Summary
Dieses Protokoll zeigt, wie eine zuverlässige HFS-Methode bei Mäusen einrichten. Neuronen in der hippocampal dentate Gyrus werden durch HFS direkt und indirekt in Vivoelektrisch stimuliert. Neuronale Aktivität und molekulare Signale werden vom c-fos und Notch1 immunofluorescent Färbung, geprüft; Neurogenese wird durch Bromodeoxyuridine Assay Kennzeichnung quantifiziert.
Abstract
Hochfrequenz-Elektrostimulation (HFS) mit implantierten Elektroden Ausrichtung auf verschiedene Gehirnregionen ist als eine wirksame Behandlung für verschiedene neurologische und psychiatrische Störungen nachgewiesen worden. HFS im tiefen Bereich des Gehirns, auch benannt Tiefe Hirnstimulation (DBS), wird in klinischen Studien immer wichtiger. Jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der Hochfrequenz-DBS (HF-DBS) Chirurgie hat damit begonnen, die Möglichkeit der Nutzung diese invasive Technik auf andere Situationen, wie z. B. die Behandlung von schweren Depressionen Störung (MDD), Zwangsstörungen (OCD), zu verbreiten und so auf.
Trotz dieser wachsenden Anzeichen bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen die segensreiche Wirkungen von HF-DBS rätselhaft. Um diese Frage zu lösen, ist ein Ansatz, implantierte Elektroden verwenden, die spärlich verteilte Subpopulationen von Neuronen durch HFS aktivieren. Es wurde berichtet, dass HFS im anterioren Nucleus des Thalamus zur Behandlung der refraktären Epilepsie in der Klinik verwendet werden könnten. Die zugrunde liegenden Mechanismen könnten im Zusammenhang mit der erhöhten Neurogenese und neuronalen Aktivität verändert. Deshalb sind wir interessiert, die physiologischen Veränderungen durch die Erkennung von neuronaler Aktivität sowie Neurogenese bei der Maus dentate Gyrus (DG) vor und nach der Behandlung der HFS.
In diesem Manuskript beschreiben wir Methoden für HFS die Aktivierung der DG bei Mäusen, direkt oder indirekt und in akuter oder chronischer Weise ausrichten. Darüber hinaus beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Zubereitung von Gehirnscheiben für c-fos und Notch1 immunofluorescent Färbung um die neuronale Aktivität zu überwachen und Signalisierung Aktivierung und Bromodeoxyuridine (BrdU) beschriften, um festzustellen, die Neurogenese nach HF-DBS-Induktion. Die Aktivierung der neuronalen Aktivität und Neurogenese nach der HF-DBS-Behandlung bietet direkte neurobiologische Erkenntnisse und mögliche therapeutische Vorteile. Insbesondere kann diese Methodik verändert und auf anderen interessierten Gehirnregionen wie den Basalganglien und subthalamic Regionen für bestimmte Hirnerkrankungen in der Klinik angewendet werden.
Introduction
HF-DBS ist eine Neurochirurgische Technik für elektrische Stimulation des Gehirns, die seit den 1870er Jahren1entwickelt wurde. In den späten 1980ern HFS diente zuerst als eine mögliche therapeutische Intervention für Morbus Parkinson und andere Bewegung Störungen2. In den letzten Jahrzehnten hat HF-DBS mehr und mehr verbreitet in der Behandlung von Erkrankungen des Gehirns, die derzeit unheilbar sind durch eine traditionelle therapeutische Strategie. Insbesondere durch die genauigkeitsverbesserung der HFS-Elektrode, hochwirksame Resultate und minimalen Nebenwirkungen, die Zahl der Erkrankungen des Gehirns von HF-DBS behandelt deutlich gestiegen in den letzten Jahrzehnten3,4, 5. Zum Beispiel wurde HF-DBS von der US Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung der Parkinson-Krankheit (PD), Typ Alzheimer Demenz, essentiellem Tremor und andere Arten von Bewegung Störungen2,6, genehmigt 7. bei Parkinson-Patienten, die dopaminergen Medikation reduziert bis zu 50 % bei HF-DBS-8. Neben der erfolgreichen Behandlung von Bewegungsstörungen zeigen HF-DBS auch seine starke Effekte bei der Behandlung von psychiatrischen Erkrankungen in der Klinik und für kognitive Augmentation als gut2,9, 10 , 11. es sollte angemerkt werden, dass die Erforschung der HFS für die Behandlung von anderen psychiatrischen Erkrankungen sind in verschiedenen Stadien, bietet viel versprechend für Patienten12.
Obwohl viele Studien gezeigt haben, dass eine fokale HFS sowohl lokale als auch remote Auswirkungen im gesamten Gehirn13hat, bleiben die neurologischen und molekularen Mechanismen der Wirkung schwer fassbaren2,14. In der Klinik gilt therapeutischen HF-DBS in der Regel in einer langfristigen Weise für die Behandlung der Parkinson-Krankheit und chronische Schmerzen, etc. , die viele Meinungen ausgelöst werden, um zu erklären, die Verbesserung, erzeugt durch eine HF-DBS-Behandlung, unter denen eine Möglichkeit dass der HFS-Strom der neuronalen Netzwerk-Aktivität, wahrscheinlich durch eine sich wiederholende Depolarisation der Axone in der Nähe der implantierten Elektrode HFS moduliert. Oder HF-DBS die Fördermenge der Ausgang Neuronen und die geplanten Ziele ändern können. Auch HF-DBS führen kann zu langfristigen synaptischen Veränderungen, einschließlich Langzeitpotenzierung (LTP) und langzeitdepression (LTD), die auf eine symptomatische Verbesserung beitragen kann. Bisher ist noch unklar, ob HFS Janin die wichtigsten molekularen Ereignisse, die regulieren zelluläre Prozesse wie als adulten Neurogenese in Vivo. Mehrere Zeilen von Studien haben gezeigt, dass HFS bei Nagetieren ähnliche Neuronale Reaktionen von klinisch angewandter DBS15,16imitieren konnte. Um zu verstehen, die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen der HF-DBS, in dieser Studie richten wir zunächst eine in Vivo HFS Methodik bei Mäusen in einer akuten (ein Tag) oder chronische (fünf Tage) Art und Weise. Zweitens, richten wir eine Methodik der Aktivierung zu bestimmen, die Veränderung der neuronalen Aktivität und Neurogenese im Auslieferzustand eine HF-DBS.
