתבנת של מערכת קבצים הירארכית ויוו. הזיהוי של הפעלת עצביים אחרי טיפול HF-DBS חריפה ישירות או בעקיפין ויוו מדגים כי טיפול מערכת קבצים הירארכית יש השפעות משמעותיות על השידור סינפטית של מקומיים וחיבורי ארוכי טווח. תנאי הגיוס מהירה של הפעלת עצביים לאחר טיפול HF-DBS מספק כלי רב עוצמה כדי לתפעל את השידור סינפטית לקוי או desynchronization בהפרעות נוירולוגיות והפסיכיאטרי רבים כגון MDD. מצד שני, אינדוקציה של נוירוג'נסיס לאחר טיפול HF-DBS כרונית ולא ישיר, אבל חריפה או עקיף מצביע על יעילות ברורים ולשינויים פונקציונלי בין גירוי חשמלי שונה נימוסים. ממצאים כאלה לספק ראיות ישירות עבור אפנון עצבית ו פוטנציאליים היתרונות הטיפוליים של מערכת קבצים הירארכית בעתיד. יחדיו, HF-DBS יציג יתרונות משמעותיים לטיפול נוירולוגיות והפרעות פסיכיאטריות על-ידי שילוב ההתקדמות הטכנולוגית של המרפאה של ההתקדמות מכניסטית במעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש ריהצהל.
Acknowledgments
נתמך על ידי קרן מדעי הטבע הלאומית של סין מענקים 31522029, 31770929 ו- 31371149 (כדי Haitao Wu), תוכנית 973 (2014CB542203) מתוכנית פיתוח המפתח המדינה למחקר בסיסי של סין (כדי Haitao Wu), גרנט Z161100000216154 מ בייג'ינג העירוני למדע וטכנולוגיה (כדי Haitao Wu). המחברים תודה לכל חברי המעבדה Haitao וו שלהם עידוד ודיונים. המחברים הם מאוד אסירת תודה ליו Zhenwei לעזרתו עם באגים המנגנון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
References
- Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Kohl, S., et al. Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review. BMC Psychiatry. 14, 214 (2014).
- Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression. Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).
- Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).
- Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).
- Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation for Parkinson's disease and other movement disorders. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).
- Garcia, L., D'Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. High-frequency stimulation in Parkinson's disease: more or less. Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).
- Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats. Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).
- Grubert, C., et al. Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation. The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).
- Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).
- McIntyre, C. C., Hahn, P. J. Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation. Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).
- Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. Sing the mind electric - principles of deep brain stimulation. European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).
- Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).
- Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (97), e52457 (2015).
- Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5 26-41 (2008).
- Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression. Behavioral and Brain Functions. 6, 35 (2010).
- Feng, S., et al. Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment. The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).
- Alberi, L., et al. Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks. Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).
- Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. A step-wise approach to deep brain stimulation in mice. Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).
- Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration. Journal of Visualized Experiments. (107), e53266 (2016).
- Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation. Journal of Visualized Experiments. (104), e53066 (2015).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6 (2007).
- McHugh, T. J., et al. Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network. Science. 317 (5834), 94-99 (2007).
- Gonzalez, C., et al. Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories. Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tse, N., et al. The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (94), e52220 (2014).
- Pizzolato, G., Mandat, T. Deep brain stimulation for movement disorders. Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2 (2012).
- Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).
- Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).
- Min, H. K., et al. Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals. NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).
- Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. 2015 (11), Cold Spring Harbor Protocols. 951-969 (2015).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Frontiers in Neural Circuits. 8, 37 (2014).
- Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).
- Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
