Summary
Этот протокол обеспечивает полное руководство диссекции и анализа для использования глубоко глазной достопримечательности, s опсин иммуногистохимии, Retistruct и пользовательского кода сориентироваться точно и надежно изолированных мыши сетчатки в анатомические пространстве.
Abstract
Точно и надежно определение пространственной ориентации сетчатки изолированных мышь имеет важное значение для многих исследований в визуального нейронауки, включая анализ плотности и размера градиенты типов клеток сетчатки, тюнинг направление направление-селективных клетки ганглии и изучение Топографическая дегенерации моделей в некоторых заболеваний сетчатки. Однако есть много различных глазных рассечение методов в литературе о, которые используются для идентификации и ярлык сетчатки ориентации в сетчатке мыши. В то время как метод ориентации, используемых в таких исследованиях часто упускается из виду, определяется не отчетности как сетчатки ориентации может вызвать расхождения в литературе и путаницу при попытке сравнения данных между исследованиями. Поверхностные глазной достопримечательности, такие как ожоги роговицы часто используются, но недавно было показано, быть менее надежными, чем глубже достопримечательности, такие как прямых мышц, сосудистое трещина или s опсин градиента. Здесь мы предоставляем полное руководство для использования глубоко глазной достопримечательности точно анализировать и документирования пространственной ориентации изолированных мыши сетчатки. Мы также сравнить эффективность двух s опсин антител и включен протокол для s опсин иммуногистохимия. Потому что ориентация сетчатки по s опсин градиент требует сетчатки реконструкции с Retistruct программного обеспечения и вращение с пользовательским кодом, мы представили важные шаги, необходимые для использования обоих этих программ. В целом цель настоящего Протокола заключается в поставлять надежные и повторяемые набор методов для точной сетчатки ориентации, которая адаптируется к наиболее экспериментальных протоколов. Главной целью этой работы заключается в стандартизации методов сетчатки ориентации для будущих исследований.
Introduction
Важную и иногда забывают аспект сетчатки нейронауки является правильной ориентации и анализ изолированных целом гора сетчатки, будь то ориентации сетчатки в камере электрофизиологии запись или на слайде гистологические. Это особенно важно для исследований с участием мыши сетчатки, который в настоящее время наиболее широко используется модель для исследования млекопитающих зрительной системы. Недавние открытия показывают, что мыши сетчатки пространственно неоднородно, но имеет плотность и размер градиенты сетчатки клетки функционально различных типов, например который клетки ганглии, переходных клеток ганглия OFF-альфа и конус опсины1,2 ,3,4,5. Следовательно, метод, используемый для определения ориентации сетчатки может повлиять на результаты экспериментов с участием ячейки типа или опсин дистрибутивов2,3,6, направление тюнинг направление селективный ганглии клетки7,8,9и топографические схемы дегенерации сетчатки10,11,12,13,14 . В самом деле сообщается не отчетности как сетчатки ориентации может вызвать расхождения в литературе и путаницы, при попытке сравнения данных между исследованиями. Поэтому важно, что исследователи сообщают метод для определения ориентации сетчатки, таким образом, чтобы результаты таких исследований может быть точно истолковано.
Сетчатки ориентации обычно идентифицируется скоринга спинной, брюшины, носа или височной роговицы до глазной Энуклеация1,3,12,,1516,17 ,18,19 или путем разрезания или окрашивание глубокие анатомические глаз достопримечательности, такие как экстраокулярные мышцы6,7, сосудистое расселина2120,, или s опсин градиента2,3. Мышцы влагалища прямой мышцы живота может использоваться для идентификации грудной, брюшной, носа и височной сетчатки, сделав глубокий снятия вырезать, что bisects вложение или Улучшенный прямая, Нижняя прямая, медиальная прямая или боковые прямая мышца, соответственно. Однако для большинства экспериментов, используя один прямая мышца является достаточным для ориентации сетчатки22. Сосудистое трещина, которая является пережитком глаз развития, можно рассматривать как слабое горизонтальной линии на задней части глаза. Каждый конец этой строки завершается на носовой или временной полюс мира23. Наконец s опсин выражение асимметрично распределены вентральной сетчатки в мышей, и s опсин антител может использоваться раскрыть вентральной сетчатки в иммуногистохимической экспериментов1.
Последние работы Stabio, и др. 22 показал, что поверхностные глазной достопримечательности, такие как ожоги роговицы менее надежный метод для ориентации сетчатки в анатомические пространства, скорее всего, из-за человеческой ошибки и изменчивости в принятии ожогом роговицы при использовании временной и медиальной canthi качестве точки отсчета. Напротив глубокая достопримечательности, такие как Улучшенный прямая мышца, сосудистое трещина и s опсин градиент, было показано, быть более надежные и точные ориентиры для ориентации сетчатки22. Однако выявление этих анатомические ориентиры требует уникальный рассечение шаги, которые не описаны подробно описаны в литературе. Таким образом цель настоящего Протокола заключается в том, предоставить всеобъемлющий учебник о том, как использовать Улучшенный прямая мышца, сосудистое трещина и s опсин градиент для точной идентификации пространственной ориентации мыши сетчатки. Кроме того мы включили сравнения эффективности двух s опсин антител, а также протокол для s опсин иммуногистохимия.
