Summary
Ce protocole indique comment mettre en place une méthode fiable de HFS chez la souris. Neurones dans l’hippocampe gyrus denté sont stimulés électriquement par HFS directement et indirectement in vivo. L’activité neuronale et la signalisation moléculaire sont examinés par c-fos et immunofluorescence Notch1, respectivement ; neurogenèse est quantifiée par la bromodéoxyuridine dosage d’étiquetage.
Abstract
Stimulation électrique de haute fréquence (HFS), utilisant des électrodes implantées, ciblant les différentes régions du cerveau, s’est avérée comme un traitement efficace pour divers troubles neurologiques et psychiatriques. HFS dans la région profonde du cerveau, également appelée stimulation profonde du cerveau (DBS), devient de plus en plus important dans les essais cliniques. Les progrès récents dans le domaine de la chirurgie de haute fréquence DBS (HF-DBS) a commencé à se répandre la possibilité d’utiliser cette technique invasive à d’autres situations, telles que le traitement pour la maladie de dépression majeure (MDD), les troubles obsessionnels compulsifs (TOC) et donc sur.
Malgré ces indications en expansion, les mécanismes sous-jacents des effets bénéfiques du HF-DBS restent énigmatiques. Pour répondre à cette question, une approche consiste à utiliser implanté des électrodes qui activent peu distribué des sous-populations de neurones par HFS. Il a été signalé que HFS dans le noyau antérieur du thalamus pourrait être utilisé pour le traitement de l’épilepsie réfractaire à la clinique. Les mécanismes sous-jacents pourraient être liées à la neurogenèse accrue et modifié l’activité neuronale. Par conséquent, nous sommes intéressés à explorer les altérations physiologiques de la détection de l’activité neuronale, mais aussi la neurogenèse dans le gyrus denté de souris (DG) avant et après traitement de HFS.
Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent les méthodologies pour HFS cibler l’activation de la DG chez la souris, directement ou indirectement et de façon aiguë ou chronique. En outre, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour la préparation des coupes de cerveau de c-fos et Notch1 immunofluorescence souillant pour surveiller l’activité neuronale et activation de la signalisation et de bromodéoxyuridine (BrdU) étiquetage afin de déterminer la neurogenèse après l’induction HF-DBS. L’activation de l’activité neuronale et la neurogenèse après le traitement HF-DBS fournit une preuve directe neurobiologique et bénéfices thérapeutiques potentiels. En particulier, cette méthodologie peut être modifiée et appliquée pour cibler d’autres régions du cerveau concernées telles que les noyaux gris centraux et subthalamique régions pour les troubles spécifiques du cerveau à la clinique.
Introduction
HF-DBS est une technologie de neurochirurgie pour la stimulation électrique dans le cerveau, qui s’est développée depuis les années 18701. Dans les années 1980, HFS servit tout d’abord une intervention thérapeutique potentielle pour la maladie de Parkinson et troubles de l’autre mouvement2. Dans les dernières décennies, HF-DBS a été plus largement utilisé dans le traitement des troubles du cerveau qui sont actuellement impossibles à traiter par une stratégie thérapeutique traditionnelle. En particulier, en raison de l’amélioration de la précision de l’électrode HFS, les résultats très efficaces et des effets secondaires minimes, le nombre de troubles du cerveau traitée par HF-DBS a considérablement augmenté au cours des dernières décennies3,4, 5. Par exemple, HF-DBS a été approuvé par la US Food and Drug Administration (FDA) pour le traitement de la maladie de Parkinson (MP), démence de type Alzheimer, tremblement essentiel et d’autres types de mouvement troubles2,6, 7. dans les patients Parkinsoniens, le médicament dopaminergique est réduit jusqu'à 50 % au cours de la HF-DBS8. En plus de la réussite du traitement des troubles du mouvement, HF-DBS a également démontré ses effets puissants dans le traitement des maladies psychiatriques dans la clinique et pour l’augmentation des cognitive comme bien2,9, 10 , 11. il convient de noter que la recherche de HFS pour le traitement d’autres troubles psychiatriques sont à divers stades, offrant très prometteur pour les patients de12.
Bien que plusieurs études ont démontré qu’une focale HFS a des effets les et distants dans tout le cerveau13, les mécanismes neurologiques et moléculaires des effets demeurent insaisissables2,14. Dans la clinique, thérapeutique HF-DBS est généralement appliquée de manière à long terme pour le traitement de la maladie de Parkinson et de douleurs chroniques, etc. que beaucoup d’opinions est déclenchés pour expliquer l’amélioration produite par un traitement HF-DBS, parmi laquelle une possibilité que le courant HFS module l’activité du réseau neuronal, probablement par une dépolarisation répétitive des axones dans le voisinage de l’électrode implantée de HFS. Ou, HF-DBS peuvent modifier le taux de décharge des neurones de sortie et les cibles projetées. Aussi, HF-DBS peut conduire à des changements de synaptiques à long terme, y compris la potentialisation à long terme (LTP) et dépression à long terme (DLT), qui peuvent contribuer à une amélioration symptomatique. Jusqu'à présent, on ignore encore si HFS influences principaux événements moléculaires qui régulent les cellulaires traite tel comme in vivode la neurogenèse adulte. Plusieurs lignes des études ont démontré que HFS chez les rongeurs pouvaient imiter des réponses neurones similaires de clinique appliquée DBS15,16. Pour comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents du HF-DBS, dans cette étude, nous tout d’abord mis en place un en vivo méthodologie HFS chez la souris dans un aigu (un jour) ou de manière chronique (cinq jours). Deuxièmement, nous avons mis en place une méthodologie d’analyse par activation pour déterminer la modification de l’activité neuronale et la neurogenèse après une livraison HF-DBS.
