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Neuroscience

माउस के सक्रियकरण के लिए एक इनवेसिव विधि उच्च आवृत्ति उत्तेजना द्वारा Dentate गाइरस

Published: June 2, 2018 doi: 10.3791/57857
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Neurobiology, Beijing Institute of Basic Medical Sciences, 2Key Laboratory of Neuroregeneration, Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University

Summary

इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे चूहों में एक विश्वसनीय HFS विधि स्थापित करने के लिए । हिप्पोकैम्पस dentate गाइरस भर में ंयूरॉंस विद्युत सीधे और vivo मेंपरोक्ष रूप से HFS द्वारा उत्तेजित कर रहे हैं । न्यूरॉन गतिविधि और आणविक संकेतन द्वारा जांच कर रहे हैं सी-फोस और Notch1 immunofluorescent धुंधला, क्रमशः; neurogenesis को bromodeoxyuridine लेबलिंग परख कर quantified है ।

Abstract

विद्युत उच्च आवृत्ति उत्तेजना (HFS), प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड का उपयोग विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित, विभिन्न स्नायविक और मनोरोग विकारों के लिए एक प्रभावी उपचार के रूप में सिद्ध किया गया है. मस्तिष्क के गहरे क्षेत्र में HFS, भी गहरे मस्तिष्क उत्तेजना (डीबीएस) नाम, नैदानिक परीक्षणों में तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है. उच्च आवृत्ति डीबीएस (HF-डीबीएस) सर्जरी के क्षेत्र में हाल ही में प्रगति इस तरह के प्रमुख अवसाद विकार (MDD), जुनूनी बाध्यकारी विकार (ओसीडी) के लिए उपचार के रूप में अंय स्थितियों के लिए इस इनवेसिव तकनीक के उपयोग की संभावना फैल शुरू हो गया है, और इसलिए पर.

इन विस्तार संकेत के बावजूद, HF-डीबीएस के लाभकारी प्रभाव के अंतर्निहित तंत्र रहस्यपूर्ण रहते हैं । इस सवाल का पता करने के लिए, एक दृष्टिकोण प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए है कि विरल HFS द्वारा न्यूरॉन्स की वितरित उपआबादी को सक्रिय. यह बताया गया है कि thalamus के पूर्वकाल नाभिक में HFS क्लिनिक में दुर्दम्य मिर्गी के उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंतर्निहित तंत्र की वृद्धि हुई neurogenesis और बदल ंयूरॉंस गतिविधि से संबंधित हो सकता है । इसलिए, हम ंयूरॉन गतिविधि का पता लगाने के द्वारा शारीरिक परिवर्तन की खोज में रुचि रखते है और साथ ही माउस dentate गाइरस (डीजी) में neurogenesis से पहले और बाद HFS उपचार ।

इस पांडुलिपि में, हम HFS के लिए तरीकों का वर्णन करने के लिए चूहों में डीजी के सक्रियकरण लक्ष्य, प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से और एक तीव्र या जीर्ण तरीके से । इसके अलावा, हम के लिए मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन c-फोस और Notch1 immunofluorescent के लिए ंयूरॉंस गतिविधि और संकेतन सक्रियण की निगरानी और bromodeoxyuridine (BrdU) लेबलिंग के लिए निर्धारित करने के लिए HF-डीबीएस प्रेरण के बाद neurogenesis । HF-डीबीएस उपचार के बाद न्यूरॉन गतिविधि और neurogenesis के सक्रियण प्रत्यक्ष neurobiological सबूत और संभावित चिकित्सीय लाभ प्रदान करता है । विशेष रूप से, इस पद्धति को संशोधित किया जा सकता है और क्लिनिक में विशिष्ट मस्तिष्क विकारों के लिए बेसल गैंग्लिया और subthalamic क्षेत्रों के रूप में अन्य रुचि मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए लागू.

Introduction

HF-डीबीएस मस्तिष्क, जो 1870 के बाद से विकसित किया गया है में बिजली की उत्तेजना के लिए एक तंत्रिकाशल्यक प्रौद्योगिकी है1। 1980 के दशक में, HFS पहले पार्किंसंस रोग और अंय आंदोलन विकारों के लिए एक संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप के रूप में इस्तेमाल किया गया था2। पिछले कुछ दशकों में, HF-डीबीएस गया है अधिक से अधिक व्यापक रूप से मस्तिष्क विकारों जो वर्तमान में एक पारंपरिक उपचारात्मक रणनीति द्वारा इलाज कर रहे है के इलाज में इस्तेमाल किया । विशेष रूप से, HFS इलेक्ट्रोड की सटीकता में सुधार करने के लिए कारण, अत्यधिक प्रभावी परिणाम, और न्यूनतम साइड इफेक्ट, HF द्वारा इलाज मस्तिष्क विकारों की संख्या-डीबीएस काफी पिछले दशकों में वृद्धि हुई है3,4, 5. उदाहरण के लिए, HF-डीबीएस को पार्किंसंस रोग (पीडी) के उपचार के लिए अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित किया गया है, अल्जाइमर प्रकार मनोभ्रंश, आवश्यक कंपन, और आंदोलन विकारों के अन्य प्रकार2,6, 7. पीडी रोगियों में, dopaminergic दवा HF-डीबीएस8के दौरान ५०% तक कम है । आंदोलन विकारों के सफल उपचार के अलावा, HF-डीबीएस भी क्लिनिक में मनोरोग रोगों के उपचार में अपने शक्तिशाली प्रभाव का प्रदर्शन किया है, और संज्ञानात्मक वृद्धि के लिए के रूप में अच्छी तरह से2,9, 10 , 11. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य मनोरोग विकारों के उपचार के लिए HFS के अनुसंधान विभिन्न चरणों में हैं,12रोगियों के लिए बहुत वादे की पेशकश.

हालांकि कई अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि एक फोकल HFS दोनों मस्तिष्क13में स्थानीय और दूरदराज के प्रभाव है, प्रभाव के स्नायविक और आणविक तंत्र2,14मायावी रहते हैं । क्लिनिक में, चिकित्सीय HF-डीबीएस आम तौर पर पार्किंसंस रोग और पुराने दर्द के उपचार के लिए एक दीर्घकालिक तरीके से लागू किया जाता है, आदि कई राय एक HF-डीबीएस उपचार द्वारा उत्पन्न सुधार समझाने के लिए उठाया जाता है, जो बीच में एक संभावना कि HFS वर्तमान में axons के एक दोहराव से प्रत्यारोपित HFS इलेक्ट्रोड के आसपास के क्षेत्र में, ंयूरॉंस नेटवर्क गतिविधि, शायद संग्राहक । या, HF-डीबीएस उत्पादन ंयूरॉंस और अनुमानित लक्ष्य की निर्वहन दर बदल सकते हैं । इसके अलावा, HF-डीबीएस लंबी अवधि के synaptic परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, दीर्घकालिक potentiation (LTP) और दीर्घकालिक अवसाद (लिमिटेड), जिसमें एक रोगसूचक सुधार करने के लिए योगदान कर सकते हैं । अब तक, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि HFS influences प्रमुख आणविक घटनाओं कि vivo मेंवयस्क neurogenesis जैसे सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित । अध्ययनों की कई लाइनें दिखा दिया है कि कुतर में HFS नैदानिक लागू डीबीएस के समान तंत्रिका प्रतिक्रियाओं की नकल कर सकता है15,16। HF-डीबीएस के अंतर्निहित सेलुलर तंत्र को समझने के लिए, इस अध्ययन में, हम पहले एक तीव्र (एक दिन) या जीर्ण (पांच दिन) तरीके से चूहों में vivo HFS पद्धति में एक सेट. दूसरे, हम एक HF-डीबीएस वितरण के बाद न्यूरॉन गतिविधि और neurogenesis के परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए एक सक्रियकरण विश्लेषण पद्धति की स्थापना की ।