Один дополнительный вызов исследования, опираясь на точные сетчатки ориентации является большой снятия сокращений, необходимых для укладки wholemount сетчатки на запись камеры, блюдо или слайд. Это может создать проблемы для анализа что такое естественно трехмерную структуру, когда его образ в виде плоской двумерной структуры. Программа под названием Retistruct24 может использоваться вернуться его трехмерную структуру плоский wholemount сетчатки, прежде чем проанализированы данные, собранные из него. Таким образом раздел настоящего протокола посвящена отметив шаги, которые необходимы для использования программного обеспечения Retistruct для реконструкции s опсин immunostained мыши сетчатки. Мы также включили раздел протокола для использования наших сценариев MATLAB, который был разработан, чтобы точно поворот и Восточный мыши сетчатки, окрашенных с s опсин.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) университета Акрон.
1. используя Улучшенный прямая мышца ориентир для определения ориентации сетчатки
Примечание: Улучшенный прямая мышца является важной вехой для спинной сетчатки (Таблица 1). Если эксперимент не требует маркировки спинной сетчатки, пропустите шаг 1 и перейдите к шагу 2.
- Следуйте утвержденным институциональный уход животных и использования Комитетом протокол для мыши эвтаназии.
- Определить общую направленность всему миру, чтобы сжечь Марк на спинной роговицы непосредственно между носовой и временных canthi вблизи границы роговицы склера сразу после эвтаназии (рис. 1А). Сделайте запись путем нагревать вверх ручка Прижигающая за десять секунд, а затем трогательно кончик пера спинной роговицы для менее чем за секунду.
Примечание: Холдинг перо Прижигающая роговицы для слишком долго будет вызывать глобус в пункционная.
Примечание: в то время как некоторые ручки Прижигающая излучают свет, Прижигающая перо, перечисленные в Таблице материалы не испускают свет при нагревании, что делает его безопасным вариантом для dark-adapted экспериментов. - Для Энуклеация Используйте щипцы изогнутые осторожно нажать глаз из гнезда и захват шара из под. Не режьте зрительного нерва для удаления шара; Вместо этого медленно поднимите шара из гнезда, перемещая одновременно он нежно слева направо до тех пор, пока глобус освобождается от розетки.
Примечание: Это предложение позволит мышцы rectus остаются прикрепленными к миру, когда глобус наконец полностью удалены из розетки. Зрительного нерва также часто будет оставаться прикрепленной к миру. - Передача шара с прилагаемой прямых мышц в чашке Петри, содержащие рассечение среднего. Убедитесь в том отслеживать какой глаз является левый и правый глаз.
Примечание: Диссектор следует использовать соответствующие рассечение среднего, который сочетается с их экспериментальный протокол. - Рамках рассечение, визуально найдите спинной ожогом роговицы и выявить Улучшенный прямая мышца с которой это связанный (рис. 1А).
- С помощью Рассечение ножницами или 20 G (0.9 мм x 25 мм) иглы прокол (см. Таблицу материалы), роговицы на отметке записи. Сделайте глубокий снятия вырезать в мире к зрительному нерву для пополам превосходной мышцы. Изолированные и реконструированных сетчатки с этот отрезок показан в цифры 1B и 1 C.
- Начинают изолировать сетчатки с помощью двух наборов щипцов (см. Таблицу материалы) аккуратно оторвать отверстия, сделанные с проколом на шаге 1.6 до тех пор, пока часть сетчатки подвергается.
Примечание: Важно сделать это мягко, как срывать слишком сильно может вызвать снятия вырезать сорвать дальнейшее. - Используйте корнцанг дразнить части сетчатки от склеры до склеры был полностью удален. Удаление диафрагмы, линзы, стекловидного тела и любые оставшиеся структуры с щипцами до сетчатки полностью изолированы.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Если ткань будет устанавливаться для иммуногистохимии s опсин, перейдите к шагу 3.5.
2. Использование сосудистое трещина ориентир для определения ориентации сетчатки
Примечание: Сосудистое трещина присутствует на склера на задней части глаза и бежит от височной полюса на носовой полюс (цифры 2B и 2 C; Таблица 1).
- Следуйте утвержденным институциональный уход животных и использования Комитетом протокол для мыши эвтаназии.
- Определить общую направленность всему миру, чтобы сжечь Марк на спинной роговицы непосредственно между носовой и временных canthi на границе роговицы и склеры, сразу же после эвтаназии (рисA). Сделайте запись путем нагревать вверх ручка Прижигающая за десять секунд, а затем трогательно кончик пера спинной роговицы для менее чем за секунду.
Примечание: Холдинг перо Прижигающая роговицы для слишком долго будет вызывать глобус в пункционная. - Enucleate глаз и передаче шара в чашке Петри, содержащие рассечение среднего. Убедитесь в том отслеживать какой глаз является левый и правый глаз.
Примечание: Диссектор следует использовать соответствующие рассечение среднего, который сочетается с их экспериментальный протокол. - Визуально обнаружить и определить сосудистое трещина на задней части глаз (рис. 2B, 2 C).
