Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En invasiv metode for aktivering av musen Dentate Gyrus av høyfrekvente stimulering

Published: June 2, 2018 doi: 10.3791/57857
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Neurobiology, Beijing Institute of Basic Medical Sciences, 2Key Laboratory of Neuroregeneration, Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University

Summary

Denne protokollen viser hvordan du setter opp en pålitelig HFS metode i mus. Nerveceller i hele den hippocampus dentate gyrus stimulert elektrisk av HFS direkte og indirekte i vivo. Neuronal aktivitet og molekylære signalene er undersøkt av c-fos og Notch1 immunofluorescent flekker, henholdsvis; neurogenesis er kvantifisert ved bromodeoxyuridine merking analysen.

Abstract

Elektrisk høyfrekvente stimulering (HFS), bruke implanterte elektroder målretting ulike områder av hjernen, har vist seg som en effektiv behandling for ulike nevrologiske og psykiske lidelser. HFS i dyp regionen av hjernen, også kalt dyp hjernestimulasjon (DBS), blir stadig viktigere i kliniske forsøk. Framskritt innen høyfrekvente DBS (HF-DBS) kirurgi har begynt å spre muligheten for å utnytte denne invasiv teknikken til andre situasjoner, for eksempel behandling for store depresjonen lidelse (MDD), Tvangslidelser (OCD), og så på.

Til tross for disse voksende indikasjoner forblir de underliggende mekanismene for de gunstige virkningene av HF-DBS gåtefull. For å løse dette spørsmålet, er en tilnærming å bruke implanterte elektroder tynt aktivere distribuert subpopulasjoner av neurons ved HFS. Det har blitt rapportert at HFS i fremre kjernen av thalamus kan brukes for behandling av ildfaste epilepsi i klinikken. De underliggende mekanismene kan være knyttet til økt neurogenesis og forandret neuronal aktivitet. Derfor er vi interessert i å utforske de fysiologiske endringene av gjenkjenning av neuronal aktivitet samt neurogenesis i musen dentate gyrus (DG) før og etter HFS behandling.

I dette manuskriptet beskriver vi metoder for HFS målrette aktivering av DG i mus, direkte eller indirekte og i en akutt eller kronisk måte. I tillegg beskriver vi en detaljert protokoll forberedelse til hjernen skiver for c-fos og Notch1 immunofluorescent flekker for å overvåke neuronal aktiviteten og signalering aktivisering og bromodeoxyuridine (BrdU) for å avgjøre den neurogenesis etter HF-DBS induksjon. Aktivering av neuronal aktivitet og neurogenesis behandlingen HF-DBS gir direkte nevrobiologiske bevis og potensielle terapeutiske fordelene. Spesielt kan denne metodikken endres og brukes til å målrette andre områder av interessert hjernen som det basal Ganglion og subthalamicus områder for spesifikke hjernens lidelser i klinikken.

Introduction

HF-DBS er en neurosurgical teknologi for elektrisk stimulering i hjernen, som er utviklet siden 1870-tallet1. I slutten av 1980, HFS ble først brukt som en potensiell terapeutisk intervensjon for Parkinsons sykdom og andre bevegelser lidelser2. I de siste tiårene, har HF-DBS vært mer mye brukt i behandlingen av hjernen lidelser som er for tiden botemiddel ved en tradisjonell terapeutiske strategi. Spesielt på grunn av nøyaktighet forbedring av HFS elektroden, effektive resultater og minimale bivirkninger, hjernen lidelser behandlet av HF-DBS har betydelig økt siste tiårene3,4, 5. For eksempel er HF-DBS godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for behandling av Parkinson's sykdom, Alzheimers type demens, viktig tremor og andre typer bevegelse lidelser2,6, 7. i PD pasienter, dopaminergic medisiner er redusert opptil 50% under HF-DBS8. I tillegg til vellykket behandling av bevegelsesforstyrrelser, har HF-DBS også vist sin kraftig effekt i behandling av psykiske lidelser i klinikken og kognitive augmentation som vel2,9, 10 , 11. det bør bemerkes at forskning HFS for behandling av andre psykiske lidelser er i ulike stadier, tilbyr mye løfte til pasienter12.

Selv om mange studier har vist at en fokal HFS har både lokale og eksterne effekter i hele hjernen13, forblir nevrologiske og molekylære mekanismer for effektene unnvikende2,14. I klinikken brukes terapeutiske HF-DBS vanligvis på en langsiktig måte for behandling av Parkinsons sykdom og kronisk smerte, etc. mange meninger er oppdratt til å forklare forbedring generert av en HF-DBS behandling, som en mulighet at HFS gjeldende modulerer nevrale nettverk aktiviteten, sannsynligvis av en repeterende depolarization av axons i implantert HFS elektroden. Eller HF-DBS endres utslipp frekvensen av utdata neurons og de beregnede målene. Også HF-DBS kan føre til langsiktige synaptic endringer, inkludert langsiktige potensiering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD), som kan bidra til en symptomatisk forbedring. Så langt det er fortsatt uklart om HFS influences nøkkel molekylære hendelsene som regulere cellular prosesser slik som voksen neurogenesis i vivo. Flere linjer av studier har vist at HFS i gnagere kunne gjengi lignende nevrale svar klinisk anvendt DBS15,16. For å forstå de underliggende cellulære mekanismene av HF-DBS, i denne studien definere vi først en i vivo HFS metodikk i mus i akutt (en dag) eller kronisk (fem dager) måte. Dernest satt vi opp en aktivisering analyse-metodikken å bestemme endring av neuronal aktivitet og neurogenesis etter en HF-DBS levering.

