Summary
Detta protokoll ger en omfattande dissektion och analys guide för användning av djupt okulär sevärdheter, s-opsin immunohistokemi, Retistruct och anpassad kod att korrekt och tillförlitligt sätt orientera isolerade mus näthinnan i anatomiska utrymme.
Abstract
Exakt och tillförlitligt identifiera rumslig orientering av isolerade mus näthinnan är viktig för många studier i visuell neurovetenskap, inklusive analys av täthet och storlek övertoningar retinal celltyper, riktning trimning av riktning-selektiv ganglionceller, och granskning av topografiska degeneration mönster i några retinala sjukdomar. Det finns dock många olika okulära dissektion metoder som rapporterats i litteraturen som används för att identifiera och märka retinal orientering i mus näthinnan. Medan metoden läggning används i sådana studier är ofta förbises, kan inte rapportering hur retinal orientering bestäms orsaka avvikelser i litteratur och förvirring när du försöker jämföra data mellan studier. Ytlig okulär sevärdheter såsom hornhinnan brännskador används ofta men har nyligen visat sig vara mindre tillförlitliga än djupare sevärdheter såsom rectus musklerna, den koroidea sprickan eller s-opsin övertoningen. Här, erbjuder vi en heltäckande guide för användning av djupt okulär sevärdheter noggrant dissekera och dokumentera rumsliga orienteringen av en enstaka mus näthinnan. Vi har också jämfördes effekten av två s-opsin antikroppar och ingår ett protokoll för s-opsin immunohistokemi. Eftersom orientering av näthinnan enligt s-opsin övertoningen kräver retinal rekonstruktion med Retistruct programvara och rotation med anpassad kod, har vi presenterat de viktiga steg som krävs för att använda båda dessa program. Sammantaget är målet med detta protokoll att leverera en pålitlig och repeterbar uppsättning metoder för korrekt retinal orientering som är anpassningsbar till mest experimentella protokoll. Ett övergripande mål med detta arbete är att standardisera retinal orientering metoder för framtida studier.
Introduction
En viktig och ibland förbisedd aspekt av retinal neurovetenskap är rätt orientering och analys av isolerade hela-mount näthinnan, oavsett om det är en näthinnan i en elektrofysiologi inspelning kammare eller på en histologisk bild orientering. Detta är särskilt viktigt för studier på mus näthinnan, som för närvarande är den mest använda modellen för undersökningar av däggdjur visuella systemet. Senaste upptäckter avslöja att musen näthinnan är inte rumsligt enhetlig men har täthet och storlek övertoningar funktionellt distinkta retinal celltyper, såsom melanopsin ganglionceller, övergående OFF-alpha ganglionceller och kon opsins1,2 ,3,4,5. Följaktligen, den metod som används för att bestämma inriktningen på näthinnan kan påverka experimentella resultat som omfattar cell typ eller opsin distributioner2,3,6, riktning trimning av riktning-selektiv ganglion celler7,8,9, och topografiska mönster av retinal degeneration10,11,12,13,14 . I själva verket kan inte rapportering hur retinal orientering rapporteras orsaka avvikelser i litteratur och förvirring när du försöker jämföra data mellan studier. Det är därför viktigt att forskare rapporterar metoden för att identifiera orienteringen på näthinnan så att resultaten av sådana studier kan tolkas korrekt.
Retinal orientering identifieras vanligen genom poängsättning dorsala, ventrala, nasal eller temporal hornhinnan före okulär enucleation1,3,12,15,16,17 ,18,19 eller genom att skära eller färgning djupt anatomiska öga sevärdheter såsom extraocular muskler6,7, åderhinnan spricka20,21, eller s-opsin lutning2,3. Rectus musklerna kan användas för att identifiera dorsala, ventrala, nasal och tidsmässiga näthinnan genom att göra en djup lindra snitt som bisects fastsättning av antingen den överlägsna rectus, sämre rectus, mediala rectus eller laterala rectus musklerna, respektive. Men för de flesta experiment är använder en rectus musklerna tillräckligt för att orientera den näthinna22. Den koroidea spricka, som är en kvarleva av ögat utveckling, kan ses som en svag horisontell linje på baksidan av ögat. Varje ände av raden avslutar vid antingen en nasal eller temporal stången av globe23. Slutligen, s-opsin uttryck är asymmetriskt fördelad på ventrala näthinnan hos möss, och s-opsin antikroppar kan användas för att avslöja den ventrala näthinnan i immunhistokemisk experiment1.
Senaste arbete av Stabio, o.a. 22 visat att ytlig okulär sevärdheter såsom hornhinnan burns är en mindre tillförlitlig metod för att orientera näthinnan i anatomiska utrymme, troligen på grund av mänskliga fel och variabilitet att göra hornhinnan Bränn när du använder temporal och mediala canthi som referenspunkter. Djupa sevärdheter, till exempel överlägsna rectus musklerna och åderhinnan spricka s-opsin övertoningen, har däremot visat sig vara mer tillförlitliga och korrekta sevärdheter för att orientera den näthinna22. Identifiering av dessa anatomiska landmärken kräver dock unika dissektion steg som inte beskrivs i detalj i litteraturen. Således, målet med detta protokoll är att tillhandahålla en omfattande handledning om hur man använder den överlägsna rectus musklerna och åderhinnan spricka s-opsin lutning att korrekt identifiera den rumsliga orienteringen mus näthinnan. Dessutom har vi inkluderat en jämförelse av effektiviteten av två s-opsin antikroppar, samt ett protokoll för s-opsin immunohistokemi.
