Summary
Detta protokoll visar hur du ställer in en pålitlig HFS metod hos möss. Nervceller i hippocampus dentate gyrus stimuleras elektriskt av HFS direkt och indirekt i vivo. Neuronal aktivitet och molekylär signalering granskas av c-fos och Notch1 Immunofluorescerande färgning, respektive; neurogenes kvantifieras i Bromdeoxiuridin märkning assay.
Abstract
Elektrisk högfrekvent stimulering (HFS), med inopererade elektroder inriktning olika hjärnregioner, har bevisats som en effektiv behandling för olika neurologiska och psykiatriska sjukdomar. HFS i regionen djupt i hjärnan, också heter deep-hjärnstimulering (DBS), blir allt viktigare i kliniska prövningar. Senaste framsteg i hög frekvens DBS (HF-DBS) kirurgi har börjat sprida sig möjligheten att utnyttja denna invasiv teknik till andra situationer, till exempel behandling av egentlig depression disorder (MDD), tvångssyndrom (OCD), och så på.
Trots dessa expanderande indikationer förblir de bakomliggande mekanismerna för de positiva effekterna av HF-DBS gåtfulla. För att lösa denna fråga, är en metod att använda implanterade elektroder som glest aktiverar distribuerade subpopulations av nervceller av HFS. Det har rapporterats att HFS i främre kärnan i thalamus kan användas för behandling av refraktär epilepsi i kliniken. De bakomliggande mekanismerna kan vara relaterat till de ökade neurogenes och förändrad neuronal aktivitet. Därför är vi intresserade av att utforska de fysiologiska förändringarna av detektion av neuronal aktivitet samt neurogenes i mus dentate gyrus (GD) före och efter HFS behandling.
I detta manuskript beskriver vi metoder för HFS att rikta aktivering av GD i möss, direkt eller indirekt och på ett sätt som akut eller kronisk. Dessutom beskriver vi ett detaljerat protokoll för beredning av hjärnan skivor för c-fos och Notch1 Immunofluorescerande färgning för att övervaka neuronala aktiviteten och signalering aktivering och Bromdeoxiuridin (BrdU) märkning för att avgöra den neurogenes efter HF-DBS induktion. Aktiveringen av neuronal aktivitet och neurogenes efter HF-DBS behandling ger direkta neurobiologiska bevis och potentiella terapeutiska fördelar. Särskilt kan denna metod vara och tillämpas för att rikta andra intresserade hjärnan såsom de basala ganglierna och subthalamic regioner för specifika hjärnsjukdomar i kliniken.
Introduction
HF-DBS är en Neurokirurgiska teknik för elektrisk stimulering i hjärnan, som har utvecklats sedan 1870-talet1. I slutet av 1980, HFS användes först som en potentiell terapeutisk intervention för Parkinsons sjukdom och annan rörelse besvär2. I de senaste decennierna, har HF-DBS mer och mer allmänt använts i behandling av sjukdomar i hjärnan som är för närvarande icke behandlingsbar av en traditionell terapeutisk strategi. Särskilt på grund av exakthet förbättring av HFS elektroden, mycket effektiva resultat och minimala biverkningar, antalet sjukdomar i hjärnan behandlas av HF-DBS ökat betydligt under senaste decennierna3,4, 5. Till exempel har HF-DBS godkänts av den amerikanska Food and Drug Administration (FDA) för behandling av Parkinsons sjukdom (PD), Alzheimerdemens typ, essentiell tremor och andra typer av rörlighet störningar2,6, 7. PD patienter, dopaminerga medicineringen minskas upp till 50% under HF-DBS8. Förutom en framgångsrik behandling av rörelsestörningar, har HF-DBS också visat sin kraftfulla effekter vid behandling av psykiatriska sjukdomar i kliniken, och för kognitiv bröstförstoring som väl2,9, 10 , 11. det bör noteras att forskningen av HFS för behandling av andra psykiatriska störningar är i olika stadier, erbjuder mycket löfte till patienter12.
Även om många studier har visat att en fokal HFS har både lokala och fjärranslutna effekter i hela hjärnan13, fortfarande de neurologiska och molekylära mekanismerna av effekterna gäckande2,14. I kliniken, är terapeutiska HF-DBS vanligen tillämpas på ett långsiktigt sätt för behandling av Parkinsons sjukdom och kronisk smärta, etc. många åsikter höjs för att förklara den förbättring som genereras av en HF-DBS-behandling, bland vilka en möjlighet att HFS nuvarande modulerar den neuronala nätverksaktiviteten, förmodligen av en repetitiv depolarisation av axoner i närheten av den implanterade HFS-elektroden. Eller HF-DBS kan ändra ansvarsfrihet för utdata nervceller och de planerade målen. Också, HF-DBS kan leda till långsiktiga synaptic förändringar, inklusive långsiktig potentiering (LTP) och långvarig depression (LTD), vilket kan bidra till en symtomatisk förbättring. Hittills, det är fortfarande oklart huruvida HFS påverkan de viktiga molekylära händelser som reglerar cellulär bearbetar sådana som adult neurogenes i vivo. Flera rader av studier har visat att HFS hos gnagare kunde härma liknande neurala Svaren kliniskt tillämpad DBS15,16. För att förstå de bakomliggande cellulära mekanismerna för HF-DBS, i denna studie ställa vi först in en i vivo HFS metodik hos möss i en akut (en dag) eller kronisk (fem dagar) sätt. För det andra, vi satte upp en aktivering analys-metod att bestämma ändringen av neuronal aktivitet och neurogenes efter en HF-DBS-leverans.