Étant donné que la production neuronale de cellules souches neuronales est abondante durant le développement embryonnaire mais continue tout au long de la vie d’adulte, la zone subgranulaire hippocampe est l’un des principaux domaines où la neurogenèse se produit. Le processus de neurogenèse est influencé par de nombreux facteurs physiologiques et pathologiques. Dans certains cas d’épilepsie, la neurogenèse hippocampique est considérablement diminuée de17,18. En outre, une thérapie par électrochocs unique pouvant accroître considérablement la production neuronale dans le gyrus denté19. Ces observations suggèrent que l’activité électrophysiologique joue un rôle essentiel dans la régulation de la neurogenèse adulte et la plasticité synaptique dans les neurones de l’hippocampe. Par conséquent, pour démontrer davantage les effets du HF-DBS sur l’activité neuronale et la neurogenèse, nous avons tout d’abord effectuer un dosage immuno-coloration de la gène (IEG) début immédiat c-fos qui est un marqueur connu de l’activité neuronale à court terme résultant de 20de l’expérience. Signalisation Notch1 est également détectée pour contrôler l’activation de signalisation après les HFS livraison21,22. En outre, nous détectons également la production neuronale par un BrdU étiquetage analyse après l’induction HF-DBS de diverses manières, mais BrdU coloration peut également être un marqueur pour gliogenesis.
Dans la présente étude, deux méthodes HFS sont adaptés pour cibler l’activation de l’hippocampe DG directement et indirectement. L’électrode est implantée directement dans le DG ou implanté dans la voie de perforante médial (PP) qui envoie des projections pour activer les neurones de la DG. Pour l’induction HF-DBS, un stimulateur programmable est présenté pour une stimulation continue par l’électrode fixe sur la tête de la souris. Pour déterminer les effets de HFS sur activation neuronale et la neurogenèse, nous détectons l’expression de c-fos et Notch1 par immunofluorescence et le nombre de neurones positifs BrdU-incorporé dans la région de l’hippocampe DG, respectivement, après le traitement de HFS. En particulier, les effets de l’HF-DBS sur la neurogenèse dans le DG sont comparés entre aiguë et un mode de stimulation chronique, ou entre un direct et un mode de stimulation indirecte, respectivement.
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Protocol
Les procédures expérimentales animales conformé aux directives institutionnelles de la Beijing Institute of Basic Medical Sciences (Beijing, Chine) et des règlements gouvernementaux chinois pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les souris (adulte masculin, 26 ~ 30 g) ont été logés et conservé à une température constante de 23 ° C, avec de l’eau et l’alimentation ad libitum, sous un cycle foncé de lumière/12 h 12 h (lampes allumées à 07:00). Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées durant le cycle de lumière.
1. préparation chirurgicale
Remarque : Une électrode de mesure a été faite maison à l’aide de la méthode modifiée de Halpern rapport23.
- Utiliser 2 micro-câbles en cuivre (avec un diamètre extérieur de 200 µm) comme électrode bipolaire parallèle. Envelopper les électrodes autour de l’autre pour former des électrodes cylindriques pour la stimulation.
NOTE : Ici, la longueur de l’électrode au sein de la DG ou PP variait selon la profondeur anatomique du noyau. - Stériliser les électrodes à l’aide d’une armoire de désinfection de l’oxyde d’éthylène. Manipuler et entreposer les maison 2 canaux micro-fils-électrodes sans n’importe quelle contamination. Les électrodes doivent être strictement stérilisés avant toute implantation chirurgicale.
- Stériliser les instruments chirurgicaux.
- Avant la chirurgie, injecter la souris au pentobarbital (20-50 mg/kg) par voie intrapéritonéale, pour réaliser un plan chirurgical de l’anesthésie.
- Injecter la souris avec une suspension de procaïne pénicilline stérile G (75 000 U, I.M.) et un agent analgésique (carprofen, 0.05 - 1 mg/kg, SC) pour diminuer les risques d’infection et de douleur, respectivement24.
- Après l’anesthésie de l’animal, appliquer un lubrifiant oculaire à deux yeux pour prévenir le dessèchement de le œil. S’assurer que l’induction de la sédation et la profondeur de l’anesthésie par des réflexes de l’animal en réponse à l’orteil de pincer et de procéder à l’opération uniquement lorsqu’aucune réponse ne survient.
Remarque : L’onguent Vet est une autre option pour prévenir le dessèchement de le œil. - La plupart de la fourrure sur le dessus de la tête de la souris vous raser avec des tondeuses électriques ou une lame de rasoir, stériliser la zone rasée avec trois gommages alternance de 70 % d’alcool et de la bétadine solution et poursuivre l’opération après que la bétadine a séché sur la peau.