Примечание: Сосудистое трещина видна также внутри наглазник под инфра красный свет20. - Ориент глобус в Петри блюдо так, что спинной сжечь расположен на Улучшенный полюс, как это было бы, если глаза все еще находились в мыши.
Примечание: Наличие спинной сжечь позволяет для идентификации носовой и временных стороне земного шара, до тех пор, как является ли это правый или левый глаз документально подтверждено: если это правый глаз, носа сосудистое трещина будет справа от ожога и Темпора l сосудистое трещина будет слева от записи. Если это левый глаз, височной сосудистое трещина будет справа от ожога и носовые сосудистое трещина будет слева от записи.
С помощью Рассечение ножницами или 20 G (0,9 x 25 мм) иглы (см. Таблицу материалы), сделать один прокол в мире, где находится спинной ожога. - Сделайте неглубокие снятия среза к зрительному нерву где находится спинной ожогом роговицы. Это сокращение будет перпендикулярно сосудистое трещина, позволяя для идентификации спинной сетчатки после изоляции (Рисунок 2D).
- Сделать следующие два глубоких снятия сокращения к зрительному нерву: один накладки лезвия Рассечение ножницами с линии временной сосудистое трещина на задней части глаза, и один накладки лезвия Рассечение ножницами с носовой хориоидеи трещина линия на задней части глаза. Эти сокращения показываются на изолированные и реконструированных сетчатки в рисунке 2D и 2E.
Примечание: в качестве альтернативы, глубоким вырезом могут быть сделаны в височной сосудистое фиссур и неглубоких надреза могут быть сделаны в носовой сосудистое трещина, делая спинной роговицы сжечь вырезать ненужные. Это позволяет для точной ориентации сетчатки с меньшим количеством снятия сокращений. - Начинают изолировать сетчатки с помощью двух наборов щипцов (см. Таблицу материалы) аккуратно оторвать отверстия, сделанные с проколом в шагах 2.7 и 2.8 до тех пор, пока часть сетчатки подвергается.
Примечание: Важно сделать это мягко, как срывать слишком сильно может вызвать снятия cut(s) сорвать дальнейшее. - Используйте корнцанг дразнить части сетчатки от склеры до склеры был полностью удален. Удаление диафрагмы, линзы, стекловидного тела и любые оставшиеся структуры с щипцами до сетчатки полностью изолированы.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Если ткань будет устанавливаться для иммуногистохимии s опсин, перейдите к шагу 3.5.
3. Маркировка S-опсин градиента в сетчатке мыши
Примечание: Выражение photopigment s опсин асимметрично распределены на вентральной сетчатки1, что делает его отличным маркер для брюшной половины сетчатки. Этот метод полезен только для фиксированных и immunostained ткани (Таблица 1). Следующие шаги могут применяться к сетчатки, которые были расчленены с помощью любого из вышеупомянутых методов.
- Следуйте утвержденным институциональный уход животных и использования Комитетом протокол для мыши эвтаназии.
- Сразу же после эвтаназии enucleate глаз и место земного шара в чашке Петри с рассечение среднего. Убедитесь в том отслеживать какой глаз левый глаз и которая является правый глаз для выявления сетчатки ориентацию после рассекается сетчатки.
Примечание: Диссектор следует использовать соответствующие рассечение среднего, который сочетается с их экспериментальный протокол. -
Начинают изолировать сетчатки с помощью двух наборов щипцов (таблица материалов) аккуратно оторвать отверстие в роговице пока подвергается части сетчатки.
Примечание: Важно сделать это мягко, как срывать слишком сильно может вызвать сетчатки рвать. - Используйте корнцанг дразнить части сетчатки от склеры до склеры был полностью удален. Удаление диафрагмы, линзы, стекловидного тела и любые оставшиеся структуры с щипцами до сетчатки полностью изолированы.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Если с помощью сетчатки для ex vivo эксперимент, провести эксперимент, прежде чем выполнять следующие шаги. - Рассечение ножницами, сделайте четыре снятия сокращений в сетчатке, так что он будет лежать. Смонтируйте стороне клеток ганглия сетчатки вверх на нитроцеллюлозную мембрану (Таблица материалов), осторожно нажав каждый угол сетчатки на мембрану с щипцами.
Примечание: Расположение снятия сокращений может быть произвольным, при использовании s опсин градиента для сетчатки ориентации. - С помощью щипцов, передачи навесные сетчатки первой скважины в 24-ну пластине (Таблица материалов) заполнены с 1 мл раствора параформальдегида 4% (Таблица материалов) для фиксации. Поместите 24-ну пластину на орбитальный шейкер при комнатной температуре (Таблица материалов) и исправить сетчатки для ровно 40 мин.
Примечание: Все следующие шаги, мыть и инкубации должна быть завершена с 24-ну пластины на орбитальный шейкер. - Вымойте сетчатки для 15 мин при комнатной температуре путем передачи его на второй, хорошо заполнены с 1 мл 0,1 М PBS. Повторите этот шаг дважды перечислив последовательно сетчатки на 0,1 М PBS-заполнены третьего и четвертого скважин.