Eftersom produktionen av neuronala från neurala stamceller är rikligt under den embryonala utvecklingen men fortsätter under hela vuxenlivet, Hippocampus subgranulära zonen är ett av de stora områden där neurogenes uppstår. Processen att neurogenes är influerad av många fysiologiska och patologiska faktorer. I vissa epileptiska fall är i hippocampus neurogenes dramatiskt minskad17,18. Dessutom kunde en enda elektrokonvulsiv terapi avsevärt öka neuronal produktionen i dentate gyrus19. Dessa observationer tyder på att den elektrofysiologiska aktiviteten spelar en avgörande roll i regleringen av adult neurogenes och synaptisk plasticitet i hippocampus nervceller. Därför, för att ytterligare påvisa effekterna av HF-DBS på neuronal aktivitet och neurogenes, vi först genomföra en immunfärgning haltbestämning av den omedelbara tidiga-genen (IEG)- c-fos som är en välkänd markör för kortsiktiga neuronal aktivitet som följd av Upplev20. Notch1 signalering upptäcks också för att övervaka signalering aktiveringen efter HFS leverans21,22. Dessutom upptäcka vi också neuronala produktionen av en BrdU märkning analys efter HF-DBS induktion på olika sätt, även om BrdU färgning kan också vara en markör för gliogenesis.
I den aktuella studien är två HFS metoder anpassade att rikta aktivering av hippocampus GD direkt och indirekt. Elektroden är implanteras i GD direkt eller implanteras i den mediala perforant sökvägen (PP) som sänder prognoser till aktivera GD nervceller. För HF-DBS induktion presenteras en programmerbar stimulator för en kontinuerlig stimulering via fast elektroden på mus huvudet. För att avgöra effekterna av HFS på neuronal aktivering och neurogenes, vi upptäcker uttryck för c-fos och Notch1 av Immunofluorescerande färgning och antalet BrdU-ingår positiva neuroner i regionen Hippocampus GD, respektive, efter HFS behandling. Särskilt, jämförs HF-DBS effekter på neurogenes i GD mellan en akut och en kronisk stimulering sätt, eller mellan en direkt och en indirekt stimulans sätt, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djura experimentella rutiner följde institutionella riktlinjerna i Beijing Institute of Basic Medical Sciences (Beijing, Kina) och de kinesiska statliga föreskrifterna för skötsel och användning av försöksdjur. Mössen (vuxen hane, 26 ~ 30 g) var inrymt och hålls vid en konstant temperatur av 23 ° C, med vatten och mat ad libitum, under en 12-h ljus/12-h mörka cykel (lamporna på klockan 7:00). Alla experimentella rutiner utfördes under lätta cykeln.
1. kirurgisk beredning
Obs: En anpassad elektrod var hemmagjord med metoden modifierad från Halperns rapport23.
- Använd 2 mikro-kopparledningar (med en yttre diameter av 200 µm) som den parallella bipolär elektroden. Wrap elektroderna runt varandra för att bilda cylindriska elektroder för stimulering.
Obs: Här, elektrod längd inom PP- eller GD varierades enligt anatomiska djupet av kärnan. - Sterilisera elektroderna med en etylen oxid desinfektion cabinet. Hantera och förvara de hemmagjord 2-kanals mikro-trådelektroder utan kontaminering. Elektroderna ska strikt steriliseras innan någon kirurgisk implantation.
- Autoklav de kirurgiska instrument.
- Innan operationen, injicera musen med pentobarbital (20-50 mg/kg) intraperitonealt, för att uppnå ett kirurgiskt plan av anestesi.
- Injicera musen med en steril penicillin G prokain suspension (75 000 U, I.M.) och ett smärtstillande medel (karprofen, 0,05 - 1 mg/kg, SC) att minska risken för infektioner och smärta, respektive24.
- Efter den animaliska anestesi, applicera ett öga smörjmedel i båda ögonen att förhindra torra ögon. Säkerställa induktion av sedering och djupet av anestesi genom djurets reflexer svar på tå klämmande och fortsätta med åtgärden endast när inget svar inträffar.
Obs: Vet salva är ett annat alternativ att förhindra torra ögon. - Raka dig de flesta av pälsen på toppen av chefen mus med elektriska hårklippningsmaskiner eller ett rakblad, sterilisera den rakade området med tre alternerande scrubs i 70% alkohol och betadine lösning och fortsätta med åtgärden efter betadine har torkat på huden.