यह देखते हुए कि तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से ंयूरॉन उत्पादन भ्रूण विकास के दौरान प्रचुर मात्रा में है, लेकिन वयस्क जीवन भर में जारी है, हिप्पोकैम्पस उपदानेदार क्षेत्र प्रमुख क्षेत्रों में से एक है जहां neurogenesis होता है । neurogenesis की प्रक्रिया कई शारीरिक और रोग कारकों से प्रभावित है । कुछ मिरगी मामलों में, हिप्पोकैम्पस neurogenesis नाटकीय रूप से17,18में कमी आई है । इसके अलावा, एक एकल electroconvulsive चिकित्सा काफी dentate गाइरस में ंयूरॉन उत्पादन में वृद्धि कर सकता है19। इन टिप्पणियों का सुझाव है कि electrophysiological गतिविधि हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में वयस्क neurogenesis और synaptic प्लास्टिक के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इसलिए, आगे HF के प्रभाव-ंयूरॉन गतिविधि और neurogenesis पर डीबीएस प्रदर्शित करने के लिए, हम पहले बाहर तत्काल जल्दी जीन (IEG) सी-फोस जो अल्पावधि के एक प्रसिद्ध मार्कर है के एक immunostaining परख ले के परिणामस्वरूप ंयूरॉन गतिविधि से उत्पंन 20का अनुभव । Notch1 सिग्नलिंग को HFS डिलिवरी21,22के बाद सिग्नलिंग सक्रियण पर नजर रखने के लिए भी पता चला है । इसके अलावा, हम भी विभिंन शिष्टाचार में HF-डीबीएस प्रेरण के बाद एक BrdU लेबलिंग विश्लेषण द्वारा ंयूरॉन उत्पादन का पता लगाने, हालांकि BrdU धुंधला भी gliogenesis के लिए एक मार्कर हो सकता है ।

वर्तमान अध्ययन में, दो HFS के तरीकों को हिप्पोकैम्पस महानिदेशक के सक्रियण लक्ष्य प्रत्यक्ष और परोक्ष रूप से अनुकूलित कर रहे हैं । इलेक्ट्रोड को सीधे डीजी में प्रत्यारोपित या औसत दर्जे का perforant पथ (पीपी) में प्रत्यारोपित कर दिया जाता है जो डीजी न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए अनुमानों को भेजता है । HF-डीबीएस प्रेरण के लिए, एक प्रोग्राम उत्तेजित करने के लिए माउस सिर पर तय इलेक्ट्रोड के माध्यम से एक सतत उत्तेजना के लिए प्रस्तुत किया जाता है । न्यूरॉन सक्रियण और neurogenesis पर HFS के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, हम immunofluorescent और BrdU महानिदेशक क्षेत्र में हिप्पोकैम्पस-शामिल सकारात्मक न्यूरॉन्स की संख्या, क्रमशः के बाद, फोस और Notch1 की अभिव्यक्ति का पता लगाने. HFS उपचार । विशेष रूप से, HF के प्रभाव-neurogenesis पर डीबीएस के डीजी में एक तीव्र और एक पुरानी उत्तेजना तरीके के बीच तुलना कर रहे हैं, या एक प्रत्यक्ष और एक अप्रत्यक्ष उत्तेजना तरीके के बीच, क्रमशः ।

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Protocol

पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं बीजिंग बुनियादी चिकित्सा विज्ञान संस्थान (बीजिंग, चीन) के संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन किया और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए चीनी सरकारी नियमों । चूहों (वयस्क पुरुष, 26 ~ 30 ग्राम) रखे गए थे और 23 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर तापमान पर रखा, पानी और खाद्य विज्ञापन libitumके साथ, एक 12-h प्रकाश के तहत/12-h डार्क साइकिल (पर 7:00 a.m. पर रोशनी). सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं प्रकाश चक्र के दौरान प्रदर्शन किया गया ।

1. सर्जिकल तैयारी

नोट: एक कस्टम इलेक्ट्रोड Halpern की रिपोर्ट23से संशोधित विधि का उपयोग कर घर का बना था ।

  1. 2 तांबे का प्रयोग करें सूक्ष्म तारों समानांतर द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड के रूप में (२०० µm के एक बाहरी व्यास के साथ) । उत्तेजना के लिए बेलनाकार इलेक्ट्रोड फार्म करने के लिए एक दूसरे के चारों ओर इलेक्ट्रोड लपेट.
    नोट: यहां, या तो पीपी या डीजी के भीतर इलेक्ट्रोड लंबाई नाभिक की संरचनात्मक गहराई के अनुसार विविध था ।
  2. एक ईथीलीन ऑक्साइड संक्रमण कैबिनेट का उपयोग इलेक्ट्रोड निष्फल. किसी भी संदूषण के बिना घर का बना 2-चैनल माइक्रो-वायर इलेक्ट्रोड को हैंडल और स्टोर करें । इलेक्ट्रोड कड़ाई से किसी भी शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपण से पहले निष्फल होना चाहिए ।
  3. शल्य यंत्रों को आटोक्लेव ।
  4. सर्जरी से पहले, pentobarbital के साथ माउस सुई (20-50 मिलीग्राम/intraperitoneally, संज्ञाहरण के एक सर्जिकल विमान को प्राप्त करने के लिए ।
  5. संक्रमण और दर्द, क्रमशः24के जोखिम को कम करने के लिए एक बाँझ पेनिसिलिन जी (७५,००० यू, आइएमएस) और एक एनाल्जेसिक एजेंट (carprofen, ०.०५-1 मिलीग्राम/किग्रा, SC) के साथ माउस सुई ।
  6. पशु संज्ञाहरण के बाद, आंख सूखापन को रोकने के लिए दोनों आंखों के लिए एक आंख स्नेहक लागू होते हैं । बेहोशी की अंगुली चुटकी और कार्रवाई के साथ आगे बढ़ने के लिए केवल जब कोई प्रतिक्रिया होती है के जवाब में जानवर की सजगता के द्वारा और संज्ञाहरण की गहराई में शामिल होने की क्रिया सुनिश्चित करें ।
    नोट: पशु चिकित्सक मरहम आंख सूखापन को रोकने के लिए एक और विकल्प है ।
  7. बिजली के बाल कतरनी या एक उस्तरा ब्लेड के साथ माउस सिर के शीर्ष पर फर के सबसे दाढ़ी, तीन ७०% शराब और betadine समाधान की सफ़ाई के साथ मुंडा क्षेत्र निष्फल और betadine त्वचा पर सूख गया है के बाद आपरेशन के साथ आगे बढ़ना ।

2. उच्च आवृत्ति उत्तेजना सर्जरी25,26

नोट: इस चरण में, एक इलेक्ट्रोड एकतरफा पृष्ठीय डीजी या औसत दर्जे का पीपी क्षेत्र, प्रासंगिक सीखने और स्मृति में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के साथ हिप्पोकैम्पस का एक हिस्सा में प्रत्यारोपित है.