2. la Stimulation haute fréquence chirurgie25,26
Remarque : Dans cette étape, une électrode est unilatéralement implantée dans la dorsale DG ou zone médiale de PP, une partie de l’hippocampe avec un rôle important dans l’apprentissage épisodique et la mémoire.
- Placez votre souris anesthésiée sur le cadre stéréotaxique. Pour conserver la tête de la souris immobile, alignez les barres d’oreilles correctement et les installer rapidement. Serrez doucement les barres d’oreilles afin qu’ils soutiennent la tête centrée et sécuriser la souris légèrement.
- Utiliser un tampon thermostatique pour maintenir la température du corps de l’animal à 37 ° c ± 0,5 ° C.
- Pince permet de saisir la peau devant les oreilles de souris et couper avec des ciseaux stérilisés à enlever sur 1 cm2 de surface de la peau sur le dessus du crâne de la souris.
NOTE : Une petite quantité de sang pourrait être observée le long des bords de la peau coupée. - Enlever le muscle et autre pièce jointe recouvrant le crâne avec un coton-tige pour exposer la surface du crâne. Utilisez un coton-tige et dissection ciseau pour nettoyer tous les périoste, les tendons et les tissus conjonctifs de surface complètement pour identifier la sagittale du crâne et les lignes de sutures lambda.
- Identifiez le bregma et point de lambda. L’intersection de la suture coronale et la suture sagittale sur la partie médiane supérieure de la calotte cranienne est où se trouve le bregma. L’intersection de la suture lambdoïde de la suture sagittale est où le lambda est visible. Utilisez le bregma comme point de départ pour définir l’autre position de noyau.
- Après l’identification de la position de bregma et lambda sur le crâne, régler ces deux points dans le plan horizontal. S’assurer que la hauteur de ces deux points est presque le même dans le sens de la dorsale-ventral (toute erreur doit être < 0,05 mm). En outre, assurez-vous que le crâne est de niveau en direction médiale-latérale dans la même voie26.
- Pour une opération unilatérale, monter une maison 2 canaux cuivre micro-fil-électrode dans le porte-électrode tournante sur le cadre de chirurgie stéréotaxique.
- Placer l’électrode verticalement au-dessus du point de bregma dans un premier temps et le définir comme site d’origine. Utilisation du numérique affiche cadre chirurgie stéréostatique pour indiquer l’antéro-postérieur (AP), medial-latérale (ML), et positionne dorso-ventral (DV).
Remarque : Pour éviter que l’électrode se plier, ne pas toucher l’extrémité de l’électrode sur le crâne pendant l’opération. - Déplacer l’électrode doucement dans la bonne position (Figure 1 a, AP-2.1/ML ± 1,0 pour DG et AP-3,8/ML ± 3.0 pour le PP, respectivement)27 au-dessus du crâne sans aucun contact. Lorsque le site désiré a été identifié pour l’insertion de l’électrode, utilisez aux adaptations stéréotaxiques dorsoventral supérieur le porte-électrodes et marquer la position avec un marqueur noir.
Remarque : L’emplacement exact en ce qui concerne les coordonnées stéréotaxiques peut varier selon le sexe, poids et souche de souris. Des souris adultes de même sexe devraient servir à réduire au minimum toute variation dans l’emplacement. Si possible, analyses anatomiques pré-opérationnelle doivent être utilisés pour identifier l’emplacement sur un sujet individuel base27. - Utiliser une perceuse à main micromanipulateur assistée (burr taille = 0,5 mm) pour faire des trous de bavures à l’emplacement marqué avec précision. Stériliser à la pointe de la meule avec l’éthanol à 70 % avant de percer. Vers le haut le foret mini à travers le crâne, le long de l’axe z 0,8 - 1,0 mm sans changer de position X-Y. Utiliser un coton stérile pour arrêter tout saignement pendant l’opération.
Remarque : Pour éviter la génération de chaleur trop forage et excessive lors du forage, vérifiez la vitesse de perçage est de 15 000-18 000 tours par minute (tr/min) et fréquemment de retirer le foret du trou de trépan chaque s 8-10. - Garder les forages jusqu'à ce que la dure-mère est exposée. Utiliser une aiguille tordue pour retirer des fragments de n’importe quel OS qui sont générés lors du forage et de faire un trou d’épingle sur la dure-mère sans endommager les tissus sous-jacents de cerveau mou.
Remarque : Pour éviter d’endommager le tissu cérébral, l’aiguille émoussée tordue peut également être remplacée avec une fine pince émoussée. - Pour confirmer que les trous de bavures ont été faites correctement sur la position désirée, réduire la hauteur de l’électrode par un ajustement de l’image de la chirurgie stéréotaxique et veiller à ce que l’électrode peut être inséré sans à-coup à travers le trou de trépan sans toucher les obstacles. Dans l’affirmative, introduire doucement les électrodes jusqu'à une profondeur de 1,8 mm pour la DG (ou 3,0 mm pour le PP) de la surface du crâne situé à la PP médial du DG (PP-DG).