2. högfrekvent stimulering kirurgi25,26
Obs: I detta steg är en elektrod ensidigt implanterade i dorsala GD eller mediala PP område, en del av hippocampus med kritiska roller i episodisk inlärning och minne.
- Placera den sövda mus på stereotaktiska ramen. För att hålla musens huvud orörliga, justera fälten örat ordentligt och installera dem snabbt. Dra försiktigt åt örat barer så att de stöder centrerade huvudet och säkra musen något.
- Använd en termostatisk pad för att underhålla djurets kroppstemperatur vid 37 ± 0,5 ° C.
- Använd tången för att greppa huden anterior mus öronen och skär den med steriliserad sax för att ta bort om 1 cm2 hudområde på toppen av musens skalle.
Obs: En liten mängd blödning kunde observeras längs kanterna av skära huden. - Ta bort muskeln och andra fastsättning överliggande skallen med en bomullstuss att exponera skalle ytan. Använd en bomullspinne och dissekera mejsel för att rengöra alla benhinnor, senor och bindväv från skallens yta helt för att identifiera den sagittala och lambda suturer linjer.
- Identifiera bregma och lambda punkt. Skärningspunkten mellan koronala suturen och sagittal suturen på den överlägsna mellersta delen av calvaria är där bregma ligger. Genomskärningen av lambdoid sutur av sagittal suturen är där lambda är synlig. Använda bregma som den ursprungliga punkten för att ange andra nucleus position.
- Efter identifiering av den bregma och lambda positionen på skallen, justera dessa två punkter i den horisontella nivån. Kontrollera att höjden på dessa två punkter är nästan detsamma i dorsal-ventrala riktning (eventuella fel bör < 0,05 mm). Se också till att skallen är nivå i mediala-lateral riktning i den samma väg26.
- För en ensidig kirurgi, montera en hemmagjord 2-kanals koppar mikro-tråden i roterande elektrodhållare på stereotaktisk kirurgiska ram.
- Placera elektroden vertikalt ovanför bregma punkten först, och ange det som ursprungliga plats. Använd digitalt visas stereotaktisk kirurgiska ram för att indikera den främre-bakre (AP), medialt-lateralt (ML), och dorso-ventrala (DV) positioner.
Obs: För att förhindra elektroden att få böjda, ta inte på spetsen elektrod på skallen under operationen. - Flytta elektroden försiktigt till rätt position (figur 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 för GD och AP-3,8/ML ± 3.0 för PP, respektive)27 ovanför skallen utan någon touch. När önskad webbplatsen identifierades för elektrod införande, använda dorsoventral stereotaktisk justeringarna högre elektroder innehavaren och markera position med en svart markering.
Obs: Den exakta platsen med hänvisning till de stereotaxic koordinaterna kan variera av mus stam, vikt och kön. Vuxna möss av samma kön bör användas för att minimera eventuella variationer på plats. Om möjligt bör föroperativa anatomiska genomsökningar används för att identifiera platsen på en individ betvingar grund27. - Använda en handhållen micromanipulator-assisted borr (skorra storlek = 0,5 mm) att göra burr hål vid den markerade punkten exakt. Sterilisera spetsen av skorrar med 70% etanol innan borrning. Flytta upp mini borrkronan genom skallen längs z-axeln 0,8 - 1,0 mm utan att ändra dess X-Y-position. Använd en steril bomull för att stoppa någon blödning under operationen.
Obs: För att undvika alltför borrning och överdriven värmeutveckling under borrningen, säkerställa borrning hastighet är 15.000-18.000 varv per minut (RPM), och ofta frånträda borrkronan burr hål varje 8-10 s. - Hålla borrning tills dura är utsatt. Använda en böjd nål för att ta bort eventuella ben rester som genereras under borrningen och göra ett hål på dura utan att skada underliggande mjuk hjärnvävnaden.
Obs: Undvik att skada hjärnvävnaden, den böjd trubbig nål kan också ersättas med en fin trubbig pincett. - För att bekräfta att burr hål har gjorts ordentligt på önskad position, minska elektrod höjden av en justering av ramen stereotaktisk kirurgi och säkerställa att elektroden kan infogas smidigt genom burr hål utan att röra några hinder. I så fall långsamt in elektroderna till ett djup av 1,8 mm för GD (eller 3,0 mm för PP) från ytan av skallen ligger på den mediala PP att GD (PP-DG).
Obs: Torka bort cerebrospinalvätska eller blod utflöden från burr hål med steril bomull under processen för elektrod implantation. - Efter isättning mikro-tråden i skallen hålet, hålla den på plats med tillräcklig dentala cement med hjälp av en liten spatel. Som cement tjocknar, forma det runt infogade elektrod och skruvar att bilda en fin slät mössa. Debride och desinficera såret kanterna.
- Loss elektroden från elektrodhållare. Ta bort musen från den stereotaktiska ramen och returnera den till en varm bur.