Da die neuronale Produktion von neuralen Stammzellen während der embryonalen Entwicklung reichlich ist aber Erwachsenenlebens andauert, ist die hippocampale subgranular Zone eines der wichtigsten Gebiete wo die Neurogenese auftritt. Der Prozess der Neurogenese wird von vielen physiologischen und pathologischen Faktoren beeinflusst. In bestimmten epileptischen Fällen ist die hippocampale Neurogenese drastisch verringerte17,18. Darüber hinaus konnte eine einzelne Elektrokrampftherapie die neuronale Produktion im dentate Gyrus19deutlich steigern. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die elektrophysiologische Aktivität eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der adulten Neurogenese und Synaptische Plastizität in hippocampal Neuronen spielt. Daher, um die Auswirkungen von HF-DBS auf neuronaler Aktivität und Neurogenese unter Beweis zu stellen, wir führen zunächst eine Immunostaining Assay der unmittelbaren frühen gen (IEG)- c-fos ist ein bekannter Marker für kurzfristige neuronaler Aktivität infolge Erleben Sie20. Notch1 Signalisierung wird auch erkannt, um die Signalisierung Aktivierung nach der HFS Lieferung21,22zu überwachen. Darüber hinaus erkennen wir auch die neuronale Produktion durch eine BrdU Kennzeichnung Analyse nach der HF-DBS-Induktion in verschiedenen Manieren, obwohl BrdU Färbung auch als Marker für Gliogenesis sein kann.
In der vorliegenden Studie werden zwei HFS-Methoden, die Aktivierung der hippocampalen GD direkt und indirekt Zielen angepasst. Die Elektrode wird direkt in der DG implantiert oder in den Projektionen, die DG-Neuronen aktivieren sendet medialen Perforant Weg (PP) implantiert. Für die HF-DBS-Induktion ist eine programmierbare Stimulator für eine kontinuierliche Stimulation über die festen Elektrode auf den Kopf der Maus vorgestellt. Ermitteln Sie die Auswirkungen der HFS auf neuronalen Aktivierung und Neurogenese, erkennen wir den Ausdruck von c-fos und Notch1 durch immunofluorescent Färbung und die Anzahl der BrdU integriert positive Neuronen im Großraum hippocampal DG jeweils nach die HFS-Behandlung. Insbesondere werden die Auswirkungen von HF-DBS auf die Neurogenese in der DG zwischen dem eine akute und eine chronische Stimulation oder zwischen einer direkten und einer indirekten Stimulierung Weise bzw. verglichen.
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Protocol
Tierische Verfahren experimentelle der institutionellen Richtlinien von der Beijing Institute of Basic Medical Sciences (Beijing, China) und der chinesischen staatlichen Regelungen für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Mäuse (Erwachsene männlich, 26 ~ 30 g) untergebracht waren, und hielt bei einer konstanten Temperatur von 23 ° C, mit Wasser und Nahrung Ad Libitum, unter einen 12 h Licht/12-h dunklen Zyklus (Leuchten bei 07:00). Alle experimentelle Verfahren wurden während der Licht-Zyklus durchgeführt.
(1) chirurgische Vorbereitung
Hinweis: Eine benutzerdefinierte Elektrode war hausgemacht mit der Methode von Halpern es Bericht23geändert.
- Verwenden Sie 2 Mikro-Kupferdrähte (mit einem äußeren Durchmesser von 200 µm) als parallele bipolare Elektrode. Wickeln Sie die Elektroden umeinander, zylindrische Elektroden zur Stimulation zu bilden.
Hinweis: Hier wurde die Elektrodenlänge innerhalb der PP oder DG nach anatomischen Tiefe des Kerns variiert. - Sterilisieren Sie die Elektroden mit einem Ethylen oxid Desinfektion Gehäuse. Handhabung und Lagerung hausgemachte 2-Kanal Micro-Wire Elektroden ohne jegliche Kontamination. Die Elektroden sollten unbedingt vor jedem chirurgischen Implantation sterilisiert werden.
- Autoklaven der chirurgischen Instrumente.
- Spritzen Sie vor der Operation die Maus mit Pentobarbital (20-50 mg/kg) intraperitoneal, um eine chirurgische Ebene der Narkose zu erreichen.
- Spritzen Sie die Maus mit einer sterilen Penicillin G Procain Suspension (75.000 U, i.m.) und ein schmerzstillende Mittel (Carprofen, 0,05 - 1 mg/kg, SC) zu verringern das Risiko von Infektionen und Schmerzen, bzw.24.
- Gelten Sie nach der tierischen Narkose ein Auge Schmiermittel für beide Augen, Augentrockenheit zu verhindern. Sorgen Sie für die Induktion der Sedierung und die Tiefe der Narkose durch Reflexe des Tieres als Reaktion auf Zeh Kneifen und fahren mit dem Betrieb nur, wenn keine Reaktion erfolgt.
Hinweis: Vet-Salbe ist eine weitere Option, Augentrockenheit zu verhindern. - Rasieren Sie die meisten das Fell auf der Oberseite der Maus-Kopf mit elektrischen Haarschneidemaschinen oder einer Rasierklinge zu, Sterilisieren Sie den rasierten Bereich mit drei wechselnden Peelings von 70 % Alkohol und Betadine Lösung und den Betrieb fortsetzen Sie, nachdem der Betadine auf der Haut getrocknet ist.
(2) hochfrequente Stimulation Chirurgie25,26
Hinweis: In diesem Schritt wird eine Elektrode einseitig implantiert in der dorsalen DG oder medialen PP-Bereich, ein Teil des Hippocampus mit kritischen Rollen in episodischen lernen und Gedächtnis.