  1. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर anesthetized माउस रखें । माउस के सिर को अपने पास रखने के लिए, कान की पट्टियों को ठीक से संरेखित करें और उंहें जल्दी से स्थापित कर दें । धीरे कान सलाखों इतना कस कि वे केंद्रित सिर का समर्थन और माउस को थोड़ा सुरक्षित ।
  2. ३७ ± ०.५ डिग्री सेल्सियस पर पशु के शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए एक थर्मोस्टेट पैड का प्रयोग करें ।
  3. संदंश का उपयोग करने के लिए माउस कान के लिए त्वचा पूर्वकाल समझ और यह निष्फल कैंची के साथ काटने के लिए माउस की खोपड़ी के शीर्ष पर त्वचा के बारे में 1 सेमी2 क्षेत्र को दूर ।
    नोट: खून बह रहा है की एक छोटी राशि कट त्वचा के किनारों के साथ मनाया जा सकता है ।
  4. खोपड़ी सतह को बेनकाब करने के लिए एक कपास झाड़ू के साथ खोपड़ी झूठ बोल मांसपेशी और अन्य लगाव निकालें । sagittal और लैंब्डा टांके लाइनों की पहचान करने के लिए पूरी तरह से खोपड़ी की सतह से सभी periosteum, tendons और संयोजी ऊतक को साफ करने के लिए एक कपास झाड़ू और विदारक छेनी का प्रयोग करें ।
  5. bregma और लैंब्डा पॉइंट को पहचानें । कोरोनरी सीवन के चौराहे और calvaria के बेहतर मध्य भाग पर sagittal टांका है, जहां bregma स्थित है । sagittal टांका द्वारा lambdoid टांका के चौराहे है जहां लैंब्डा दिखाई दे रहा है । अंय नाभिक की स्थिति सेट करने के लिए मूल बिंदु के रूप में bregma का उपयोग करें ।
  6. खोपड़ी पर bregma और लैंब्डा स्थिति की पहचान के बाद, इन दो बिंदुओं को क्षैतिज स्तर में समायोजित करें । सुनिश्चित करें कि इन दो बिंदुओं की ऊँचाई पृष्ठीय-ventral दिशा में लगभग समान है (कोई भी त्रुटियाँ < ०.०५ mm होनी चाहिए). इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि खोपड़ी एक ही रास्ते में औसत दर्जे का दिशा में स्तर है26।
  7. एक एकतरफा सर्जरी के लिए, स्टीरियोटैक्टिक सर्जिकल फ्रेम पर घूर्णन इलेक्ट्रोड धारक में एक घर का बना 2-चैनल कॉपर माइक्रो-वायर इलेक्ट्रोड माउंट ।
  8. इलेक्ट्रोड अनुलंब रूप से पहले bregma बिंदु के ऊपर रखें, और इसे मूल साइट के रूप में सेट करें । पूर्वकाल-पीछे (एपी), औसत दर्जे का (एमएल), और dorso-ventral (डीवी) पदों को इंगित करने के लिए डिजिटल प्रदर्शित स्टीरियोटैक्टिक सर्जिकल फ्रेम का प्रयोग करें ।
    नोट: तुला हो रही से इलेक्ट्रोड को रोकने के लिए, आपरेशन के दौरान खोपड़ी पर इलेक्ट्रोड टिप को छूने नहीं है.
  9. इलेक्ट्रोड को धीरे से सही स्थिति में ले जाएँ (चित्र 1a, एपी-2.1/एमएल ± १.० के लिए डीजी और एपी-3.8/एमएल ± ३.० पीपी के लिए, क्रमशः)27 किसी भी स्पर्श के बिना खोपड़ी के ऊपर । जब वांछित साइट इलेक्ट्रोड प्रविष्टि के लिए पहचान की गई थी, इलेक्ट्रोड धारक उच्च करने के लिए dorsoventral स्टीरियोटैक्टिक समायोजन का उपयोग करें, और एक काले मार्कर के साथ स्थिति को चिह्नित.
    नोट: stereotaxic निर्देशांक के संदर्भ में सटीक स्थान माउस दबाव, वजन, और सेक्स के द्वारा भिन्न हो सकते हैं. एक ही लिंग के वयस्क चूहों स्थान में किसी भी भिन्नता को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यदि संभव हो, पूर्व संचालन संरचनात्मक स्कैन एक व्यक्ति विषय के आधार पर स्थान की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए27.
  10. एक हाथ का प्रयोग करें-आयोजित micromanipulator-असिस्टेड ड्रिल (गड़गड़ाहट आकार = ०.५ मिमी) के लिए चिह्नित स्थिति ठीक पर गड़गड़ाहट छेद बनाने के लिए । ड्रिलिंग से पहले ७०% इथेनॉल के साथ गड़गड़ाहट की नोक निष्फल । Z-अक्ष ०.८-१.० mm साथ खोपड़ी के माध्यम से मिनी ड्रिल बिट अपने एक्स-वाई स्थिति को बदलने के बिना ले जाएं । आपरेशन के दौरान किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए एक बाँझ कपास का उपयोग करें ।
    नोट: ड्रिलिंग के दौरान से अधिक ड्रिलिंग और अत्यधिक गर्मी पीढ़ी से बचने के लिए, ड्रिलिंग की गति सुनिश्चित १५,०००-१८,००० प्रति मिनट क्रांतियों (RPM) है, और अक्सर गड़गड़ाहट छेद से ड्रिल बिट हर 8-10 एस वापस ले लो ।
  11. बाडी सामने आने तक ड्रिलिंग रखें । किसी भी हड्डी स्क्रैप कि ड्रिलिंग के दौरान उत्पंन कर रहे है और अंतर्निहित नरम मस्तिष्क ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना बाडी पर एक pinhole बनाने के लिए एक तुला सुई का प्रयोग करें ।
    नोट: मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए, तुला कुंद सुई भी एक ठीक कुंद संदंश के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।
  12. गड़गड़ाहट छेद वांछित स्थिति में ठीक से बनाया गया है कि पुष्टि करने के लिए, स्टीरियोटैक्टिक सर्जरी फ्रेम का एक समायोजन द्वारा इलेक्ट्रोड ऊंचाई को कम करने और इलेक्ट्रोड किसी भी बाधाओं को छूने के बिना गड़गड़ाहट छेद के माध्यम से सुचारू रूप से डाला जा सकता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए. यदि हां, तो धीरे से डीजी के लिए १.८ mm की गहराई के लिए इलेक्ट्रोड (या पीपी के लिए ३.० mm) के डीजी (पीपी-डीजी) को औसत दर्जे का पीपी पर स्थित खोपड़ी की सतह से डालें ।
    नोट: इलेक्ट्रोड आरोपण की प्रक्रिया के दौरान बाँझ कपास के साथ गड़गड़ाहट छेद से किसी भी मस्तिष्कमेरु द्रव या रक्त बहिर्वाह से पोंछ.
  13. खोपड़ी छेद में माइक्रो तार इलेक्ट्रोड डालने के बाद, यह जगह में पर्याप्त दंत एक छोटे रंग का उपयोग सीमेंट के साथ पकड़. के रूप में सीमेंट और अधिक मोटा होना, यह डाला इलेक्ट्रोड और एक अच्छा चिकनी टोपी फार्म के लिए शिकंजा के आसपास ढालना । स्त्री और घाव किनारों को संक्रमित ।
  14. इलेक्ट्रोड से इलेक्ट्रोड धारक छुड़ाना. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम से माउस निकालें और एक गर्म पिंजरे में वापस ।
    नोट: सर्जरी के बाद, उनके पिंजरों को जानवरों लौटने के साथ इंतजार जब तक वे पूरी तरह से पर्याप्त चेतना के साथ संज्ञाहरण से बरामद किया है ।
  15. माउस को स्वतंत्र रूप से ले जाने के लिए और यह पिंजरे में 2 दिनों के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं । फिर, लीड्स के माध्यम से एक प्रोग्राम को उत्तेजित करने के लिए माउस मस्तिष्क में प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड कनेक्ट. चित्र 2में प्रस्तुत के रूप में सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस सेट करें । ४०० हर्ट्ज पर 6 दालों की 6 गाड़ियों की 6 श्रृंखला के रूप में HFS मानकों को सेट (चित्रा 1बी, ट्रेनों के बीच १०० एमएस, श्रृंखला के बीच 20 एस)28. २०० μA उत्तेजना तीव्रता सेट करें ।
  16. निर्धारित समय की वांछित अवधि के लिए एक HFS उद्धार । उद्धार उत्तेजना 2x एक दिन में 8:00 बजे और 8:00 बजे
  17. नियंत्रण समूह के लिए, चूहों में इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण और एक उत्तेजना प्रदर्शन नहीं करते.
  18. सी-फोस धुंधला के लिए, प्रयोगात्मक चूहों तीव्रता से उत्तेजित (प्रति दिन 2x) । BrdU लेबलिंग के लिए, एक तीव्र उत्तेजना समूह में प्रयोगात्मक चूहों विभाजित (प्रति दिन 2x लागू) और एक पुरानी उत्तेजना समूह (5 दिन में 10x लागू किया, प्रति दिन 2x) । उत्तेजना के दौरान, सुनिश्चित करें कि माउस जाग रहा है । सुराग सुनिश्चित करने के लिए मुड़ नहीं कर रहे है याद है ।
    नोट: प्रक्रिया के अंतिम दिन में, तीव्र उत्तेजना समूह में चूहों को एक साथ उत्तेजित किया गया ।
  19. उत्तेजना किया जाता है, तो ध्यान से इलेक्ट्रोड धारक से इलेक्ट्रोड पिन और रिकॉर्डिंग प्रणाली के कनेक्टर डिस्कनेक्ट.