Obs: Efter operation, vänta med att återvända djuren till sina burar tills de har återhämtat sig helt från anestesi med tillräckligt medvetande. - Låt musen röra sig fritt och gör det möjligt att återställa i 2 dagar i buren. Anslut sedan elektroden implanteras i musen hjärnan till en programmerbar stimulator via leder. Ställa in programvarugränssnitt som presenteras i figur 2. Ange parametrarna HFS som 6 serie 6 tåg 6 pulser vid 400 Hz (figur 1B, 100 ms mellan tågen, 20 s mellan serien)28. Ange stimulering intensiteten till 200 μA.
- Leverera ett HFS för önskad tidsperiod som uppsättning. Leverera stimulering 2 x en dag klockan 8:00 och klockan 8:00.
- För kontrollgruppen, implantera elektroder i möss och utför inte en stimulering.
- För c-fos färgningen, stimulera de experimentella möss akut (2 x per dag). För BrdU märkning, dela experimentella mössen i en akut stimulering grupp (tillämpas 2 x per dag) och en kronisk stimulering grupp (tillämpas 10 x i 5 dagar, 2 x per dag). Under loppet av stimulering, kontrollera att musen är vaken. Kom ihåg att säkerställa leder inte är vridna.
Observera: På den sista dagen av förfarandet, möss i gruppen akut stimulering skulle stimuleras samtidigt. - När stimuleringen görs, noggrant koppla elektrod pin från elektrodhållare och anslutning av inspelningssystemet.
3. immunofluorescens färgning och Bromdeoxiuridin märkning29
- För c-fos och Notch1 färgning, söva ca 3 h efter sista HF-DBS stimulering, möss genom att injicera pentobarbital (20-50 mg/kg I.P.) för att uppnå ett kirurgiskt plan av anestesi.
- För BrdU märkning, ger ca 12 h efter sista HF-DBS stimulering, 6 injektioner av BrdU och stimulerad möss med 2 timmars intervall (50 mg/kg i 0,9% saltlösning, I.P.). 36 timmar efter den sista injektionen, söva möss genom att injicera pentobarbital (20-50 mg/kg I.P.) för att uppnå ett kirurgiskt plan.
- Gör snitt med en skalpell genom bröstkorgen att exponera hjärtat och sedan passera en 22 gauge trubbiga perfusion nål till vänster kammare. Gör ett litet snitt i höger förmak. Transcardially BEGJUTA det med 50 mL kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av 50 mL kallt 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS (pH 7,4).
Obs: Växla PBS till PFA när mus blod i vivo ersättas och vätskan är klart. En bra perfusion kan bedömas av clearing av levern. Perfusionen bör stoppas när fixering skalv observerats30. - Halshugga musen med oftalmologiska sax, gör ett snitt på huden och exponera skallen. Med pincett, chip bort skallen lite och noggrant dissekera hjärnans hela musen. Post-fix hjärnan i 4% PARAFORMALDEHYD ytterligare 2 dagar och överföra den till en 30% sackaroslösning vid 4 ° C över natten.
- Använder en kryostaten, skär hjärnor i 20 µm koronalt avsnitt. Överföra och montera avsnitten till glas bild med en borste och lagra dem vid-20 ° C.
Obs: Djur med elektrod misplacements eller mekaniska skador kommer att uteslutas från den efterföljande analysen. - Överför bilderna till normal PBS (0,1 M, pH 7,4) som innehåller inget fixativ. Tvätta skivor med PBS för 3-4 x 5 min varje ta bort någon överflödig fixativ. För gruppen BrdU-märkt Inkubera avsnitten i 2-N HCl under 30 minuter vid 37 ° C, och skölj dem i en 0,1-M Borat buffert (pH 8,4; 10 min). Tvätta sedan skivor 2 x 5 min i PBS.
Obs: Immunfärgning utförs sedan. - Behandla skivor genom inkubation i blockering lösning (1% normala get serum, 3% bovint serumalbumin < BSA >, 0,5% Triton x-100 och 0,02% natriumazid i 1 x PBS) för 1 h i rumstemperatur (RT).
- Inkubera skivor med anti -c-fos polyklonala antikroppar (1: 500, kanin), anti-Notch1 antikropp (1:50, get) eller anti-BrdU antikropp (1:800; råtta) i blockerande lösningen vid 4 ° C över natten.
- Tvätta skivor 3 x i PBS, sedan ruva dem med Alexa Fluor 568-konjugerad anti-kanin (1: 500), Alexa Fluor 488-konjugerad anti Get (1:1, 000), eller Alexa Fluor 488-konjugerad anti råtta (1: 500) sekundära antikroppar för 1 h på RT.
- Tvätta proverna 3 x i PBS (10 min varje gång). Täcka avsnitten immuno-märkt hjärnan använder en anti fade reagens monteringsmedium innehållande DAPI. Låt skivorna lufttorka och förvara dem skyddas från ljus vid 4 ° C.
- Skaffa bilder av hippocampus områden från stimuleras och ostimulerade sidorna av hjärnan med en högupplöst flerkanalsljud (sekventiell) skanning confocal Mikroskop. Ange parametrarna imaging konsekvent mellan kontroll och experimentella grupper.