- Platzieren Sie die narkotisierten Maus auf der Stereotaktische Rahmen. Um die Maus Kopf unbeweglich zu halten, die Ohr-Bars richtig ausrichten und schnell zu installieren. Ziehen Sie vorsichtig an den Ohr-Bars, so dass sie zentriert Kopf zu unterstützen und die Maus etwas zu sichern.
- Eine Thermostat-Pad verwenden, um das Tier Körpertemperatur auf 37 ± 0,5 ° C.
- Verwenden Sie Zange zu fassen die Haut anterior-Mouse-Ohren und schneiden Sie es mit einer sterilisierten Schere, über 1 cm-2 -Gebiet der Haut auf der Oberseite der Maus Schädel zu entfernen.
Hinweis: Eine kleine Menge von Blutungen konnte an den Rändern der geschnittenen Haut beobachtet werden. - Entfernen Sie den Muskel und andere Anlage über den Schädel mit einem Wattestäbchen, die Schädel-Oberfläche verfügbar zu machen. Verwenden Sie ein Wattestäbchen und sezierenden Meißel, um alle Knochenhaut, Sehnen und Bindegewebe von des Schädels Oberfläche komplett auf die sagittale identifizieren und Lambda-Nähte Linien zu reinigen.
- Identifizieren Sie die Bregma und Lambda-Punkt. Schnittpunkt der Kranznaht und die sagittale Naht auf der überlegenen Mittelteil der Calvaria befindet sich die Bregma. Der Schnittpunkt der lambdoid Naht durch die sagittale Naht ist wo der Lambda-Ausdruck sichtbar ist. Verwenden Sie die Bregma als den ursprünglichen Punkt, die anderen Kern Position festzulegen.
- Stellen Sie nach der Identifizierung der Bregma und Lambda-Position auf dem Schädel diese beiden Punkte in der horizontalen Ebene. Stellen Sie sicher, dass die Höhe dieser beiden Punkte fast das gleiche in Richtung dorsal-Ventral ist (Fehler sollte < 0,05 mm). Stellen Sie außerdem sicher, dass der Schädel in der Medial-laterale Richtung in der gleichen Weise26ist.
- Montieren Sie für eine einseitige Operation einen hausgemachte 2-Kanal-kupfernen-Mikro-Draht-Elektrode in den rotierenden Elektrodenhalter auf die Stereotaktische Chirurgie Rahmen.
- Legen Sie die Elektrode senkrecht über dem Punkt Bregma zuerst, und legen Sie es als original-Website. Nutzung der digitalen angezeigt Stereotaktische chirurgischen Rahmen um der anterior-posterioren (AP), Medial-laterale (ML), anzugeben und dorsal-Ventral (DV) positioniert.
Hinweis: Damit die Elektrode nicht immer gebogen, berühren Sie nicht die Elektrodenspitze auf den Schädel während des Betriebs. - Ziehen Sie die Elektrode vorsichtig in die richtige Position (Abbildung 1A, AP-2.1/ML ± 1,0 für DG und AP-3,8/ML ± 3.0 für PP, beziehungsweise)27 über den Schädel ohne jede Berührung. Wenn die gewünschte Seite zum einführen der Elektrode identifiziert wurde, verwenden Sie den dorsoventral stereotaktischen Anpassungen höher des Elektroden-Halters, und markieren Sie die Position mit einem schwarzen Marker.
Hinweis: Die genaue Position in Bezug auf die stereotaktischen Koordinaten variieren je nach Maus Belastung, Gewicht und Geschlecht. Erwachsener Mäuse des gleichen Geschlechts sollte verwendet werden, um Abweichungen in der Lage zu minimieren. Wenn möglich, sollten präoperativen anatomische Scans zur Bestimmung des Standorts auf einem einzelnen Thema Grundlage27. - Handgeführten Mikromanipulator-gestützte Bohrer verwenden (burr Größe = 0,5 mm), Burr Löcher an der markierten Position genau zu machen. Sterilisieren Sie die Spitze der Grat mit 70 % Ethanol, vor dem Bohren. Die Mini-Bohrer durch den Schädel entlang der z-Achse 0,8 - 1,0 mm ohne Änderung seiner X-Y-Position aufrücken. Verwenden Sie eine sterile Baumwolle Blutungen während der Operation.
Hinweis: Um überbohren und übermäßige Wärmeentwicklung während des Bohrens zu vermeiden, stellen Sie sicher die Bohrgeschwindigkeit 15.000-18.000 Umdrehungen pro Minute (u/min) und häufig entziehen der Bohrkrone Bohrlochs alle 8-10 s. - Bohren Sie halten Sie bis die Dura ausgesetzt ist. Verwenden Sie eine verbogene Nadel Knochen Fetzen entfernen, die während des Bohrens entstehen und machen ein Loch auf die Dura ohne Beschädigung der zugrunde liegenden weichen Hirngewebe.
Hinweis: Um Beschädigungen zu vermeiden das Hirngewebe, die verbogene stumpfe Nadel kann auch mit einer feinen stumpfen Pinzette ersetzt werden. - Um zu bestätigen, dass Burr Löcher an der gewünschten Position richtig vorgenommen wurden, verringern Sie die Höhe der Elektrode durch eine Anpassung des Rahmens Stereotaktische Chirurgie und sicherstellen Sie, dass die Elektrode reibungslos durch die Bohrlochs eingefügt werden kann, ohne irgendwelche Hindernisse zu berühren. Wenn ja, fügen Sie langsam die Elektroden bis zu einer Tiefe von 1,8 mm für die Generaldirektion (oder 3,0 mm für PP) von der Oberfläche des Schädels befindet sich an der medialen PP an die GD (PP-DG).
Hinweis: Wischen Sie alle Liquor oder Blut Abflüsse aus den Grat Löcher mit sterilen Baumwolle während des Prozesses der Elektrode Implantation. - Nach dem Einlegen der Micro-Draht-Elektrode in den Schädel Loch, halten Sie es mit ausreichend dental Zement mit einem kleinen Spatel. Da der Zement verdichtet, Schimmel es rund um die eingefügten Elektrode und Schrauben um eine schöne glatte Kappe zu bilden. Debride und die Wundränder desinfizieren.