Gitt at neuronal produksjonen fra nevrale stamceller er rikelig under embryonale utviklingen, men fortsetter hele voksenlivet, er hippocampus subgranular sonen en av de viktigste områdene hvor neurogenesis oppstår. Prosessen med neurogenesis påvirkes av mange fysiologiske og patologiske faktorer. I enkelte epileptiske tilfeller er hippocampus neurogenesis dramatisk redusert17,18. I tillegg kan en enkelt Elektrosjokkterapi betydelig øke neuronal produksjonen i dentate gyrus19. Disse observasjonene foreslår at elektrofysiologiske aktiviteten spiller en avgjørende rolle i regulering av voksen neurogenesis og synaptiske plastisitet i hippocampus neurons. Derfor, for å ytterligere vise effekten av HF-DBS på neuronal aktivitet og neurogenesis, vi først gjennomføre immunostai-analysen av den umiddelbare tidlig genet (IEG) c-fos som er en velkjent kortsiktige neuronal aktivitet skyldes Opplev20. Notch1 signalering registreres også overvåke signalnettverk aktivering etter at HFS levering21,22. Dessuten, vi også merker neuronal produksjonen av en BrdU merking analyse etter HF-DBS induksjon på ulike måter, om BrdU flekker kan også være en markør for gliogenesis.

Studien er to HFS metoder tilpasset å målrette aktivering av hippocampus DG direkte og indirekte. Elektroden er implantert inn i DG direkte eller implantert i mediale perforant banen (PP) som sender anslag aktivere DG neurons. For HF-DBS induksjon presenteres en programmerbar stimulator for en kontinuerlig stimulering via fast elektroden på mus hodet. For å fastslå effekten av HFS på neuronal aktivisering og neurogenesis, vi oppdager uttrykk for c-fos og Notch1 av immunofluorescent flekker og antall BrdU-innlemmet positiv nevroner i hippocampus DG regionen, henholdsvis etter HFS behandling. Spesielt sammenlignes effekten av HF-DBS på neurogenesis i DG mellom en akutt og en kronisk stimulering måte, eller mellom en direkte og en indirekte stimulering måte, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyr eksperimentelle prosedyrer fulgte institusjonelle retningslinjene i Beijing Institutt for medisinske basalfag (Beijing, Kina) og de kinesiske myndighetenes forskriftene og bruk av forsøksdyr. Mus (voksen hann, 26 ~ 30 g) ble plassert og holdt på en konstant temperatur på 23 ° C, med vann og mat ad libitum, under en 12-h lys/12-h mørke syklus (lys på på 7:00). Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført under lyset syklus.

1. kirurgisk forberedelse

Merk: En egendefinert elektrode var hjemmelaget med metoden endret fra Halperns rapport23.

  1. Bruk 2 kobber mikro-ledninger (med en ytre diameter på 200 µm) som parallell bipolar elektroden. Pakk elektrodene rundt hverandre for å danne sylindriske elektroder stimulering.
    Merk: Her, hvor elektrode i enten PP eller DG var variert ifølge anatomiske dybden av kjernen.
  2. Sterilisere elektrodene bruker en etylen oksid desinfisering cabinet. Behandle og lagre hjemmelaget 2-kanals mikro-wire elektrodene uten noen forurensning. Elektrodene bør strengt steriliseres før noen kirurgiske implantasjon.
  3. Autoclave Kirurgiske instrumenter.
  4. Før kirurgi, injisere musen med pentobarbital (20-50 mg/kg) intraperitoneally, for å oppnå et kirurgisk fly av anestesi.
  5. Sette inn musen et sterilt penicillin G procaine suspensjon (75.000 U, im) og et smertestillende middel (carprofen, 0,05 - 1 mg/kg, SC) å redusere risikoen for infeksjon og smerte, henholdsvis24.
  6. Bruke en øye smøremiddel begge øynene å hindre øye tørrhet bedøvelsen dyr. Sikre induksjon av beroligende og dybden av bedøvelsen ved dyrets reflekser i reaksjon på tå klemming og fortsette operasjonen bare når ingen respons skjer.
    Merk: Vet salve er et alternativ å hindre øye tørrhet.
  7. Barbere mesteparten av pelsen på mus hodet med elektrisk hårklippere eller et barberblad, sterilisere barberte området med tre vekslende scrubs 70% alkohol og betadine løsning og fortsette operasjonen etter betadine har tørket på huden.

2. høy frekvens stimulering kirurgi25,26

Merk: I dette trinnet en elektrode er ensidig implantert i dorsal DG eller mediale PP området, en del av hippocampus med avgjørende roller i episodisk læring og hukommelse.