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलान और Bromodeoxyuridine लेबलिंग29

  1. के लिए सी-फोस और Notch1 धुंधला, पिछले HF-डीबीएस उत्तेजना के बाद लगभग 3 ज, anesthetize pentobarbital (20-50 मिलीग्राम/किग्रा, आईएफसआई) इंजेक्शन द्वारा चूहों को संज्ञाहरण के एक सर्जिकल विमान को प्राप्त करने के लिए ।
  2. BrdU लेबलिंग के लिए, पिछले HF-डीबीएस उत्तेजना के बाद के बारे में 12 ज, BrdU के 6 इंजेक्शन के लिए नियंत्रण और 2-एच अंतराल पर उत्तेजित चूहों (५० मिलीग्राम/०.९% खारा, आईएफसआई में) दे । ३६ ज लास्ट इंजेक्शन के बाद चूहों को anesthetize इंजेक्शन लगाकर pentobarbital (20-50 मिलीग्राम/kg, आईएफसआई) एक सर्जिकल प्लेन हासिल करने के लिए ।
  3. रिब पिंजरे के माध्यम से एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए दिल का पर्दाफाश और फिर बाईं निलय के लिए एक 22 गेज कुंद छिड़काव सुई पारित चीरा बनाओ । सही atrium में एक छोटा सा चीरा बनाओ । Transcardially perfuse इसे कोल्ड फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) के ५० मिलीलीटर के साथ ५० 1x पंजाब (पीएच ७.४) में ठंड 4% paraformaldehyde (पीएफए) की मिलीलीटर के साथ ।
    नोट: पीएफए के लिए पंजाबियों स्विच जब vivo में माउस खून की जगह है और द्रव स्पष्ट चलता है । एक अच्छा छिड़काव जिगर के समाशोधन द्वारा ंयाय किया जा सकता है । छिड़काव बंद कर दिया जाना चाहिए एक बार निर्धारण कंपन देखा गया है30।
  4. नेत्र कैंची के साथ माउस Decapitate, त्वचा पर एक चीरा बनाने के लिए और खोपड़ी बेनकाब । संदंश का प्रयोग, खोपड़ी से थोड़ा चिप और ध्यान से पूरे माउस मस्तिष्क काटना । पोस्ट-fix 4% paraformaldehyde में मस्तिष्क को एक अतिरिक्त 2 दिनों के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 30% सुक्रोज समाधान करने के लिए इसे रातोंरात हस्तांतरण ।
  5. एक cryostat का प्रयोग, 20 में दिमाग कट-µm राज्याभिषेक वर्गों । स्थानांतरण और एक ब्रश के साथ कांच स्लाइड के लिए वर्गों माउंट और उन पर स्टोर-20 ° c ।
    नोट: इलेक्ट्रोड प्रतिस्थापन या अत्यधिक यांत्रिक क्षति के साथ जानवरों बाद में विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा ।
  6. स्लाइड् स को सामांय पंजाब (०.१ मीटर, पीएच ७.४) में स्थानांतरित करें जिसमें कोई निर्धारण नहीं है । किसी भी अतिरिक्त निर्धारण को हटाने के लिए 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3-4x के लिए पंजाबियों के साथ स्लाइस धो लें । BrdU-लेबल वाले समूह के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 2-N एचसीएल में वर्गों की मशीन, और उंहें एक ०.१-M बोराटे बफर (पीएच ८.४; 10 मिनट) में कुल्ला । फिर पंजाब में 5 मिनट के लिए स्लाइस 2x धो लो ।
    नोट: Immunostaining तो प्रदर्शन किया है ।
  7. समाधान अवरुद्ध में मशीन द्वारा स्लाइस का इलाज (1% सामांय बकरी सीरम, 3% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन < BSA >, ०.५% ट्राइटन x-१०० और ०.०२% सोडियम azide 1 एक्स पंजाब में) के लिए 1 घंटे में कमरे के तापमान (आरटी) ।
  8. विरोधी के साथ स्लाइसेंसी-फोस polyclonal एंटीबॉडी (1:500; खरगोश), विरोधी Notch1 एंटीबॉडी (1:50; बकरी), या विरोधी BrdU एंटीबॉडी (1:800; चूहा) अवरुद्ध समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में ।
  9. पंजाब में स्लाइस 3x धो लो, तो उंहें alexa Fluor ५६८-संयुग्मित विरोधी खरगोश (1:500), alexa Fluor ४८८-संयुग्मित विरोधी बकरी (1:1000), या alexa Fluor ४८८-संयुग्मित विरोधी चूहा (1:500) माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए 1 ज पर आरटी के साथ गर्मी ।
  10. (10 मिनट हर बार) पंजाब में 3x नमूने धो लो । कवर इंयूनो-लेबल मस्तिष्क वर्गों एक विरोधी फीका एजेंट बढ़ते DAPI युक्त माध्यम का उपयोग कर । स्लाइस हवा-सूखा और उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित स्टोर करते हैं ।
  11. एक उच्च संकल्प मल्टी चैनल (अनुक्रमिक) स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप के साथ मस्तिष्क के उत्तेजित और उत्तेजित पक्षों से हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों की छवियों को प्राप्त करें । इमेजिंग पैरामीटर लगातार नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच सेट करें ।
  12. एक मोज़ेक एक उच्च आवर्धन उद्देश्य का उपयोग कर इमेजिंग प्रदर्शन (20X एयर उद्देश्य, एनए ०.४५) को देखने के सतत 3 डी (XYZ) छवियों के आसंन क्षेत्रों के अधिग्रहण के लिए मोटर की अवस्था का उपयोग कर और उंहें एक साथ सिलाई के लिए बड़े समग्र बनाने के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल छवियों.
    नोट: टाइलिंग कार्यों में सुधार निर्बाध छवियों के लिए सच सिलाई और चिकनी विकल्प शामिल हैं । समग्र छवियों को जल्दी और आसानी से सिलाई समारोह का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं, एक व्यापक क्षेत्र पर एक छवि बनाने के लिए ।
  13. सी-फोस और Notch1 धुंधला के लिए, सिले छवियों के immunofluorescent घनत्व21 का एक सकारात्मक नाभिक मात्रात्मक विश्लेषण करते हैं । बेतरतीब ढंग से rostral, पृष्ठीय, और ventral हिप्पोकैम्पस महानिदेशक उपक्षेत्रों में 3 क्षेत्रों का चयन करें और एक डबल अंधा तरीके से छवि जंमू सॉफ्टवेयर (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31का उपयोग कर immunofluorescent घनत्व को मापने ।
  14. एक BrdU लेबलिंग के लिए, पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के माध्यम से ड्रिलिंग बिंदु के आसपास स्लाइस का विश्लेषण (-१.७ मिमी करने के लिए-२.७ मिमी bregma के सापेक्ष) एक डबल अंधा तरीके से ।
  15. गिनती केवल BrdU-सकारात्मक ंयूरॉंस में डीजी । गिनती में दाना सेल के 2-सेल व्यास के भीतर झूठ बोल कोशिकाओं को शामिल करें ।
    नोट: यहां, गिनती एक 40X हवा उद्देश्य का उपयोग किया गया था । बेतरतीब, पशु प्रति 3-5 वर्गों की गिनती की गई, और गिनती औसत और के रूप में व्यक्त कर रहे थेडीजी19 के अनुसार मतलब ।

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Representative Results

हिप्पोकैम्पस महानिदेशक उपक्षेत्र के लिए HF-डीबीएस उत्तेजना के बाद सीधे या पीपी उपक्षेत्र स्टीरियोटैक्टिक समायोजन का उपयोग कर डाला इलेक्ट्रोड के माध्यम से डीजी परोक्ष सक्रिय करने के लिए, कुतर pentobarbital के साथ anesthetized थे और 3 ज नमूना के बाद पिछले HF-डीबीएस उत्तेजना के लिए सी-फोस और Notch1 immunostaining. BrdU धुंधला के लिए, ३६ ज पिछले BrdU इंजेक्शन के बाद 1 दिन या 5 दिनों के HF-डीबीएस उत्तेजना के बाद, कुतर मस्तिष्क वर्गों की तैयारी के लिए pentobarbital के साथ anesthetized थे । चित्रा 3 से पता चलता है कि डीजी के ipsilateral पक्ष में सी-फोस की अभिव्यक्ति काफी बढ़ गई थी । इसके अलावा, महानिदेशक के contralateral पक्ष में सी-फोस अभिव्यक्ति भी नहीं-HF-डीबीएस उत्तेजना नियंत्रण की तुलना में विनियमित किया गया था जो एक सी-फोस संकेत की लगभग कोई अभिव्यक्ति दिखाई । Notch1-विशिष्ट immunofluorescent मस्तिष्क स्लाइस में धुंधला के आधार पर, के रूप में अनुपूरक चित्रा 1में दिखाया गया है, हम आगे का प्रदर्शन किया है कि Notch1 संकेत भी एक प्रेरण द्वारा HFS उत्तेजना के बाद वयस्क हिप्पोकैम्पस डीजी में सक्रिय हो सकता है पीपी में न्यूरॉन्स के ध्रुवीकरण (भी रॉ अनुपूरक फ़ाइल 1के रूप में आपूर्ति की गई डेटा को देखें).

महानिदेशक उपक्षेत्र में प्रत्यक्ष HF-डीबीएस उत्तेजना के अलावा, चित्रा 4एक स्थिति और इलेक्ट्रोड टिप है, जो औसत दर्जे का पीपी में स्थापित किया गया था HF-डीबीएस उत्तेजना साइट से पता चलता है. चित्रा 4बी का प्रदर्शन है कि HF-डीबीएस पीपी में उत्तेजना इतना ही नहीं डीजी के ipsilateral पक्ष में सी-फोस एक्सप्रेशन का स्तर भी काफी बढ़ गया, लेकिन डीजी की तुलना में contralateral साइड में नो-HF-डीबीएस उत्तेजना के चलते सी-फोस की अभिव्यक्ति बढ़ गई नियंत्रण.

मस्तिष्क स्लाइस के BrdU लेबलिंग विश्लेषण के आधार पर, के रूप में धारा 5-5Cमें दिखाया गया है, हम आगे का प्रदर्शन किया है कि neurogenesis भी वयस्क हिप्पोकैम्पस डीजी में एक जीर्ण (5 दिन) HF-डीबीएस उत्तेजना के बाद सीधे डीजी में सक्रिय कर सकते हैं । डीजी में एक जीर्ण HF-डीबीएस उत्तेजना न केवल काफी ipsilateral पक्ष में neurogenesis को विनियमित लेकिन यह भी contralateral पक्ष में neurogenesis की तुलना में वृद्धि नहीं HF-डीबीएस उत्तेजना नियंत्रण । हालांकि, तीव्र (1 दिन) उत्तेजना या तो ipsilateral पक्ष में या contralateral के महानिदेशक के पक्ष में neurogenesis के एक विनियमन प्रेरित करने में विफल रहा है । के रूप में चित्रा 5डीमें दिखाया गया है, या तो तीव्र उत्तेजना समूह में या जीर्ण उत्तेजना समूह में, पीपी में एक अप्रत्यक्ष HF-डीबीएस हिप्पोकैम्पस महानिदेशक में neurogenesis स्तर को बदल नहीं सकता है ।