- Utföra en mosaik bildåtergivning med en hög förstoring mål (20 X air mål, NA 0,45) att förvärva kontinuerlig 3D (XYZ)-bilder av intilliggande fält av beskådar med motoriserad scenen och utnyttja lämplig programvara för att sy dem tillsammans för att göra stora komposit bilder.
Obs: Plattsättning funktioner inkluderar sann sömmar och utjämning alternativ för förbättrad sömlösa bilder. Sammansatta bilder tillagas snabbt och enkelt använda funktionen sömmar, för att bilda en bild över ett stort område. - För c-fos och Notch1 färgning, utföra en positiva kärnor kvantitativ analys av Immunofluorescerande densitet21 sydda bilder. Slumpmässigt väljer 3 områden i de rostralt, dorsala och ventrala Hippocampus GD underregioner och mäta Immunofluorescerande densiteten i en dubbel-blind sätt använder Bild J programvara (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
- För en BrdU märkning, analysera skivor runt den borrning punkten genom dorsala hippocampus (-1,7 mm till -2,7 mm i förhållande till bregma) i en dubbel-blind sätt.
- Räkna endast BrdU-positiv nervceller i GD. Inkludera de celler som liggande inom 2-cells diametrar av granule cellen i räkningen.
Obs: Här räknar utfördes med hjälp av en 40 X air mål. Slumpmässigt, 3-5 sektioner per djur räknades, och räkningarna var i genomsnitt och uttryckt som medel per DG19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter HF-DBS stimulering till Hippocampus GD underregionen direkt eller PP underregionen att aktivera GD indirekt via införas elektroder med hjälp av stereotaktisk justeringarna, gnagare var bedövas med pentobarbital och provtas 3 h efter den sista HF-DBS stimuleringen för c-fos och Notch1 immunfärgning. För BrdU färgningen, 36 h efter den sista BrdU injektionen efter 1 dag eller 5 dagar av HF-DBS stimulering, var gnagare bedövas med pentobarbital för beredning av hjärnan sektioner. Figur 3 visar att uttrycket av c-fos höjdes betydligt i ipsilaterala sidan GD. C-fos uttrycket i den kontralaterala sidan GD var dessutom också uppreglerad jämfört med kontrollerna nr-HF-DBS stimulering som visade nästan inga uttryck för en c-fos -signal. Baserat på de Notch1-specifika Immunofluorescerande färgning i hjärnan skivor, som kompletterande figur1, visat vi ytterligare att den Notch1 signalering kunde också aktiveras i vuxen Hippocampus GD efter HFS stimulering av en induktion av depolarisation av nervceller i PP (se även raw-data levereras som kompletterande fil 1).
Förutom den direkta HF-DBS stimuleringen i GD underregionen, figur 4A visar position och webbplatsen HF-DBS stimulering av elektroden spetsen, som installerades i den mediala PP. figur 4B visade att HF-DBS stimulering i PP inte bara avsevärt ökat c-fos uttrycket i den ipsilaterala sidan GD, men också ökat uttryck av c-fos i den kontralaterala sidan GD jämfört med no-HF-DBS stimulering kontroller.
Baserat på BrdU visat märkning analys av hjärnan skivor, som visas i diagram 5A - 5 C, vi ytterligare att neurogenes kan också aktiveras i vuxen Hippocampus GD efter en kronisk (5 dagar) HF-DBS stimulering i GD direkt. En kronisk HF-DBS-stimulering i GD inte bara avsevärt uppreglerad neurogenes i den ipsilaterala sidan men också ökade neurogenes i den kontralaterala sidan jämfört med kontrollerna nr-HF-DBS stimulering. Dock inte akut (1 dag) stimulering framkalla en uppreglering av neurogenes i ipsilaterala sidan eller i den kontralaterala sidan GD. Som visas i figur 5D, antingen i gruppen akut stimulering eller i gruppen kronisk stimulering kunde en indirekt HF-DBS i PP inte ändra neurogenes i hippocampus GD.