- Lösen Sie die Elektrode von der Elektrodenhalter. Entfernen Sie die Maus aus der Stereotaktische Rahmen und an einem warmen Käfig zurück.
Hinweis: Warten Sie nach der Operation, mit der Rückkehr der Tiere in ihren Käfigen, bis sie aus der Narkose mit ausreichend Bewusstsein vollständig erholt haben. - Lassen Sie die Maus bewegen sich frei und lassen Sie es für 2 Tage in den Käfig zu erholen. Dann verbinden Sie die Elektrode implantiert Gehirn ein programmierbarer Stimulator über die Maus führt. Richten Sie die Softwareschnittstelle, wie in Abbildung 2dargestellt. Die HFS-Parameter als 6er 6 Züge 6 Pulse bei 400 Hz festgelegt (Abbildung 1B, 100 ms zwischen den Zügen, 20 s zwischen den Serien)28. Legen Sie die Intensität der Stimulation auf 200 μA.
- Liefern Sie eine HFS für den gewünschten Zeitraum festgelegt. Liefern Sie die Stimulation 2 x täglich 08:00 und 20:00
- Für die Kontrollgruppe Implantat-Elektroden in den Mäusen und führen Sie eine Stimulation.
- Für die c-fos -Färbung, stimulieren die experimentellen Mäuse akut (2 X pro Tag). Für die Kennzeichnung von BrdU, teilen die experimentellen Mäuse in einer akuten Stimulation-Gruppe (2 X pro Tag angewendet) und eine chronische Stimulation-Gruppe (angewandte 10 X in 5 Tagen, 2 X pro Tag). Im Verlauf der Stimulation sicherstellen Sie, dass die Maus wach ist. Denken Sie daran, um sicherzustellen, dass die Leitungen nicht verdreht sind.
Hinweis: Am letzten Tag des Verfahrens waren die Mäuse in der akuten Stimulation Gruppe stimuliert gleichzeitig. - Wenn die Stimulation erfolgt trennen Sie sorgfältig die Elektrode Pin der Elektrodenhalter und Stecker von der Recording-System.
(3) Immunfluoreszenz-Färbung und Bromodeoxyuridine Kennzeichnung29
- Für die c-fos und Notch1 Färbung ca. 3 h nach der letzten HF-DBS-Stimulation zu betäuben die Mäuse durch Injektion von Pentobarbital (20-50 mg/kg, i.p.) um eine chirurgische Ebene der Narkose zu erreichen.
- Geben Sie für die Kennzeichnung von BrdU ca. 12 h nach der letzten HF-DBS-Stimulation, 6 Injektionen von BrdU auf das Steuerelement und die stimulierte Mäuse in 2-h-Intervallen (50 mg/kg in 0,9 % Kochsalzlösung, i.p.). 36 h nach der letzten Injektion zu betäuben die Mäuse durch Injektion von Pentobarbital (20-50 mg/kg, i.p.) um eine chirurgische Ebene zu erreichen.
- Stellen Sie Einschnitte mit einem Skalpell durch den Brustkorb zu entlarven die Herzen und übergeben Sie dann eine stumpfe Perfusion 22-Gauge-Nadel an der linken Herzkammer. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof. Transcardially es durchspülen mit 50 mL kalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefolgt von 50 mL kalten 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer (pH 7,4).
Hinweis: Wechseln Sie die PBS zu der PFA wenn die Maus Blut in Vivo ersetzt wird und die Flüssigkeit klar läuft. Eine gute Durchblutung kann durch die Lichtung der Leber beurteilt werden. Die Perfusion sollte gestoppt werden, sobald Fixierung Zittern30beobachtet wurden. - Enthaupte die Maus mit ophthalmologischen Schere, einen Einschnitt auf der Haut machen und setzen den Schädel. Mit Pinzette, Chip aus dem Schädel leicht und vorsichtig zerlegen die ganze Mäusegehirn. Post-ausflug des Gehirns in 4 % Paraformaldehyd für weitere 2 Tage und überträgt es auf eine 30 % Saccharoselösung bei 4 ° C über Nacht.
- Die Gehirn mit einem Kryostat geschnitten 20 µm koronalen Abschnitte. Übertragen Sie und montieren Sie die Abschnitte auf dem Objektträger mit einer Bürste und bei-20 ° c Lagern
Hinweis: Tiere mit Elektrode Misplacements oder übermäßige mechanische Schäden werden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. - Übertragen Sie die Folien in normalen PBS (0,1 M, pH 7,4), enthält keine Fixiermittel. Waschen Sie die Scheiben mit PBS für 3 bis 4 X 5 min jede, jede überschüssige Fixativ zu entfernen. Für die Gruppe mit der Bezeichnung von BrdU in den Abschnitten 2 N HCl für 30 min bei 37 ° C inkubieren und spülen Sie sie in eine 0,1 M Borat-Puffer (pH 8,4; 10 min). Dann waschen Sie die Scheiben 2 X für 5 min in PBS.
Hinweis: Immunostaining wird dann durchgeführt. - Behandeln Sie Scheiben durch Inkubation in blocking-Lösung (1 % normalem ziegenserum, Rinderserumalbumin < BSA > 3 %, 0,5 % Triton x-100 und 0,02 % Natriumazid in 1 X PBS) für 1 h bei Raumtemperatur (RT).
- Über Nacht inkubieren Sie die Scheiben mit Anti -c-fos polyklonalen Antikörper (1: 500, Kaninchen), Anti-Notch1 Antikörper (01:50, Ziege) oder Anti-BrdU Antikörper (1:800, Ratte) in die blockierende Lösung bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Scheiben 3 X mit PBS-Puffer, dann Brüten sie mit Alexa Fluor 568-konjugierten Anti-Kaninchen (1: 500), Alexa Fluor 488-konjugierten Anti-Ziege (1:1, 000), oder Alexa Fluor 488-konjugierten Anti-Ratte (1: 500) sekundäre Antikörper für 1 h bei RT
- Waschen Sie die Proben 3 X mit PBS-Puffer (10 min jedes Mal). Decken Sie die Immuno-Label Gehirn-Abschnitte mit einem Anti-Fade Reagenz Eindeckmittel mit DAPI. Lassen Sie die Scheiben an der Luft trocknen und bei 4 ° c lichtgeschützt aufbewahren
- Bilder der hippocampal Bereiche stimuliert und unstimulierte seitlich des Gehirns mit einem hochauflösenden Mehrkanal (sequenziell) Scannen confocal Mikroskop zu erwerben. Legen Sie die bildgebenden Parameter konstant zwischen Steuerung und experimentellen Gruppen.