En ytterligare utmaning till studier förlitar sig på exakt retinal orientering är stor lindra nedskärningarna krävs att platta wholemount näthinnor på en inspelning kammare, maträtt eller bild. Detta kan innebära utmaningar för analys av vad som är naturligt en tredimensionell struktur när det är avbildad som en platt tvådimensionell struktur. Ett program som heter Retistruct24 kan användas att återvända en platt wholemount retina till dess tredimensionella struktur innan de insamlade från det analyseras. Således är en del av detta protokoll tillägnad belyser de steg som är nödvändiga för att använda programvaran Retistruct för att rekonstruera s-opsin immunostained mus näthinnor. Vi har även inkluderat ett avsnitt av protokoll för att använda våra egna MATLAB script, som utvecklades till korrekt rotera och orient mus näthinnor färgas med s-opsin.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av The University of Akron.
1. använda den överlägsna Rectus muskler landmärket att identifiera Retinal orientering
Obs: Överlägsna rectus musklerna är ett landmärke för den dorsala retina (tabell 1). Om experimentet inte kräver märkning av dorsala näthinnan, hoppa över steg 1 och fortsätter till steg 2.
- Följ din godkända institutionella djur vård och användning kommittén protokoll för mus dödshjälp.
- För att identifiera den allmänna inriktningen av världen, gör en bränna mark den dorsala hornhinnan direkt mellan de nasala och tidsmässiga canthi nära gränsen till hornhinnan-sklera omedelbart efter dödshjälp (figur 1A). Gör brännskadan Markera genom uppvärmning upp en diatermi penna i tio sekunder och sedan röra spetsen på pennan för att dorsala hornhinnan för mindre än en sekund.
Obs: Innehav diatermi pennan på hornhinnan för länge kommer att orsaka hela världen för att punktera.
Obs: Medan vissa diatermi pennor avger ljus, diatermi pennan som anges i Tabell av material inte avger något ljus när uppvärmd, vilket gör det ett säkert alternativ för stjärnkartsschema experiment. - För enucleation, använda böjda pincetten försiktigt push ögat ur hållaren och grepp i världen från undersidan. Skär inte synnerven för att ta bort i världen. i stället långsamt lyfta världen från sin sockel medan du samtidigt flyttar det försiktigt från vänster till höger tills Globen släpps från uttaget.
Obs: Denna rörelse gör att rectus musklerna att sitta kvar till Globen när världen tas slutligen bort helt från uttaget. Synnerven kommer också ofta kvar till Globen. - Överföra i världen med bifogade rectus musklerna i en petriskål med dissektion medium. Se till att hålla reda på vilket öga är vänster öga och som är höger öga.
Obs: DISSEKTOR bör använda ett lämpligt dissektion medium som justeras med sina experimentella protokoll. - Omfattas dissektion, visuellt lokalisera dorsala korneal brännskadan och identifiera den överlägsna rectus musklerna med som det är knuten (figur 1A).
- Med hjälp av dissektion sax eller en 20 G (0,9 mm x 25 mm) nålen (se Tabell för material), punktering hornhinnan på varumärket burn. Göra en djup lindra snittet i världen mot synnerven till Tudela den överlägsna muskeln. En isolerad och rekonstruerade näthinnan med denna nedskärning visas i siffror 1B och 1 C.
- Börja med att isolera näthinnan med hjälp av två uppsättningar av tången (se Tabell för material) att försiktigt riva hålet gjort med punkteringen i steg 1,6 tills delen av näthinnan är utsatt.
Obs: Det är viktigt att detta bör göras försiktigt, som sliter alltför kraftfullt kan orsaka lindra snittet att riva ytterligare. - Använd tången för att retas sönder näthinnan från sklera tills sklera har tagits bort helt. Ta bort iris, linsen, glaskroppen och eventuella återstående strukturer med pincett tills näthinnan är helt isolerad.
Obs: Protokollet kan pausas här. Om vävnaden kommer att fastställas för s-opsin immunohistokemi, Fortsätt till steg 3.5.
2. använda den koroidea fissur landmärket att identifiera Retinal orientering
Obs: Den koroidea sprickan finns på sklera på baksidan av ögat, och går från den temporal Polen till den nasala Polen (siffror 2B och 2 C; Tabell 1).
- Följ godkända institutionella djur vård och användning kommittén protokoll för mus dödshjälp.
- För att identifiera den allmänna inriktningen av världen, gör en bränna mark den dorsala hornhinnan direkt mellan de nasala och tidsmässiga canthi nära gränsen till hornhinnan-sklera omedelbart efter dödshjälp (figur 2A). Gör brännskadan Markera genom uppvärmning upp en diatermi penna i tio sekunder och sedan röra spetsen på pennan för att dorsala hornhinnan för mindre än en sekund.
Obs: Innehav diatermi pennan på hornhinnan för länge kommer att orsaka hela världen för att punktera. - Enucleate ögat och överföra hela världen i en petriskål med dissektion medium. Se till att hålla reda på vilket öga är vänster öga och som är höger öga.
Obs: DISSEKTOR bör använda ett lämpligt dissektion medium som justeras med sina experimentella protokoll. - Visuellt lokalisera och identifiera den koroidea sprickan på baksidan av ögat (figur 2B, 2 C).