Figur 1 . Schematisk bild av hjärnan målen av elektroden spetsen och parametrar för HFS. (A), neuronala projektionen av mediala perforant sökvägen till en sämre bladet av dentate gyrus är indicerat. Positionen för infogade elektroderna (i lila) för att stimulera antingen GD direkt eller PP underregionen indikeras. (B) parametern HFS är indicerat som 6 serie 6 tåg 6 pulser med 400 Hz, med 100 ms mellan tågen och 20 s mellan serien. CA = den Cornu Ammonis; GD = dentate gyrus; PP = perforant sökvägen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Gränssnitt och parametrar för multistimulator. Den var ansluten till en digital-analog-omvandlare och aktiveras av proprietär programvara. Vilken stimulans HFS var monofasiska. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Neuronal aktivering i GD i svar på HF-DBS-behandlingen direkt. (A) elektrod spetsen (den vita ofyllda rutan) var placerad ovanför regionen GD direkt (AP -2,1/ML ±1.0 / DV +1.8) med eller utan HFS. I denna panel visas immunfärgning av den koronala delen av hjärnan skivor meden c-fos antikropp i kontrollen och HFS grupper. DAPI blå färgning användes för att ange platsen för Hippocampus atomkärnor. Skalstapeln = 100 µm. (B) denna panel visar en kvantitativ analys av immunofluorescens signal tätheten. I ipsilaterala sidan GD, nervceller aktiverades betydligt med ett högt uttryck av c-fos, och c-fos uttrycket i den kontralaterala sidan GD är också relativt ökade jämfört med c-fos uttrycket av kontroll möss utan en HFS-behandling. Innebär ± SEM, envägs ANOVA, F2,24 = 216, P < 0,0001, Bonferroni post hoc test, ***P < 0,001, nnr-sti = 9 (3 skivor från 3 möss), nHFS Contra = 9 (3 skivor/mus från 3 möss), nHFS IPS = 9 (3 skivor/mus från 3 möss). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Neuronal aktivering i GD som svar på HFS i PP underregionen. (A) elektrod spetsen (den vita ofyllda rutan) var placerad i mediala PP på positionen för AP -3,8 ML ±3.0 och DV + 3,0, med eller utan HFS. (B) denna panel visar immunfärgning av den koronala delen av hjärnan skivor meden c-fos antikropp i kontrollen och HFS grupper. DAPI blå färgning användes för att ange platsen för Hippocampus atomkärnor. Skalstapeln = 100 µm. (C), denna panel visar en kvantitativ analys av Immunofluorescerande tätheten. HFS behandling i PP kunde betydligt aktivera ipsilaterala nervceller i GD med ett högt uttryck av c-fos. Uttrycket av c-fos i kontralaterala GD är också relativt ökade jämfört med c-fos uttryck för kontroll möss utan en HFS-behandling. Innebär ± SEM, envägs ANOVA, F2,24 = 189,3, P < 0,0001, Bonferroni post hoc test, ***P < 0,001, nnr-sti = 9 (3 skivor från 3 möss), nHFS Contra = 9 (3 skivor/mus från 3 möss), nHFS IPS = 9 (3 skivor/mus från 3 möss). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Distinkta aktivering av neurogenes i GD svar på HFS i GD och PP respektive. (A) denna panel visar ett experimentella paradigm för HFS behandling och generering av BrdU-märkt prolifererande nervceller i GD. Djuren delades in i en akut och en kronisk grupp. I gruppen akut möss utsattes för en HFS behandling 2 x på dag 5. I gruppen kronisk möss utsattes för en HFS behandling i 5 dagar (från dag 1 till dag 5, 2 x per dag). Sedan injicerades djuren i båda grupperna med BrdU (50 mg/kg, 6 x av 2-timmars intervall) på dag 6. Dag 8, var djuren bedövas och perfusion för beredning av kryostaten sektioner. (B) i denna panel visas de Immunofluorescerande färgning av BrdU (i grönt) post-HF-DBS i GD. (C), en kvantitativ analys av neuronala produktionen indikerade att akut (2 x i 1 dag) stimulering i GD kunde inte förbättra neurogenes, medan den kroniska (10 x inom 5 dagar) stimulering i GD kraftigt uppreglerad neurogenes. Jämfört med kontrollgruppen, antalet BrdU märkning celler ökade avsevärt under det kroniska grupp både i den ipsilaterala och kontralaterala hemisfären. Skalstapeln = 100 µm. medel ± SEM, tvåvägs ANOVA, stimulering typ effekt F2, 14 = 97.09, P < 0,0001, halvklotet effekt F1, 14 = 1.137, P = 0.3044, Bonferroni post hoc test, ***P < 0,001, n Kontroll = 3 (3 skivor från 3 möss), Nilsson1 dag = 4 (4 skivor från 3 möss), n5 dagar = 3 (3 skivor från 3 möss). (D) i denna panel visas immunofluorescens färgningen BrdU (i grönt) post-HF-DBS i PP underregionen. (E) A kvantitativ analys av neuronala produktion anges som antingen akut (två gånger på en dag) eller kronisk (10 x i 5 dagar) stimulering i PP kunde inte förbättra neurogenes betydligt. Antalet BrdU märkning celler var relativt stabilt med eller utan HFS behandling. Skalstapeln = 100 µm. medel ± SEM, tvåvägs ANOVA, stimulering typ effekt F2, 16 = 0.9025, P = 0.4252, halvklotet effekt F1, 16 = 1.402, P = 0.2537, Bonferroni post hoc test, P > 0,05, n Kontroll = 3 (3 skivor från 3 möss), Nilsson1 dag = 3 (3 skivor från 3 möss), n5 dagar = 5 (5 skivor från 3 möss). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1. Uttryck för Notch1 i GD i HF-DBS behandlingssvaret. (A) i denna panel visas de Immunofluorescerande färgning av Notch1 (i grönt) 3 h efter HF-DBS i GD. Denna siffra var ovan och modifierad från Fengs rapport21. (B) en kvantitativ analys av fluorescensen anges att HFS i GD skulle kunna öka uttrycket av Notch1. Skalstapeln = 100 µm. medel ± SEM, student t-test, t = 12, ***P < 0,001, nnr-sti = 9 (3 skivor/mus från 3 möss), nHFS = 9 (3 skivor/mus från 3 möss). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1. Rådata. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HF-DBS tekniken har använts som ett kraftfullt verktyg för behandling av många neurologiska sjukdomar sedan 1990-talet. Hittills, är landmark arbete HF-DBS för behandling av Parkinsons sjukdom och essentiell tremor, som har rönt mycket uppmärksamhet och intresse både på klinik och forskarsamhället. Det finns olika typer av pågående HF-DBS studier av många grupper för HF-DBSS terapeutisk tillämpning i vissa neurologiska och psykiatriska störningar32,33. Några av dessa studier är för närvarande i olika stadier av kliniska prövningar2,34. Även om HF-DBS bör medföra betydande fördelar, stimulering biverkningar kan inträffa även med en perfekt placering i hjärnan, såsom negativa förändringar i humör och tänkande, etc., som är vändbar och kan undvikas med ändringar av den inställningar för stimulering.