Figure 1
चित्र 1 . इलेक्ट्रोड टिप और HFS के मापदंडों के मस्तिष्क लक्ष्यों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (क) dentate गाइरस के एक अवर ब्लेड में औसत दर्जे का perforant पथ के ंयूरॉन प्रक्षेपण संकेत दिया है । डाला इलेक्ट्रोड की स्थिति (बैंगनी में) या तो डीजी सीधे या पीपी उपक्षेत्र को उत्तेजित करने के लिए संकेत कर रहे हैं । (ख) HFS पैरामीटर 6 दालों की 6 गाड़ियों की 6 श्रृंखला के रूप में संकेत दिया है ४०० हर्ट्ज, ट्रेनों के बीच १०० एमएस के साथ और श्रृंखला के बीच 20 एस. CA = the Cornu Ammonis; DG = द dentate गाइरस; पीपी = perforant पथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . इंटरफेस और multistimulator के मापदंडों । उत्तेजितकर्ता एक डिजिटल एनालॉग कनवर्टर करने के लिए जुड़ा हुआ था और मालिकाना सॉफ्टवेयर के द्वारा सक्रिय । HFS के उत्तेजना प्रकार monophasic था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . सीधे HF-डीबीएस उपचार के जवाब में महानिदेशक में ंयूरॉन सक्रियण । (क) इलेक्ट्रोड टिप (सफेद infill बॉक्स) HFS के साथ या बिना सीधे (एपी-2.1/एमएल ± 1.0/DV + १.८) डीजी क्षेत्र के ऊपर तैनात किया गया था । इस पैनल से मस्तिष्क स्लाइस के immunostaining के राज्याभिषेक खंड के नियंत्रण और HFS समूहों मेंएक सी-फोस एंटीबॉडी से पता चलता है. DAPI नीले दाग हिप्पोकैम्पस नाभिक के स्थान का संकेत करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । स्केल बार = १०० µm. (B) यह पैनल इम्यूनोफ्लोरेसेंस संकेत घनत्व का एक मात्रात्मक विश्लेषण दिखाता है । महानिदेशक के ipsilateral पक्ष में न्यूरॉन्स काफी हद तक सी-फोसकी उच्च अभिव्यक्ति के साथ सक्रिय थे, और महानिदेशक के contralateral पक्ष में सी-फोस अभिव्यक्ति की सी-फोस अभिव्यक्ति की तुलना में भी अपेक्षाकृत वृद्धि हुई है एक HFS उपचार के बिना चूहों पर नियंत्रण. मतलब ± SEM, एक तरह से ANOVA, एफ2, 24 = २१६, p < ०.०००१, Bonferroni पोस्ट हॉक परीक्षण, * * *p < ०.००१, nno-sti = 9 (3 चूहों से 3 स्लाइसें), nHFS विपरीत = 9 (3 स्लाइस/ 3 चूहों), एनHFS आईपीएस = 9 (3 चूहों से तीन स्लाइस/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . पीपी उपक्षेत्र में HFS के जवाब में डीजी में न्यूरॉन सक्रियण । (क) इलेक्ट्रोड टिप (सफेद unfilled बॉक्स) के साथ या बिना HFS एपी-३.८, एमएल ± ३.०, और डीवी + ३.० की स्थिति में औसत दर्जे पीपी में तैनात किया गया था । (ख) यह पैनल मस्तिष्क के स्लाइस के immunostaining मेंएक सी-फोस एंटीबॉडी के साथ नियंत्रण और HFS समूहों के राज्याभिषेक की धारा का पता चलता है. DAPI नीले दाग हिप्पोकैम्पस नाभिक के स्थान का संकेत करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । स्केल बार = १०० µm. (C) इस पैनल immunofluorescent घनत्व का एक मात्रात्मक विश्लेषण से पता चलता है । पीपी में HFS उपचार काफी एक उच्च अभिव्यक्ति के साथ डीजी में ipsilateral न्यूरॉन्स को सक्रिय कर सकता है सी-फोस. contralateral डीजी में सी-फोस की अभिव्यक्ति भी अपेक्षाकृत एक HFS उपचार के बिना नियंत्रण चूहों की सी-फोस अभिव्यक्ति की तुलना में बढ़ जाती है. मतलब ± SEM, एक तरफ़ ANOVA, F2, 24 = १८९.३, P < ०.०००१, Bonferroni पोस्ट हॉक परीक्षण, * * *P < ०.००१, nno-sti = 9 (3 चूहों से 3 स्लाइसें), nHFS विपरीत = 9 (3 स्लाइस/ 3 चूहों से), एनHFS आईपीएस = 9 (3 चूहों से तीन स्लाइस/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . महानिदेशक और पीपी में क्रमशः HFS के जवाब में डीजी में neurogenesis की विशिष्ट सक्रियण. (क) इस पैनल HFS उपचार और BrdU की पीढ़ी के लिए एक प्रयोगात्मक प्रतिमान से पता चलता है-डीजी में proliferating न्यूरॉन्स लेबल । जानवरों को एक तीव्र और एक जीर्ण समूह में विभाजित किया गया था । तीव्र समूह में, चूहों 5 दिन पर एक HFS उपचार 2x के अधीन थे । जीर्ण समूह में, चूहों 5 दिनों के लिए एक HFS उपचार के अधीन थे (1 दिन से दिन 5, 2x प्रति दिन). फिर, दोनों समूहों में जानवरों BrdU के साथ इंजेक्शन थे (५० मिलीग्राम/किलोग्राम, 6x द्वारा 2-h अंतराल) 6 दिन पर । 8 दिन पर, जानवरों anesthetized और cryostat वर्गों की तैयारी के लिए perfused थे । (ख) इस पैनल के डीजी में BrdU (ग्रीन में) पोस्ट-HF-डीबीएस के immunofluorescent दाग दिखाता है । (ग) ंयूरॉन उत्पादन का एक मात्रात्मक विश्लेषण संकेत दिया कि तीव्र (1 दिन में 2x) महानिदेशक में उत्तेजना neurogenesis नहीं बढ़ा सकता है, जबकि जीर्ण (5 दिन के भीतर 10x) के डीजी में उत्तेजना काफी neurogenesis को विनियमित । नियंत्रण समूह की तुलना में, BrdU लेबलिंग कक्षों की संख्या ipsilateral और contralateral गोलार्द्ध में जीर्ण समूह में काफी बढ़ गई । स्केल बार = १०० µm. का अर्थ है ± SEM, दो तरह के ANOVA, उत्तेजना प्रकार प्रभाव f2, 14 = ९७.०९, P < ०.०००१, गोलार्द्ध प्रभाव f1, 14 = १.१३७, p = ०.३०४४, Bonferroni पोस्ट हॉक परीक्षण, * * *p < ०.००१, n नियंत्रण = 3 (3 चूहों से 3 स्लाइसें), n1 दिन = 4 (3 चूहों से 4 स्लाइसें), n5 दिन = 3 (3 चूहों से 3 स्लाइसें) । (घ) यह पैनल पीपी उपक्षेत्र में BrdU (ग्रीन में) पोस्ट-HF-डीबीएस के इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग दिखाता है । (ङ) न्यूरॉन उत्पादन का एक मात्रात्मक विश्लेषण संकेत दिया कि या तो तीव्र (एक दिन में दो बार) या जीर्ण (5 दिनों में 10x) पीपी में उत्तेजना neurogenesis काफी वृद्धि नहीं कर सका । BrdU लेबलिंग कोशिकाओं की संख्या के साथ या HFS उपचार के बिना अपेक्षाकृत स्थिर था । स्केल बार = १०० µm । मतलब ± SEM, दो तरह ANOVA, उत्तेजना प्रकार प्रभाव एफ2, 16 = ०.९०२५, पी = ०.४२५२, गोलार्द्ध प्रभाव एफ1, 16 = १.४०२, पी = ०.२५३७, Bonferroni पोस्ट हॉक टेस्ट, पी > ०.०५, एन नियंत्रण = 3 (3 चूहों से 3 स्लाइसें), n1 दिन = 3 (3 चूहों से 3 स्लाइसें), n5 दिन = 5 (3 चूहों से 5 स्लाइसें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक आंकड़ा 1. HF-डीबीएस उपचार के जवाब में डीजी में Notch1 की अभिव्यक्ति । (क) इस पैनल में HF-डीबीएस के डीजी के बाद Notch1 (हरे रंग में) ३ एच के immunofluorescent दाग का पता चलता है. फेंग की रिपोर्ट21से यह आंकड़ा उद्धृत और संशोधित किया गया । (ख) प्रतिदीप्ति के एक मात्रात्मक विश्लेषण ने संकेत दिया कि डीजी में HFS Notch1 की अभिव्यक्ति में वृद्धि कर सकता है । स्केल बार = १०० µm. का अर्थ है ± SEM, छात्र t-परीक्षण, t = 12, * * *P < ०.००१, nno-sti = 9 (3 चूहों से 3 स्लाइस/माउस, nHFS = 9 (3 स्लाइस/माउस से 3 चूहे) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary File 1
अनुपूरक फाइल 1. रॉ डेटा । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