Obs: Koroidea sprickan syns även inuti ögonmusslan under infrarött ljus20. - Orientera i världen i petriskål så att dorsala brännskadan ligger på den överlägsna Polen, eftersom det skulle vara om ögat var fortfarande i musen.
Obs: Förekomsten av den dorsala burn möjliggör identifiering av den nasala och tidsmässiga sidan av världen, så länge om det är en höger eller vänster öga har dokumenterats: om det är en höger öga, den nasala koroidea sprickan kommer att vara till höger om brännskadan och kundavtalets l koroidea fissur blir till vänster om brännskadan. Om det är en vänster öga, temporal koroidea sprickan kommer att vara till höger om brännskadan och nasal koroidea sprickan blir till vänster om brännskadan.
Med hjälp av dissektion sax eller en 20 G (0,9 x 25 mm) nålen (se Tabell för material), göra en punktering i Globen där dorsala brännskadan ligger. - Göra ett grunt befriande skär mot synnerven där dorsala korneal brännskadan ligger. Detta snitt kommer att vara vinkelrät mot den koroidea spricka, möjliggör identifiering av dorsala näthinnan efter isolering (figur 2D).
- Göra följande två djupt lindra nedskärningar mot synnerven: en genom att bladen av dissektion sax upp med raden temporal koroidea spricka på baksidan av ögat, och en av foder blad av dissektion saxar upp med nasal åderhinnan fissur linje på baksidan av ögat. Dessa nedskärningar är visas på en isolerad och rekonstruerade näthinnan i figur 2D och 2E.
Obs: Alternativt ett djupt snitt kan göras på den temporal koroidea sprickan och ett grunt snitt kan göras på den nasala koroidea spricka, att göra dorsala korneal Bränn skär onödiga. Detta möjliggör korrekt orientering av näthinnan med färre lindra skärsår. - Börja med att isolera näthinnan med hjälp av två uppsättningar av tången (se Tabell för material) att försiktigt riva hålet gjort med punkteringen i steg 2.7 och 2.8 tills delen av näthinnan är utsatt.
Obs: Det är viktigt att detta bör göras försiktigt, som sliter alltför kraftfullt kan orsaka den avlösande cut(s) att riva ytterligare. - Använd tången för att retas sönder näthinnan från sklera tills sklera har tagits bort helt. Ta bort iris, linsen, glaskroppen och eventuella återstående strukturer med pincett tills näthinnan är helt isolerad.
Obs: Protokollet kan pausas här. Om vävnaden kommer att fastställas för s-opsin immunohistokemi, Fortsätt till steg 3.5.
3. märkning S-opsin övertoningen i mus näthinnan
Obs: S-opsin photopigment uttrycket är asymmetriskt distribueras till den ventrala näthinna1, vilket gör det till en utmärkt markör för den ventrala delen av näthinnan. Denna metod är endast användbar för fasta och immunostained vävnad (tabell 1). Följande steg kan tillämpas på näthinnor som har varit dissekerade med någon av ovan nämnda metoder.
- Följ godkända institutionella djur vård och användning kommittén protokoll för mus dödshjälp.
- Omedelbart efter eutanasi, enucleate ögat och placera i världen i en petriskål med dissektion medium. Se till att hålla reda på vilket öga är vänster öga och som är höger öga för att identifiera retinal orientering efter näthinnan är dissekeras.
Obs: DISSEKTOR bör använda ett lämpligt dissektion medium som justeras med sina experimentella protokoll. -
Börja med att isolera näthinnan med hjälp av två uppsättningar av tången (tabell av material) att försiktigt riva ett hål i hornhinnan tills delen av näthinnan är utsatt.
Obs: Det är viktigt att detta bör göras försiktigt, som sliter alltför kraftfullt kan orsaka näthinnan att riva. - Använd tången för att retas sönder näthinnan från sklera tills sklera har tagits bort helt. Ta bort iris, linsen, glaskroppen och eventuella återstående strukturer med pincett tills näthinnan är helt isolerad.
Obs: Protokollet kan pausas här. Om använder näthinnan för en ex vivo experimentera, genomföra experimentet innan du utför följande steg. - Med dissektion sax, göra fyra lindra nedskärningar i näthinnan så att det kommer att ligga platt. Montera den näthinna ganglion cell-sidan upp på nitrocellulosa membran (Tabell för material) genom att försiktigt trycka på varje hörn av näthinnan på membranet med pincett.
Obs: Platsen för de avlösande nedskärningarna kan vara godtycklig när du använder s-opsin övertoningen för retinal orientering. - Med pincett, överföring monterade näthinnan till den första brunnen i en 24-well platta (Tabell för material) fylld med 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD (Tabell för material) för fixering. Placera plattan 24 brunnar i orbitalskak vid rumstemperatur (Tabell av material) och fixa näthinnan för exakt 40 min.
Obs: Alla stegen följande wash och inkubation bör kompletteras med 24-väl plattan i orbitalskak. - Tvätta näthinnan för 15 min i rumstemperatur genom att överföra den till andra väl fylld med 1 mL 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning. Upprepa detta steg två gånger genom att sekventiellt överföra näthinnan till 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning-fyllda tredje och fjärde brunnarna.