Utöver de betydande framsteg av HF-DBS teknik ackumulerats i kliniska studier under de senaste decennierna, presenterar studier av HF-DBS i levande djur också möjlighet att förstå de fysiologiska förändringarna och neurobiologiska mekanismer som framkallas genom elektrisk stimulering. I detta manuskript, har vi beskrivit en modifierad HF-DBS-metod utförs i möss att stimulera Hippocampus GD underregionen med ett HFS direkt eller indirekt. Även om protokollet beskrivs utförs på gnagare, HFS svar studier har också framgångsrikt genomförts i andra modellorganismer, inklusive svin35. För den här tekniken kan stereotaktisk kirurgi också användas för en potentiell nucleus-riktad stimulering för att testa effekten av de HFS använder vissa djurmodeller med neurologiska och psykiska störningar. Slutsatserna från sådana studier bör lätt översätta till kliniken, speciellt för förfining av HFS på befintliga mål. Observera att i motsats till serien av flera exponeringar av HF-DBS i kliniken, i denna metodologiska studie valde vi en enda, kortvarig exponering av HFS att stimulera och framkalla den neuronala aktiviteten i hippocampus GD, parameter och en del av paradigm för HFS som tidigare rapporterats inducera LTP i hippocampus skivor21,28.
Allmänna begränsningar av HF-DBS har varit utförligt recenserade någon annanstans24,25. En av utmaningarna för experimentet här är också behovet av en utmärkt operationsteknik och för den pågående vård av kirurgiska anatomiska locus. För att korrekt och precist implantatet elektroden i målet kärnan för stimulering, är en av de viktigaste processerna en lyckad operation av en kvalificerad tekniker för att undvika onödiga blodkärl skador och felplacering av elektroden. Dessutom behövs ytterligare anatomiska och histologiska analys av hjärnan preparatet också bekräfta att korrekt rikta elektroden efter ett HFS. Detta är också en av fördelarna med detta tillvägagångssätt, att tydligt visa korrigerade inriktningen av elektroden efter operationen i en intakt djurens hjärna. Många av de uppgifter som anges i detta protokoll kan lätt anpassas för en långvarig stimulering via en inopererad stimulator i djuret. Det bör noteras att det också är mottagliga för alternativa stimulering parametrar i potentiella terapeutiska hjärnan mål med olika HFS leverans mönster. Denna artikel rapporterade dock på en enstaka akut HFS levereras av en programmerbar stimulator enhet att förstå de cellulära förändringarna efter elektrisk stimulering.
Även om HF-DBS fungerar som ett alternativ för behandling av neurologiska och psykiatriska sjukdomar i kliniken under flera år, fortfarande mekanismerna bakom dess effektivitet dåligt förstådd. Med tanke på användning och framtida förbättringar av HF-DBS krävs ett mer pragmatiskt synsätt. Som ett verktyg för utveckling behöver HFS tekniken ytterligare teknisk innovation och mekanistiska upptäckten. För att studera de cellulära och molekylära mekanismerna för HF-DBS, kommer att en global transkriptom analys baserat på hög genomströmning sekvensering teknik ge viktig information för att förstå de molekylära händelser och signalering förändringar efter en HF-DBS induktion 36. Utöver den opartiska screening strategi, baserad på undersökning av befintliga molekylära kandidater som har visat sig svara på neuronal depolarisation, kommer det förmodligen också ge viktiga ledtrådar för att identifiera de viktigaste effektorer ansvarig för HFS med. C-fos är uppreglerad svar på inneboende neuronal aktivitet, så tittar på dess uttryck skulle åtminstone ge oss ett landskap av nervceller nyligen sparken37. Dock bör c-fos inte bara vara för att bara reflektera aktiviteter eftersom det verkar också markera nervceller som genomgår LTP37. Tidigare verk, däribland vår, har visat att Notch1 spelar en avgörande roll i synaptisk plasticitet i mogen Hippocampus nervceller och är viktigt för adult neurogenes i vivo21,22. När det gäller denna situation, en detaljerad kvantitativ och spatiotemporal lokalisering av nyckel kandidater bör noggrant kännetecknas och beskrivs pre och post-HFS induktion av en immunhistokemisk analys av c-fos uttrycket. Studier som denna kommer att ge direkta bevis för att påvisa förändringarna av gen uttrycksmönster i olika regioner i hjärnan som svar på en HFS21, som också kommer att vara till nytta att avslöja de cellulära förändringarna såsom neuronal aktivering, neurogenes eller neurodegeneration.