NOTE : Effacer tout le liquide céphalorachidien ou des sorties de sang par les trous de la ronce avec du coton stérile pendant le processus de l’implantation de l’électrode. - Après avoir inséré la micro-fil-électrode dans le trou du crâne, maintenez-le en place avec du ciment dentaire adéquate, à l’aide d’une petite spatule. Comme le ciment s’épaissit, il moule autour de l’électrode insérée et vis pour former une belle casquette lisse. Débrider et désinfecter les bords de la plaie.
- Dégager l’électrode du porte-électrode. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et retourner à une cage chaude.
Remarque : Après la chirurgie, attendre au retour les animaux à leurs cages jusqu'à ce qu’ils ont pleinement récupéré de l’anesthésie avec conscience suffisante. - Laissez la souris se déplacer librement et lui permettre de récupérer pendant 2 jours dans la cage. Ensuite, connecter l’électrode implantée chez la souris le cerveau à un stimulateur programmable via conduit. Configurer l’interface de logiciel tel que présenté dans la Figure 2. Définissez les paramètres HFS comme 6 séries de 6 trains de 6 impulsions à 400 Hz (Figure 1B, 100 ms entre les trains, 20 s entre les séries)28. Régler l’intensité de la stimulation de 200 μA.
- Livrer un HFS pour la période souhaitée de temps dans le jeu. Le niveau de stimulation 2 x par jour à 08:00 et 20:00
- Pour le groupe témoin, implanter des électrodes dans les souris et n’effectuent pas une stimulation.
- Pour la coloration de c-fos , stimuler les souris expérimentales aiguë (2 x par jour). Pour l’étiquetage de BrdU, diviser les souris expérimentales en un groupe de stimulation aiguë (appliquer 2 x par jour) et un groupe de stimulation chronique (appliqué 10 x en 5 jours, 2 fois par jour). Au cours de la stimulation, assurez-vous que la souris est éveillée. N’oubliez pas de s’assurer que les fils ne soient pas vrillées.
Remarque : À la clôture de la procédure, les souris dans le groupe stimulation aiguë ont été stimulés simultanément. - Lorsque la stimulation est terminée, soigneusement débrancher la broche de l’électrode du porte-électrode et le connecteur du système d’enregistrement.
3. immunofluorescence souillant et bromodéoxyuridine étiquetage29
- Pour le c-fos et Notch1 coloration, environ 3 h après la dernière stimulation HF-DBS, anesthésier les souris en injectant du pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) pour réaliser un plan chirurgical de l’anesthésie.
- Pour l’étiquetage de BrdU, environ 12 h après la dernière stimulation HF-DBS, donner 6 injections de BrdU au contrôle et aux souris stimulées à intervalles de 2 h (50 mg/kg de sérum physiologique à 0,9 %, I.P.). 36 h après la dernière injection, anesthésier les souris en injectant du pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) pour réaliser un plan chirurgical.
- Faire des incisions en utilisant un scalpel à travers la cage thoracique pour exposer le cœur puis passez une aiguille de calibre 22 perfusion émoussé au ventricule gauche. Faites une petite incision à l’oreillette droite. Transcardially on perfuse avec 50 mL de froid tampon phosphate salin (PBS) suivie de 50 mL de paraformaldéhyde froide de 4 % (PFA) dans du PBS 1 x (pH 7,4).
NOTE : Passer du PBS à la PFA quand la souris sang in vivo est remplacé et le liquide s’écoule soit propre. Une bonne perfusion peut être jugée par le franchissement du foie. La perfusion doit être arrêtée dès que les tremblements de fixation ont été observés à30. - Décapiter la souris avec des ciseaux ophtalmique, faites une incision sur la peau et exposer le crâne. À l’aide de pinces, puce hors du crâne légèrement et soigneusement disséquer le cerveau de souris ensemble. Post-fixer le cerveau à la paraformaldéhyde à 4 % pour une période supplémentaire de 2 jours et le transférer dans une solution de saccharose 30 % à 4 ° C durant la nuit.
- À l’aide d’un cryostat, couper les cerveaux en sections coronale de 20 µm. Transfert et monter les sections à la lame de verre avec un pinceau et les stocker à-20 ° C.
NOTE : Animaux avec l’oubli de l’électrode ou des dégâts mécaniques excessifs est exclus l’analyse ultérieure. - Transférer les lames dans PBS normale (0,1 M, pH 7,4) ne contenant aucun fixateur. Laver les tranches avec du PBS pour 3-4 x de 5 min chacun pour enlever tout excès fixateur. Pour le groupe marqué BrdU, incuber les sections 2-N HCl pendant 30 min à 37 ° C et les rincer dans un tampon de borate 0,1 M (pH 8,4 ; 10 min). Puis laver les tranches de 2 x 5 min dans du PBS.
NOTE : Immunomarquage est ensuite effectuée. - Traiter les tranches en incubation en bloquant la solution (sérum de chèvre normal de 1 %, 3 % d’albumine sérique bovine < BSA >, 0,5 % Triton X-100 et 0,02 % d’azide de sodium dans du PBS 1 x) pendant 1 h à température ambiante (RT).