- Överföra monterade näthinnan till den femte väl innehållande 1 mL av blockering lösning (1,7% Triton x-100 och 5,2% åsna normala serum i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning, se Tabell av material) och inkubera över natten vid 4 ° C.
- Lägg till kanin anti-s-opsin primära antikroppen (se Tabell för material) till blockerande lösning med en koncentration på 1: 500 och Inkubera under tre dagar vid 4 ° C.
- Tvätta den överskjutande primär antikroppen från näthinnan sex gånger genom sekventiellt att placera den i sex brunnar fyllda med 1 mL 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Placera näthinnan i en brunn med färska blockerande lösning (1,7% Triton x-100 och 5,2% åsna normala serum i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning) och tillsätt åsna anti-kanin Alexa-594 sekundär antikropp (se Tabell för material). Inkubera näthinnan med sekundära antikroppen över natten vid 4 ° C.
- Tvätta den överskjutande sekundär antikroppen från näthinnan sex gånger genom sekventiellt att placera den i sex brunnar fyllda med 1 mL färsk 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Använda pincett, överföra monterade näthinnan till en petriskål som innehåller 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning. Släpp på näthinnan från nitrocellulosa membranet genom att försiktigt sätta tips av tången mellan näthinnan och membranet tills näthinnan sitter längre.
- Montera näthinnan på ett glas objektglas genom försiktigt petade det med tången tills näthinnan pinnar till glaset och ta bort bilden från petriskål.
- Täcka näthinnan i bilden med Aquamount och täck den med ett #1.5 täckglas. Placera bilden i en bild bricka (se Tabell av material) och låt den stå i rumstemperatur i en timme.
- Tillbaka bilden till kylskåpet och förvaras i en bild bricka (se Tabell för material) vid 4 ° C när inte i använda. Efter bilden blivit ordning för 24 timmar, Använd nagellack för att täta sidorna av bilden för att förhindra uttorkning.
Obs: Protokollet kan pausas här.
4. använda rekonstruerade näthinnor Immunostained med S-opsin att identifiera Retinal orientering
- Visualisera s-opsin övertoningen med antingen en confocal Mikroskop eller en epifluorescerande Mikroskop med en kamera kvarstad (se Tabell av material) och bilden på näthinnan så att hela näthinnan syns i en bild (siffror 1B, 2D, 3A, och 3D). Detta kan göras genom imaging näthinnan i sektioner vid låg förstoring och sedan sammanfoga bilderna.
- Namn näthinnor så de är identifierbara. Till exempel namn första näthinnan vara rekonstruerat ”Retina1”.
- Hämta och installera ImageJ på https://imagej.nih.gov/ij/download.html.
- Skapa en enskild mapp för varje näthinnan som måste rekonstrueras, men lämnar mapparna tom. Till exempel skapa en mapp som heter ”Retina1”. Alla filer som behövs för att rekonstruera denna näthinnan kommer att placeras i denna mapp i efterföljande steg.
Obs: De enda filer som dessa mappar bör innehålla är de filer som ska analyseras av Retistruct. Alla filer än de som beskrivs nedan kommer att göra näthinnan inte kan öppnas av programvaran Retistruct. - Öppna bilden av näthinnan i ImageJ genom att välja Arkiv → Öppna och sedan välja ”Retina1”.
- Utan att göra några ändringar i bilden, spara den som ”image.png” till mappen med titeln ”Retina 1” genom att välja fil → Spara som → PNG.
Obs: Filen måste namnges ”image.png” för den Retistruct programvaran för att känna igen filen som en näthinnan för återuppbyggnad. - Använd verktyget segmenterad linje för att skissera kanterna på näthinnan. Genom att klicka på två intilliggande fläckar på gränsen till näthinnan, kommer verktyget segmenterad linje i huvudsak ”ansluta prickar” mellan de två intilliggande ställen, att skapa en disposition. Upprepa tills hela näthinnan har beskrivits. Spara näthinnan dispositionen som ”outline.roi” till mappen med titeln ”Retina1” genom att välja analysera → verktyg → ROI manager → Lägg [t] → mer → Spara.
Obs: I utkanten av näthinnan kan identifieras där s-opsin färgningen övergångar till bakgrunden. - Använda verktyget segmenterad linje enligt instruktionerna i steg 4,7 för att beskriva gränsen av synnervspapillen. Spara synnervspapillen dispositionen som ”od.roi” till mappen med titeln ”Retina1” genom att välja analysera → verktyg → ROI manager → Lägg [t] → mer → Spara.
Obs: Den optiska skivan identifieras som det lilla hålet i mitten av näthinnan, och varierar beroende på kvaliteten på dissektion.
Obs: Alla filer som behövs för Retistruct återuppbyggnad (”image.png”, ”outline.roi” och ”od.roi”) bör nu sparas mappen ”Retina1”. - För att ladda ner, installera och öppna programmet Retistruct, följ instruktionerna i användarhandboken Retistruct finns i avsnittet kompletterande material av Sterratt, et al. 24
- När den Retistruct fönster har dykt upp, klicka på ”öppna” ikonen längst upp till vänster i fönstret och välj mappen katalog ”Retina1”.
- Ett bildfönster dyker upp som visar att det inte finns någon skalstapeln. Klicka på ”Stäng” och en bild av näthinnan visas i rutan. Visualisera konturerna av näthinnan genom att klicka på knappen ”Egenskaper” längst upp till höger i fönstret och ändra konturfärgen till en synlig färg (figur 5A).