- Führen Sie ein Mosaik-Bildgebung mit einer hohen Vergrößerung Ziel (20 X Luft Ziel, NA 0,45) kontinuierliche 3D-Bilder (XYZ) der angrenzenden Gesichtsfelder mit motorisierten Stage erwerben und nutzen Sie geeignetsten Software, um sie große Verbund zusammen zu nähen Bilder.
Hinweis: Tiling Funktionen enthalten echte Nähte und Optionen für verbesserte nahtlose Bilder glätten. Zusammengesetzte Bilder sind schnell und einfach zubereitet stitching-Funktion, um ein Bild über ein weites Gebiet zu bilden. - Führen Sie für c-fos und Notch1 Färbung eine positive Kerne Quantitative Analyse der immunofluorescent Dichte21 der Gestickte Bilder. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie 3 Bereiche in den rostral, dorsalen und ventralen hippocampalen DG Teilregionen und Messen Sie die immunofluorescent Dichte in eine doppelblinde Weise mit Bild J Software (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
- Analysieren Sie für eine BrdU Kennzeichnung die Scheiben um die Bohrungen Punkt durch den dorsalen Hippocampus (-1,70 mm bis-2,70 mm im Vergleich zu den Bregma) in gewissem Sinne doppelblinde.
- Zählen Sie nur BrdU-positiven Neuronen in der DG. Zählen der Zellen liegen innerhalb von 2-Zelle Durchmesser der Granulat-Zelle in der Graf.
Hinweis: Hier zählen erfolgte mittels einer 40 X Luft Ziel. Nach dem Zufallsprinzip, 3-5 Abschnitte pro Tier wurden gezählt, und die Grafen wurden gemittelt und als Mittel pro DG19ausgedrückt.
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Representative Results
Im Anschluss an die HF-DBS-Stimulation der hippocampalen DG Subregion direkt oder PP Subregion im Hinblick auf die DG indirekt aktivieren über eingefügt Elektroden verwenden die stereotaktischen Anpassungen, die Nagetiere wurden mit Pentobarbital betäubt und beprobt 3 h nach der letzten HF-DBS-Stimulation für die c-fos und Notch1 Immunostaining. Für die BrdU Färbung, 36 h nach der letzten Injektion von BrdU nach 1 Tag oder 5 Tage der HF-DBS Stimulation, wurden die Nagetiere mit Pentobarbital für die Vorbereitung des Gehirns Abschnitte betäubt. Abbildung 3 zeigt, dass die Expression von c-fos in der ipsilateralen Seite der DG deutlich erhöht wurde. Darüber hinaus wurde die c-fos -Ausdruck in der kontralateralen Seite der GD auch hochreguliert im Vergleich zu den keine-HF-DBS Stimulation-Kontrollen, die fast kein Ausdruck eines c-fos -Signals zeigte. Basierend auf der Notch1-spezifische immunofluorescent Färbung in Hirnschnitten, wie zusätzliche Abbildung1 gezeigt, wir weiter gezeigt, dass die Notch1 Signalisierung auch in der Erwachsenen hippocampal DG nach dem HFS-Stimulation durch eine Induktion aktiviert werden konnte der die Depolarisation von Neuronen in der PP (siehe auch die Rohdaten als ergänzende Datei 1geliefert).
Neben der direkten Stimulation der HF-DBS in der DG-Subregion, Abbildung 4A zeigt die Position und die HF-DBS Stimulation Website der Elektrodenspitze, die in der medialen PP. Abbildung 4B installiert wurde gezeigt, dass die HF-DBS Stimulation in der PP nicht nur deutlich erhöht das Niveau der c-fos Expression in der ipsilateralen Seite der DG, sondern erhöht auch die Expression von c-fos in der kontralateralen Seite der GD im Vergleich zu den keine-HF-DBS-stimulation Kontrollen.
Basierend auf der BrdU demonstrierte Kennzeichnung Analyse der Gehirnscheiben, siehe Figuren 5A - 5 C, wir weiter die Neurogenese auch in der Erwachsenen hippocampal DG nach einer chronischen (5 Tage) HF-DBS-Stimulation in der DG direkt aktiviert werden kann. Eine chronische Stimulation der HF-DBS in der DG nicht nur deutlich hochreguliert der Neurogenese in der ipsilateralen Seite aber auch erhöht die Neurogenese in der kontralateralen Seite im Vergleich zu den keine-HF-DBS Stimulation Kontrollen. Jedoch nicht die akute (1 Tag) Stimulation induzieren eine Hochregulation der Neurogenese ipsilateralen Seite oder in der kontralateralen Seite der DG. Wie in Abbildung 5D, entweder in der akuten Stimulation-Gruppe oder in der Gruppe chronische Stimulation könnte eine indirekte HF-DBS in der PP nicht die Neurogenese in der hippocampal DG ändern.
Abbildung 1 . Schematische Darstellung des Gehirns Ziele der Elektrodenspitze und Parameter der HFS. (A) die neuronalen Projektion des medialen Perforant Weg in eine minderwertige Klinge dentate Gyrus wird angezeigt. Die Position der eingelegten Elektroden (in lila) zur Förderung der DG direkt oder Subregion PP angegeben. (B) der HFS-Parameter wird als 6-Serie von 6 Züge von 6 Impulsen bei 400 Hz mit 100 ms zwischen den Zügen und 20 s zwischen den Serien. CA = Cornu Ammonis; DG = dentate Gyrus; PP = Perforant Weg. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Schnittstelle und Parameter für die Multistimulator. Der Stimulator wurde an einen Digital-Analog-Wandler angeschlossen und durch proprietäre Software aktiviert. Der Reiz der HFS war monophasisch. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Neuronale Aktivierung in der DG in Reaktion auf die HF-DBS Behandlung direkt. (A) die Elektrodenspitze (die ungefüllten Whitebox) war direkt über dem DG-Region positioniert (AP -2,1/1,0 ML / DV + 1,8) mit oder ohne die HFS. Dieses Panel zeigt die Immunostaining koronalen Teil der Gehirnscheiben miteinem c-fos -Antikörper in der Kontrolle und der HFS-Gruppen. DAPI blaue Färbung wurde verwendet, um die Position der Kerne hippocampal zeigen. Die Maßstabsleiste = 100 µm. (B) dieses Panel zeigt eine Quantitative Analyse der Immunfluoreszenz-Signaldichte. In der ipsilateralen Seite der DG die Neuronen wurden deutlich mit eine hohe Expression von c-fosaktiviert und die c-fos -Ausdruck in der kontralateralen Seite der GD auch relativ erhöht im Vergleich zum c-fos Ausdruck Kontroll-Mäusen ohne eine HFS-Behandlung. ± SEM, einfache ANOVA bedeutet F2,24 = 216, P < 0,0001, Bonferroni Post Hoc Test ***P < 0,001, nkeine-Sti = 9 (3 Scheiben aus 3 Mäuse), nHFS Contra = 9 (3 Scheiben/Maus aus 3 Mäuse), nHFS-IPS = 9 (3 Scheiben/Maus von 3 Mäuse). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Neuronale Aktivierung in der DG als Reaktion auf die HFS in der PP-Subregion. (A) die Elektrodenspitze (die ungefüllten Whitebox) wurde in der medialen PP an der Position des AP -3,8 ML ±3.0 und DV + 3,0, mit oder ohne die HFS positioniert. (B) dieses Panel zeigt die Immunostaining koronalen Teil der Gehirnscheiben miteinem c-fos Antikörper in die Steuerung und die HFS-Gruppen. DAPI blaue Färbung wurde verwendet, um die Position der Kerne hippocampal zeigen. Die Maßstabsleiste = 100 µm (C) dieses Panel zeigt eine Quantitative Analyse der immunofluorescent Dichte. Die HFS-Behandlung in der PP konnte deutlich ipsilateral Neuronen in der DG mit eine hohe Expression von c-fosaktiviert werden. Die Expression von c-fos in der kontralateralen DG ist auch relativ im Vergleich zu c-fos Ausdruck Kontroll-Mäusen ohne eine HFS-Behandlung erhöht. Bedeutet ± SEM, einfache ANOVA F2,24 189,3, P = 0,0001 <, Bonferroni Post Hoc Test ***P < 0,001, nkeine-Sti = 9 (3 Scheiben aus 3 Mäuse), nHFS Contra = 9 (3 Scheiben/Maus aus 3 Mäuse), nHFS-IPS = 9 (3 Scheiben/Maus von 3 Mäuse). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Unterschiedliche Aktivierung der Neurogenese in der DG als Reaktion auf HFS in DG und PP bzw.. (A) dieses Panel zeigt eine experimentellere Paradigma für die HFS-Behandlung und die Generierung von BrdU beschriftet wuchernden Neuronen in der DG. Die Tiere wurden in eine akute und eine chronische Gruppe eingeteilt. Im Bereich "akut" die Mäuse ausgesetzt waren eine HFS-Behandlung 2 X am Tag 5. Im Bereich "chronische" die Mäuse eine HFS-Behandlung für 5 Tage ausgesetzt waren (von Tag 1 bis Tag 5, 2 X pro Tag). Dann wurden die Tiere in beiden Gruppen mit BrdU (50 mg/kg, 6 X 2-h-Intervallen) am 6. Tag injiziert. Am 8. Tag wurden die Tiere betäubt und für die Vorbereitung der Kryostat Abschnitte durchblutet. (B) zeigt dieses Fenster die immunofluorescent Färbung von BrdU (in grün) Post-HF-DBS in der DG. (C) eine Quantitative Analyse der neuronalen Produktion darauf hingewiesen, dass die akute (2 X 1 Tag) Stimulation in der DG könnte nicht verbessern die Neurogenese, während die chronische Stimulation (10 X innerhalb von 5 Tagen) in der DG deutlich die Neurogenese hochreguliert. Im Vergleich zur Kontrollgruppe, die Anzahl der BrdU Kennzeichnung Zellen deutlich erhöht in der chronischen Gruppe sowohl in der ipsilateralen und kontralateralen Hemisphäre. Die Maßstabsleiste = 100 µm. Mittel ± SEM, zwei-Wege-ANOVA Stimulation Art Effekt F2, 14 = 97.09, P < 0,0001, Hemisphäre Effekt F1, 14 = 1.137, P = 0.3044, Bonferroni Post Hoc Test ***P < 0,001, n Control = 3 (3 Scheiben aus 3 Mäuse), n1 Tag = 4 (4 Scheiben aus 3 Mäuse), n5 Tage = 3 (3 Scheiben aus 3 Mäuse). (D) zeigt dieses Fenster die Immunfluoreszenz-Färbung von BrdU (in grün) Post-HF-DBS in der PP-Subregion. (E) A Quantitative Analyse der neuronalen Produktion darauf hingewiesen, dass die akute (zweimal an einem Tag) oder chronische (10 X in 5 Tagen) Stimulation im PP könnte die Neurogenese nicht erheblich verbessern. Die Anzahl der BrdU Kennzeichnung Zellen war relativ stabil, mit oder ohne die HFS-Behandlung. Die Maßstabsleiste = 100 µm. Mittel ± SEM, zwei-Wege-ANOVA Stimulation Art Effekt F2, 16 = 0.9025, P = 0.4252, Halbkugel-Effekt F1, 16 = 1.402, P = 0.2537, Bonferroni post Hoc Test, P > 0,05, n Control = 3 (3 Scheiben aus 3 Mäuse), n1 Tag = 3 (3 Scheiben aus 3 Mäuse), n5 Tage = 5 (5 Scheiben aus 3 Mäuse). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung 1. Ausdruck des Notch1 in der DG in Reaktion auf die Behandlung von HF-DBS. (A) dieses Panel zeigt die immunofluorescent Färbung des Notch1 (in grün) 3 h nach der HF-DBS in der DG. Diese Zahl wurde zitiert und von Fengs Bericht21geändert. (B) eine Quantitative Analyse der Fluoreszenz angegeben, dass die HFS in der DG die Expression von Notch1 steigern könnte. Die Maßstabsleiste = 100 µm. Mittel ± SEM, Student t-test, t = 12, ***P < 0,001, nkeine-Sti = 9 (3 Scheiben/Maus von 3 Mäuse), nHFS = 9 (3 Scheiben/Maus von 3 Mäuse). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Datei 1. RAW-Daten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Die HF-DBS-Technik hat als ein mächtiges Werkzeug für die Behandlung von vielen neurologischen Erkrankungen seit den 1990er Jahren verbreitet. Bisher ist das Wahrzeichen Werk von HF-DBS für die Behandlung von Parkinson und essentiellem Tremor, der viel Aufmerksamkeit und das Interesse sowohl in der Klinik und der wissenschaftlichen Gemeinschaft angezogen hat. Es gibt verschiedene Arten der laufenden HF-DBS-Studien von vielen Gruppen für HF-DBS therapeutische Anwendung bestimmte neurologische und psychiatrische Erkrankungen32,33. Einige dieser Studien sind derzeit in verschiedenen Stadien der klinischen Studien2,34. Obwohl HF-DBS erheblichen Nutzen bringen sollte, Stimulation Nebenwirkungen können auftreten, sogar mit einer perfekten Platzierung im Gehirn, wie negative Veränderungen in der Stimmung und denken, etc., die reversibel sind und mit Änderungen vermieden werden die Stimulation-Einstellungen.
