Summary
이 프로토콜에는 생쥐에서 신뢰할 수 있는 HFS 메서드를 설정 하는 방법을 보여 줍니다. Hippocampal가 뇌 전체 신경 전기 HFS 직접 및 간접적으로 비보에 의해 자극 된다. 신경 활동 및 분자 신호 검사 c-fos 와 Notch1 immunofluorescent 얼룩, 각각; 성체는 bromodeoxyuridine 분석 결과 라벨에 의해 정량 이다.
Abstract
전기-고주파 자극 (HFS), 이식된 전극 다양 한 두뇌 지역 타겟팅을 사용 하 여 다양 한 신경 및 정신 질환에 대 한 효과적인 치료로 입증 되었습니다. 또한 라는 깊은 뇌 자극 (DBS), 뇌의 깊은 지역에서 HFS 임상 시험에서 점점 더 중요 해지고 있다. 높은 주파수 (HF-DBS) DBS 수술의 분야에서 최근 진행 주요 우울증 장애 (MDD), 강 박 장애 (강 박 증)에 대 한 치료와 같은 다른 상황에이 침략 적인 기술 활용의 가능성을 확산 하기 시작 했다 그래서 .
이러한 확대 징후에도 불구 하 고 HF-DBS의 유익한 효과의 기본 메커니즘 수수께끼 남아 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 한 가지 방법은 사용 하는 이식된 전극 띄엄띄엄 HFS에 의해 뉴런의 분산된 모집단을 활성화 하는. 그것은 알려졌다 시상의 앞쪽 핵에서 HFS 내 화 간 질 클리닉에서의 치료를 위해 사용 될 수 있습니다. 기본 메커니즘 증가 신생 관련이 있을 수도 있습니다 하 고 신경 활동을 변경. 따라서, 우리는 HFS 치료 전후 생리 변경 마우스가 이랑 (DG)에서 성체 신경 활동의 탐지에 의해 탐험에 관심이 있습니다.
이 원고에서 우리가 직접 또는 간접적으로, 급성 또는 만성 방식 마우스에 DG의 활성화를 목표로 HFS에 대 한 방법론을 설명 합니다. 또한, c fos 와 얼룩 신경 활동을 모니터링 하 고 활성화 신호 immunofluorescent Notch1 및 bromodeoxyuridine (BrdU) 결정을 라벨에 대 한 뇌 조각의 준비를 위한 상세한 프로토콜 설명 합니다 HF DBS 유도 후의 신경 신생 HF DBS 치료 후 신경 활동과 성체의 활성화 직접 neurobiological 증거 및 잠재적인 치료 혜택을 제공합니다. 특히,이 방법론 수정 하 고 기초 중추 등 다른 관심된 뇌 영역 및 시상 지역 병원에서 특정 뇌 질환에 대 한 대상에 적용 될 수 있습니다.
Introduction
HF DBS 18701이후 개발 된 두뇌에 전기 자극에 대 한 신경외과 기술 이다. 1980 년대 후반에, HFS 처음 파 킨 슨 병에 대 한 잠재적인 치료 적 개입으로 사용 하 고 다른 운동 장애2. 지난 몇 십년에서 HF-DBS 점점 더 널리 사용 되었습니다 현재 치료 되지 않은 뇌 질환의 치료에는 전통적인 치료 전략에 의해. 특히, 때문에 HFS 전극, 매우 효과적인 결과, 최소한의 부작용의 정확도 향상, 뇌 장애 HF DBS에 의해 처리 수 크게 증가 지난 수십 년간3,4, 5. 예를 들어 HF-DBS 승인 되었습니다 미국 식품의 약 청 (FDA)에 의해 파 킨 슨 병 (PD), Alzheimer 유형 치 매, 진전, 운동 장애2,6, 의 다른 종류의 치료에 대 한 7. PD 환자에서 dopaminergic 약물 감소 HF DBS8동안 최대 50%. 또한 운동 장애의 성공적인 치료, HF-DBS 또한 보여주었다 정신 질환 클리닉, 그리고 잘2,9, 로 인식 확대의 치료에는 강력한 효과 10 , 11. 환자12많은 약속을 제공 하는 다양 한 단계에서 다른 정신 장애의 치료에 대 한 HFS의 연구는 주목 해야 한다.
많은 학문은 초점 HFS 뇌13를 통해 로컬 및 원격 효과 설명 했다, 비록 효과의 신경 및 분자 메커니즘 애매2,14남아 있습니다. 일반적으로 클리닉, 치료 HF-DBS는 파 킨 슨 병 및 만성 통증, 등 많은 의견 설명 어떤 하나의 가능성 중 HF DBS 치료에 의해 생성 된 개선 발생의 치료에 대 한 장기적인 방식으로 적용 HFS 전류 조절 한다 신경 네트워크 활동을 아마 이식된 HFS 전극 주변 축 삭의 반복적인 도발은 여. 또는, HF-DBS 출력 뉴런 및 예상된 대상의 방전 율 변경 될 수 있습니다. 또한, HF-DBS 이어질 수 있습니다 장기 potentiation (LTP) 장기 불경기 (주식 회사), 등 장기 시 냅 스 변화는 증상 개선에 기여할 수 있습니다. 지금까지, 그것은 아직 불분명 HFS influences 휴대 규제 키 분자 이벤트 등을 처리 하는 여부 성체 비보로. 여러 줄 연구의 HFS 설치류에 임상 적용된 DBS15,16의 유사한 신경 응답을 모방 수 설명 했다. 이 연구에서 HF-DBS의 기본 셀룰러 메커니즘을 이해 하기 우리 먼저 설정는 vivo에서 HFS 방법론 쥐에서에 급성 (1 일) 또는 만성 (5 일) 방식으로. 둘째, 우리는 HF DBS 납품 후 신경 활동과 성체의 변경 확인 하려면 활성화 분석 방법론을 설정 합니다.