- Incuber les tranches avec anti -c-fos anticorps polyclonal (1/500, lapin), anticorps anti-Notch 1 (01:50, chèvre) ou anticorps anti-BrdU (1:800 ; rat) dans la solution de blocage à 4 ° C jusqu’au lendemain.
- Laver les tranches 3 x dans du PBS, puis les incuber avec Alexa Fluor 568 conjugué anti-rabbit (1/500), anti-chèvre conjugué Alexa Fluor 488 (1:1 000), ou de l’anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 488 anti-rat (1/500) pendant 1 h à température ambiante.
- Laver les échantillons 3 x dans du PBS (10 min chaque fois). Couvrir les sections immuno-étiqueté cerveau utilisant un milieu de montage anti-fondu réactif contenant DAPI. Laissez les tranches de sécher et les ranger à l’abri de la lumière à 4 ° C.
- Acquérir des images des zones hippocampiques des côtés du cerveau avec une haute résolution (séquentiel) microscope confocal à balayage multi-canaux stimulées et non stimulées. Définissez les paramètres d’imagerie constamment entre le contrôle et les groupes expérimentaux.
- Effectuer une imagerie de mosaïque en utilisant un objectif à fort grossissement (objectif 20 X air, NA 0,45) pour acquérir des images (XYZ) 3D continues des champs adjacents de vue en utilisant la platine motorisée et utiliser des logiciels appropriés pour piquer ensemble pour faire de grande composite images.
Remarque : Le carrelage fonctions incluent le vrai couture et lissage des options pour des images améliorées sans soudure. Images composites sont rapidement et facilement préparés à l’aide de la fonction couture, pour former une image sur une large zone. - Pour c-fos et Notch1 coloration, effectuer une analyse quantitative de noyaux positifs de la densité par immunofluorescence21 des images piquées. Au hasard, sélectionner 3 zones dans les sous-régions DG hippocampe rostrales, dorsales et ventrales et mesurer la densité par immunofluorescence de façon double insu en utilisant Image J logiciels (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
- Pour un BrdU étiquetage, analyser les tranches autour du point de forage par l’intermédiaire de l’hippocampe dorsal (-1,70 mm à-2,70 mm par rapport à la bregma) d’une manière double aveugle.
- Comptez seulement les neurones BrdU séropositifs à la DG. Inclure les cellules situées dans les diamètres 2-cellulaire de la cellule de granules dans le comptage.
NOTE : Ici, comptage a effectué un un 40 X objectif de l’air. Au hasard, coupes de 3 à 5 par animal ont été comptés, et les chefs d’accusation ont été en moyenne et exprimées comme moyen par DG19.
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Representative Results
Suite à la stimulation de HF-DBS à la sous-région DG hippocampe directement ou la sous-région PP pour activer le DG indirectement via inséré les électrodes à l’aide des réglages stéréotaxiques, les rongeurs ont été anesthésiés au pentobarbital et échantillonné 3 h après la dernière stimulation HF-DBS pour le c-fos et Notch1 immunostaining. Pour la coloration BrdU, 36 h après la dernière injection de BrdU après 1 jour ou 5 jours de stimulation HF-DBS, les rongeurs ont été anesthésiés au pentobarbital pour la préparation des sections du cerveau. La figure 3 montre que l’expression de c-fos a été augmentée dans le côté homolatéral de la DG. En outre, l’expression de c-fos dans le côté controlatéral de la DG a également augmenté par rapport aux contrôles no-HF-DBS stimulation qui ne montra presque aucune manifestation d’un signal de c-fos . Basé sur le Notch1 spécifiques par immunofluorescence souillant dans des tranches de cerveau, comme le montre supplémentaire Figure 1, nous avons démontré plus loin que la signalisation Notch 1 pourrait également être activée à la DG hippocampe adulte après la stimulation HFS par une induction de la dépolarisation des neurones dans le PP (voir aussi les données brutes fournies comme supplémentaire 1 fichier).
En plus de la stimulation directe de HF-DBS dans la sous-région DG, Figure 4A montre la position et le site de stimulation HF-DBS de la pointe de l’électrode, qui a été installé à la médiale PP. Figure 4B montre que le HF-DBS la stimulation dans le PP non seulement augmenté de façon significative le niveau de l’expression de c-fos dans le côté homolatéral de la DG, mais également augmenté l’expression de c-fos dans le côté controlatéral de la DG par rapport à la stimulation de la no-HF-DBS contrôles.
Basé sur le BrdU étiquetage analyse des tranches de cerveau, tel qu’illustré dans les Figures 5 a - 5C, nous encore démontré que cette neurogenèse peut aussi être activée à la DG hippocampe adulte après une stimulation chronique (5 jours) de HF-DBS dans la DG directement. Une stimulation chronique de HF-DBS dans la DG non seulement considérablement surexprimés la neurogenèse dans l’ipsilatéral côté mais également a augmenté la neurogenèse dans le côté controlatéral par rapport aux contrôles stimulation no-HF-DBS. Toutefois, la stimulation aiguë (1 jour) n’a pu induire une régulation de la neurogenèse côté ipsilatérale ou dans le côté controlatéral de la DG. Comme illustré à la Figure 5D, soit dans le groupe stimulation aiguë, soit dans le groupe stimulation chronique, un HF-DBS indirecte dans le PP ne pouvait pas changer le niveau de la neurogénèse dans l’hippocampe DG.