- VIKTIGT: Ange om näthinnan är från en höger öga eller vänster öga i panelen till vänster (figur 5A).
- Klicka på knappen ”Lägg till Riva” till vänster och ange där en tår eller cut är i näthinnan genom att klicka på de tre hörnen i revan (figur 5A). Detta kommer att skapa linjer som ansluter tre hörnen i snittet. Upprepa för alla nedskärningar i näthinnan.
- Ange den dorsala retina genom att klicka på en godtycklig punkt i näthinnans dispositionen. En stor bokstav ”D” visas på den punkten på konturen (figur 5B).
Obs: Dorsala näthinnan blir den mörka halvan av näthinnan, mittemot s-opsin övertoningen. Markera den dorsala retina i Retistruct är dock inte en tillförlitlig metod för att identifiera den dorsala halvan av näthinnan, så att märkning av ”dorsala” kan vara godtycklig i det här steget. - Rekonstruera näthinnan genom att klicka på knappen ”rekonstruera näthinnan” längst upp till vänster på skärmen (figur 5B). En polär plot av rekonstruerade näthinnan visas med nedskärningarna som är synliga i samma färg som kontur (bild 5C).
- Klicka på knappen ”Spara” till höger på skärmen så att rekonstruerade näthinnan och alla data som associeras med det sparas i katalogen ”Retina1” mapp (figur 5D).
- Spara rekonstruerade näthinnan genom att klicka på ”PDF” i den högra panelen (figur 5D). En ruta visas som frågar för storlek specifikationer. Standardstorleken är acceptabel för de följande stegen. Denna åtgärd kommer att spara rekonstruerade näthinnan som ”image.polar.pdf” i katalogen ”Retina1” mappen.
- Öppna ”image.polar.pdf” i ett ritprogram (eller andra bildmanipuleringsprogram) och Använd verktyget ”Färgpyts” (eller liknande) att ändra bakgrund av rekonstruerade näthinnan till svart. Spara rekonstruerade näthinnan som en .tif-fil, till exempel ”Retina1_reconstructed.tif” i katalogen ”Retina1” mappen.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Hämta MATLAB koden för roterande näthinnan som kallas ”Retina_Rotator.m” (se kompletterande material). Placera koden filen i en egen mapp med inga andra filer i mappen.
- Öppna MATLAB, version 2007b eller senare. Dubbelklicka på kodfilen för att öppna den i MATLAB. Skriv ”Retina_Rotator” i kommandofönstret och tryck sedan på Enter. En Sök-fönstret visas.
Obs: Koden är specifika för TIF-filer. Om filen till roteras inte är i rätt format, kommer koden inte rotera näthinnan korrekt. Se steg 4.17 och 4,18. för att spara rekonstruerade näthinnan i rätt format. - Öppna den fil som ska roteras. Exempelvis välja ”Retina1_reconstructed.tif”. Koden kommer sedan att analysera rekonstruerade näthinnan och sparar automatiskt roterade näthinnan som ”Retina1_reconstructed_rotated.tif” i mappen där den ursprungliga filen ligger.
- När koden har slutförts analysera näthinnan visas ett fönster även visar bilder av näthinnan före och efter rotation för jämförelse (siffror 3B och 3 C; Siffror 3E och 3F).
Obs: Denna kod roterar rekonstruerade näthinnan så att den ventrala (ljusaste) hälften är på botten och den dorsala (dämpad) hälften är på toppen, alltså exakt orientering näthinnan enligt den s-opsin lutning1. Om huruvida näthinnan är från en höger öga eller vänstra öga har dokumenterats, kan platsen för nasal och tidsmässiga polackerna också extrapoleras från denna metod för orientering (figur 3).
Representative Results
En enda lindra klippa som bisects överlägsna rectus musklerna korrekt och tillförlitligt sätt identifierar den dorsala retina (figur 1). Den koroidea sprickan identifierar exakt och tillförlitligt nasal och tidsmässiga näthinnan med djupa lindra snitt längs den tidsmässiga och nasal koroidea sprickan (figur 2). I det här exemplet har en befriande nedskärning också gjorts i dorsala retina för att identifiera den dorsala/ventrala axeln av näthinnan (figur 2D, lodrät pil). Stegen i dessa processer visas i syftet att replikering av framtida analysera. En kombination av s-opsin immunohistokemi (figur 3A och 3D), rekonstruktion med Retistruct programvara (3B, 3E) och korrekt rotation med en anpassad MATLAB-kod (3 C, 3F) gör det möjligt för den identifiering av de ventrala och dorsala halvorna av näthinnan, liksom nasala och tidsmässiga polackerna om det är känt om näthinnan är från en höger eller vänster öga (figur 3). Vi jämförde också två vanliga s-opsin primära antikroppar för effektivitet i märkning s-opsin kottar (figur 4A-D): båda geten anti-s-opsin primär antikropp och den kanin anti-s-opsin primär antikroppen effektivt etikett s-opsin kottar (figur 4E) i samma mus.