  1. Plass bedøvet musen stereotactic rammen. For å holde musen er hodet immobile, rett øret barer skikkelig og installere dem raskt. Forsiktig stram øret linjene slik at de støtter sentrert hodet og sikre musen litt.
  2. Bruke en termostatstyrt pute for å vedlikeholde dyrets kroppstemperatur på 37 ± 0,5 ° C.
  3. Bruk tang til å forstå huden anterior mus ører og kutt den med sterilisert saks fjerne om 1 cm2 område av huden på musen er skallen.
    Merk: En liten mengde blødning kan observeres langs kantene på kutt huden.
  4. Fjern muskelen og andre vedlegg overliggende skallen med en bomull swab å utsette skallen overflaten. Bruk en bomullspinne og dissecting meisel for å rengjøre alle periosteum, sener og bindevev fra skallen overflate helt til å identifisere den sagittal og lambda suturer linjer.
  5. Identifisere bregma og lambda punkt. Skjæringspunktet mellom det Koronal suture og det sagittal suture på overlegen midtre delen av calvaria er der bregma er plassert. Skjæringspunktet mellom den lambdoid Sutur av det sagittal suture er der lambda er synlig. Bruk av bregma som det opprinnelige punktet angi andre kjernen posisjonen.
  6. Etter identifisering av bregma og lambda posisjon på skallen justere disse to punktene i horisontalt nivå. Kontroller at høyden på disse to punktene er nesten det samme i dorsal ventrale retning (feil skal være < 0.05 mm). Kontroller også at skallen er nivå i mediale-lateral retning i den samme måte26.
  7. For en ensidig kirurgi, montere en hjemmelaget 2-kanals kobber mikro-wire elektrode i den roterende elektrodeholderen på stereotactic kirurgisk rammen.
  8. Plasser elektroden vertikalt over bregma punktet først, og angi det som opprinnelige området. Bruk digitalt vises stereotactic kirurgisk ramme for å angi den anterior-posterior (AP), mediale-lateral (ML), og dorso-ventrale (DV) posisjoner.
    Merk: For å forhindre elektroden får bøyd, ikke berør elektrode spissen på skallen under operasjonen.
  9. Varsomt elektroden til riktig posisjon (figur 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 for DG og AP-3.8/ML ± 3.0 for PP, henholdsvis)27 over skallen uten noen touch. Når ønsket område ble identifisert for elektrode innsetting, bruk dorsoventral stereotactic justeringene til høyere elektroder holderen, og markere posisjonen med en svart markør.
    Merk: Den nøyaktige plasseringen i referanse til stereotaxic koordinatene kan variere fra musen belastning, vekt og kjønn. Voksen mus av samme kjønn skal brukes til å minimere alle variasjoner i stedet. Hvis mulig, bør pre-operasjonelle anatomiske skanner brukes til å identifisere plasseringen på en enkelt emne basis27.
  10. Bruke en håndholdt micromanipulator-assistert drill (burr størrelse = 0,5 mm) å gjøre burr hull i merket posisjon nøyaktig. Sterilisere spissen av burr med 70% etanol før boring. Flytt opp mini borekronen gjennom skallen langs z-aksen 0,8 - 1.0 mm uten å endre sin X-og Y-posisjon. Bruk en steril bomull stoppe blødninger under operasjonen.
    Merk: Hvis du vil unngå over boring og overdreven varme etter boring, kontroller boring hastigheten er 15,000-18,000 omdreininger per minutt (RPM), og ofte trekke borekronen fra burr hull hver 8-10-s.
  11. Holde bore inntil dura er utsatt. Bruk en bøyd nål for å fjerne noen bein utklipp som genereres under boring og gjøre et pinhole på dura uten å skade det underliggende myk hjernevevet.
    Merk: For å unngå skade hjernevev, bøyd sløv nålen kan også erstattes med en fin sløv tang.
  12. For å bekrefte at burr hullene er gjort riktig på ønsket plassering, redusere elektrode høyden av en justering av stereotactic kirurgi rammen og sikre at elektroden kan settes jevnt gjennom burr hullet uten å berøre noen hindringer. Hvis så, sakte inn elektrodene til en dybde på 1,8 mm for DG (eller 3.0 mm for PP) fra overflaten av skallen på medial PP til DG (PP-DG).
    Merk: Tørke av eventuelle Cerebrospinalvæske eller blod avgang fra burr hullene med steril bomull under av elektroden implantation.
  13. Etter setter inn den mikro-wire elektroden i skallen hullet, hold den på plass med tilstrekkelig dental sement ved hjelp av en liten spatel. Som sement tykner, mold den rundt innsatte elektrode og skruer å danne en fin jevn caps. Debride og desinfisere sår kantene.
  14. Frigjøre elektroden fra elektrodeholderen. Fjern musen fra stereotactic rammen og returnere det til en varm bur.
    Merk: Etter kirurgi, vente med tilbake dyrene til deres burene før de er helt friske av bedøvelsen med tilstrekkelig bevissthet.
  15. La musen flytte fritt og tillate den å gjenopprette i 2 dager i buret. Deretter kobler elektroden implantert i musen hjernen til en programmerbar stimulator via fører. Konfigurere programvaregrensesnitt som presenteres i figur 2. Angi parameterne HFS som 6-serie 6 tog 6 pulser på 400 Hz (figur 1B, 100 ms mellom togene, 20 s mellom serier)28. Angi stimulering intensiteten til 200 μA.
  16. Lever et HFS for den ønskede perioden som sett opp. Levere stimulering 2 x en dag klokken 8:00 og 20:00:00
  17. For kontrollgruppen, implantatet elektrodene i mus og utfører ikke en stimulering.
  18. For c-fos farging, stimulere eksperimentelle musene akutt (2 x per dag). For BrdU merking, dele de eksperimentelle mus i en akutt stimulering gruppe (brukt 2 x per dag) og en kronisk stimulering gruppe (brukt 10 x 5 dager, 2 x per dag). I løpet av stimulering, kontroller at musen er våken. Husk å sikre fører ikke blir vridd.
    Merk: På den siste dagen av prosedyren, musene i gruppen akutt stimulering var stimulert samtidig.
  19. Når stimulering er gjort, nøye koble elektrode pin fra elektrodeholderen og koblingen av innspillingen.