Figure 1 . Représentation schématique de la cible de cerveau de la pointe de l’électrode et paramètres de HFS. Voie perforante (A) la projection neuronale de la médiale dans une lame inférieure du gyrus denté est indiqué. La position des électrodes insérés (en violet) pour stimuler la DG directement ou la sous-région PP sont indiqués. (B), le paramètre HFS est indiqué en 6 séries de 6 trains de 6 impulsions à 400 Hz, avec 100 ms entre les trains et 20 s entre les séries. CA = le Cornu Ammonis ; DG = le gyrus denté ; PP = la voie perforante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Interface et paramètres de le multistimulator. Le stimulateur était relié à un convertisseur numérique-analogique et activé par des logiciels propriétaires. Le type de stimulus de HFS est monophasique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Une activation neuronale de la DG en réponse au traitement HF-DBS directement. (A), à la pointe de l’électrode (la case vide blanche) se trouvait au-dessus de la région DG directement (AP -2,1/ML ± 1,0 / DV + 1,8) avec ou sans le HFS. Ce panneau indique l’immunomarquage de la section coronale des tranches de cerveau avec des anticorpsd’un c-fos dans le contrôle et les groupes HFS. La coloration DAPI bleu a été utilisée pour indiquer l’emplacement des noyaux hippocampe. La barre d’échelle = 100 µm. (B), ce panneau présente une analyse quantitative de la densité de signal par immunofluorescence. Le côté homolatéral de la DG, les neurones ont été considérablement activées avec une forte expression de c-fos, en l’expression de c-fos dans le côté controlatéral de la DG est également relativement augmentée par rapport à l’expression de c-fos de contrôle souris sans un traitement HFS. Signifie ± SEM, ANOVA à, F2,24 = 216, P < 0,0001, test post hoc de Bonferroni, ***P < 0,001, nno-sti = 9 (3 tranches de 3 souris), nHFS Contra = 9 (3 tranches/souris à partir de 3 souris), nHFS IPS = 9 (3 tranches/souris de 3 souris). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Une activation neuronale de la DG en réponse à HFS dans la sous-région PP. (A), à la pointe de l’électrode (la case vide blanche) se trouvait dans le PP médial à la position de l’AP -3,8 ML ±3.0 et DV + 3,0, avec ou sans le HFS. (B), ce panneau indique l’immunomarquage de la section coronale des tranches de cerveau avec des anticorpsd’un c-fos dans le contrôle et les groupes HFS. La coloration DAPI bleu a été utilisée pour indiquer l’emplacement des noyaux hippocampe. La barre d’échelle = 100 µm. (C), ce panneau présente une analyse quantitative de la densité par immunofluorescence. Le traitement de HFS dans le PP pourrait activer considérablement neurones ipsilatérale à la DG avec une forte expression de c-fos. L’expression de c-fos dans le DG controlatéral est également relativement a augmenté par rapport à l’expression de c-fos des souris de contrôle sans un traitement HFS. Signifie ± SEM, ANOVA à, F2,24 = 189,3, P < 0,0001, test post hoc de Bonferroni, ***P < 0,001, nno-sti = 9 (3 tranches de 3 souris), nHFS Contra = 9 (3 tranches/souris 3 souris), nHFS IPS = 9 (3 tranches/souris de 3 souris). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Activation distincte de la neurogenèse dans le DG en réponse à HFS dans DG et PP respectivement. (A), ce panneau indique un modèle expérimental pour le traitement de HFS et la génération de neurones prolifèrent BrdU marquée à la DG. Les animaux ont été divisés en un groupe chronique et aiguë. Dans le groupe aiguë, les souris ont été soumis à un traitement de HFS 2 x jour 5. Dans le groupe chronique, les souris ont été soumis à un traitement de HFS pendant 5 jours (du jour 1 au jour 5, 2 x par jour). Ensuite, les animaux dans les deux groupes ont été injectés avec BrdU (50 mg/kg, 6 x par intervalles de 2 h) au jour 6. Jour 8, les animaux ont été anesthésiés et perfusés pendant la préparation des sections du cryostat. (B) ce panneau montre l’immunofluorescence de BrdU (en vert) post-HF-DBS à la DG. (C), une détermination quantitative de la production neuronale a indiqué que l’aigu (x 2 en 1 jour) stimulation de la DG ne pourrait pas renforcer la neurogenèse, tandis que les chroniques (10 x 5 jours) la stimulation de la DG significativement augmentée la neurogenèse. Comparativement au groupe témoin, le nombre de BrdU marquage de cellules a augmenté considérablement dans la chronique du groupe tant dans l’hémisphère homolatéral et controlatéral. La barre d’échelle = 100 µm. moyens ± SEM, ANOVA bidirectionnelle, stimulation type effet F2, 14 = 97.09, P < 0,0001, hémisphère effet F1, 14 = 1,137, P = 0.3044, test post hoc de Bonferroni, ***P < 0,001, n Control = 3 (3 tranches de 3 souris), n1 jour = 4 (4 tranches de 3 souris), n5 jours = 3 (3 tranches de 3 souris). (D) ce panneau montre la coloration par immunofluorescence de BrdU (en vert) post-HF-DBS dans la sous-région PP. (E), une détermination quantitative de la production neuronale a indiqué que les aigus (deux fois en une journée) ou chronique (10 x 5 jours) stimulation dans le PP ne pourrait pas renforcer la neurogenèse significativement. Le nombre de BrdU étiquetage cellules était relativement stable, avec ou sans le traitement HFS. La barre d’échelle = 100 µm. moyens ± SEM, ANOVA bidirectionnelle, stimulation type effet F2, 16 = 0.9025, P = 0.4252, hémisphère effet F1, 16 = 1.402, P = 0.2537, Bonferroni test post hoc , P > 0,05, n Control = 3 (3 tranches de 3 souris), n1 jour = 3 (3 tranches de 3 souris), n5 jours = 5 (5 tranches de 3 souris). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1. Expression de Notch1 dans la DG dans la réponse au traitement HF-DBS. (A) ce panneau montre l’immunofluorescence de Notch1 (en vert) 3 h après le HF-DBS à la DG. Ce chiffre a été cité et modifié à partir rapport21 de Feng. L’analyse quantitative de la fluorescence (B), A indiqué que HFS dans la DG pourrait favoriser l’expression de Notch1. La barre d’échelle = 100 µm. moyens ± SEM, étudiant t-test, t = 12, ***P < 0,001, nno-sti = 9 (3 tranches/souris de 3 souris), nHFS = 9 (3 tranches/souris de 3 souris). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Fichier complémentaire 1. Les données brutes. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La technique HF-DBS a été largement utilisée comme un outil puissant pour le traitement de nombreux troubles neurologiques depuis les années 1990. Jusqu’ici, les travaux de point de repère du HF-DBS sont pour le traitement de la maladie de Parkinson et tremblement essentiel, qui a attiré beaucoup d’attention et intérêt aussi bien dans la clinique et de la communauté scientifique. Il existe différents types d’études en cours de HF-DBS par de nombreux groupes pour application thérapeutique du HF-DBS dans certains troubles neurologiques et psychiatriques32,33. Certaines de ces études sont actuellement à divers stades d’essais cliniques2,,34. Bien que HF-DBS devrait apporter des avantages importants, effets secondaires de la stimulation peut se produire même avec un positionnement parfait dans le cerveau, comme des changements négatifs dans l’humeur et de réflexion, etc., qui sont réversibles et peuvent être évités avec des modifications de la paramètres de stimulation.
Outre les importants progrès de la technique de HF-DBS accumulée d’essais cliniques au cours des dernières décennies, les études de HF-DBS animaux vivants présente également la possibilité de comprendre les changements physiologiques et neurobiologiques mécanismes induits par la stimulation électrique. Dans ce manuscrit, nous avons décrit une méthode modifiée de HF-DBS effectuée chez la souris pour stimuler la sous-région DG hippocampe avec un HFS, directement ou indirectement. Bien que le protocole décrit est réalisé chez les rongeurs, HFS réponse a également été avec succès étudié dans d’autres organismes modèles, y compris les porcs35. Pour cette technique, la chirurgie stéréotaxique permet également pour une stimulation ciblée noyau potentielle pour tester l’efficacité de HFS en utilisant certains modèles animaux souffrant de troubles neurologiques et psychiatriques. Les conclusions tirées de ces études devraient se traduire facilement à la clinique, spécifiquement pour le raffinement de HFS cibles existants. Notez que, contrairement à la série d’expositions multiples du HF-DBS dans la clinique, dans cette étude méthodologique, nous avons choisi une exposition unique et à court terme des HFS de stimuler et d’induire l’activité neuronale dans l’hippocampe DG, le paramètre et la partie du paradigme de HFS, qui a été signalé auparavant pour induire LTP dans l’hippocampe tranches21,28.
Limitations générales de HF-DBS ont été largement examinés ailleurs24,25. Un des défis pour l’expérience ici est aussi la nécessité d’une excellente technique chirurgicale et pour le traitement continu de locus anatomique chirurgical. Pour correctement et précisément implanter des électrodes dans le noyau cible pour la stimulation, l’un des principaux processus est une chirurgie réussie par un technicien qualifié afin d’éviter les blessures inutiles des vaisseaux sanguins et le déplacement de l’électrode. Par ailleurs, plu l’analyse anatomique et histologique de l’échantillon du cerveau est également nécessaire pour confirmer le bon ciblage de l’électrode après un HFS. C’est aussi l’un des avantages de cette approche, pour démontrer clairement le ciblage corrigée de l’électrode après l’opération dans un cerveau animal intact. Beaucoup de détails fournis dans le présent protocole peuvent être facilement adaptés pour un long terme stimulation via un stimulateur implanté chez l’animal. Il est à noter que c’est aussi se prêtent aux paramètres de la stimulation alternative dans des cibles potentielles de cerveau thérapeutique avec différents modes de livraison HFS. Toutefois, cet article a un HFS aiguë unitaires livrés par une unité de stimulateur programmable pour comprendre les changements cellulaires après la stimulation électrique.