Lindra skärsår identifierades på s-opsin immunostained rekonstrueras näthinnor och deras platser jämfördes med orientering bestäms av s-opsin övertoningen. Med hjälp av våra anpassade MATLAB-kod (se Kompletterande material), näthinnor var exakt roteras så att den högsta koncentrationen av s-opsin färgning ligger ventralt, således placera sant dorsala vid 90 ° (för överlägsna rectus), sanna nasal vid 0 ° (för nasal koroidea fissur) och sanna temporal vid 180 ° (för temporal koroidea fissur). Värdet av varje enskild lindra klippa vinkel bestämdes med verktyget vinkel i ImageJ efter näthinnor var roterat enligt s-opsin övertoningen. En genomsnittlig vinkel beräknades för varje lindra skär typ och det genomsnittliga värdet av varje lindra skär typ var sedan plottas på en polär plot (figur 6). I genomsnitt överlägsna rectus muskler nedskärningar identifieras den dorsala stången på 96,3 ± 4,3 ° (n = 11) (figur 6). Nasal koroidea sprickan identifieras den nasala Polen vid 6,7 ± 5,8 ° och den temporal koroidea sprickan identifieras den temporal Polen vid 172.0 ± 4,4 ° (n = 9; (Se figur 6).
Figur 1: använda överlägsna rectus musklerna att korrekt identifiera dorsala retina hos en högra öga. (A) ett exempel på en dorsal korneal bränna nära korneal-skleral gränsen med en diatermi spets penna (vit pil). Överlägsna rectus musklerna syns också i den här vyn (vit pil). (B) ett exempel på hela monterade näthinnan med ett befriande cut gjord i dorsala näthinnan av tudelar överlägsna rectus musklerna. Pilen visar den djupa lindra nedskärningen i dorsala näthinnan av tudelar överlägsna rectus musklerna. Näthinnan är målat med primär antikropp get anti-s-opsin (se Tabell av material) och sekundär antikropp åsna anti get Alexa 594 (se Tabell för material; excitation: 590 nm, emission: 620 nm) (cyan). Näthinnan fotograferades med en epifluorescerande Mikroskop med Texas röd filter (595 nm). (C) en näthinnan rekonstrueras i Retistruct och roteras med en anpassad MATLAB-kod (se Kompletterande material) med den överlägsna rectus muskler lindra skär synliga (vit pil). D: dorsala, V: ventrala, T: temporal, N: nasal. Skala barer = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: använda koroidea sprickan att korrekt identifiera nasal och tidsmässiga polerna av en höger öga näthinna. (A) ett exempel på en dorsal korneal bränna nära korneal-skleral gränsen med en diatermi spets penna. (B), åderhinnan sprickan syns på baksidan av ögat på sklera (vit pil). Dorsala korneal Bränn syns också i den här vyn, ligger ungefär 90° från den temporal koroidea sprickan. (C), åderhinnan sprickan syns på baksidan av ögat på sklera, reser från synnerven till hornhinnan-skleral gränsen. (D) ett näthinnan färgas med geten anti-s-opsin (se Tabell av material) och sekundär antikropp åsna anti get Alexa 594 (se Tabell för material; excitation: 590 nm, emission: 620 nm) (cyan) med koroidea fissur nedskärningar (horisontell pilar) och den dorsala lindra skär (lodrät pil). Näthinnan fotograferades med en epifluorescerande Mikroskop med Texas röd filter (595 nm). (E) en näthinnan rekonstrueras i Retistruct och roteras med en anpassad MATLAB-kod (se kompletterande material) med dorsal lindra snittet och nasal och tidsmässiga koroidea fissur styckningsdelar synliga (vita pilar). D: dorsala, V: ventrala, T: temporal, N: nasal. Skala barer = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: använda s-opsin övertoningen för att identifiera alla fyra stolpar av näthinnan. (A) ett exempel på en näthinnan dissekeras från en höger öga som har immunostained att märka s-opsin och avbildas med en epifluorescerande Mikroskop med Texas röd filter (595 nm). Nedskärningarna i denna näthinnan är godtyckliga eftersom topografiska orientering bestäms av s-opsin övertoningen. (B) resultaten av rekonstruera näthinnan i A med Retistruct. Observera att s-opsin toningen inte är korrekt justerad eftersom näthinnan inte har körts genom den anpassade MATLAB-kod (se Kompletterande material). (C) resultaten av roterande näthinnan i A med den anpassade koden. Näthinnan har roteras så att den högsta koncentrationen av s-opsin färgning är längst och identifierats som den ventrala retinal. Eftersom näthinnan är från en höger öga, den temporal Polen är belägen 90° moturs från dorsala pole och nasal pole är belägen 90° medurs från dorsala Polen. (D) ett exempel på en näthinnan dissekeras från en vänster öga som har immunostained att märka s-opsin och avbildas med Texas röd filter (595 nm). Nedskärningarna i denna näthinnan är godtyckliga eftersom topografiska orientering bestäms av s-opsin övertoningen. (E) resultaten av digitalt rekonstruera näthinnan i D med Retistruct. Observera att s-opsin toningen inte är korrekt justerad eftersom näthinnan inte har roterats av den anpassade koden. (F) resultaten av roterande näthinnan i D med den anpassade koden. Näthinnan har roteras så att den högsta koncentrationen av s-opsin färgning är längst och identifierats som den ventrala retinal. Eftersom näthinnan är från en vänster öga, nasal pole är belägen 90° moturs från dorsala pole och den temporal Polen är belägen 90° medurs från dorsala Polen. D: dorsala, V: ventrala, T: temporal, N: nasal. Skala barer = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: jämförelse av två primära s-opsin antikroppar i märkning s-opsin kottar. (A) A näthinnan färgas med den get-anti-s-opsin primär antikroppen (se Tabell för material). (B) andra näthinnan av samma mus färgas med kanin anti-s-opsin primär antikropp (se Tabell för material). (C), en representant region (0,1 x 0,1 mm2) från en näthinna som färgas med den get-anti-s-opsin primär antikroppen. Bild tagen på en epifluorescerande Mikroskop med 40 X förstoring. (D) ett representativt regionen (0,1 x 0,1 mm2) från en näthinna färgas med kanin anti-s-opsin (se Tabell för material), en primär antikropp alternativ. Bilden togs på en epifluorescerande Mikroskop med 40 X förstoring. (E) både antikroppar etikett samma antal s-cone yttre segment eftersom det inte finns någon signifikant skillnad i antalet immunopositive s-kottar som färgas av geten anti-s-opsin och kanin anti-s-opsin på någon av de testade retinal egenheter (n = 2; ANOVA med post hoc Bonferroni test; p > 0,05). Skala barer = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: en visuell guide för att använda programvaran Retistruct för att rekonstruera näthinnor immunostained med s-opsin. (A) A näthinnan öppnas i Retistruct med en kontur som är synliga och en ”Riva” lagt till. Punkterna i ”tår” indikeras med överlagrade vita pilarna. Alla nedskärningar i denna näthinnan är godtyckliga, som ingen särskild landmark användes för att markera retinal orientering under dissektion. Viktiga knapparna markeras med rött. (B) en retina med alla ”tårar” lagt till och den dorsala retina identifieras med ”D” på kanten av näthinnan. Lägg märke till att knappen ”rekonstruera näthinnan” är nu synlig. Viktiga knapparna markeras med rött. (C) processen för att rekonstruera en näthinnan. Den polär plot av rekonstruerade näthinnan visas till höger, visar de lindra nedskärningar i cyan (blå pilar ovanpå för att klargöra skär platser). (D) det slutliga resultatet av kör en näthinnan genom Retistruct. Ursprungliga wholemount näthinnan fortfarande på vänster och rekonstruerade näthinnan visas till höger. Lindra nedskärningarna är synliga i cyan (vita pilar ovanpå för att klargöra skär platser). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: den överlägsna rectus muskler och åderhinnan sprickan kan användas för att orientera korrekt mus näthinnan. En polär plot av vinklarna från antingen överlägsna rectus musklerna lindra skärsår eller koroidea fissur nedskärningar i näthinnor som har rekonstruerats med Retistruct. Lindra skärsår identifierades på s-opsin immunostained rekonstrueras näthinnor och deras platser jämfördes till platsen för s-opsin övertoningen. Med hjälp av anpassade MATLAB-koden korrekt rotera näthinnan så att den högsta koncentrationen av s-opsin färgning är ligger ventralt, sann dorsala (90° för överlägsna rectus), true nasal (0° för nasal koroidea fissur) och sanna temporal (180° för temporal åderhinnan fissur) fastställdes för varje retina. Värdet av varje enskild lindra klippa vinkel var beslutsam i ImageJ och genomsnittliga vinkel beräknades för varje lindra skär typ. Överlägsna rectus muskler nedskärningar identifieras den dorsala stången på 96,3 ± 4,3 ° (n = 11). Nasal koroidea sprickan identifieras den nasala Polen vid 6,7 ± 5,8 ° och den temporal koroidea sprickan identifieras den temporal Polen vid 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Djupa Landmark | Hornhinnans bränna läge | Stolpe av näthinnan som identifierats | Försöket att tillämpa |
| Överlägsna Rectus | Dorsala | Dorsala | Levande eller fasta |
| Nasal koroidea spricka | Dorsala | Nasal | Levande eller fasta |
| Temporal koroidea spricka | Dorsala | Temporal | Levande eller fasta |
| S-opsin Gradient | Ingen | Dorsala, ventrala, Nasal, Temporal | Fast |
Tabell 1: Djupa landmärken, Polen för näthinnan de identifiera och huruvida de kan användas för live eller fasta vävnad ansökan.
Discussion
Har man inget omfattande, standardiserade protokoll för fastställande och märkning orienteringen av isolerade mus näthinnan i anatomiska utrymme. Protokollet beskrivs här försök att fylla detta tomrum genom att standardisera och beskriver hur man använder djupt anatomiska landmärken som referenspunkter att tillförlitligt identifiera retinal orientering. Det har visat att djupt anatomiska landmärken i detta protokoll ger en mer exakt och tillförlitlig metod för att orientera mus näthinnan än ytliga sevärdheter såsom hornhinnan brännskador22. Således, studier som har förlitat sig på hornhinnans brännskador för retinal orientering kan ha haft större fel i orientering än studier som har förlitat sig på landmärken som rectus musklerna och åderhinnan spricka. Denna diskrepans belyser behovet och betydelsen av detta standardiserade protokoll med avseende på tolkningen av resultaten och göra jämförelser mellan studier som är beroende av korrekt retinal orientering. Sammantaget kommer att ett standardiserat protokoll ge en gemensam metod för vision forskare att följa, vilket eliminerar förekomsten av en förbryllande variabel i datainsamling som kan uppstå med icke-standardiserade metoder för att identifiera retinal läggning.