HF-डीबीएस तकनीक व्यापक रूप से 1990 के दशक के बाद से कई स्नायविक विकारों के उपचार के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है । अब तक, HF के मील का पत्थर काम-डीबीएस पार्किंसंस रोग और आवश्यक कंपन है, जो दोनों क्लिनिक और वैज्ञानिक समुदाय में बहुत ध्यान और ब्याज आकर्षित किया है के उपचार के लिए है । कुछ स्नायविक और मनोरोग विकारों में HF-डीबीएस के चिकित्सीय अनुप्रयोग के लिए कई समूहों द्वारा चल रहे HF-डीबीएस अध्ययन के विभिन्न प्रकार हैं३२,३३. इन अध्ययनों से कुछ नैदानिक परीक्षण2,३४के विभिंन चरणों में वर्तमान में कर रहे हैं । हालांकि HF-डीबीएस महत्वपूर्ण लाभ लाना चाहिए, उत्तेजना साइड इफेक्ट भी मस्तिष्क में एक आदर्श स्थान के साथ हो सकता है, मूड और सोच में नकारात्मक परिवर्तन के रूप में, आदि, जो प्रतिवर्ती कर रहे हैं और के संशोधनों के साथ टाला जा सकता है उत्तेजना सेटिंग्स ।

पिछले दशकों में नैदानिक परीक्षणों से संचित HF-डीबीएस प्रौद्योगिकी की उल्लेखनीय प्रगति के अलावा, जीवित पशुओं में HF-डीबीएस की पढ़ाई भी शारीरिक परिवर्तन और neurobiological को समझने का अवसर प्रस्तुत करती है विद्युत उत्तेजना से प्रेरित तंत्र । इस पांडुलिपि में, हम एक संशोधित HF-डीबीएस पद्धति का वर्णन किया है चूहों में प्रदर्शन के लिए एक HFS प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से हिप्पोकैम्पस महानिदेशक उपक्षेत्र को उत्तेजित । हालांकि वर्णित प्रोटोकॉल कुतर में किया जाता है, HFS प्रतिक्रिया अध्ययन भी सफलतापूर्वक सूअरों३५सहित अंय मॉडल जीवों में आयोजित किया गया है । इस तकनीक के लिए, स्टीरियोटैक्टिक सर्जरी भी एक संभावित नाभिक लक्षित उत्तेजना स्नायविक और मनोरोग विकारों के साथ कुछ जानवरों के मॉडल का उपयोग कर HFS की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तरह के अध्ययनों से तैयार निष्कर्ष आसानी से क्लिनिक में अनुवाद करना चाहिए, विशेष रूप से मौजूदा लक्ष्य पर HFS के शोधन के लिए । ध्यान दें कि क्लिनिक में HF-डीबीएस के कई जोखिम की श्रृंखला के विपरीत, इस methodological अध्ययन में, हम HFS के एक एकल और अल्पकालिक जोखिम को उत्तेजित और हिप्पोकैम्पस महानिदेशक, पैरामीटर और प्रतिमान के भाग में न्यूरॉन गतिविधि प्रेरित करने के लिए चुना HFS कि पहले हिप्पोकैम्पस स्लाइसें21,28में LTP प्रेरित करने के लिए सूचित किया गया था ।

HF-डीबीएस की सामान्य सीमाएं बड़े पैमाने पर24,25की अन्यत्र समीक्षा की गई हैं. एक प्रयोग के लिए चुनौतियों का यहां भी एक उत्कृष्ट शल्य चिकित्सा तकनीक के लिए और शल्य संरचनात्मक लोकस की चल रही देखभाल के लिए की जरूरत है । सही ढंग से और ठीक करने के लिए उत्तेजना के लिए लक्ष्य नाभिक में इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण, प्रमुख प्रक्रियाओं में से एक एक कुशल तकनीशियन द्वारा एक सफल सर्जरी के लिए अनावश्यक रक्त वाहिका चोट और इलेक्ट्रोड के प्रतिस्थापन से बचने के लिए है । इसके अलावा, आगे शारीरिक और मस्तिष्क के नमूने के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण भी एक HFS के बाद इलेक्ट्रोड के उचित लक्ष्यीकरण की पुष्टि की जरूरत है । यह भी एक बरकरार पशु मस्तिष्क में आपरेशन के बाद इलेक्ट्रोड के सही लक्ष्यीकरण को स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करने के लिए, इस दृष्टिकोण के लाभों में से एक है. इस प्रोटोकॉल में प्रदान की विवरण के कई आसानी से जानवर में एक प्रत्यारोपित उत्तेजितकर्ता के माध्यम से एक दीर्घकालिक उत्तेजना के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह भी अलग HFS वितरण पैटर्न के साथ संभावित चिकित्सकीय मस्तिष्क लक्ष्यों में वैकल्पिक उत्तेजना मापदंडों के लिए उत्तरदायी है । हालांकि, इस अनुच्छेद के एक एकल इकाई तीव्र HFS एक प्रोग्राम उत्तेजित करने के लिए बिजली उत्तेजना के बाद सेलुलर परिवर्तन को समझने की इकाई द्वारा दिया पर सूचना दी ।

हालांकि HF-डीबीएस कई वर्षों के लिए क्लिनिक में स्नायविक और मनोरोग विकारों के उपचार के लिए एक वैकल्पिक विकल्प के रूप में कार्य करता है, इसके प्रभाव अंतर्निहित तंत्र खराब समझ में रहते हैं । HF-डीबीएस के उपयोग और भविष्य के सुधार को ध्यान में रखते हुए, एक अधिक व्यावहारिक दृष्टिकोण की आवश्यकता है । एक विकासशील उपकरण के रूप में, HFS तकनीक आगे तकनीकी नवाचार और यंत्रवत खोज की जरूरत है । HF-डीबीएस के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए, एक वैश्विक transcriptome विश्लेषण उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों पर आधारित एक HF-डीबीएस प्रेरण के बाद आणविक घटनाओं और संकेत परिवर्तन को समझने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करेगा ३६. निष्पक्ष जांच की रणनीति के अलावा, मौजूदा आणविक उंमीदवारों जो न्यूरॉन ध्रुवीकरण का जवाब साबित हो गया है की परीक्षा के आधार पर, यह शायद महत्वपूर्ण सुराग भी प्रदान करने के लिए कुंजी प्रभाव की पहचान करेगा के साथ HFS के लिए जिंमेदार है । सी-फोस आंतरिक ंयूरॉन गतिविधि के जवाब में विनियमित है, तो इसकी अभिव्यक्ति को देख कम से हमें प्रदान करेगा ंयूरॉंस की एक परिदृश्य हाल ही में३७निकाल दिया । हालांकि, सी-फोस सिर्फ गतिविधियों को प्रतिबिंबित के बाद से यह भी मार्क न्यूरॉन्स LTP३७के दौर से गुजरना प्रतीत नहीं किया जाना चाहिए । हमारे सहित पिछले कार्यों, प्रदर्शन किया है कि Notch1 परिपक्व हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस में synaptic प्लास्टिक में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और vivo21,22 मेंवयस्क neurogenesis के लिए आवश्यक है । इस स्थिति के संदर्भ में, प्रमुख उंमीदवारों की एक विस्तृत मात्रात्मक और spatiotemporal स्थानीयकरण सावधानी से किया जाना चाहिए और वर्णित पूर्व और बाद में HFS प्रेरण सी-फोस अभिव्यक्ति का एक immunohistochemical विश्लेषण द्वारा । इस तरह के अध्ययन के लिए प्रत्यक्ष सबूत प्रदान करने के लिए एक HFS21, जो भी ऐसे न्यूरॉन सक्रियण के रूप में सेलुलर परिवर्तन प्रकट लाभप्रद होगा के जवाब में विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के परिवर्तन प्रदर्शित करेगा, neurogenesis, या neurodegeneration.

यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि क्लिनिक में एक HF-डीबीएस आवेदन के लाभ के बावजूद, तथ्य यह है कि उत्तेजना प्रभाव के परिणाम कसकर उत्तेजना मानकों और मस्तिष्क में लक्ष्य स्थान के साथ जुड़े रहे हैं के कारण, सेलुलर और आणविक अंतर्निहित है HFS प्रभाव तंत्र बहुत जटिल हो सकता है । इस अध्ययन में, हम आगे BrdU लेबलिंग वयस्क neurogenesis पर HFS के तीव्र और जीर्ण प्रभाव की जांच करने के लिए बाहर किया । हालांकि BrdU धुंधला दोनों neurogenesis और gliogenesis के लिए एक मार्कर, पिछले रिपोर्टों के आधार पर किया जा सकता है, वृद्धि हुई BrdU सकारात्मक ंयूरॉंस के बहुमत एक SGZ-डीबीएस उपचार के बाद HF में मनाया प्रफलन वयस्क तंत्रिका progenitors होना चाहिए21 , ३८ , ३९. HFS उपचार अंतर्निहित तंत्र की जटिलता की परवाह किए बिना, तरीकों और परिणाम हम इस पांडुलिपि में वर्णित प्रत्यक्ष सबूत है कि दोहराव उच्च आवृत्ति विद्युत उत्तेजना हिप्पोकैम्पस महानिदेशक को सक्रिय करने के लिए प्रदान काफी vivo मेंंयूरॉन गतिविधि और neurogenesis के सक्रियकरण प्रेरित कर सकता है ।

संक्षेप में, हम प्रदर्शन किया है कि एक HF-डीबीएस ंयूरॉन गतिविधि और चूहों के neurogenesis में सुधार कर सकते हैं, न्यूरॉन गतिविधि और नियंत्रण चूहों जो एक HF-डीबीएस से गुजरना नहीं था की neurogenesis की तुलना में. यह वैज्ञानिक संज्ञानात्मक प्रभाव और HFS के vivo मेंउत्तेजना पैटर्न के बारे में समझ अग्रिम कर सकते हैं । एक तीव्र HF-डीबीएस उपचार के बाद न्यूरॉन सक्रियण की पहचान प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से vivo में दर्शाता है कि एक HFS उपचार स्थानीय और लंबी दूरी के कनेक्शन के synaptic संचरण पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है. एक HF-डीबीएस उपचार के बाद न्यूरॉन सक्रियण की तेजी से प्रेरण एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है बिगड़ा synaptic संचरण में हेरफेर करने के लिए या MDD के रूप में कई स्नायविक और मनोरोग विकारों में तुल्यकालन. दूसरी ओर, एक पुरानी और प्रत्यक्ष, लेकिन तीव्र या अप्रत्यक्ष HF-डीबीएस उपचार के बाद neurogenesis की प्रेरण विभिंन विद्युत उत्तेजना शिष्टाचार के बीच विशिष्ट प्रभावकारिता और कार्यात्मक परिवर्तनशीलता पता चलता है । इस तरह के निष्कर्षों के तंत्रिका मॉडुलन और भविष्य में HFS के संभावित चिकित्सीय लाभों के लिए प्रत्यक्ष सबूत प्रदान करते हैं । एक साथ ले लिया, HF-डीबीएस क्लिनिक में किए गए तकनीकी विकास और प्रयोगशाला में किए गए यंत्रवत प्रगति को एकीकृत करके स्नायविक और मनोरोग विकारों के उपचार के लिए पर्याप्त लाभ पेश करेंगे.

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Disclosures

लेखकों की घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है.

Acknowledgments

चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित ३१५२२०२९, ३१७७०९२९ और ३१३७११४९ (Haitao वू करने के लिए), कार्यक्रम ९७३ (2014CB542203) चीन के बुनियादी अनुसंधान के लिए राज्य कुंजी विकास कार्यक्रम से (Haitao वू करने के लिए), और अनुदान Z161100000216154 से बीजिंग नगर विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (Haitao वू करने के लिए) । लेखकों ने Haitao वू लेबोरेटरी के सभी सदस्यों को उनके प्रोत्साहन और विचार-विमर्श के लिए धन्यवाद दिया । लेखक तंत्र debugging के साथ उनकी मदद के लिए Zhenwei लियू के लिए अत्यंत आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain stereotaxic instrument Stoelting 51730D Stereotactic intracranial implantation for mouse
Stimulator A-M systems Model 3800 MultiStim 8-Channel programmable stimulator
Dental driller Saeshin Precision Co., Ltd STRONG 90 For drilling and crainiotomy 
Burr Meisinger HM1 005# For drilling and crainiotomy 
Digidata 1550 Digitizer Molecular Devices AXON 1550 High-resolution data acquisition
Cryotome Thermo Fisher Scientific Thermo Cryotome FSE Cutting frozen sections of specimens
Confocal microscope Olympus FV-1200 Japan, with 20x Objective (NA 0.45)
Mouse surgery tools F.S.T. 14084-08,11254-20,16109-14 Scissors, forceps, bone cutter, holders etc.
Pentobarbital sodium R&D systems 4579 20-50mg/kg for i.p. injection
Penicillin G  Sigma-Aldrich P3032 75,000 U for i.m. injection
Carprofen Sigma-Aldrich SML1713 5-10mg/kg, for s.c. injection
4% Paraformaldehyde (PFA) Beijing Solarbio Sci-Tech Co.  P1110 stocking solution for tissue fixation
Phosphate buffer (PBS) Invitrogen 10010023 pH7.4, 500ml in stocking
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura 4583 Formulation of water-soluble glycols and resins
anti-BrdU antibody Abcam ab6326 Dilutions:1/800
anti-c-fos antibody Abcam ab209794 Dilutions:1/500
Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) Thermo Fisher Scientific A11036 Dilutions:1/500
Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) Jackson ImmunoResearch 712-546-150 Dilutions:1/500
Antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Counterstaining with DAPI
anti-Notch1 antibody (C-20) Santa Cruz Biotech sc-6014 Dilutions:1/50
Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) Abcam ab150073 Dilutions:1/1000

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३६ उच्च आवृत्ति उत्तेजना dentate गाइरस न्यूरॉन गतिविधि neurogenesis BrdU लेबलिंग
माउस के सक्रियकरण के लिए एक इनवेसिव विधि उच्च आवृत्ति उत्तेजना द्वारा Dentate गाइरस
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Zhao, Z., Wu, H. An Invasive Method… More

Zhao, Z., Wu, H. An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation. J. Vis. Exp. (136), e57857, doi:10.3791/57857 (2018).

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