3. immunofluorescence flekker og Bromodeoxyuridine merking29

  1. For c-fos og Notch1 flekker, bedøve ca 3 timer etter siste HF-DBS stimulering, mus ved å injisere pentobarbital (20-50 mg/kg, IP) for å oppnå et kirurgisk fly av anestesi.
  2. For BrdU merking, ca 12t etter siste HF-DBS stimulering, gi 6 injeksjoner av BrdU kontroll og stimulert mus med 2-h mellomrom (50 mg/kg i 0,9% saltvann, IP). 36 h etter siste injeksjon, bedøve mus ved å injisere pentobarbital (20-50 mg/kg, IP) for å oppnå et kirurgisk fly.
  3. Lage snitt ved hjelp av en skalpell gjennom ribbe buret å avsløre hjertet og sende en 22-måle stump perfusjon nål til venstre ventrikkel. Lag et lite innsnitt i høyre atriet. Transcardially perfuse det med 50 mL kaldt fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) etterfulgt av 50 mL kaldt 4% paraformaldehyde (PFA) i 1 x PBS (pH 7.4).
    Merk: Slå PBS til PFA når den musen blod i vivo er erstattet og væsken går klart. En god perfusjon kan bedømmes av clearing av leveren. Perfusjonen bør stoppes når fiksering rystelser er observert30.
  4. Halshugge musen med ophthalmica saks, gjør et snitt på huden og utsette skallen. Bruke pinsett, chip av skallen litt og nøye analysere hele musen hjernen. Post-fix hjernen i 4% paraformaldehyde for ytterligere 2 dager og overføre den til en 30% sukrose løsning på 4 ° C over natten.
  5. Bruker en kryostaten, kutt hjernen i 20-µm framskaffet. Overføre og montere delene til glass lysbilde med pensel og lagre dem på 20 ° C.
    Merk: Dyr med elektroden misplacements eller overdreven mekanisk skade utelukkes fra påfølgende analyse.
  6. Overføre lysbildene til normal PBS (0.1 M, pH 7.4) inneholder ingen bindemiddel. Vask skiver med PBS 3-4 x i 5 min hver fjerne alle overflødig bindemiddel. Gruppen BrdU-merket ruge avsnittene i 2-N HCl i 30 min på 37 ° C og skyll i en 0.1-M borate buffer (pH 8.4; 10 min). Deretter vaske skiver 2 x i 5 min på PBS.
    Merk: Immunostaining deretter utføres.
  7. Behandle skiver av inkubasjon i blokkering løsning (1% normal geit serum, 3% bovin serum albumin < BSA >, 0,5% Triton X-100 og 0.02% Natriumazid i 1 x PBS) 1t ved romtemperatur (RT).
  8. Inkuber skiver med anti -c-fos polyklonale antistoff (1:500, kanin), anti-Notch1 antistoff (1:50, geit) eller anti-BrdU antistoff (1:800, rotten) i blokkering løsningen på 4 ° C over natten.
  9. Vask skiver 3 x i PBS, deretter ruge dem med Alexa Fluor 568-konjugerte anti-kanin (1:500), Alexa Fluor 488-konjugerte anti-geit (1:1, 000), eller Alexa Fluor 488-konjugerte anti-rotte (1:500) sekundære antistoff 1t på RT.
  10. Vask prøvene 3 x i PBS (10 min hver gang). Dekk delene immuno-merket hjernen ved hjelp av en anti-fade reagens montering medium som inneholder DAPI. La skiver air-dry og lagre dem beskyttet mot lys i 4 ° C.
  11. Hente bilder av hippocampus områder fra stimulert og unstimulated sidene av hjernen med en høy oppløsning flerkanals (sekvensiell) skanning AC confocal mikroskop. Angi parameterne tenkelig konsekvent mellom kontrollen og eksperimentelle grupper.
  12. Utføre en mosaikk bildevisning en høy forstørrelse målsetting (20 X air mål, NA 0.45) å skaffe sammenhengende 3D (XYZ) bilder av tilstøtende synsfelt bruke motoriserte scenen og bruke riktig programvare for å sy dem sammen for å gjøre store kompositt bilder.
    Merk: Flislegging funksjoner inkluderer ekte sømmer og utjevning alternativer for forbedret sømløs bilder. Sammensatte bilder lages raskt og enkelt av funksjonen søm, danner et bilde over et stort område.
  13. C-fos og Notch1 flekker, utføre en positiv kjerner kvantitativ analyse av immunofluorescent tetthet21 sydd bilder. Tilfeldig velge 3 områder i rostral, rygg og ventrale hippocampus DG underregionene og måle immunofluorescent tetthet på en dobbel-blindet måte ved hjelp av Image J programvare (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
  14. For en BrdU merking, analysere skiver rundt boring punktet gjennom dorsal hippocampus (-1.7 mm-2.7 mm i forhold til bregma) på en dobbel-blindet måte.
  15. Tell bare BrdU-positive nerveceller i DG. Ta med cellene ligger i 2-celle diameter granule cellen i opptellingen.
    Merk: Her, teller det ble utført en 40 X air mål. Tilfeldig, 3-5 deler per dyr ble regnet, og teller var gjennomsnitt og uttrykt som betyr per DG19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HF-DBS stimulering hippocampus DG subregion direkte eller PP subregion å aktivere DG indirekte via inn elektroder bruker stereotactic justeringene, gnagere var anesthetized med pentobarbital og samplet 3t etter siste HF-DBS stimulering for c-fos og immunostai-Notch1. For BrdU farging, 36 h etter siste BrdU injeksjon etter 1 dag eller 5 dager med HF-DBS stimulering, var gnagere anesthetized med pentobarbital for utarbeidelse av hjernen deler. Figur 3 viser at uttrykket av c-fos betydelig økt i ipsilateral siden av DG. I tillegg var c-fos uttrykket i kontralateral siden av DG også upregulated sammenlignet med no-HF-DBS stimulering kontrollene som viste nesten ingen uttrykk for et c-fos -signal. Basert på Notch1-spesifikke immunofluorescent flekker i hjernen skiver, som vist i supplerende figur 1, demonstrert vi ytterligere at Notch1 signalene kan også aktiveres i den voksne hippocampus DG etter HFS stimulering av en induksjon av depolarization av nerveceller i PP (også se rådataene som supplerende fil 1).