De metoder som presenteras här är enkelt repeterbara och gäller för många typer av experimentella protokoll. I själva verket är en av de största fördelarna med detta protokoll dess anpassningsförmåga. Eftersom den koroidea fissur, s-opsin uttryck och rectus muskler sevärdheter har alla visat sig tillförlitligt identifiera retinal orientering22 kan landmärket som bäst passar de experimentella parametrarna väljas att optimera datainsamling (tabell 1). Dessutom metoder för dissektion kan kombineras för att ytterligare klargöra orientering på näthinnan. Till exempel koroidea fissur nedskärningar kan kombineras med s-opsin immunhistokemi för att orientera alla fyra stolpar av näthinnan: nasal och tidsmässiga hjärnhalvorna kan identifieras av koroidea fissur nedskärningarna och s-opsin immunohistokemi kan identifiera ventrala och dorsala halvklot. Ännu, anpassningsförmåga i detta protokoll kan begränsas av den känsliga naturen i fysiologi experiment. Eftersom den tid det tar att identifiera ett landmärke, göra en hornhinnan bränna och köra ett befriande snitt kan leda till betydande vävnadsdöd i ex vivo -experiment, kan vissa av metoderna dissektion vara mindre än optimal. Lyckligtvis, när en DISSEKTOR har blivit bekant med antingen koroidea spricka eller överlägsna rectus muskler dissektion metod, att identifiera de djupa landmärkena och att göra den lindra nedskärningar snabbt bli en del av rutinen dissektion och Lägg inte avsevärt med längden av dissektion. Även om vi erkänner att de steg som beskrivs här kan lägga tid till extremt tidskänsliga experiment, föreslår vi att du använder s-opsin övertoningen för post hoc retinal orientering när livskraften i vävnaden är inte längre ett problem (figur 3 ). Färgning näthinnan för s-opsin är ett effektivt sätt att orientera näthinnan, som den kan identifiera alla fyra stolpar: s-opsin färgning delar näthinnan i rygg- och ventrala polacker och möjliggör identifiering av nasal och temporal stolpar beroende på om näthinnan är från en höger eller vänster öga (figur 3). Därför anser vi detta protokoll ger en tillförlitlig och repeterbar uppsättning metoder för korrekt retinal orientering som kan uppfylla alla experimentella parametrar.
Som med alla modifierade retinal dissektion begränsas giltigheten av metoden dissektion av riktigheten i DISSEKTOR och kvaliteten på den vävnad som har isolerats. Om någon vävnad förloras under dissektion eller en näthinnan är alltför sargade för korrekt återuppbyggnad, kommer Retistruct och programmet MATLAB inte att kunna tillförlitligt rekonstruera eller orient näthinnan. Det är därför viktigt att öva metoden dissektion innan använder den för data-samla experiment. Medan typerna av dissektioner förklarade här inte är svårt, måste de praktiseras för att säkerställa repeterbarheten identifiera retinal läggning med ett särskilt landmärke. Dessutom är det viktigt att DISSEKTOR praxis att visuellt identifiera de anatomiska landmärkena före början datainsamling för att se till att den rätta landmärket används. Ett sätt att kontrollera riktigheten av en viss DISSEKTOR är att göra antingen koroidea fissur nedskärningar eller överlägsna rectus musklerna skär och sedan jämföra placeringen av nedskärningarna på s-opsin övertoningen, eftersom det är en fast markör och därmed inte är beroende av noggrannheten i dissectio n. potentiella analysera kan också jämföra deras rekonstruerade näthinnor att exemplen på rekonstruerade näthinnor med korrekt landmark nedskärningar visas i figur 1 och figur 2. I huvudsak en potentiell DISSEKTOR bör utföra stegen som beskrivs i detta protokoll för en viss dissektion typ, oavsett om det är den överlägsna rectus musklerna eller åderhinnan spricka metod, och jämföra resultaten på s-opsin övertoningen att fastställa giltigheten av en särskilt DISSEKTOR. Eftersom om DISSEKTOR är osäker på platsen för stadens landmärke, det kan resultera i en felaktig orientering av näthinnan som kommer att, som standard, påverka datainsamling och tolkning.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Bretagne dag och Jessica Onyak för deras tekniska bistånd och Dr Liu för vänligt låter oss använda hans epifluorescerande Mikroskop. Bekräftelser av stöd: NIH R15EY026255-01 och stiftelsen Karl Kirchgessner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
| Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
| Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
| Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
| Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
| Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
| Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
| Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
| Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
| Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
| Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
| PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
| Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
| R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
| Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
| Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
| Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
| Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |
References
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
- Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina. Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).
- Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina. J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).
- Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).
- Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina. Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).
- Valiente-Soriano, F. J., et al. Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina. Front Neuroanat. 8, 131 (2014).
- Sabbah, S., et al. A retinal code for motion along the gravitational and body axes. Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).
- Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function. Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).
- Huberman, A. D., et al. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).
- Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Maiorano, N. A., Hindges, R. Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map. Nat Commun. 4, 1938 (2013).
- Hadj-Said, W., et al. Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).
- Tao, Y., et al. The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina. Sci Rep. 5, 18612 (2015).
- Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).
- Estevez, M. E., et al. Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision. J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses. J Vis Exp. (61), (2012).
- Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts. Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).
- Ortin-Martinez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
- Zhang, H., et al. The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice. J Ophthalmol. 2017, 9721362 (2017).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Wang, J., et al. Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. J Comp Neurol. 526 (11), (2018).
- Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup. Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).
- Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package. PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921 (2013).