신경 줄기 세포에서 신경 생산 배아 개발 하는 동안 풍부한 이지만 성인 생활 내내 계속, hippocampal subgranular 영역은 신생 발생 하는 주요 지역 중 하나입니다. 성체의 과정은 많은 생리 적 및 병 적인 요인에 의해 영향을 받습니다. 경우에 따라 간 질 hippocampal 신생 극적으로 감소17,18이다. 또한, 단일 electroconvulsive 치료 크게가 이랑19신경 생산을 증가할 수 있었다. 이러한 관측 제안 electrophysiological 활동 성체와 hippocampal 신경에 시 냅 스가 소성의 규칙에 있는 중요 한 역할을 한다. 따라서, 더 신경 활동 및 신생에 HF DBS의 효과 보여, 우리가 처음 실시는 즉시 이른 유전자 (IEG) c-fos 단기 신경 활동에서 결과의 잘 알려진 마커는의 immunostaining 분석 결과 경험20. HFS 배달21,22후 신호 활성화를 모니터링 하 Notch1 신호 감지 됩니다. 또한, 우리 또한 감지 BrdU 다양 한 매너에 HF DBS 유도 후 분석을 라벨에 의해 신경 생산 BrdU 얼룩은 또한 gliogenesis에 대 한 마커 수 있지만.
현재 연구에서 두 HFS 방법론 직접 및 간접적으로 hippocampal DG의 활성화를 대상에 맞게 있습니다. 전극은 DG에 직접 이식 또는 DG 뉴런을 활성화 하는 계획을 보내는 중간 perforant 경로 (PP)로 이식. HF DBS 유도 대 한 프로그래밍 가능한 자극 기는 마우스 머리에 고정된 전극에 지속적인 자극을 통해 에 대 한 제공 됩니다. 신경 활성화와 신경 신생에 HFS의 효과 확인 하려면 immunofluorescent 얼룩이 지 고 hippocampal DG 지역에서 긍정적인 뉴런 BrdU 통합의 수에 의해 c-fos 와 Notch1의 식 감지 후 각각, HFS 치료입니다. 특히,는 DG에서 성체에 HF-DBS의 효과 비교는 급성 및 만성 자극 방식으로, 또는 직접 및 간접적인 자극 방법, 각각.
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Protocol
동물 실험 절차는 베이징의 기본적인 의료 과학 연구소 (베이징, 중국) 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 중국 정부 규정의 기관 지침에 따 랐 다. 쥐 (성인 남성, 26 ~ 30 g) 지 내게 되었고 12 h 빛/12-h 어두운 주기 (오전 7 시에 조명) 아래 물과 음식 광고 libitum, 23 ° C의 일정 한 온도에서 보관. 모든 실험 절차는 가벼운 주기 동안 수행 했다.
1. 수술 준비
참고: 사용자 지정 전극은 Halpern의 보고서23에서 수정 하는 방법을 사용 하 여 만든.
- 2 구리 마이크로-전선 (200 µ m의 외부 직경)를 사용 하 여 병렬 양극 전극으로. 자극에 대 한 원통형 전극 형성에 서로 주위 전극 랩.
참고: 여기, PP 또는 DG 내 전극 길이 핵의 해부학 적 깊이 따라 다양 했다. - 에틸렌 산화물 소독 캐비닛을 사용 하 여 전극 소독. 처리 하 고 제 2 채널 마이크로 와이어 전극 어떤 오염 없이 저장 합니다. 전극 엄격 하 게 어떤 수술 주입 하기 전에 살 균 되어야 한다.
- 압력솥 수술 도구.
- 수술 하기 전에 주사 마우스 pentobarbital (20-50 mg/kg)와 intraperitoneally, 마 취의 수술 비행기를 달성 하기 위해.
- 살 균 페니실린 G procaine 정지 (75000 U, 인스턴트 메신저)와 각각24통증과 감염의 위험을 줄이는 진통 에이전트 (carprofen, 0.05-1 mg/kg, 사우스 캐롤라이나) 마우스를 주사.
- 동물 마 취 후 눈 건조를 방지 하기 위해 두 눈을 눈 윤 활 유를 적용 합니다. 동물의 반사 응답 곤란 발가락 응답이 발생 하는 경우에 작업을 진행 하 여는 진정의 유도 및 마 취의 깊이 확인 합니다.
참고: 수 의사 연 고 눈 건조를 방지 하기 위해 또 다른 옵션입니다. - 마우스 머리 위에 모피의 대부분 전기 머리 또는 면도날 면도, 면도 영역 70% 알코올과 betadine 솔루션의 세 가지 번갈아 스크럽을 소독 하 고는 betadine 피부에 건조 후 작업 진행.