Det bör också noteras att trots fördelarna med ett HF-DBS program i kliniken, på grund av att resultaten av stimulering effekten är tätt förknippade med parametrarna stimulering och rikta läge i hjärnan, cellulära och molekylära mekanismerna bakom HFSS effekter kan vara mycket komplicerat. I denna studie genomförde vi ytterligare BrdU märkning för att undersöka HFS akuta och kroniska effekter på adult neurogenes. Även om BrdU färgning kan vara en markör för både neurogenes och gliogenesis, baserat på tidigare rapporter, majoriteten av ökad BrdU positiva nervceller observerades vid SGZ efter en HF-DBS-behandling bör proliferativa vuxen neurala föräldraparets21 , 38 , 39. oavsett komplexiteten i mekanismerna bakom HFS behandling, metoder och resultat som vi beskrivit i detta manuskript ge direkta bevis att repetitiva högfrekvent elektrisk stimulering för att aktivera Hippocampus GD kunde betydligt framkalla aktivering av neuronal aktivitet och neurogenes i vivo.
Sammanfattningsvis visade vi att en HF-DBS kan förbättra neuronal aktivitet och neurogenes hos möss, jämfört med neuronal aktivitet och neurogenes kontroll möss som inte genomgick en HF-DBS. Detta kan avancera vetenskapliga förståelsen om kognitiva effekter och stimulering mallning av HFS i vivo. Identifiering av neuronal aktivering efter en akut HF-DBS behandling direkt eller indirekt i vivo visar att en HFS-behandling har betydande effekter på synaptisk överföring av lokala och långväga anslutningar. Snabb induktion av neuronal aktivering efter en HF-DBS-behandling ger ett kraftfullt verktyg för att manipulera den nedsatt synaptisk transmissionen eller desynchronization i många neurologiska och psykiatriska sjukdomar såsom MDD. Däremot, tyder induktion av neurogenes efter en kronisk och direkt, men inte akut eller indirekt HF-DBS-behandling på olika effekt och funktionella variabilitet mellan olika elektrisk stimulering seder. Sådana slutsatser ge direkta bevis för de neurala modulering och potentiella terapeutiska fördelarna med HFS i framtiden. Sammantaget presenterar HF-DBS betydande fördelar för behandling av neurologiska och psykiatriska störningar genom att integrera tekniska framstegen inom kliniken och mekanistiska framstegen i laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att deklarera.
Acknowledgments
Stöds av National Natural Science Foundation av Kina bidrag 31522029, 31770929 och 31371149 (till Haitao Wu), programmera 973 (2014CB542203) från det statliga Key Development programmet för grundforskning av Kina (till Haitao Wu) och Grant Z161100000216154 från den Beijing Municipal vetenskap och teknik kommissionen (till Haitao Wu). Författarna vill tacka alla medlemmar för Haitao Wu laboratoriet för deras uppmuntran och diskussioner. Författarna är ytterst tacksamma för Zhenwei Liu för hans hjälp med felsökning av apparaten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
References
- Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Kohl, S., et al. Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review. BMC Psychiatry. 14, 214 (2014).
- Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression. Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).
- Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).
- Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).
- Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation for Parkinson's disease and other movement disorders. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).
- Garcia, L., D'Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. High-frequency stimulation in Parkinson's disease: more or less. Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).
- Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats. Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).
- Grubert, C., et al. Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation. The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).
- Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).
- McIntyre, C. C., Hahn, P. J. Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation. Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).
- Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. Sing the mind electric - principles of deep brain stimulation. European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).
- Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).
- Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (97), e52457 (2015).
- Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5 26-41 (2008).
- Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression. Behavioral and Brain Functions. 6, 35 (2010).
- Feng, S., et al. Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment. The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).
- Alberi, L., et al. Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks. Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).
- Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. A step-wise approach to deep brain stimulation in mice. Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).
- Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration. Journal of Visualized Experiments. (107), e53266 (2016).
- Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation. Journal of Visualized Experiments. (104), e53066 (2015).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6 (2007).
- McHugh, T. J., et al. Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network. Science. 317 (5834), 94-99 (2007).
- Gonzalez, C., et al. Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories. Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tse, N., et al. The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (94), e52220 (2014).
- Pizzolato, G., Mandat, T. Deep brain stimulation for movement disorders. Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2 (2012).
- Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).
- Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).
- Min, H. K., et al. Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals. NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).
- Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. 2015 (11), Cold Spring Harbor Protocols. 951-969 (2015).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Frontiers in Neural Circuits. 8, 37 (2014).
- Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).
- Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