Bien que HF-DBS sert comme option alternative pour le traitement des troubles neurologiques et psychiatriques dans la clinique pendant plusieurs années, les mécanismes qui sous-tendent son efficacité restent mal compris. Compte tenu de l’utilisation et les améliorations futures du HF-DBS, il faut une approche plus pragmatique. Comme un outil de développement, la technique HFS a besoin davantage l’innovation technique et découverte mécaniste. Afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du HF-DBS, une analyse du transcriptome global basée sur des technologies de séquençage haut débit fournira des informations importantes pour comprendre les événements moléculaires et les changements de signalisation après une induction HF-DBS 36. outre la stratégie de dépistage non biaisée, basée sur l’examen des candidats de moléculaires existants qui ont fait leurs preuves pour répondre à la dépolarisation neuronale, il sera sans doute également fournir des indices importants pour identifier les principaux effecteurs responsable de HFS avec. C-fos est augmentée en réponse à l’activité neuronale intrinsèque, donc en regardant son expression au moins nous donnerait un paysage de neurones ont tiré récemment37. Cependant, c-fos ne doit pas seulement servir à juste reflètent les activités car il semble également marquer les neurones en cours de LTP37. Des travaux antérieurs, y compris la nôtre, ont démontré que les Notch1 joue un rôle essentiel dans la plasticité synaptique dans les neurones de l’hippocampe matures et est essentiel pour la neurogenèse adulte en vivo21,,22. En ce qui concerne cette situation, une localisation spatio-temporelle et quantitative détaillée de clé candidats devraient être soigneusement caractérisés et décrit avant et induction post-HFS par une analyse immunohistochimique de l’expression de c-fos . Les études comme ceci fourniront une preuve directe pour illustrer les changements des modèles d’expression de gène dans différentes régions du cerveau en réponse à un HFS21, qui sera aussi bénéfique pour révéler les changements cellulaires tels que l’activation neuronale, neurogenèse, ou la neurodégénérescence.
Il devrait aussi être noté que malgré les avantages d’une demande de HF-DBS dans la clinique, dû au fait que les résultats de l’effet de stimulation sont étroitement associés avec les paramètres de stimulation et ciblent l’emplacement dans le cerveau, les cellulaires et moléculaires mécanismes sous-jacents aux effets de HFS peuvent être très compliqués. Dans cette étude, nous avons effectué davantage BrdU étiquetage afin d’étudier les effets aigus et chroniques de HFS sur la neurogenèse adulte. Bien que BrdU coloration peut être un marqueur pour la neurogenèse et gliogenesis, basée sur les rapports précédents, la majorité des accrue BrdU neurones positifs observés à la SGZ après qu’un traitement de HF-DBS devrait être la proliférative progéniteurs neuronaux adultes21 , 38 , 39. quelle que soit la complexité des mécanismes qui sous-tendent le traitement HFS, les méthodes et les résultats que nous avons décrit dans ce manuscrit fournissent une preuve directe que répétitive haute fréquence de la stimulation électrique pour activer l’hippocampe DG pourrait induire significativement l’activation de l’activité et la neurogenèse neuronale in vivo.
En résumé, nous avons démontré qu’un HF-DBS peut améliorer l’activité neuronale et la neurogenèse de souris, par rapport à l’activité neuronale et la neurogenèse des souris témoins qui n’ont pas subi un HF-DBS. Cela peut avancer les connaissances scientifiques concernant les effets cognitifs et structuration de la stimulation des HFS en vivo. L’identification d’activation neuronale après un traitement de courte durée HF-DBS directement ou indirectement en vivo montre qu’un traitement de HFS a des effets importants sur la transmission synaptique des connexions locales et à longue distance. L’induction rapide d’activation neuronale après un traitement de HF-DBS fournit un outil puissant pour manipuler la transmission synaptique avec facultés affaiblies ou désynchronisation dans de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques tels que MDD. En revanche, l’induction de la neurogenèse après un traitement de HF-DBS chronique et directe, mais pas aiguë ou indirecte suggère l’efficacité distincte et la variabilité fonctionnelle entre les manières différentes de stimulation électrique. Ces résultats fournissent une preuve directe pour la modulation neuronale et les bénéfices thérapeutiques potentiels de HFS dans l’avenir. Pris ensemble, HF-DBS présentera un avantage substantiel pour le traitement des troubles neurologiques et psychiatriques en intégrant les progrès technologiques réalisés dans la clinique et le mécaniste progrès réalisés dans le laboratoire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à déclarer.
Acknowledgments
Soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine subventions 31522029, 31770929 et 31371149 (à Haitao Wu), programme 973 (2014CB542203) du programme de développement clés Etat pour la recherche fondamentale de la Chine (à Haitao Wu) et Grant Z161100000216154 de la Beijing Municipal Science et Technology Commission (Haitao Wu). Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Haitao Wu pour leur encouragement et discussions. Les auteurs sont extrêmement reconnaissants à Zhenwei Liu pour son aide avec le débogage de l’appareil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
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