- Перенести пятый хорошо содержащие 1 мл блокирования решения (1,7% Тритон X-100 и 5,2% осла нормальной сыворотки в 0,1 М PBS; см. Таблицу материалы) монтируется сетчатки и инкубировать на ночь при 4 ° C.
- Добавление основного антитела анти s опсин кролик (см. Таблицу материалы) для блокирования решения в концентрации 1: 500 и инкубировать в течение трех дней при 4 ° C.
- Вымойте избыток основного антитела от сетчатки шесть раз, последовательно, поместив его в шести скважин, заполнены с 1 мл 0,1 М PBS 10 минут при комнатной температуре.
- Место сетчатки в колодец с свежий раствор блокировки (1,7% Тритон X-100 и 5,2% осла нормальной сыворотки в PBS 0,1 М) и добавить осла анти кролик Alexa-594 вторичное антитело (см. Таблицу материалы). Инкубировать сетчатки с вторичное антитело на ночь при 4 ° C.
- Вымойте избыток вторичные антитела от сетчатки шесть раз, последовательно, поместив его в шести скважин, заполнены с 1 мл свежего 0,1 М PBS 10 мин при комнатной температуре.
- С помощью щипцов, передачи навесные сетчатки на чашку Петри, содержащих 0,1 М PBS. Релиз сетчатки от нитроцеллюлозную мембрану, аккуратно вставив советы щипцы между сетчатки и мембраны до тех пор, пока больше не прилагается сетчатки.
- Смонтировать сетчатки на стекло микроскопа, мягко подталкивая его пинцетом, до тех пор, пока сетчатки прилипает к стеклянной и удалить слайд из Петри.
- Обложка сетчатки на слайде с Aquamount и покрывают его с #1.5 coverslip. Поместите в лоток слайд слайд (см. Таблицу материалы) и позволить ему сидеть в час при комнатной температуре.
- Возвращение слайд в холодильник и хранить в слайд лотка (см. Таблицу материалов) при 4 ° C, когда не в пользе. После слайд был coverslipped за 24 часа, используйте лак для уплотнения стороны слайд для предотвращения высыхания.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
4. с помощью реконструкции Immunostained сетчатки с S-опсин для определения ориентации сетчатки
- Визуализировать s опсин градиент с Конфокальный микроскоп или epifluorescent микроскопом с насадкой-камеры (см. Таблицу материалы) и изображение сетчатки, так что весь сетчатки видны в одном изображении (цифры 1B, 2D, 3а и 3D). это может быть сделано путем imaging сетчатки в разделах при низком увеличении и затем сшивая изображения.
- Имя сетчатки, чтобы они идентифицируются. Например, имя первого сетчатки для реконструкции «Retina1».
- Скачать и установить ImageJ в https://imagej.nih.gov/ij/download.html.
- Создайте отдельные папки для каждого сетчатки, который должен быть восстановлен, но оставить папки пустым. Например создайте папку под названием «Retina1». В этой папке в последующих шагах будет делаться все файлы, необходимые для воссоздания этого сетчатки.
Примечание: Только файлы, которые должны содержать эти папки являются файлы, которые должны быть проанализированы Retistruct. Все файлы, кроме тех, которые подробно описаны ниже сделает сетчатки может быть открыт Retistruct программного обеспечения. - Открыть изображение сетчатки в ImageJ, выбрав файл → открыть, а затем выбрав «Retina1».
- Без внесения изменений в образ, сохранить его как «image.png» в папку под названием «Retina 1», выбрав файл → сохранить как → PNG.
Примечание: Файл должен называться «image.png» для Retistruct программное обеспечение признать файл в качестве сетчатки для реконструкции. - Используйте средство сегментирована линия наметить края сетчатки. Нажав на двух соседних пятен на границе сетчатки, инструмент сегментирована линия будет, по сути «соединить точки» между двумя смежными пятна, создание наброски. Повторяйте до тех пор, пока изложил весь сетчатки. Сохранить наброски сетчатки как «outline.roi» в папку под названием «Retina1», выбрав анализ ROI менеджер → инструменты → добавить [t] → Подробнее → сохранить.
Примечание: Краем сетчатки могут быть определены где s опсин пятнать переходы на задний план. - Используйте средство сегментирована линия как описано в шаге 4.7 наметить границы диска зрительного нерва. Сохранить наброски диска зрительного нерва, как «od.roi» в папку под названием «Retina1», выбрав анализ ROI менеджер → инструменты → добавить [t] → Подробнее → сохранить.
Примечание: Диск зрительного нерва идентифицируется как небольшое отверстие в центре сетчатки и будет зависеть от качества рассечение.
Примечание: Все файлы, необходимые для восстановления Retistruct («image.png», «outline.roi» и «od.roi») должны быть сохранены папку «Retina1». - Чтобы скачать, установить и открыть программу Retistruct, следуйте инструкциям, изложенным в руководстве пользователя Retistruct, в разделе дополнительных материалов Sterratt, et al. 24
- После того, как Retistruct, появилось окно, нажмите значок «Открыть» в верхней левой части окна и выберите папку «Retina1».