Neben der bedeutende Fortschritte der HF-DBS-Technologie aus den klinischen Studien in den vergangenen Jahrzehnten gesammelt, die Studien von HF-DBS mit lebenden Tieren stellt auch die Möglichkeit, die physiologischen Veränderungen zu verstehen und neurobiologische durch die elektrische Stimulation induzierte Mechanismen. In dieser Handschrift haben wir eine modifizierte HF-DBS-Methodik durchgeführt bei Mäusen Subregion hippocampale DG mit einem HFS direkt oder indirekt stimulieren beschrieben. Obwohl das beschriebene Protokoll bei Nagetieren durchgeführt wird, wurden HFS Antwort Studien auch erfolgreich in anderen Modellorganismen, darunter Schweine35durchgeführt. Für diese Technik Stereotaktische Chirurgie auch für eine mögliche Kern-gezielte Stimulation lässt sich testen, die Wirksamkeit der HFS mit bestimmten Tiermodellen mit neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen. Die Schlussfolgerungen aus solchen Studien sollten leicht in die Klinik, speziell für die Verfeinerung der HFS auf bestehende Ziele übersetzen. Beachten Sie, dass im Gegensatz zu der Serie von Mehrfachbelichtungen von HF-DBS in der Klinik, in dieser methodische Studie, wir entschieden uns für ein Einzel- und kurzfristige Exposition von HFS zu stimulieren und induzieren die neuronale Aktivität im Hippokampus DG, Parameter und Teil des Paradigmas HFS, die zuvor berichtet wurde, in der Hippocampus-Scheiben-21,-28LTP induzieren.
Allgemeine Einschränkungen der HF-DBS wurden umfassend überprüft an anderer Stelle24,25. Eine der Herausforderungen für das Experiment hier ist auch die Notwendigkeit für eine hervorragende Operationstechnik und der laufenden Betreuung chirurgische anatomische Locus. Um richtig und präzise Implantat Elektrode in den Ziel-Kern für die Stimulation, ist einer der Schlüsselprozesse eine erfolgreiche Operation von einem qualifizierten Techniker zur Vermeidung von unnötigen Blutgefäß Verletzungen und das Abhandenkommen der Elektrode. Darüber hinaus weitere anatomische und histologische Analyse der Probe Gehirn mussten auch bestätigen die korrekte Ausrichtung der Elektrode nach einem HFS. Dies ist auch einer der Vorteile dieses Ansatzes zu zeigen die korrigierte Ausrichtung der Elektrode nach der Operation in einer intakten tierischen Gehirns. Viele von den Angaben in diesem Protokoll können für eine langfristige Stimulation über einen implantierten Stimulator in das Tier leicht angepasst werden. Es sei darauf hingewiesen, dass es auch offen für alternative Stimulationsparameter in potentielle therapeutische Gehirn Ziele mit verschiedenen Mustern der HFS-Lieferung. Jedoch berichtet in diesem Artikel auf eine Monoblock-akute HFS geliefert von einem programmierbaren Stimulator zu verstehen, die Zellveränderungen nach der elektrischen Stimulation.
Obwohl HF-DBS als Alternative für die Behandlung von neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen in der Klinik seit einigen Jahren dient, bleiben die Mechanismen, die seine Wirksamkeit schlecht verstanden. In Anbetracht der Nutzung und künftige Verbesserungen der HF-DBS ist ein pragmatischer Ansatz erforderlich. Als dritten Werkzeug braucht die HFS-Technik weitere technische Innovation und mechanistischen Entdeckung. Um die zellulären und molekularen Mechanismen der HF-DBS zu untersuchen, wird eine globale Transkriptom-Analyse basierend auf Hochdurchsatz-Sequenziertechnologien wichtige Informationen um zu verstehen, die molekularen Ereignisse und Signalisierung Veränderungen nach einer HF-DBS-Induktion bieten. 36. neben der unvoreingenommene screeningstrategie aufgrund der Prüfung der vorhandenen molekularen Kandidaten die sich bewährt haben, reagieren auf neuronale Depolarisation wird es wohl auch geben wichtige Aufschlüsse zur Identifizierung der wichtigsten Effektoren verantwortlich für HFS mit. C-fos ist hochreguliert in Reaktion auf intrinsische neuronaler Aktivität, so betrachtet man seinen Ausdruck würde mindestens bieten uns eine Landschaft von Neuronen feuerte kürzlich37. Jedoch sollten c-fos nicht nur verwendet werden, nur Aktivitäten widerspiegeln, da es offenbar auch Neuronen in der LTP37markieren. Frühere Werken, einschließlich der unsrigen, haben gezeigt, dass Notch1 eine entscheidende Rolle in der synaptischen Plastizität in Reife hippocampal Neuronen spielt und unerlässlich für die adulten Neurogenese in Vivo21,22 ist. In Bezug auf diese Situation, eine detaillierte quantitative und räumlich-zeitliche Lokalisierung der Schlüssel Kandidaten sollten sorgfältig gekennzeichnet und beschrieben Pre- und Post-HFS Induktion durch eine immunhistochemische Analyse von c-fos Expression. Studien wie diese bieten direkte Beweise, um die Veränderungen des Gens Expressionsmuster in verschiedenen Gehirnregionen in Reaktion auf eine HFS21, zu demonstrieren, die auch für die Zellveränderungen wie neuronale Aktivierung offenbaren Vorteil sein wird, Neurogenese oder Neurodegeneration.