2. 고주파 자극 수술25,26
참고:이 단계에서 전극이 아니다 일방적으로 심은 지 DG 또는 중간 PP 영역, 에피소드 학습과 기억에 중요 한 역할을 해 마의 한 부분으로.
- 정위 적 프레임에 마 취 마우스를 놓습니다. 마우스의 머리를 움직이기 힘 드는 유지 하 귀 바 제대로 정렬 하 고 신속 하 게 그들을 설치 합니다. 중심으로 머리를 지원 하 고 약간 마우스를 보안 부드럽게 귀 바 조입니다.
- 37 ±에 동물의 체온을 유지 하기 위해 온도 조절 패드를 사용 하 여 0.5 ° c.
- 집게를 사용 하 여 마우스 귀 앞쪽 피부를 파악 하 여 마우스의 두개골의 정상 피부 1 c m2 지역에 대 한 제거 하는 소독가 위로 잘라.
참고: 적은 양의 출혈 컷된 피부의 가장자리를 따라 관찰 될 수 있었다. - 근육 및 두개골 표면 노출 면봉으로 두개골을 overlying 다른 첨부 파일을 제거 합니다. 모든과, 힘 줄 및 두개골의 완전히는 화살을 식별 하는 표면 및 람다 봉합 라인에서 결합 조직 청소는 면봉와 해를 사용 합니다.
- Bregma와 람다 포인트를 식별 합니다. 혀끝 봉합 교차는 calvaria의 우수한 중간 부분에 화살 봉합은 bregma이 있는 곳입니다. 화살 봉합에 의해 lambdoid 봉합의 교집합 람다는 표시입니다. 원래 지점으로는 bregma를 사용 하 여 다른 핵 위치를 설정.
- 두개골에 bregma 람다 위치 식별 후 수평에이 두 지점을 조정 합니다. 이러한 두 지점의 높이 (모든 오류 < 0.05 m m 이어야 한다) 등 쪽 복 부 방향으로 거의 동일 다는 것을 확인 하십시오. 또한, 두개골 수준 같은 방법26의 중간 측면 방향에 있는지 확인 합니다.
- 일방적인 수술에 대 한 정위 적 수술 프레임에 만든 2-채널 구리 마이크로 와이어 전극 회전 전극 홀더에 탑재 합니다.
- 처음에, bregma 지점 위에 수직으로 전극을 놓고 원래 사이트로 설정 합니다. 사용 디지털 표시를 나타내는 앞쪽-뒷부분 (AP), 중간 옆 (ML), 정위 적 수술 프레임을 dorso-복 부 (DV) 합니다.
참고: 전극 휘어 지 고 되지 않도록 만지지 마십시오 두개골에 전극 팁 작업 중. - 올바른 위치로 전극을 부드럽게 이동 하는 방법 (그림 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 DG와 AP-3.8/ML ± 3.0 PP, 각각) 어떤 터치 하지 않고 두개골 위에27 . 원하는 사이트 전극 삽입을 위해 확인 되었다 때 높은 dorsoventral 정위 적 조정을 사용 하 여 전극 홀더, 고 검은색 표시와 함께 위치를 표시 합니다.
참고: stereotaxic 좌표에 관하여 정확한 위치는 마우스 스트레인, 무게, 그리고 섹스에 의해 달라질 수 있습니다. 성인 생쥐 같은 섹스의 위치에 어떤 변화를 최소화 하기 위해 사용 되어야 한다. 가능 하면 개별 주제 기초27에 위치를 식별 하 작전 해 부 검사를 사용 해야 합니다. - 휴대용 micromanipulator 도움 드릴을 사용 하 여 (크기 규 석 = 0.5 m m) 정확 하 게 표시 된 위치에서 버는 구멍을. 드릴링 하기 전에 70% 에탄올과 버의 끝을 소독. Z 축 0.8-1.0 m m의 X-Y 위치를 변경 하지 않고 따라 두개골을 통해 미니 드릴 비트를 이동 합니다. 메 마른 목화를 사용 하 여 작업 하는 동안 어떤 출혈을 멈추게.
참고: 시추 하는 동안-드릴링과 과도 한 열 발생을 피하기 위해, 드릴링 속도 15000-18000 분당 회전 (RPM), 그리고 자주 드릴 비트 마다 8-10의 버 구멍에서 인출 확인 합니다. - 계속 두 라 노출까지 드릴링. 구부러진된 바늘을 사용 하 여 훈련 하는 동안 생성 되 고 기본 부드러운 뇌 조직 손상 없이 경질에는 작은 구멍을 만들어 모든 뼈 스크랩 제거.
참고: 뇌 조직 손상 되지 않도록, 구부러진된 무딘 바늘 수 또한 대체 잘 무뚝뚝한 겸 자. - 확인 하려면 그 버 구멍 만들어진 제대로 원하는 위치에 정위 적 수술 프레임의 조정에 의해 전극 높이 줄일 고 전극은 전파 장애물을 건드리지 않고의 버는 구멍을 통해 원활 하 게 삽입할 수 있습니다. 그렇다면, 천천히 삽입 전극 1.8 m m는 DG (또는 PP에 대 한 3.0 m m)의 깊이 (PP-DG) dg 중간 PP에 있는 두개골의 표면에서.