I tillegg til direkte HF-DBS stimulering i DG subregion, Figur 4A viser posisjonen og HF-DBS stimulering nettstedet av elektroden spissen, som ble installert i den mediale PP. Figur 4B vist at HF-DBS stimulering i PP ikke bare betydelig økt nivået i c-fos uttrykket i ipsilateral siden av DG, men også økt uttrykk for c-fos i kontralateral siden av DG sammenlignet med no-HF-DBS stimulering Kontroller.

Basert på BrdU demonstrert merking analyse av hjernen sektorene, som vist i tall 5A - 5 C, vi ytterligere at neurogenesis kan også aktiveres i den voksne hippocampus DG etter en kronisk (5 dager) HF-DBS stimulering i DG direkte. En kronisk HF-DBS stimulering i DG ikke bare vesentlig upregulated neurogenesis i den ipsilateral side men også økt neurogenesis i kontralateral siden sammenlignet med no-HF-DBS stimulering kontrollene. Akutt (1 dag) stimulering mislyktes imidlertid å indusere en oppregulering av neurogenesis i ipsilateral side eller kontralateral side av DG. Som vist i figur 5D, i gruppen akutt stimulering eller gruppen kronisk stimulering kan en indirekte HF-DBS i PP ikke endre neurogenesis nivået i hippocampus DG.