Es sollte auch darauf hingewiesen, dass trotz der Vorteile einer HF-DBS-Anwendung in der Klinik, dass die Ergebnisse des Effekts Stimulation eng verbunden mit der Stimulationsparameter sind und in das Gehirn, die zellulären und molekularen Zielort Mechanismen, die HFS Effekte können sehr kompliziert sein. In dieser Studie haben wir weitere durchgeführt BrdU Kennzeichnung auf um die akute und chronische Effekte von HFS auf adulten Neurogenese zu untersuchen. Obwohl BrdU Färbung ein Marker für die Neurogenese und Gliogenesis sein kann, basierend auf früheren Berichten, die Mehrheit der erhöhten BrdU positive Neuronen bei der SGZ beobachtet, nach eine HF-DBS-Behandlung sollte die proliferative Erwachsenen neuronalen Vorläuferzellen21 , 38 , 39. unabhängig von der Komplexität der Mechanismen, die die HFS-Behandlung, die Methoden und Ergebnisse, die wir in dieser Handschrift beschrieben bieten direktem Beweis, dass sich wiederholende hochfrequente elektrischen Stimulation aktivieren die hippocampale DG die Aktivierung der neuronalen Aktivität und Neurogenese in Vivokonnte deutlich induzieren.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass eine HF-DBS verbessern kann, die neuronale Aktivität und Neurogenese von Mäusen, verglichen mit der neuronalen Aktivität und Neurogenese von Kontroll-Mäusen, die keine HF-DBS unterzogen. Dies kann das wissenschaftliche Verständnis über kognitive Effekte und Stimulation Strukturierung von HFS in Vivovoraus. Die Identifizierung der neuronalen Aktivierung nach einer HF-DBS Akutbehandlung direkt oder indirekt in Vivo zeigt, dass eine HFS-Behandlung erhebliche Auswirkungen auf die synaptische Übertragung von lokalen und Langstrecken-Verbindungen hat. Die schnelle Induktion der neuronalen Aktivierung nach einer HF-DBS-Behandlung ist ein leistungsstarkes Tool zu manipulieren beeinträchtigte synaptische Übertragung oder desynchronization in vielen neurologischen und psychiatrischen Störungen wie MDD. Auf der anderen Seite schlägt die Induktion der Neurogenese nach einer chronischen und direkte, aber nicht akut oder indirekte HF-DBS-Behandlung unterschiedliche Wirksamkeit und funktionale Variabilität zwischen verschiedenen Elektrostimulation Manieren. Solche Erkenntnisse liefern direkte Beweise für die neuronale Modulation und möglichen therapeutischen Vorteile von HFS in der Zukunft. Zusammengenommen wird HF-DBS erhebliche Vorteile für die Behandlung von neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen durch die Integration der technologischen Fortschritte in der Klinik und die mechanistische Fortschritte im Labor vorstellen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verzollen.
Acknowledgments
Unterstützt von der National Natural Science Foundation China Zuschüsse, 31522029, 31770929 und 31371149 (um Haitao Wu), Programm 973 (2014CB542203) aus dem Staat wichtige Entwicklungsprogramm für die Grundlagenforschung von China (, Haitao Wu) und Grant Z161100000216154 aus der Beijing Municipal Science and Technology Kommission (, Haitao Wu). Die Autoren danken allen Mitgliedern des Haitao Wu Labor für ihre Ermutigung und Diskussionen. Die Autoren sind sehr dankbar für seine Hilfe beim debugging der Apparat Zhenwei Liu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
References
- Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Kohl, S., et al. Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review. BMC Psychiatry. 14, 214 (2014).
- Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression. Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).
- Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).
- Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).
- Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation for Parkinson's disease and other movement disorders. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).
- Garcia, L., D'Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. High-frequency stimulation in Parkinson's disease: more or less. Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).
- Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats. Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).
- Grubert, C., et al. Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation. The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).
- Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).
- McIntyre, C. C., Hahn, P. J. Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation. Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).
- Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. Sing the mind electric - principles of deep brain stimulation. European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).
- Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).
- Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (97), e52457 (2015).
- Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5 26-41 (2008).
- Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression. Behavioral and Brain Functions. 6, 35 (2010).
- Feng, S., et al. Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment. The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).
- Alberi, L., et al. Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks. Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).
- Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. A step-wise approach to deep brain stimulation in mice. Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).
- Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration. Journal of Visualized Experiments. (107), e53266 (2016).
- Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation. Journal of Visualized Experiments. (104), e53066 (2015).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6 (2007).
- McHugh, T. J., et al. Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network. Science. 317 (5834), 94-99 (2007).
- Gonzalez, C., et al. Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories. Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tse, N., et al. The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (94), e52220 (2014).
- Pizzolato, G., Mandat, T. Deep brain stimulation for movement disorders. Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2 (2012).
- Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).
- Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).
- Min, H. K., et al. Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals. NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).
- Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. 2015 (11), Cold Spring Harbor Protocols. 951-969 (2015).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Frontiers in Neural Circuits. 8, 37 (2014).
- Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).
- Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