참고: 닦아 모든 중추 신 경계 또는 메 마른 목화와 함께 버 구멍에서 혈액 유출 전극 이식의 과정. - 삽입 후 두개골 구멍에 마이크로 와이어 전극 잡고 자리에 작은 주걱을 사용 하 여 적절 한 치과 시멘트로. 시멘트가 복잡로 삽입 된 전극과 좋은 부드러운 모자를 나사 주위 금형. Debride 하 고 상처 가장자리를 소독.
- 전극 홀더에서 전극을 분리 합니다. 정위 적 프레임에서 마우스를 제거 하 고 따뜻한 케이지를 반환 합니다.
참고: 수술 후, 그들은 완전히 충분 한 의식으로 마 취에서 회복 될 때까지 그들의 감 금 소에는 동물을 반환을 기다립니다. - 마우스를 자유롭게 이동 하 고 감 금 소에 있는 2 일 동안 복구할 수 그것을 허용 하자. 그런 다음, 연결 하는 전극 이식 마우스에는 프로그래밍 가능한 자극을 통해 뇌 지도. 그림 2에 제시 된으로 소프트웨어 인터페이스를 설정 합니다. 400 Hz에서 6 펄스의 6 열차의 6 시리즈 HFS 매개 변수 설정 (그림 1B, 열차, 20 사이 100 ms 계열 간의 s)28. 200 µ a 자극 강도 설정 합니다.
- 시간 설정으로 원하는 기간 동안 한 HFS를 제공 합니다. 자극 2 x 하루 오전 8 시와 오후 8 시에 제공
- 컨트롤 그룹에 대 한 생쥐에 전극을 이식 하 고는 자극을 수행 하지 마십시오.
- C-fos 얼룩에 대 한 심하게 자극 실험 쥐 (2 x 하루). BrdU 라벨에 대 한 급성 자극 그룹으로 실험 쥐 분할 (일 당 2 배 적용) 및 만성 자극 그룹 (10 x 5 일에, 일 당 2 배 적용). 자극의 과정, 마우스 깨어 있는지 확인 합니다. 리드는 트위스트 하지 수 있도록 기억 하십시오.
참고: 프로시저의 마지막 날에 급성 자극 그룹에 마우스 했다 자극 동시에. - 자극을 할 때 신중 하 게 전극 홀더 및 녹화 시스템의 커넥터에서 전극 핀을 분리 합니다.
3. 면역 형광 염색 및29 라벨 Bromodeoxyuridine
- C-fos 와 Notch1 얼룩이, 마지막 HF DBS 자극 후 약 3 h pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) 마 취의 수술 비행기를 달성 하기 위해 주입 하 여 쥐를 anesthetize.
- BrdU 라벨에 대 한 마지막 HF DBS 자극 후 약 12 h 2-h 간격 (50 mg/kg 0.9% 식 염 수, I.P.) 컨트롤 및 자극된 쥐에 6 주사 BrdU의을 제공 합니다. 마지막 주입 후 36 h 외과 비행기를 달성 하기 위해 pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.)를 주입 하 여 쥐를 anesthetize.
- 절 개 흉 곽 통해 메스를 사용 하 여 마음을 노출 한 다음 22 게이지 무딘 관류 바늘 왼쪽된 심 실에 전달 하 게. 오른쪽 아 트리 움에 작은 절 개를 확인 합니다. Transcardially 찬 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 뒤에 1 x PBS (pH 7.4)에 찬 4 %paraformaldehyde (PFA)의 50 mL 50 mL와 함께 그것을 perfuse.
참고: 전환 PBS는 PFA에는 마우스 피에서 vivo에서 교체 되 고 액체 실행 취소 됩니다. 좋은 관류 간 개간 하 여 재판 될 수 있다. 관류 고정 떨림을 관찰 되었습니다30일단 중지 되어야 합니다. - 안과 위 마우스를 목을 벨, 피부에 절 개를 확인 하 고 두개골을 노출. 집게를 사용 하 여 두개골에서 약간 칩 하 고 신중 하 게 전체 쥐의 뇌를 해 부. 포스트-fix 4 %paraformaldehyde 추가 2 일에 뇌와 하룻밤 4 ° C에서 30% 자당 해결책에 그것을 전송.
- 20 µ m 코로나 섹션으로 머리를 잘라 cryostat를 사용 하 여. 전송 및 브러시와 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 하 고-20 ° c.에서 그들을 저장합니다
참고: 전극 misplacements 또는 과도 한 기계적 손상 동물 이후 분석에서 제외 됩니다. - 일반 PBS (0.1 m M, pH 7.4)에 슬라이드를 전송 없음 정착 액을 포함 하. 씻어 각 어떤 초과 정착 액을 제거 하 5 분에 대 한 3-4 x PBS 가진 조각. BrdU 표시 그룹에 대 한 37 ° C에서 30 분 동안 2 N HCl에 섹션을 품 어 하 고 0.1 M borate 버퍼에 그들을 씻어 (pH 8.4; 10 분). 다음 씻어 슬라이스 2 x PBS에서 5 분.
참고: Immunostaining 다음 수행 합니다. - 보육 실 온 (RT)에서 1 시간에 대 한 솔루션 (1% 정상 염소 혈 청, 3% 소 혈 청 알 부 민 < BSA > 0.5% 트라이 톤 X-100 그리고 0.02% 나트륨 아 지 드 1 x PBS에서) 차단에 의해 분할 영역을 취급 합니다.