Figure 1
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av hjerne målene elektrode tips og parametere for HFS. (A) neuronal projeksjon av medialt perforant vei til en mindreverdig blad av dentate gyrus er angitt. Plasseringen av innsatte elektrodene (i lilla) for å stimulere DG direkte eller PP subregion er angitt. (B) parameteren HFS er angitt som 6-serie 6 tog 6 pulser på 400 Hz, med 100 ms mellom tog og 20 s mellom serier. CA = Cornu Ammonis; DG = dentate gyrus; PP = perforant banen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Grensesnittet og parameterne for multistimulator. Stimulator var koblet til en analog-digital omformer og aktivert av proprietær programvare. Stimulans typen HFS var monophasic. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Neuronal aktivering i DG svar på HF-DBS behandling direkte. (A) elektroden spissen (hvit ufylte boksen) ble plassert over regionen DG direkte (AP-2.1/ML ±1.0 / DV +1.8) med eller uten HFS. Dette panelet viser immunostaining koronale delen av hjernen skiver meden c-fos antistoff i kontrollen og HFS gruppene. DAPI blå flekker ble brukt til å indikere plasseringen av hippocampus kjerner. Baren skala = 100 µm. (B) dette panelet viser en kvantitativ analyse av immunofluorescence signal tetthet. Den ipsilateral siden av DG, neurons var betydelig aktivert med en høy uttrykk for c-fosog c-fos uttrykket i kontralateral siden av DG økes også relativt i forhold til c-fos uttrykk for kontroll mus uten en HFS behandling. Betyr ± SEM, enveis ANOVA, F2,24 = 216, P < 0,0001, Bonferroni innlegget hoc teste ***P < 0,001, n forNei-sti = 9 (3 skiver fra 3 mus), nHFS Contra = 9 (3 skiver/mus fra 3 mus), nHFS IPS = 9 (3 skiver/mus fra 3 mus). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Neuronal aktivering i DG svar til HFS i PP subregion. (A) elektroden spissen (hvit ufylte boksen) ble plassert i den mediale PP ved AP-3.8 ML ±3.0 og DV +3.0, med eller uten HFS. (B) dette panelet viser immunostaining koronale delen av hjernen skiver meden c-fos antistoff i kontrollen og HFS gruppene. DAPI blå flekker ble brukt til å indikere plasseringen av hippocampus kjerner. Baren skala = 100 µm. (C) dette panelet viser en kvantitativ analyse av immunofluorescent tetthet. HFS behandling i PP kan betydelig aktivere ipsilateral nerveceller i DG med en høy uttrykk for c-fos. Uttrykk for c-fos i den kontralateral DG økes også relativt i forhold til c-fos uttrykket av kontroll mus uten en HFS behandling. Betyr ± SEM, enveis ANOVA, F2,24 = 189.3, P < 0,0001, Bonferroni innlegget hoc teste ***P < 0,001, n forNei-sti = 9 (3 skiver fra 3 mus), nHFS Contra = 9 (3 skiver/mus fra 3 mus), nHFS IPS = 9 (3 skiver/mus fra 3 mus). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Forskjellige aktivering av neurogenesis i DG svar HFS i DG og PP henholdsvis. (A) dette panelet viser en eksperimentell paradigme for HFS behandling og generering av BrdU-merket voksende nerveceller i DG. Dyrene ble delt inn i en akutt og kronisk gruppe. I gruppen akutt musene ble utsatt for en HFS behandling 2 x på dag 5. I gruppen kronisk musene ble utsatt for en HFS behandling for 5 dager (fra dag 1 dag 5, 2 x per dag). Deretter ble dyrene i begge grupper injisert med BrdU (50 mg/kg, 6 x etter 2-h intervaller) på dag 6. På dag 8, var dyrene anesthetized og parfyme for utarbeidelse av kryostaten deler. (B) dette panelet viser den immunofluorescent flekker av BrdU (i grønt) post-HF-DBS i DG. (C) en kvantitativ analyse av neuronal produksjonen indikerte at akutt (2 x 1 dag) stimulering i DG kan ikke forbedre neurogenesis, mens den kroniske (10 x innen 5 dager) stimulering i DG betydelig upregulated i neurogenesis. Sammenlignet med kontrollgruppen, antall BrdU merking cellene betraktelig i den kroniske gruppe både i den ipsilateral og kontralateral halvkulen. Baren skala = 100 µm. betyr ± SEM, toveis VARIANSANALYSE, stimulering type effekt F2, 14 = 97.09, P < 0,0001, halvkule effekt F1, 14 = 1.137, P = 0.3044, Bonferroni innlegget hoc test, ***P < 0,001, n Kontroll = 3 (3 skiver fra 3 mus), n1 dag = 4 (4 skiver fra 3 mus), n5 dager = 3 (3 skiver fra 3 mus). (D) dette panelet viser den immunofluorescence flekker av BrdU (i grønt) post-HF-DBS i PP subregion. (E) A kvantitativ analyse av neuronal produksjonen indikerte at enten akutte (to ganger på en dag) eller kronisk (10 x 5 dagene) stimulering i PP kan ikke styrke neurogenesis betydelig. Antall BrdU merking celler var relativt stabilt med eller uten HFS behandling. Baren skala = 100 µm. betyr ± SEM, toveis VARIANSANALYSE, stimulering type effekt F2, 16 = 0.9025, P = 0.4252, halvkule effekt F1, 16 = 1.402, P = 0.2537, Bonferroni legge hoc test, P > 0,05, n Kontroll = 3 (3 skiver fra 3 mus), n1 dag = 3 (3 skiver fra 3 mus), n5 dager = 5 (5 skiver fra 3 mus). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1. Uttrykk for Notch1 i DG svar på HF-DBS behandling. (A) dette panelet viser den immunofluorescent flekker av Notch1 (i grønt) 3 h etter HF-DBS i DG. Dette tallet var sitert og endret fra Fengs rapport21. (B) en kvantitativ analyse av fluorescensen indikerte at HFS i DG kan styrke uttrykk for Notch1. Baren skala = 100 µm. betyr ± SEM, student t-test, t = 12 ***P < 0,001, n forNei-sti = 9 (3 skiver/mus fra 3 mus), nHFS = 9 (3 skiver/mus fra 3 mus). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary File 1
Supplerende fil 1. Rådata. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HF-DBS teknikken har vært mye brukt som et kraftig verktøy for behandling av mange nevrologiske lidelser siden 1990. Så langt, er landemerke arbeidet med HF-DBS for behandling av Parkinsons sykdom og viktig tremor, som har tiltrukket seg mye oppmerksomhet og interesse både klinikken og vitenskapelige samfunn. Det finnes ulike typer pågående HF-DBS studier av mange grupper for HF-DBS terapeutisk program visse nevrologiske og psykiske lidelser32,33. Noen av disse studiene er i ulike stadier av kliniske forsøk2,34. Selv om HF-DBS skal bringe betydelige fordeler, stimulering bivirkninger kan forekomme selv med en perfekt plassering i hjernen, som negative endringer i humør og tenkning, etc., som er reversibel og kan unngås med modifikasjoner av den stimulering innstillinger.

I tillegg til betydelige utviklingen av HF-DBS teknologien akkumulert fra den kliniske forsøk de siste tiårene, studier av HF-DBS i levende dyr gir også mulighet til å forstå fysiologiske endringer og nevrobiologiske mekanismer av elektrisk stimulering. I dette manuskriptet har vi beskrev en modifisert HF-DBS metodikk i mus å stimulere hippocampus DG subregion med et HFS direkte eller indirekte. Selv om beskrevet protokollen utføres i gnagere, HFS svar studier er også vellykket utført i andre modellen organismer, inkludert griser35. For denne teknikken, kan stereotactic kirurgi også brukes for en potensiell kjernen målrettede stimulering til å teste effekten av HFS enkelte dyr modeller med nevrologiske og psykiske lidelser. Konklusjonene fra slike studier bør lett oversette til klinikken, spesielt for avgrensningen av HFS på eksisterende mål. Merk at i motsetning til serien av flere eksponeringer av HF-DBS i klinikken, i denne metodologiske studien, vi valgte en enkelt og kortsiktige eksponering av HFS å stimulere og indusere neuronal aktiviteten i hippocampus DG, parameter og del av paradigmet for HFS som tidligere rapportert å indusere LTP i hippocampus skiver21,28.