- Окно изображения будет всплывающее означающее, что существует не линейки шкалы. Нажмите кнопку «Закрыть» и в поле появится изображение сетчатки. Визуализировать наброски сетчатки, нажав кнопку «Свойства» в верхней правой части окна и изменить цвет контура в видимый цвет (рис. 5A).
- Важно: Укажите, является ли сетчатки от правого глаза или левый глаз на панели в левой части (рис. 5A).
- Нажмите кнопку «Добавить порвать» на левой стороне и укажите, где слезы или вырезать в сетчатке, нажав на три вершины слезоточивый (рис. 5A). Это создаст линии, которые соединяют три вершины разреза. Повторите для всех разрезах в сетчатке.
- Укажите спинной сетчатки, нажав на произвольной точке сетчатки набросков. Прописная буква «D» будут появляться в тот момент на наброски (рис. 5B).
Примечание: Спинной сетчатки будет темнее половины сетчатки, напротив s опсин градиента. Однако маркировка спинной сетчатки в Retistruct не является надежным методом для определения в спинной части сетчатки, поэтому маркировка «спинной» может быть произвольным в этом шаге. - Реконструировать, которую сетчатки, нажав кнопку «Восстановить сетчатки» в верхней левой части экрана (рис. 5B). Полярный участке реконструированной сетчатки появится с разрезами, видимые в тот же цвет контура (рис. 5C).
- Нажмите кнопку «Сохранить» в правой части экрана, так что реконструированный сетчатки и все связанные с ней данные сохраняются в папку «Retina1» (рис. 5D).
- Сохраните восстановленные сетчатки, нажав кнопку «PDF» в правой панели (рис. 5D). Окно будет появляться просят размер спецификации. Размер по умолчанию приемлемо для следующих шагов. Это действие позволит сэкономить реконструированный сетчатки как «image.polar.pdf» в папку «Retina1».
- Открыть «image.polar.pdf» в программе Paint (или другой программы манипуляции изображения) и используйте инструмент «Заливка» (или аналогичный) чтобы изменить фон реконструированный сетчатки на черный. Сохраните восстановленные сетчатки в формате .tif, такие как «Retina1_reconstructed.tif» в папку «Retina1».
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. - Скачайте MATLAB код для вращающихся сетчатки, под названием «Retina_Rotator.m» (см. Дополнительные материалы). Поместите файл кода в своей собственной папке без других файлов в папке.
- Откройте MATLAB, версия 2007b или более поздней версии. Дважды щелкните на файл кода, чтобы открыть его в MATLAB. В окне командной строки введите «Retina_Rotator» и затем нажмите клавишу enter. Появится окно поиска.
Примечание: Код специфичен для .tif файлов. Если файл поворачиваться не в правильный формат, код будет не вращать сетчатки. Увидеть шаги 4.17 и 4.18. для сохранения восстановленных сетчатки в нужном формате. - Откройте файл, чтобы вращать. Например выберите «Retina1_reconstructed.tif». Код затем проанализировать реконструированный сетчатки и будет автоматически сохранять повернутый сетчатки как «Retina1_reconstructed_rotated.tif» в папке, где расположен исходный файл.
- После того, как код завершения анализа сетчатки, также появится окно показаны образы сетчатки до и после поворота для сравнения (цифры 3B и 3 C; Мультфильмов 3E и 3F).
Примечание: Этот код поворачивает реконструированный сетчатки, так что вентральной (яркий) половина на дне и спинной (наименьшая) половина находится на верхней части, таким образом точно ориентировать сетчатки по s опсин градиента1. Если ли сетчатки от правого глаза или документально левый глаз, расположение носа и временных поляков также могут быть экстраполированы из этого метода ориентации (рис. 3).
Representative Results
Один снятия вырезать, что bisects Улучшенный прямая мышца, точно и надежно идентифицирует спинной сетчатки (рис. 1). Сосудистое трещина точно и надежно идентифицирует носовой и временных сетчатки с глубокой снятия разрезами вдоль временной и носовой сосудистое трещины (Рисунок 2). В этом примере снятия кроя также был достигнут в спинной сетчатки с целью определения оси спинной/вентральный сетчатки (Рисунок 2D, вертикальная стрелка). Будущих Диссекторы показаны шаги этих процессов для целей репликации. Комбинация иммуногистохимии s опсин (Рисунок 3А и 3D), реконструкции с программным обеспечением Retistruct (3Б, 3E) и точная поворота с пользовательским кодом MATLAB (3 C, 3F) позволяет Идентификация брюшной и спинной половинки сетчатки, а также носовой и временных поляков, если оно известно, является ли сетчатки от правого или левого глаза (рис. 3). Мы также сравнили два часто используемых s опсин первичного антитела для эффективности маркировки s опсин конусов (рис. 4A-D): оба коза основного антитела анти s опсин и кролик анти s опсин основное антитело эффективно этикетки Шишки (Рисунок 4E) s опсин в том же мышь.
Снятия сокращений были определены на s опсин immunostained реконструкции сетчатки и их места были по сравнению с ориентации, определяется s опсин градиента. Используя наши пользовательские MATLAB код (см. Дополнительные материалы), сетчатки точно были повернуты так, что самая высокая концентрация s опсин пятнать расположен вентрально, таким образом поместив истинный спинной на 90 ° (для превосходной прямая), правда носа при 0 ° (для носа сосудистое трещина) и правда височной на 180 ° (для временных сосудистое трещина). Значение каждого снятия сократить угол был определен с использованием инструмент «угол» в ImageJ после сетчатки были повернуты согласно s опсин градиента. Средний угол рассчитывается для каждого снятия вырезать тип и среднее значение каждого снятия резки типа затем наносятся на участке полярных (рис. 6). В среднем, Улучшенный прямая мышечной порезов определены спинной полюс в 96.3 ± 4.3° (n = 11) (рис. 6). Носовые сосудистое трещина определены носовой полюс в 6,7 ± 5,8 ° и височной сосудистое трещина определены временные полюс в 172.0 ± 4,4 ° (n = 9; Рисунок 6).
Рисунок 1: использование Улучшенный прямая мышца точно определить спинной сетчатке правого глаза. (A) пример спинной ожога роговицы около границы роговицы и склеры, сделанные с помощью Прижигающая кончик пера (белая стрелка). Улучшенный прямая мышца видна также в этом представлении (белая стрелка). (B) пример целого навесные сетчатки с снятия сделал сократить в спинной сетчатки рассекает Улучшенный прямая мышца. Стрелка изображает глубокое облегчение разруба в спинной сетчатки, рассекает Улучшенный прямая мышца. Сетчатки запачкается с основное антитело коза анти s опсин (см. Таблицу материалы) и вторичные антитела осла анти коза Alexa 594 (см. Таблицу материалов; возбуждения: 590 нм; выбросов: 620 Нм) (голубой). Сетчатки было imaged с epifluorescent микроскопом с Техас красный фильтр (595 Нм). (C) A сетчатки реконструирован в Retistruct и поворачивается с пользовательским кодом MATLAB (см. Дополнительные материалы) с превосходной прямая мышцы снятия вырезать видимым (белая стрелка). D: спинной, V: брюшной, T: височной, N: носовые. Масштаб баров = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: точно идентифицировать носовой и временных поляков сетчатке правого глаза с помощью сосудистое фиссуру. (A) пример спинной ожога роговицы около границы роговицы и склеры, сделанные с помощью Прижигающая кончика пера. (B) сосудистое трещина видна на задней части глаза на склеры (белая стрелка). Дорсальная ожогом роговицы также отображается в данном представлении, расположенный около 90° от височной сосудистое трещина. (C) сосудистое трещина видна на задней части глаза на склеры, путешествие из зрительного нерва в роговицы и склеры границы. (D) A сетчатки витражи с Коза анти s опсин (см. Таблицу материалы) и вторичные антитела осла анти коза Alexa 594 (смотрите Таблицу материалов; возбуждения: 590 нм; выбросов: 620 Нм) (голубой) с разрезами сосудистое трещина (горизонтальный стрелки) и спинной снятия вырезать (вертикальная стрелка). Сетчатки было imaged с epifluorescent микроскопом с Техас красный фильтр (595 Нм). (E) сетчатки реконструирован в Retistruct и поворачивается с пользовательским кодом MATLAB (см. Дополнительные материалы) с срезе спинной обезболивающее и носовой и временных сосудистое трещина отрубы видимым (белые стрелки). D: спинной, V: брюшной, T: височной, N: носовые. Масштаб баров = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: использование s опсин градиента для идентификации все четыре электрода сетчатки. (A) пример сетчатки расчлененный из правого глаза, который был immunostained для обозначения s опсин и образы с epifluorescent микроскопом с Техас красный фильтр (595 Нм). Сокращения в этом сетчатки являются произвольными, поскольку топографических ориентация определяется s опсин градиента. (B) результаты восстановления сетчатки в С Retistruct. Обратите внимание, что градиент s опсин не выровнен правильно потому что сетчатка не выполнялась через пользовательский MATLAB код (см. Дополнительные материалы). (C) результаты вращающихся сетчатки в A с пользовательским кодом. Сетчатка поворачивается так, что самая высокая концентрация s опсин пятнать расположен в нижней части и определены как брюшной сетчатки. Потому что сетчатки от правого глаза, височной полюс расположен 90° против часовой стрелки от дорсальной полюса предоставляется носовой полюс расположен 90° по часовой стрелке от дорсальной полюса. (D) пример сетчатки расчлененный от левый глаз, который был immunostained для обозначения s опсин и образы с Техас красный фильтр (595 Нм). Сокращения в этом сетчатки являются произвольными, поскольку топографических ориентация определяется s опсин градиента. (E) результаты цифровой реконструкции сетчатки в D с Retistruct. Обратите внимание, что градиент s опсин не выровнен правильно потому что сетчатка не был повернут от пользовательского кода. (F) результаты вращающихся сетчатки в D с пользовательским кодом. Сетчатка поворачивается так, что самая высокая концентрация s опсин пятнать расположен в нижней части и определены как брюшной сетчатки. Потому что сетчатки от левого глаза, носовые полюс находится 90° против часовой стрелки от дорсальной полюса а временной полюс-расположен 90° по часовой стрелке от дорсальной полюса. D: спинной, V: брюшной, T: височной, N: носовые. Масштаб баров = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: сравнение двух первичных s опсин антител в маркировке s опсин конусов. (A) A сетчатки витражи с основного антитела анти s опсин коза (см. Таблицу материалы). (B) другие сетчатки же мыши витражи с кролик анти s опсин основное антитело (см. Таблицу материалы). Представитель региона (0,1 x 0,1 мм2) (C) A от сетчатки витражи с основного антитела анти s опсин коза. Изображение снято на epifluorescent микроскоп с увеличением 40 X. Представитель региона (0,1 x 0,1 мм2) (D) A от сетчатки витражи с кролик анти s опсин (см. Таблицу материалов), является альтернативой основное антитело. Изображение было взято на epifluorescent микроскоп с увеличением 40 X. (E) оба антитела ярлык одинаковое количество внешнего сегмента s конус, потому что нет никакого существенного различия в количестве immunopositive s конусов, которые окрашены коза анти s опсин и кролик анти s опсин в какой-либо из проверенных сетчатки чудачества (n = 2; Дисперсионный анализ с должности специального Бонферрони испытания; p > 0,05). Масштаб баров = 1 мм (A-B); 25 мкм (C-D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: наглядное руководство для использования программного обеспечения Retistruct для реконструкции immunostained сетчатки с s опсин. (A) A сетчатки, открыт в Retistruct с видимым контуром и «Порвать» добавил. Очки «Слеза» указаны с наложенными белые стрелки. Все отрубы в этом сетчатки являются произвольными, поскольку нет определенной вехой используется для обозначения сетчатки ориентации во время вскрытия. Важные кнопки описаны в красный. (B) сетчатки с всеми «слезы» добавлены и спинной сетчатки, отождествляется с «D» на краю сетчатки. Обратите внимание, что теперь отображается кнопка «Восстановить сетчатки». Важные кнопки описаны в красный. (C) процесс восстановления сетчатки. Полярный сюжет реконструированный сетчатки появится справа, показывая снятия сокращений в голубой (синие стрелки накладывается уточнить отрезока мест). (D) окончательный результат выполнения сетчатки через Retistruct. Оригинальный wholemount сетчатки остается на левой стороне и реконструированный сетчатки появляется справа. Снятия отрубы видны в голубой (белые стрелки накладывается уточнить отрезока мест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Улучшенный прямая мышца и сосудистое трещина может использоваться для точно сориентировать мыши сетчатки. Участок полярных углов получены либо Улучшенный прямая мышца снятия отрубы или сосудистое трещина сокращений сетчатки, которые были восстановлены с Retistruct. Снятия сокращений были определены на s опсин immunostained реконструкции сетчатки и их места были по сравнению с расположение s опсин градиента. Использование пользовательского кода MATLAB для точного поворота retinas таким образом, чтобы самая высокая концентрация s опсин пятнать расположен вентрально, правда спинной (90° для превосходной прямая), true носовой (0° для носа сосудистое фиссур) и правда временной (180° для временных хориоидеи трещина) были определены для каждой сетчатки. Значение каждого индивидуального освобождения сократить угол был определен в ImageJ и средний угол был рассчитан для каждого снятия вырезать типа. Улучшенный прямая мышечной порезов определены спинной полюс в 96.3 ± 4.3° (n = 11). Носовые сосудистое трещина определены носовой полюс в 6,7 ± 5,8 ° и височной сосудистое трещина определены временные полюс в 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Глубокая ориентир | Место ожога роговицы | Полюс определены сетчатки | Экспериментальное применение |
| Улучшенный прямая | Спинной | Спинной | Живой или фиксированной |
| Носовые сосудистое трещина | Спинной | Носовые | Живой или фиксированной |
| Височной сосудистое трещина | Спинной | Временные | Живой или фиксированной |
| S-опсин градиент | Нет | Спинной, брюшины, носовые, височной | Исправлено |
Таблица 1: Глубокий достопримечательности, полюс сетчатки они определяют, и ли они могут использоваться для применения живой или фиксированной ткани.
Discussion
Там был не всеобъемлющий, стандартизированный протокол для определения и маркировки ориентации изолированных мыши сетчатки в анатомические пространстве. Протокол подробно здесь попытки заполнить этот пробел путем стандартизации и детализируя как использовать глубокие анатомические ориентиры как ориентир для надежно идентифицировать сетчатки ориентации. Было показано, что глубокие анатомические ориентиры в этом протоколе обеспечить более точный и надежный метод для ориентации мыши сетчатки чем поверхностные достопримечательности, такие как ожоги роговицы22. Таким образом исследования, которые полагались на роговицы ожогов сетчатки ориентации может имели больше ошибок в ориентации чем исследования, которые опирались на такие достопримечательности, как мышцы влагалища прямой мышцы живота и сосудистое трещина. Это несоответствие подчеркивает необходимость и значимость этого стандартизованного протокола в отношении интерпретации результатов и сравнений между исследованиями, которые зависят от точной ориентации сетчатки. В целом стандартизированный протокол будет обеспечивать общий метод для исследователей видение, чтобы следовать, таким образом устраняя наличие смешанных переменной в сбор данных, которые могут возникнуть с использованием нестандартизированного методов для выявления сетчатки ориентация.
Представленные здесь методы легко воспроизводимой и для многих видов экспериментальных протоколов. В самом деле один из величайших преимуществ этот протокол основывается на ее адаптивности. Потому что сосудистое трещина, s опсин выражение и прямая мышца достопримечательности все были найдены надежно определить сетчатки ориентации22 ориентир, который лучше всего подходит экспериментальные параметры могут быть выбраны для оптимизации сбора данных (таблицы 1). Кроме того, методы вскрытия могут быть объединены с целью дальнейшего уточнения ориентации сетчатки. Например, сосудистое трещина сокращений могут быть объединены с s опсин иммуногистохимия для того, чтобы ориентировать все четыре электрода сетчатки: носовой и временных полушарий могут быть идентифицированы по отрубы сосудистое трещина, и s опсин иммуногистохимия можно определить брюшной и спинной полушарий. Тем не менее адаптируемость настоящего Протокола может быть ограничен срочным характером физиологии экспериментов. Потому что время, необходимое для выявления ориентир, сделать ожог роговицы и выполнения снятия кроя может привести к значительным ткани смерти в ex vivo экспериментов, некоторые из этих методов диссекции может быть меньше оптимальной. К счастью после диссектор стал знаком с сосудистое трещина или Улучшенный прямая мышца рассечение метод, выявления глубокую достопримечательности и делая снятия отрубы быстро стать частью процедура диссекции и не добавлять значительно к длине рассечение. Хотя мы признаем, что шаги, описанные здесь можно добавить на время экспериментов крайне критичный по времени, мы предлагаем использовать s опсин градиента для пост Специального сетчатки ориентации, когда жизнеспособность тканей больше не является проблемой (рис. 3 ). Окрашивание сетчатки для s опсин является эффективным способом для ориентации сетчатки, как оно может идентифицировать все четыре электрода: s опсин пятнать делит сетчатки на дорсальной и вентральной поляков и позволяет для идентификации носовой и височной поляков в зависимости от сетчатки — из правого или левого глаза (рис. 3). Поэтому мы считаем, что этот протокол обеспечивает надежные и повторяемые набор методов для точной сетчатки ориентации, который может выполнить любой экспериментальной параметров.
Как с любой изменение сетчатки рассечение, действительность этого способа диссекции ограничен точности диссектор и качество ткани, был выделен. Если любой ткани теряется во время вскрытия или сетчатки слишком искажается для точной реконструкции, Retistruct и в программе MATLAB не будет возможность надежно восстановить или Ориент сетчатки. Поэтому важно практиковать метод вскрытия, прежде чем использовать его для сбора данных экспериментов. В то время как типы Анатомирование объяснил здесь не сложны, они должны быть осуществлены для обеспечения повторяемости идентификации сетчатки ориентации с определенной вехой. Кроме того важно, что используется практика диссектор, визуально определить анатомические ориентиры до начала сбора данных, чтобы убедиться, что правильный ориентир. Один из способов проверить точность конкретного диссектор это сделать либо сосудистое трещины, порезы или Улучшенный прямая мышечных сокращений и затем сравнить расположение сокращений s опсин градиент, поскольку она является фиксированной маркером и таким образом не зависит от точности dissectio n. потенциальных Диссекторы можно также сравнить их реконструированный сетчатки примеры реконструированный сетчатки с точной ориентир, порезы показано на рисунке 1 и Рисунок 2. По существу, потенциальные диссектор должен выполнить шаги, описанные в этом протоколе для конкретного рассечение типа, будь то Улучшенный прямая мышца или сосудистое расселина метод и сравнить полученные результаты для s опсин градиента установить действительность особое диссектор. Потому что если диссектор уверены о местонахождении ориентир, это может привести к неточной ориентации сетчатки что будет, по умолчанию, влияет на сбор данных и толкование.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Brittany день и Джессика Onyak для их технической помощи и д-р Лю за любезно позволить нам использовать его epifluorescent Микроскоп. Подтверждений поддержки: низ R15EY026255-01 и Фондом Карла Кирчгесснер.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
| Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
| Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
| Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
| Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
| Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
| Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
| Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
| Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
| Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
| Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
| PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
| Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
| R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
| Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
| Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
| Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
| Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |
References
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
- Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina. Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).
- Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina. J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).
- Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).
- Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina. Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).
- Valiente-Soriano, F. J., et al. Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina. Front Neuroanat. 8, 131 (2014).
- Sabbah, S., et al. A retinal code for motion along the gravitational and body axes. Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).
- Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function. Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).
- Huberman, A. D., et al. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).
- Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Maiorano, N. A., Hindges, R. Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map. Nat Commun. 4, 1938 (2013).
- Hadj-Said, W., et al. Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).
- Tao, Y., et al. The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina. Sci Rep. 5, 18612 (2015).
- Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).
- Estevez, M. E., et al. Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision. J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses. J Vis Exp. (61), (2012).
- Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts. Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).
- Ortin-Martinez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
- Zhang, H., et al. The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice. J Ophthalmol. 2017, 9721362 (2017).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Wang, J., et al. Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. J Comp Neurol. 526 (11), (2018).
- Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup. Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).
- Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package. PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921 (2013).