- 안티-c-fos polyclonal 항 체 (1: 500, 토끼), 안티-Notch1 항 체 (1시 50분; 염소), 또는 안티-BrdU 항 체 (1:800; 쥐) 4 ° C에서 차단 솔루션에서 슬라이스를 밤새 품 어.
- 씻어 3 조각에 PBS, x 다음 알 렉 사 Fluor 568 활용 반 토끼 (1: 500), 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 항 염소 (1:1, 000), 그들을 품 어 또는 실시간에 1 시간에 대 한 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 반대로 쥐 (1: 500) 이차 항 체
- 워시 샘플 3 PBS (10 분 마다)에 x. DAPI를 포함 하는 안티-페이드 시 약 장착 매체를 사용 하 여 면역 표시 된 뇌 섹션 커버. 조각 건조 및 4 ° c.에 빛 으로부터 보호 저장 하자
- 고해상도 멀티 채널 (순차적) confocal 현미경 검사와 뇌의 자극 및 unstimulated 측면에서 hippocampal 분야의 이미지를 취득 합니다. 제어 및 실험 그룹 사이 일관 되 게 이미지 매개 변수를 설정 합니다.
- 모자이크 영상 연속 3 차원 (XYZ) 이미지 전동된 스테이지를 사용 하 여 인접 한 필드의 보기의 큰 합성 수 있도록 함께 그들을 꿰 매 적절 한 소프트웨어를 활용 하 고 확대 목표 (20 X 어 목표, 나 0.45)를 사용 하 여 수행 이미지입니다.
참고: 진정한 바느질과 향상 된 완벽 한 이미지에 대 한 옵션을 매끄럽게 타일링 기능 포함 됩니다. 합성 이미지는 신속 하 고 쉽게 준비 넓은 지역 이미지를 바느질 함수를 사용 하 여. - C-fos 와 Notch1 얼룩, 맞춘된 이미지의 immunofluorescent 밀도21 의 긍정적인 핵 정량 분석을 수행 합니다. 임의로 rostral와 등, 복 부 hippocampal DG 오는 아구에 3 개의 영역을 선택 하 고 이미지 J 소프트웨어 (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31를 사용 하 여 눈 멀게 하는 이중 방식에서 immunofluorescent 밀도 측정.
- BrdU 라벨, 눈 멀게 하는 이중 방식에서 등 해 마는 bregma 상대적인-2.7 mm (-1.7 mm)을 통해 드릴링 지점 슬라이스를 분석 합니다.
- DG에 BrdU 양성 신경만을 계산 합니다. 2 셀 개수에과 립 세포의 직경 안에 누워 셀을 포함 합니다.
참고: 여기, 계산 수행 되었다 공기 목표 X 40을 사용 하 여. 임의로, 동물 당 3-5 섹션 계산 했다, 그리고 카운트 평균 DG19당 수단으로 표현 했다.
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Representative Results
Hippocampal DG 하위 직접 또는 PP 하위는 DG를 직접 활성화 하기 위해 HF DBS 자극 통해 삽입 전극을 사용 하 여 정위 적 조정, 설치류 pentobarbital로 취 했다 고 3 h 샘플링 후 c-fos 와 Notch1 immunostaining에 대 한 마지막 HF DBS 자극. BrdU 얼룩, 1 일 또는 HF DBS 자극의 5 일 후 마지막 BrdU 주입 후 36 h에 대 한 설치류 뇌 섹션의 준비에 대 한 pentobarbital로 취 했다. 그림 3 c-fos 의 표정을 DG의 동측 측에서 크게 증가 했다 보여줍니다. 또한,는 DG의 contralateral 측에 c fos 식 또한 upregulated 보였다 c fos 신호의 식이 거의 없는 노-HF-DBS 자극 컨트롤에 비해 했다. Notch1 전용 immunofluorescent 뇌 조각, 얼룩에 따라 보충 그림 1에서 보듯이, 우리 다시 한번 입증 하 Notch1 신호도 활성화 될 수 성인 hippocampal DG에서 HFS 자극 후 유도 의해 PP에서 뉴런의 도발은의 (또한 보충 파일 1로 제공 하는 원시 데이터를 참조).
DG 하위 영역에서 직접적인 HF DBS 자극 외에도 그림 4A 위치를 표시 하 고 중간 pp. 그림 4B 에 설치 된 전극 팁의 HF DBS 자극 사이트 시연 하는 HF-DBS PP에 자극 크게는 DG의 동측 측에 c fos 식의 수준을 증가 뿐만 아니라 노-HF-DBS 자극에 비해 DG의 contralateral 측에 c fos 의 식을 증가 제어 합니다.
BrdU는에 따라 그 성체도 활성화 될 수 있다 성인 hippocampal DG에는 DG에서 만성 (5 일) HF-DBS 자극 후 직접 시연 5A-5 C 수치, 우리 더 같이 뇌 조각의 분석을 라벨. 만성 HF DBS 자극은 DG에서만 크게 하지 upregulated는 동측에 신생 측면 또한 증가 하지만 없음-HF-DBS 자극 컨트롤에 비해 contralateral 측면에서 신생. 그러나, 급성 (1 일) 자극 동측 측 나는 DG의 contralateral 측면에서 성체의 upregulation를 유도 하지 못했습니다. 그림 5D, 급성 자극 그룹 또는 만성 자극 그룹에서 PP에서 간접 HF DBS hippocampal DG에서 성체 레벨을 변경할 수 없습니다.