De generelle begrensninger av HF-DBS er grundig gjennomgått andre steder24,25. En av utfordringene for eksperimentet her er også behovet for en utmerket kirurgisk teknikk og den pågående vare kirurgisk anatomiske locus. Å korrekt og nøyaktig implantat elektroden i målet kjernen for stimulering, er en av de viktigste prosessene en vellykket operasjon av en dyktig tekniker å unngå unødvendige blodkaret skade og misplacement av elektroden. Videre er videre anatomiske og histologiske analyse av hjernen prøven også nødvendig for å bekrefte riktig målretting av elektroden etter et HFS. Dette er også en av fordelene med denne tilnærmingen til tydelig vise korrigert målretting av elektroden etter operasjonen i en intakt dyr hjerne. Mange av detaljene i denne protokollen kan lett tilpasses for en langsiktig stimulering via en implantert stimulator i dyr. Det bør bemerkes at det også er mottakelig for alternative stimulering parametere i potensielle terapeutiske hjernen mål med forskjellige HFS levering. Men denne artikkelen rapportert på en enheter akutt HFS levert av en programmerbar stimulator enhet å forstå mobilnettet endringene etter elektrisk stimulering.

Selv om HF-DBS fungerer som et alternativ for behandling av nevrologiske og psykiske lidelser i klinikken i flere år, forblir mekanismene bak dens effektivitet dårlig forstått. Bruk og fremtidige forbedringer av HF-DBS er en mer pragmatisk tilnærming nødvendig. Som utvikle verktøy trenger HFS teknikken ytterligere teknisk innovasjon og mekanistisk oppdagelsen. For å studere cellulære og molekylære mekanismer av HF-DBS, gir en global transcriptome analyse basert på høy gjennomstrømming sekvensering teknologi viktig informasjon for å forstå den molekylære hendelser og signalnettverk endringer etter en HF-DBS induksjon 36. i tillegg til den upartiske screening strategien, basert på undersøkelse av eksisterende molekylær kandidater som har vist seg for å svare på neuronal depolarization, vil det trolig også gi viktige ledetråder for å identifisere de viktige effektor ansvarlig for HFS med. C-fos upregulated svar på iboende neuronal aktivitet, så se på uttrykket vil minst gi oss et landskap av neurons nylig sparken37. Men bør c-fos ikke bare brukes til å bare reflektere aktiviteter siden det synes også å merke neurons gjennomgår LTP37. Tidligere arbeider, inkludert vår, har vist at Notch1 spiller en avgjørende rolle i synaptiske plastisitet i modne hippocampus nevroner og er avgjørende for voksen neurogenesis i vivo21,22. I denne situasjonen, en detaljert kvantitative og spatiotemporal lokalisering av nøkkelen kandidater bør nøye preget og beskrevet pre og post-HFS induksjon av en immunohistochemical analyse av c-fos uttrykket. Studier som dette vil gi direkte bevis for å vise endringene av gene expression mønstre i ulike områder av hjernen som svar på en HFS21, som også vil være gunstig å avsløre mobilnettet endringene som neuronal aktivisering, neurogenesis, eller neurodegeneration.

Det skal også bemerket at til tross for fordelene med en HF-DBS applikasjon i klinikken, skyldes at utfallet av stimulering effekten er tett forbundet med parameterne stimulering og målrette plassering i hjernen, mobilnettet og molekylære mekanismene bak HFSS effekter kan være svært komplisert. I denne studien gjennomført vi videre BrdU for å undersøke akutte og kroniske effekten av HFS på voksen neurogenesis. Selv om BrdU flekker kan være en markør for både neurogenesis og gliogenesis, basert på tidligere rapporter, flertallet av økt BrdU positive neurons observert i SGZ etter en HF-DBS behandling bør være proliferativ voksen nevrale progenitors21 , 38 , 39. uansett kompleksiteten i mekanismene bak HFS behandling, metoder og resultater vi beskrevet i dette manuskriptet gir direkte bevis at repeterende høyfrekvent elektrisk stimulering for å aktivere den hippocampus DG kan betydelig indusere aktivering av neuronal aktivitet og neurogenesis i vivo.