그림 1 . 전극 팁의 두뇌 목표 및 매개 변수는 HFS의 도식 대표. (A)는 중간의 신경 투영 perforant 경로 뇌의 열 등 한 블레이드로 표시 됩니다. (보라색)에 삽입 된 전극의 위치 자극 하 DG 직접 또는 PP 하위 표시 됩니다. (B) HFS 매개 변수는 기차와 20 사이 100 ms 400 Hz에서 6 펄스의 6 열차의 6 시리즈도 표시 되는 시리즈 사이 s. CA = 뿔 Ammonis; DG가 이랑; = PP = perforant 경로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 인터페이스 및 매개 변수는 multistimulator의. 는 자극 했다 디지털-아날로그 변환기에 연결 하 고 독점 소프트웨어에 의해 활성화. HFS의 자극 유형은 monophasic 이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 직접 HF DBS 치료에 대 한 응답에서 DG에서 신경 활성화. (A) 전극 팁 (흰색 빈된 상자) DG 지역 위에 직접 배치 했다 (AP-2.1/ML ± 1.0 / DV +1.8)는 HFS의 유무에 관계 없이. 이 패널 컨트롤에 HFS 그룹c-fos 항 체와 뇌 조각의 코로나 섹션의 immunostaining를 보여 줍니다. DAPI 블루 얼룩 hippocampal 핵의 위치를 나타내는 데 사용 되었다. 눈금 막대 = 100 µ m. (B)이이 패널 면역 형광 신호 밀도의 정량 분석을 보여줍니다. DG의 동측 측에서 뉴런 c-fos의 높은 식이 크게 활성화 했다 그리고는 DG의 contralateral 측에 c fos 식 또한 상대적으로 c fos 표현에 비해 증가 HFS 치료를 하지 않고 마우스를 제어 합니다. 의미 ± SEM, 일방통행 ANOVA, F2,24 216, P = < 0.0001, Bonferroni 게시물 임시 테스트 * * *P < 0.001, n노 sti = 9 (3 쥐에서 3 조각), nHFS 콘트라 = 9 (3 조각/마우스에서 3 쥐), nHFS IP = 9 (3 쥐에서 3 조각/마우스). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . PP 하위에서 HFS에 대 한 응답에서 DG에서 신경 활성화. (A) 전극 팁 (흰색 빈된 상자) AP-3.8, ± 3.0 ML, 및 DV 3.0, 또는 HFS 없이 위치에 중간 PP에 배치 했다. (B)이이 패널 컨트롤에 HFS 그룹c-fos 항 체와 뇌 조각의 코로나 섹션의 immunostaining를 보여 줍니다. DAPI 블루 얼룩 hippocampal 핵의 위치를 나타내는 데 사용 되었다. 눈금 막대 = 100 µ m. (C)이이 패널 immunofluorescent 밀도의 정량 분석을 보여줍니다. PP에서 HFS 치료 수 크게 c-fos의 높은 식이 DG에서 동측 뉴런을 활성화 합니다. C-fos contralateral DG에서의 표현 또한 상대적으로 HFS 치료를 하지 않고 제어 마우스의 c fos 식에 비해 증가 합니다. 의미 ± SEM, 일방통행 ANOVA, F2,24 189.3, P = < 0.0001, Bonferroni 게시물 임시 테스트 * * *P < 0.001, n노 sti = 9 (3 쥐에서 3 조각), nHFS 콘트라 = 9 (3 조각/마우스 3 마우스의 경우)에서 nHFS IP = 9 (3 쥐에서 3 조각/마우스). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . DG와 PP HFS에 대 한 응답에서 DG에서 성체의 고유 활성화 각각. (A)이이 패널은 DG에서 HFS 치료 및 확산 신경 BrdU 분류의 생성에 대 한 실험적인 패러다임을 보여줍니다. 동물을 급성과 만성 그룹으로 분할 되었다. 급성 그룹 쥐 HFS 치료 2에 복종 되었다 날 5 x. 만성 그룹 쥐는 HFS 치료 5 일에 복종 되었다 (하루 5, 1 한 일 당 2 배). 다음, 두 그룹에서 동물 주 6에 BrdU (50mg/kg, 6 x 2 h 간격으로)로 주입 했다. 8 일에는 동물 마 취 되었고 cryostat 섹션의 준비에 끼얹는다. (B)이이 패널 (에서 녹색) BrdU 게시물-HF-DBS는 DG에서의 immunofluorescent 얼룩을 보여줍니다. 신경 생산의 (C) 정량 분석 표시는 급성 (2 x 1 일에)는 DG에서 자극 만성 동안 성체를 향상 시킬 수 (10 x 5 일 이내) 자극은 DG에서 크게 upregulated는 신생. 컨트롤 그룹에 비해, BrdU 라벨 만성에서 크게 증가 하는 세포의 수 모두 동측 및 contralateral 반구에서 그룹. 눈금 막대 100 µ m. 수단 ± SEM, 양방향 ANOVA 자극 유형 효과 F2, 14 = 97.09, P = 0.0001 <, 반구 효과 F1, 14 1.137, P = = 0.3044, Bonferroni 게시물 임시 테스트, * * *P < 0.001, n 제어 = 3 (3 쥐에서 3 조각), n1 일 = 4 (4 조각 3 쥐에서), n일 = 3 (3 쥐에서 3 조각). (D)이이 패널 (에서 녹색) BrdU 게시물-HF-DBS PP 하위 영역에서의 면역 형광 염색을 보여줍니다. (E) A 신경 생산의 정량 분석을 표시 (1 일)에 두 번 급성 또는 만성 (10 x 5 일에서) PP에 자극을 크게는 신생을 향상 수. BrdU 셀 라벨의 수 또는 HFS 치료 없이 상대적으로 안정 됐다. 눈금 막대 100 µ m. 수단 ± SEM, 양방향 ANOVA 자극 유형 효과 F2, 16 = 0.9025, P = 0.4252, 반구 효과 F1, 16 = 1.402, P = = 0.2537, Bonferroni 특별 게시물 테스트, P > 0.05, n 제어 = 3 (3 쥐에서 3 조각), n1 일 = 3 (3 쥐에서 3 조각), n일 = 5 (5 조각 3 쥐에서). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1입니다. HF DBS 치료에 DG에서 Notch1의 식. (A)이이 패널 표시 (녹색)에서 Notch1의 immunofluorescent 얼룩은 DG에서 HF DBS 후 3 h. 이 그림 인용 되었고 Feng의 보고서21에서 수정. (B) 형광의 정량 분석은 DG에서 HFS Notch1의 식을 향상 시킬 수 있는 표시. 눈금 막대 = 100 µ m. 수단 ± SEM, 학생 t-테스트, t = 12, * * *P < 0.001, n노 sti = 9 (3 조각/마우스 3 쥐에서), nHFS = 9 (3 쥐에서 3 조각/마우스). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 1입니다. 원시 데이터. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
HF DBS 기술 널리 사용 되었습니다 강력한 도구로 1990 년대 이후 많은 신경 성 질환의 치료에 대 한. 지금까지, HF DBS의 랜드마크 일 많은 관심과 모두 클리닉 및 사회 과학에 관심을 끌고있다 진전, 파 킨 슨 병의 치료입니다. 특정 신경 및 정신 장애32,33에서 HF-DBS의 치료 응용 프로그램에 대 한 많은 그룹에 의해 지속적인 HF DBS 연구의 다양 한 유형이 있다. 이러한 연구의 일부는 현재 임상2,34의 다양 한 단계에 있습니다. HF DBS 상당한 혜택을 가져다 해야 합니다, 비록 자극도 되돌릴 수 있는 분위기와 생각, 등, 부정적인 변화 같은 뇌의 완벽 한 배치와 함께 발생할 수 있습니다 부작용과의 수정을 피할 수는 자극 설정입니다.
HF DBS 기술 임상 시험에서 지난 수 십년 동안 축적의 중요 한 진행 외에 살아있는 동물에서 HF DBS의 연구 또한 생리 적 변화를 이해 하 기회 제공 및 neurobiological 전기 자극에 의해 유도 하는 메커니즘. 이 원고에서 우리가 직접 또는 간접적으로 HFS와 hippocampal DG 하위 영역을 자극 하는 쥐에서 수정 된 HF DBS 방법론을 설명 했습니다. 설치류에 설명 된 프로토콜을 수행 하는 있지만 HFS 응답 연구는 또한 성공적으로 실시 되었습니다 돼지35를 포함 한 다른 모델 유기 체에. 이 기술에 대 한 정위 적 수술도 사용할 수 있습니다 잠재적인 핵 대상 자극에 대 한 특정 동물 모델을 사용 하 여 신경 및 정신 장애와 HFS의 효능 테스트. 이러한 연구 결과에서 도출 하는 결론 쉽게 기존 대상에서 HFS의 구체화를 위해 특별히 병원에 번역 한다. HF-DBS이 방법론 연구, 병원에서의 다중 노출의 시리즈와 달리 우리 HFS 자극 하 고 유도 hippocampal DG, 매개 변수 및 패러다임의 부분에 신경 활동의 단일 및 단기 노출 선택 note HFS의 그 이전 해 마 조각21,28에서 LTP를 유도 하기 위해 보고 되었다.
HF DBS의 일반적인 제한 광범위 하 게 되어 다른24,25검토. 여기에 실험에 대 한 과제 중 하나는 우수한 수술 기법에 대 한 및 지속적인 수술 해 부 로커 들에 대 한 필요 이기도합니다. 올바르고 정확 하 게 자극에 대 한 대상 핵에 전극 이식, 하 키 프로세스 중 하나는 불필요 한 혈관 상해 및 전극의 방치를 방지 하려면 숙련 된 기술자에 의해 성공적인 수술입니다. 또한, 뇌 견본 추가 해부학 및 조직학 분석 또한는 HFS 후 전극의 적절 한 타겟팅 확인 필요 합니다. 이것은 또한 명확 하 게 그대로 동물 두뇌에 작업 후 전극의 수정 대상 보여이 방법의 장점 중 하나. 많은이 프로토콜에서 제공 하는 세부는 장기 자극을 통해 동물에 이식된 자극에 쉽게 적용할 수 있습니다. 그것은 또한 다른 HFS 배달 패턴 잠재적인 치료 뇌 대상 매개 변수 대체 자극 의무가 주목 한다. 그러나,이 기사 보고 프로그래밍 가능한 자극 단위에 의해 전달 되는 단일-단위 급성 HFS에 전기 자극 후 세포질 변화를 이해.
HF DBS는 몇 년 동안 병원에서 신경 정신 장애의 치료에 대 한 대체 옵션으로 제공, 하지만 그 효과 기본 메커니즘 제대로 이해 남아 있습니다. 사용 및 HF DBS의 미래의 개선을 고려 하면 더 실용적 접근이 필요 합니다. 개발 도구로 서, HFS 기술 기술 혁신 및 기계적 발견 더 필요합니다. HF DBS의 세포 및 분자 메커니즘 연구, 높은 처리량 시퀀싱 기술을 기반으로 글로벌 transcriptome 분석 HF DBS 유도 후 분자 이벤트와 신호 변화를 이해 하는 중요 한 정보를 제공할 것입니다. 36. 신경 도발은 하 응답 입증 된는 기존 분자 후보자의 심사에 따라 공평한 심사 전략 이외에 그것은 아마 것입니다 또한 키 이펙터를 식별에 중요 한 단서를 제공 HFS와 담당 합니다. C-fos upregulated 내장 신경 활동에 대 한 응답에서, 뉴런의 발사37최근 그래서 그것의 표정을 보고는 적어도 제공. 그러나, c-fos 해야만 사용할 수 없습니다 그냥 활동을 반영 하는 그것은 또한 LTP37를 받고 신경 표시 것 처럼 보이기 때문에. 우리를 포함 한 이전 작품 시연 Notch1 성숙 hippocampal 신경에 시 냅 스가 소성에서 중요 한 역할을 담당 하 고21,22 vivo에서성체에 대 한 필수적입니다. 이 상황, 키 후보자를 신중 하 게 특성화 하 고 사전 설명 한다 c fos 식의 immunohistochemical 분석에 의해 게시물-HFS 유도의 상세한 양적 및 spatiotemporal 지역화 이 같은 연구는 HFS21또한 신경 활성화 등 세포 변화를 공개 도움이 될 것입니다.에 대 한 응답의 다양 한 두뇌 지구에서 유전자 표현 패턴의 변화를 설명 하기 위해 직접 증거를 제공할 것입니다. 성체, 또는 neurodegeneration입니다.
그것은 또한 해야 자극 효과의 결과 밀접 하 게 관련 된 자극 매개 변수 및 대상 위치 뇌, 세포와 분자는 사실 때문 클리닉, HF DBS 응용 프로그램의 장점에도 불구 하 고 주의 HFS의 효과 기본 메커니즘은 매우 복잡 한 수 있습니다. 이 연구에서 우리가 더 BrdU 성체에 HFS의 급성 및 만성 효과 조사 하기 위해 라벨 수행. BrdU 염색 될 수 있지만 모두 신생 및 gliogenesis에 대 한 마커, 이전 보고서, HF DBS 치료는 증식 성인 신경 창시자21 이어야 한다 후 긍정적인 뉴런은 SGZ에서 관찰 증가 BrdU의 대부분에 따라 , 38 , 39. HFS 치료 기본 메커니즘의 복잡도에 방법 및 결과 우리가이 원고에 설명 된 직접 증거 제공 hippocampal DG를 활성화 하는 반복적인-고주파 전기 자극 크게 신경 활동과 성체 비보의 활성화를 유도 하는 수 있습니다.
요약, 우리는 HF-DBS 신경 활동과 신경 활동 및 HF DBS를 받아야 하지 않았다 누가 통제 쥐의 성체에 비해 쥐의 성체를 향상 시킬 수 있는 시연 했다. 이 인지 효과 관한 과학적 이해와 vivo에서HFS의 모방 하는 자극 진행 수 있습니다. 급성 HF DBS 치료에 직접 또는 간접적으로 비보 후 신경 활성화의 식별 HFS 치료는 로컬 및 장거리 연결의 시 냅 스 전송에 중요 한 영향을 보여 줍니다. HF DBS 치료 후 신경 활성화의 급속 한 유도 장애 시 냅 스 전송 조작 또는 desynchronization MDD 등 많은 신경 및 정신 질환에 강력한 도구를 제공 합니다. 다른 한편으로, 만성 하 고 직접, 하지만 급성 하지 또는 간접 HF DBS 치료 후의 신생 유도 뚜렷한 효능 및 다른 전기 자극 매너 사이 기능 변화 제안합니다. 이러한 연구 결과 미래에 신경 변조 및 HFS의 잠재적인 치료 혜택에 대 한 직접 증거를 제공합니다. 함께 찍은, HF-DBS 병원에서 기술 진보 및 실험실에서 만든 기계를 통합 하 여 신경 및 정신 질환의 치료에 대 한 상당한 장점을 발표할 예정 이다.
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Disclosures
저자는 선언할 수 없다.
Acknowledgments
(하이 타오 우), 중국과 그랜트 Z161100000216154에서의 기초 연구에 대 한 국가 주요 개발 프로그램에서 973 (2014CB542203) 프로그램 31522029, 31770929 및 31371149 (하이 타오 우) 중국의 국가 자연과학 기초에 의해 지원 되는 베이징 시 과학 및 기술 위원회 (하이 타오 우). 저자는 그들의 격려와 토론에 대 한이 타오 우 연구소의 모든 구성원을 감사합니다. 저자는 그의 도움 장치 디버깅에 대 한 Zhenwei 류를 매우 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
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