I sammendraget viste vi at en HF-DBS kan forbedre neuronal aktivitet og neurogenesis mus, sammenlignet med neuronal aktivitet og neurogenesis kontroll mus som ikke gjennomførte en HF-DBS. Dette kan fremme vitenskapelig forståelse om kognitiv effekter og stimulering mønstre av HFS i vivo. Identifikasjonen nevronale aktivisering etter en akutt HF-DBS behandling direkte eller indirekte i vivo viser at en HFS behandling har betydelige effekter på synaptic overføring av lokale og langtrekkende tilkoblinger. Raske induksjon av neuronal aktivisering etter en HF-DBS behandling gir et kraftig verktøy for å manipulere svekket synaptic overføring eller desynchronization i mange nevrologiske og psykiske lidelser som MDD. På den annen side, tyder induksjon av neurogenesis etter en kronisk og direkte, men ikke akutt eller indirekte HF-DBS behandling distinkte effekt og funksjonelle variasjon mellom ulike elektrisk stimulering manerer. Slike funn gir direkte bevis for neural modulering og potensielle terapeutiske fordelene ved HFS i fremtiden. Samlet presenterer HF-DBS betydelige fordeler for behandling av nevrologiske og psykiske lidelser ved å integrere den teknologiske fremskritt i klinikken og mekanistisk fremdriften i laboratoriet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å fortolle.

Acknowledgments

Støttet av National Natural Science Foundation av Kina tilskudd 31522029, 31770929 og 31371149 (å Haitao Wu), programmet 973 (2014CB542203) fra den statlige nøkkel utviklingsprogrammet for grunnleggende forskning fra Kina (på Haitao Wu), og gi Z161100000216154 fra den Beijing kommunale vitenskap og teknologi-kommisjonen (Haitao Wu). Forfatterne takker alle medlemmer av Haitao Wu laboratoriet for oppmuntring og diskusjoner. Forfatterne er ekstremt takknemlig til Zhenwei Liu for hans hjelp med feilsøking apparatet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain stereotaxic instrument Stoelting 51730D Stereotactic intracranial implantation for mouse
Stimulator A-M systems Model 3800 MultiStim 8-Channel programmable stimulator
Dental driller Saeshin Precision Co., Ltd STRONG 90 For drilling and crainiotomy 
Burr Meisinger HM1 005# For drilling and crainiotomy 
Digidata 1550 Digitizer Molecular Devices AXON 1550 High-resolution data acquisition
Cryotome Thermo Fisher Scientific Thermo Cryotome FSE Cutting frozen sections of specimens
Confocal microscope Olympus FV-1200 Japan, with 20x Objective (NA 0.45)
Mouse surgery tools F.S.T. 14084-08,11254-20,16109-14 Scissors, forceps, bone cutter, holders etc.
Pentobarbital sodium R&D systems 4579 20-50mg/kg for i.p. injection
Penicillin G  Sigma-Aldrich P3032 75,000 U for i.m. injection
Carprofen Sigma-Aldrich SML1713 5-10mg/kg, for s.c. injection
4% Paraformaldehyde (PFA) Beijing Solarbio Sci-Tech Co.  P1110 stocking solution for tissue fixation
Phosphate buffer (PBS) Invitrogen 10010023 pH7.4, 500ml in stocking
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura 4583 Formulation of water-soluble glycols and resins
anti-BrdU antibody Abcam ab6326 Dilutions:1/800
anti-c-fos antibody Abcam ab209794 Dilutions:1/500
Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) Thermo Fisher Scientific A11036 Dilutions:1/500
Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) Jackson ImmunoResearch 712-546-150 Dilutions:1/500
Antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Counterstaining with DAPI
anti-Notch1 antibody (C-20) Santa Cruz Biotech sc-6014 Dilutions:1/50
Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) Abcam ab150073 Dilutions:1/1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  2. Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
  3. Kohl, S., et al. Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review. BMC Psychiatry. 14, 214 (2014).
  4. Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression. Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).
  5. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).
  6. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).
  7. Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation for Parkinson's disease and other movement disorders. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).
  8. Garcia, L., D'Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. High-frequency stimulation in Parkinson's disease: more or less. Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).
  9. Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats. Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).
  10. Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).
  11. Grubert, C., et al. Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation. The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).
  12. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).
  13. McIntyre, C. C., Hahn, P. J. Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation. Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).
  14. Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. Sing the mind electric - principles of deep brain stimulation. European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).
  15. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).
  16. Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (97), e52457 (2015).
  17. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5 26-41 (2008).
  18. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).
  19. Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).
  20. Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression. Behavioral and Brain Functions. 6, 35 (2010).
  21. Feng, S., et al. Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment. The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).
  22. Alberi, L., et al. Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks. Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).
  23. Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. A step-wise approach to deep brain stimulation in mice. Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).
  24. Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration. Journal of Visualized Experiments. (107), e53266 (2016).
  25. Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation. Journal of Visualized Experiments. (104), e53066 (2015).
  26. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
  27. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6 (2007).
  28. McHugh, T. J., et al. Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network. Science. 317 (5834), 94-99 (2007).
  29. Gonzalez, C., et al. Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories. Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  31. Tse, N., et al. The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (94), e52220 (2014).
  32. Pizzolato, G., Mandat, T. Deep brain stimulation for movement disorders. Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2 (2012).
  33. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).
  34. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).
  35. Min, H. K., et al. Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals. NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).
  36. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. 2015 (11), Cold Spring Harbor Protocols. 951-969 (2015).
  37. Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Frontiers in Neural Circuits. 8, 37 (2014).
  38. Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).
  39. Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).

Tags

Nevrovitenskap problemet 136 høyfrekvens stimulering dentate gyrus neuronal aktivitet neurogenesis BrdU merking
En invasiv metode for aktivering av musen Dentate Gyrus av høyfrekvente stimulering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Z., Wu, H. An Invasive Method… More

Zhao, Z., Wu, H. An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation. J. Vis. Exp. (136), e57857, doi:10.3791/57857 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter