Summary
Denne protokol giver en omfattende dissektion og analyse guide til brug af dybt okulær vartegn, s-opsin immunhistokemi, Retistruct og brugerdefinerede kode til præcist og pålideligt orientere isolerede mus nethinden i anatomiske rum.
Abstract
Præcist og pålideligt identificerer rumlige orientering af isolerede mus nethinden er vigtigt for mange undersøgelser i visuelle neurovidenskab, herunder analyse af tæthed og størrelse forløb af retinale celletyper, retning tuning af retning-selektive ganglion celler, og undersøgelsen af topografisk degeneration mønstre i nogle retinal sygdomme. Men der er mange forskellige okulær dissektion metoder rapporteret i litteraturen, der bruges til at identificere og navngive retinal orientering i mus nethinden. Mens metoden for orientering anvendes i sådanne undersøgelser er ofte overset, kan ikke rapportering hvordan retinal orientering bestemmes forårsage forskelle i litteratur og forvirring når du forsøger at sammenligne data mellem undersøgelser. Overfladiske okulær vartegn såsom hornhinde burns er almindeligt anvendt, men har for nylig vist sig at være mindre pålidelige end dybere vartegn såsom rectus musklerne, den plexus revne eller s-opsin gradient. Her, leverer vi en omfattende guide til brug af dybe okulær vartegn til præcist at dissekere og dokumentere de rumlig orientering af en isoleret mus nethinden. Vi har også sammenlignede effektiviteten af to s-opsin antistoffer og omfattede en protokol for s-opsin Immunhistokemi. Fordi orientering af nethinden ifølge s-opsin gradient kræver retinal genopbygning med Retistruct software og rotation med brugerdefineret kode, har vi fremlagt de vigtige skridt, der kræves for at bruge begge af disse programmer. Samlet set er målet med denne protokol til at levere en pålidelig og repeterbare sæt af metoder til præcis retinal orientering, der kan tilpasses til mest eksperimenterende protokoller. Et overordnet mål for dette arbejde er at standardisere retinal orientering metoder for fremtidige undersøgelser.
Introduction
En vigtig og ofte overset aspekt af retinale neurovidenskab er ordentlig orientering og analyse af isolerede hele-mount nethinden, hvad enten det er retningen af en nethinden i et Elektrofysiologi optagelse kammer eller på en histologisk dias. Dette er især vigtigt for undersøgelser, hvor mus nethinden, som er i øjeblikket den mest udbredte model til undersøgelser af de pattedyr visuelle system. De seneste opdagelser afsløre at musen nethinden ikke er rumligt ensartet men har tæthed og størrelse forløb af funktionelt adskilte retinal celletyper, som melanopsin ganglion celler, forbigående OFF-alpha ganglion celler og kegle opsins1,2 ,3,4,5. Derfor, metoden anvendes til at bestemme retningen af nethinden kan påvirke de eksperimentelle resultater med celle type eller opsin distributioner2,3,6, retning tuning af retning-selektive ganglion celler7,8,9, og topografiske mønstre af retinale degeneration10,11,12,13,14 . Faktisk kan ikke rapportering hvordan retinal orientering er rapporteret forårsage forskelle i litteratur og forvirring når du forsøger at sammenligne data mellem undersøgelser. Det er derfor vigtigt, at forskere rapport metode til at identificere orientering af nethinden, således at resultaterne af sådanne undersøgelser kan fortolkes præcist.
Retinal orientering er almindeligt identificeret ved at score den dorsale, ventrale, nasal eller tidsmæssige hornhinden inden okulære enucleation1,3,12,15,16,17 ,18,19 eller ved at skære eller farvning dybe anatomiske øje vartegn såsom ekstraokulær muskler6,7, årehinden revne20,21, eller s-opsin gradient2,3. Rectus muskler kan bruges til at identificere den dorsale, ventrale, nasal, og tidsmæssige nethinden ved at gøre et dybt lindre snit, der gennemskærer udlæg i enten den overlegne rectus, ringere rectus, mediale rectus eller laterale rectus musklen, henholdsvis. Men for de fleste eksperimenter, ved hjælp af en rectus muskler er tilstrækkelig til orientere nethinden22. Den plexus revne, som er en rest af øjet udvikling, kan ses som en svag vandret streg på bagsiden af øjet. Hver ende af denne linje afslutter på enten nasale eller den tidsmæssige pol på kloden23. Endelig, s-opsin udtryk distribueres asymmetrisk til den ventrale nethinden i mus, og s-opsin antistoffer kan bruges til at afsløre den ventrale nethinden i immunhistokemisk eksperimenter1.
De seneste arbejde af Stabio, et al. 22 viste at overfladiske okulær vartegn såsom hornhinde burns er en mindre pålidelig metode til orientere nethinden i anatomisk rum, sandsynligvis på grund af menneskelige fejl og variabilitet i at gøre hornhindens brænde når ved hjælp af tidsmæssige og mediale canthi som referencepunkter. Derimod har dybe vartegn, såsom den overlegne rectus musklen, plexus fissur og s-opsin gradient, vist sig at være mere pålidelige og nøjagtige vartegn for orientere nethinden22. Identifikation af disse anatomiske landemærker kræver imidlertid entydigt dissektion trin, der ikke er beskrevet i detaljer i litteraturen. Målet med denne protokol er således at levere en omfattende tutorial om hvordan man bruger overlegen rectus muskel, plexus fissur og s-opsin gradient præcist identificere den rumlige orientering af musen nethinden. Desuden har vi medtaget en sammenligning af effektiviteten af to s-opsin antistoffer, samt en protokol for s-opsin Immunhistokemi.
En yderligere udfordring til undersøgelser, der er afhængige af præcise retinal orientering er de store lindre nedskæringer kræves at flade wholemount nethinder på en optagelse kammer, parabol eller dias. Dette kan indføre udfordringer til analyse af hvad er naturligvis en tredimensionel struktur, når det er afbildet som en flad todimensional struktur. Et program kaldet Retistruct24 kan bruges til at returnere en flad wholemount nethinden til sine tre-dimensionelle struktur, før data indsamlet fra det er analyseret. Således, en del af denne protokol er dedikeret til at fremhæve de skridt, der er nødvendige for at bruge Retistruct software til at rekonstruere s-opsin immunostained mus nethinder. Vi har også medtaget et afsnit af protokollen for at bruge vores custom MATLAB script, som blev udviklet til præcist rotere og orientere mus nethinder farves med s-opsin.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af The University i Akron.
1. ved hjælp af den overlegne Rectus muskel skelsættende at identificere Retinal orientering
Bemærk: Den overlegne rectus musklen er et vartegn for den dorsale nethinden (tabel 1). Hvis forsøget ikke kræver mærkning af den dorsale nethinden, springe trin 1 og fortsætte til trin 2.
- Følg din godkendte institutionelle Animal Care og brug Udvalget protokol for musen eutanasi.
- For at identificere de generelle retningslinjer for kloden, gøre et Brænd mærke på den dorsale hornhinden direkte mellem de nasale og tidsmæssige canthi nær grænsen til hornhinden-sclera umiddelbart efter eutanasi (fig. 1A). Gøre Brænd mærke af varme op en cautery pen i ti sekunder og derefter røre spidsen af pennen til at den dorsale hornhinden for mindre end et sekund.
Bemærk: Bedrift cautery pen til hornhinden for længe vil forårsage globe at punktere.
Bemærk: Mens nogle cautery penne udsender lys, cautery pennen listet i Tabel af materialer ikke udleder nogen lys når opvarmet, hvilket gør det til en sikker indstilling for dark-adapted eksperimenter. - For enucleation, skal du bruge buet pincet til at forsigtigt skubbe øjet ud af sin sokkel og greb globe fra nedenunder. Ikke skære synsnerven for at fjerne verden; i stedet, løft langsomt kloden fra sin sokkel mens du samtidig flytter det forsigtigt fra venstre mod højre indtil kloden er frigivet fra soklen.
Bemærk: Denne bevægelse vil tillade rectus musklerne forbliver knyttet til hele verden, når verden Endelig fjernes helt fra soklen. Synsnerven forbliver også ofte knyttet til hele verden. - Overføre globe med vedlagte rectus musklerne i en petriskål, som indeholder dissektion medium. Sørg for at holde styr på hvilke øje er venstre øje, og som er det højre øje.
Bemærk: Dissector skal bruge en passende dissektion medium, der flugter med deres forsøgsplan. - Omfattet dissektion synligt lokalisere den dorsale hornhinde brænde og identificere den overlegne rectus musklen med som det er tilknyttet (fig. 1A).
- Ved hjælp af dissektion saks eller en 20 G (0,9 mm x 25 mm) nål (Se Tabel af materialer), punktering hornhinden på burn mark. Gøre en dyb lindre cut i verden mod synsnerven at gennemskære den superior muscle. En isoleret og rekonstruerede nethinden med denne nedskæring er vist i tal 1B og 1 C.
- Begynd at isolere nethinden ved hjælp af to sæt af pincet (Se Tabel af materialer) at forsigtigt rive hul lavet med punktering i trin 1,6 indtil del af nethinden er eksponeret.
Bemærk: Det er vigtigt, at dette gøres forsigtigt, som rive alt for kraftigt kan forårsage at lindre snit til at rive yderligere. - Bruge pincet til at drille hinanden nethinden fra sclera indtil sclera er blevet fuldstændig fjernet. Fjerne iris, linse, glasagtige, og enhver resterende strukturer med pincet, indtil nethinden er helt isoleret.
Bemærk: Protokollen kan midlertidigt her. Hvis væv vil blive fastsat for s-opsin immunhistokemi, skal du fortsætte tiltrin 3.5.
2. ved hjælp af plexus revne Landmark at identificere Retinal orientering
Bemærk: Den plexus fissur er til stede på sclera på bagsiden af øjet, og løber fra den tidsmæssige Pol til den nasale pole (tal 2B og 2 C; Tabel 1).
- Følg godkendte institutionelle Animal Care og brug Udvalget protokol for musen eutanasi.
- For at identificere de generelle retningslinjer for kloden, gøre et Brænd mærke på den dorsale hornhinden direkte mellem de nasale og tidsmæssige canthi nær grænsen til hornhinden-sclera umiddelbart efter eutanasi (fig. 2A). Gøre Brænd mærke af varme op en cautery pen i ti sekunder og derefter røre spidsen af pennen til at den dorsale hornhinden for mindre end et sekund.
Bemærk: Bedrift cautery pen til hornhinden for længe vil forårsage globe at punktere. - Enucleate øjet og overføre globe i en petriskål, som indeholder dissektion medium. Sørg for at holde styr på hvilke øje er venstre øje, og som er det højre øje.
Bemærk: Dissector skal bruge en passende dissektion medium, der flugter med deres forsøgsplan. - Visuelt lokalisere og identificere den plexus revne på bagsiden af øjet (figur 2B, 2 C).
Bemærk: Den plexus revne er også synlig inde øjestykket under infra-røde lys20. - Orientere globe i petriskålen således at ryggens brænde er placeret i den overlegne pol, som det ville være hvis øjet var stadig i musen.
Bemærk: Tilstedeværelsen af den dorsale brænde giver mulighed for identifikation af den nasale og tidsmæssige side af kloden, så længe om det er en højre eller venstre øje er blevet dokumenteret: Hvis det er en højre øje, den nasale plexus revne bliver til højre for brænde og temperamalerier l plexus fissur vil være til venstre for at brænde. Hvis det er en venstre øje, den tidsmæssige plexus revne bliver til højre for brænde og nasal plexus revne vil være til venstre for at brænde.
Ved hjælp af dissektion saks eller en 20 G (0,9 x 25 mm) nål (Se Tabel af materialer), gør en punktering i verden hvor den dorsale brænde er placeret. - Gøre en lavvandet lindre cut mod synsnerven hvor den dorsale hornhinde brænde er placeret. Denne nedskæring vil være vinkelret på plexus revne, giver mulighed for identifikation af den dorsale nethinden efter isolation (figur 2D).
- De følgende to dybe lindre nedskæringer mod synsnerven: en af foring vinger af dissektion saks op med linjen tidsmæssige plexus revne på bagsiden af øjet, og en af foring vinger af dissektion saks op med nasal choroidea revne linje på bagsiden af øjet. Disse nedskæringer er vist på en isoleret og rekonstruerede nethinden i figur 2D og 2E.
Bemærk: Alternativt, en dyb udskæring kan foretages på den tidsmæssige plexus revne og et lavvandet snit kan gøres på nasal plexus revne, hvilket gør den dorsale hornhinde brænde skære unødvendige. Dette giver mulighed for præcis orientering af nethinden med færre lindre nedskæringer. - Begynd at isolere nethinden ved hjælp af to sæt af pincet (Se Tabel af materialer) at forsigtigt rive hul lavet med punktering i trin 2.7 og 2.8 indtil del af nethinden er eksponeret.
Bemærk: Det er vigtigt, at dette gøres forsigtigt, som rive alt for kraftigt kan forårsage at lindre cut(s) at rive yderligere. - Bruge pincet til at drille hinanden nethinden fra sclera indtil sclera er blevet fuldstændig fjernet. Fjerne iris, linse, glasagtige, og enhver resterende strukturer med pincet, indtil nethinden er helt isoleret.
Bemærk: Protokollen kan midlertidigt her. Hvis væv vil blive fastsat for s-opsin immunhistokemi, skal du fortsætte tiltrin 3.5.
3. mærkning S-opsin Gradient i mus nethinden
Bemærk: S-opsin photopigment udtryk er asymmetrisk distribueret til den ventrale nethinden1, hvilket gør det en glimrende markør for den ventrale halvdel af nethinden. Denne metode er kun nyttig for faste og immunostained væv (tabel 1). Følgende fremgangsmåde kan anvendes til nethinder, der har været dissekeret ved hjælp af nogen af de ovennævnte metoder.
- Følg godkendte institutionelle Animal Care og brug Udvalget protokol for musen eutanasi.
- Umiddelbart efter eutanasi, enucleate øjet og placere kloden i en petriskål med dissektion medium. Sørg for at holde styr på hvilke øje er venstre øje, og som er det højre øje for at identificere retinal orientering efter nethinden er dissekeret.
Bemærk: Dissector skal bruge en passende dissektion medium, der flugter med deres forsøgsplan. -
Begynd at isolere nethinden ved hjælp af to sæt af pincet (Table of Materials) at forsigtigt rive hul i hornhinden indtil del af nethinden er eksponeret.
Bemærk: Det er vigtigt, at dette gøres forsigtigt, som rive alt for kraftigt kan forårsage nethinden at rive. - Bruge pincet til at drille hinanden nethinden fra sclera indtil sclera er blevet fuldstændig fjernet. Fjerne iris, linse, glasagtige, og enhver resterende strukturer med pincet, indtil nethinden er helt isoleret.
Bemærk: Protokollen kan midlertidigt her. Hvis du bruger nethinden for en ex vivo eksperimentere, foretage eksperiment før du udfører følgende trin. - Ved hjælp af dissektion saks, gøre fire lindre nedskæringer i nethinden, så det vil ligge fladt. Montere nethinden ganglion celle-side op på nitrocellulose membran (Table of Materials) ved forsigtigt at trykke på hvert hjørne af nethinden på membranen med pincet.
Bemærk: Placeringen af de aflaste nedskæringer kan være vilkårlig ved brug af s-opsin gradient til retinal orientering. - Brug af pincet, overførsel monteret nethinden i den første brønd i en 24-godt plade (Table of Materials) fyldt med 1 mL af 4% PARAFORMALDEHYD (Table of Materials) til fiksering. 24-godt pladen anbringes på en orbitalryster ved stuetemperatur (Table of Materials) og lave nethinden for præcis 40 min.
Bemærk: Alle de følgende trin, vask og inkubering skal udfyldes med den 24-godt plade på en orbitalryster. - Vask nethinden i 15 min. ved stuetemperatur ved at overføre det til den anden, godt fyldt med 1 mL 0,1 M PBS. Gentag dette trin to gange af sekventielt overføre nethinden 0,1 M PBS-fyldte tredje og fjerde brønde.
- Overføre monteret nethinden til den femte godt indeholdende 1 mL blokerende løsning (1,7% Triton X-100 og 5,2% æsel normale serum i 0,1 M PBS; Se Tabel af materialer) og der inkuberes natten over ved 4 ° C.
- Tilføje kanin anti-s-opsin primære antistof (Se Tabel af materialer) til de blokerende løsning ved en koncentration på 1: 500 og Inkuber i tre dage ved 4 ° C.
- Vask det overskydende primære antistof fra nethinden seks gange af sekventielt placere det i seks wells fyldt med 1 mL 0,1 M PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Placer nethinden i et godt med frisk blokerende løsning (1,7% Triton X-100 og 5,2% æsel normale serum i 0,1 M PBS) og tilføje æsel anti-kanin Alexa-594 sekundær antistof (Se Tabel af materialer). Inkuber nethinden med den sekundære antistof natten over ved 4 ° C.
- Vask det overskydende sekundære antistof fra nethinden seks gange af sekventielt placere det i seks wells fyldt med 1 mL frisk 0,1 M PBS i 10 min ved stuetemperatur.
- Brug af pincet, overføre monteret nethinden til en petriskål, som indeholder 0,1 M PBS. Release nethinden fra nitrocellulose membran af forsigtigt indsætte tips af pincet mellem nethinden og membranen indtil nethinden er ikke længere knyttet.
- Montere nethinden på et glas objektglas ved forsigtigt prodding det med pincet, indtil nethinden holder sig til glas og fjerne diasset fra petriskålen.
- Dækker nethinden på dias med Aquamount og dække det med en #1.5 coverslip. Placere diasset i dias bakken (Se Tabel af materialer) og gør det muligt at sidde ved stuetemperatur i en time.
- Returnere diasset til køleskab og butik i en bakke, slide (Se Tabel af materialer) ved 4 ° C når den ikke er i brug. Efter diasset har været coverslipped i 24 timer, skal du bruge neglelak til at forsegle sider af dias til at forhindre udtørring.
Bemærk: Protokollen kan pause her.
4. ved hjælp af rekonstrueret nethinder Immunostained med S-opsin at identificere Retinal orientering
- Visualisere s-opsin gradueringsfyld med enten en Konfokal mikroskop eller en epifluorescerende mikroskop med et kamera udlæg (Se Tabel af materialer) og billede til nethinden, således at hele nethinden er synlige i ét billede (tal 1B, 2D, 3A, og 3D). Dette kan gøres ved imaging nethinden i sektioner på lav forstørrelse og derefter sammenstrikke billederne.
- Navngiv nethinder, så de kan identificeres. For eksempel nævne den første nethinden til at blive rekonstrueret "Retina1".
- Hent og Installer ImageJ på https://imagej.nih.gov/ij/download.html.
- Oprette en individuel mappe for hver nethinden, der skal genopbygges, men lad mapperne tomt. For eksempel oprette en mappe med titlen "Retina1". Alle filer er nødvendige for at rekonstruere denne nethinden vil blive placeret i denne mappe i de efterfølgende trin.
NOTE: Kun filer bør indeholder disse mapper er de filer, der skal analyseres ved Retistruct. Nogen filer end dem, der er nærmere beskrevet nedenfor vil gøre nethinden ikke åbnes af Retistruct software. - Åbn billedet af nethinden i ImageJ ved at vælge fil → åben og derefter vælge "Retina1".
- Uden at ændre billedet, gemme det som "image.png" til mappen med titlen "nethinden 1" ved at vælge filer → Gem som → PNG.
Bemærk: Filen skal hedde "image.png" for at Retistruct software til at genkende filen som en nethinden for genopbygning. - Brug værktøjet segmenterede linje for at skitsere kanterne af nethinden. Ved at klikke på to tilstødende steder på grænsen af nethinden, bliver segmenteret stregværktøjet, hovedsagelig "forbinde prikker" mellem de to tilstødende steder, opretter en disposition. Gentag indtil hele nethinden er blevet skitseret. Gem nethinden skitse som "outline.roi" til mappen med titlen "Retina1" ved at vælge Analyze → værktøjer → ROI manager → Tilføj [t] → flere → Gem.
Bemærk: Kanten af nethinden kan være identificeret hvor s-opsin farvning overgange til baggrunden. - Brug værktøjet segmenterede linje som anvist i trin 4.7 for at skitsere kanten af den optiske disk. Gem den optiske disk skitse som "od.roi" til mappen med titlen "Retina1" ved at vælge Analyze → værktøjer → ROI manager → Tilføj [t] → flere → Gem.
Bemærk: Den optiske disk er identificeret som det lille hul i midten af nethinden, og vil variere baseret på kvaliteten af dissektion.
Bemærk: Alle de filer, der er nødvendige for Retistruct genopbygning ("image.png", "outline.roi" og "od.roi") bør nu være gemt mappen "Retina1". - For at downloade, installere, og Åbn programmet Retistruct, Følg instruktionerne i guiden Retistruct fundet i afsnittet supplerende materialer i Sterratt, et al. 24
- Når det Retistruct vindue har optrådt, klik på "Åbn"-ikonet øverst til venstre i vinduet og vælge mappen "Retina1".
- Et billedvindue vil poppe op med angivelse af at der ingen skalalinjen findes. Klik på "Luk" og et billede på nethinden vises i boksen. Visualisere omridset af nethinden ved at klikke på knappen "Egenskaber" i øverste højre hjørne af vinduet og ændre konturfarve til en synlig farve (figur 5A).
- VIGTIGT: Angiv, om nethinden er fra en højre øje eller venstre øje i panelet til venstre (figur 5A).
- Klik på knappen "Tilføj rive" til venstre og angive, hvor en rive eller skære er i nethinden ved at klikke på de tre toppunkter af tåre (figur 5A). Dette vil oprette linjer, der forbinder de tre toppunkter af snittet. Gentag for alle nedskæringer i nethinden.
- Angiv den dorsale nethinden ved at klikke på et vilkårligt punkt i retinal dispositionen. Et stort bogstav "D" vises på det tidspunkt på kontur (figur 5B).
Bemærk: Den dorsale nethinden bliver den mørkere halvdel af nethinden, overfor s-opsin gradient. Markerer den dorsale nethinden i Retistruct er imidlertid ikke en pålidelig metode til at identificere den dorsale halvdel af nethinden, så mærkning af "dorsale" kan være vilkårlig i dette trin. - Rekonstruere nethinden ved at klikke på knappen "Rekonstruere nethinden" øverst til venstre på skærmen (figur 5B). En polar plot af rekonstruerede nethinden vises med de nedskæringer, der er synlige i samme farve som kontur (figur 5C).
- Klik på knappen "Gem" på højre side af skærmen, så den rekonstruerede nethinden og alle de data, der er tilknyttet det er gemt i mappen "Retina1" mappe (fig. 5D).
- Gem den rekonstruerede nethinden ved at klikke på knappen "PDF" i det højre panel (fig. 5D). Der vises en boks bede om størrelse specifikationer. Standardstørrelsen er acceptabelt for følgende trin. Denne handling vil gemme den rekonstruerede nethinden som "image.polar.pdf" i mappen "Retina1" mappe.
- Åbn "image.polar.pdf" i en maling program (eller andre image manipulation program) og bruge værktøjet "Malerspand" (eller lignende) til at ændre baggrunden i den rekonstruerede nethinden til sort. Gem den rekonstruerede nethinden som en .tif-fil, såsom "Retina1_reconstructed.tif" i mappen "Retina1" mappe.
Bemærk: Protokollen kan pause her. - Dataoverføre MATLAB koden for roterende nethinden kaldet "Retina_Rotator.m" (Se supplerende materialer). Placer filen kode i sin egen mappe med ingen andre filer i mappen.
- Åbne MATLAB, version 2007b eller senere. Dobbeltklik på filen kode til at åbne det i MATLAB. I den befale rude, skrive "Retina_Rotator" og derefter slå den postere nøglen. En ransage rude vises.
Bemærk: Koden er specifikke for .tif-filer. Hvis den fil, der skal roteres ikke er i det korrekte format, vil koden ikke rotere nethinden korrekt. Se trin 4.17 og 4.18. for at redde den rekonstruerede nethinden i det korrekte format. - Åbn den fil, der skal roteres. For eksempel, vælge "Retina1_reconstructed.tif". Koden vil derefter analysere den rekonstruerede nethinden og gemmer automatisk roteret nethinden som "Retina1_reconstructed_rotated.tif" i den mappe, hvor den oprindelige fil.
- Når koden er færdig med at analysere nethinden, vises et vindue også viser billeder af nethinden, før og efter rotation til sammenligning (tal 3B og 3 C; Tal 3E og 3F).
Bemærk: Denne kode roterer den rekonstruerede nethinden, således at den ventrale (lyseste) halvdel er på bunden, og den dorsale (dimmest) halvdel er på toppen, hvilket præcist orientere nethinden ifølge s-opsin gradient1. Hvis nethinden er fra en højre øje eller venstre øje er blevet dokumenteret, kan placeringen af de nasale og tidsmæssige polakkerne også ekstrapoleres fra denne metode til orientering (figur 3).
Representative Results
En enkelt lindre snit, der gennemskærer den overlegne rectus musklen, nøjagtigt og pålideligt identificerer den dorsale nethinden (figur 1). Den plexus revne identificerer præcist og pålideligt nasal og tidsmæssige nethinden med dyb lindre nedskæringer langs den tidsmæssige og nasal plexus revne (figur 2). I dette eksempel er en lindre cut også gjort i den dorsale nethinden for at identificere den dorsale/ventral akse af nethinden (figur 2D, lodret pil). Trin i disse processer er vist med henblik på replikering af fremtidige dissectors. En kombination af s-opsin Immunhistokemi (figur 3A og 3D), genopbygning med Retistruct software (3B, 3E) og nøjagtig rotation med en brugerdefineret MATLAB kode (3 C, 3F) giver mulighed for at identifikation af de ventrale og dorsale halvdele af nethinden, samt nasal og tidsmæssige polakkerne hvis det vides, om nethinden er fra en højre eller venstre øjet (figur 3). Vi sammenlignede også to almindeligt anvendte s-opsin primære antistoffer til effektiv mærkning s-opsin kegler (figur 4A-D): begge ged anti-s-opsin primære antistof og kanin anti-s-opsin primære antistof effektivt label s-opsin kegler (figur 4E) i samme mus.
Lindre nedskæringer blev identificeret på s-opsin immunostained rekonstrueret nethinder og deres steder var i forhold til orienteringen bestemmes af s-opsin gradient. Ved hjælp af vores brugerdefinerede MATLAB kode (Se Supplerende materialer), nethinder var præcist drejes således at den højeste koncentration af s-opsin farvning er placeret ventrally, dermed markedsføring sande dorsale på 90 ° (for overlegne rectus), sande nasal ved 0 ° (for nasal plexus fissur) og true tidsmæssige på 180 ° (for tidsmæssige plexus fissur). Værdien af hver enkelt lindre klippe vinkel var bestemmes ved hjælp af værktøjet vinkel i ImageJ efter nethinder var roteret ifølge s-opsin gradient. En gennemsnitlig vinkel blev beregnet for hver lindre skære type og den gennemsnitlige værdi af hver lindre cut type blev derefter afbildet på en polar plot (figur 6). I gennemsnit overlegen rectus muskel nedskæringer identificeret den dorsale pol på 96.3 ± 4,3 ° (n = 11) (figur 6). Den nasale plexus revne identificeret den nasale pol på 6,7 ± 5,8 ° og den tidsmæssige plexus revne identificeret den tidsmæssige pol på 172.0 ± 4,4 ° (n = 9; Figur 6).
Figur 1: ved hjælp af den overlegne rectus musklen til at identificere den dorsale nethinden i et højre øje. (A) et eksempel på en dorsal hornhinde brænde nær hornhinde-scleral grænsen med en cautery spids pen (hvid pil). Den overlegne rectus musklen er også synligt i denne visning (hvid pil). (B) et eksempel på en helhed monteret nethinden med en lindre skære lavet i den dorsale nethinden af bisecting overlegne rectus musklen. Pil skildrer den dybe lindre cut lavet i den dorsale nethinden af bisecting overlegne rectus musklen. Nethinden er plettet med primær antistof ged anti-s-opsin (Se Tabel af materialer) og sekundær antistof æsel anti-ged Alexa 594 (Se Tabel af materialerexcitation: 590 nm; emission: 620 nm) (cyan). Nethinden blev afbildet med en epifluorescerende mikroskop med en Texas rødt filter (595 nm). (C) en nethinden rekonstrueret i Retistruct og roteres med en brugerdefineret MATLAB kode (Se Supplerende materialer) med den overlegne rectus muskel lindre skære synlige (hvid pil). D: dorsale, V: ventrale, T: tidsmæssige, N: nasal. Skalere barer = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: ved hjælp af plexus revne præcist identificere de nasale og tidsmæssige poler af nethinden i et højre øje. (A) et eksempel på en dorsal hornhinde brænde nær hornhinde-scleral grænsen med en cautery spids pen. (B) choroid revne synlige på bagsiden af øjet på sclera (hvid pil). Den dorsale hornhinde burn er også synligt i denne visning, placeret omkring 90° fra den tidsmæssige plexus revne. (C) choroidea revne synlige på bagsiden af øjet på sclera, rejser fra synsnerven til hornhinde-scleral grænsen. (D) A nethinden farves med ged anti-s-opsin (Se Tabel af materialer) og sekundær antistof æsel anti-ged Alexa 594 (Se Tabel af materialerexcitation: 590 nm; emission: 620 nm) (cyan) med plexus revne nedskæringer (vandret pilene), og den dorsale lindre skåret (lodret pil). Nethinden blev afbildet med en epifluorescerende mikroskop med en Texas rødt filter (595 nm). (E) en nethinden rekonstrueret i Retistruct og roteres med en brugerdefineret MATLAB kode (Se supplerende materialer) med dorsal lindre snittet og nasal og tidsmæssige plexus revne nedskæringer synlige (hvide pile). D: dorsale, V: ventrale, T: tidsmæssige, N: nasal. Skalere barer = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: brug af s-opsin gradient til at identificere alle fire pæle af nethinden. (A) et eksempel på en nethinden dissekeret fra en højre øje, der er blevet immunostained til at mærke s-opsin og afbildet med en epifluorescerende mikroskop med en Texas rødt filter (595 nm). Nedskæringer i denne nethinden er vilkårlige, da den topografiske orientering bestemmes af s-opsin gradient. (B) resultater af rekonstruere nethinden i A med Retistruct. Bemærk, at s-opsin gradient ikke er justeret korrekt fordi nethinden ikke er blevet kørt igennem den brugerdefinerede MATLAB kode (jf. Supplerende materialer). (C) resultaterne af roterende nethinden i A med den brugerdefinerede kode. Nethinden er roteret således at den højeste koncentration af s-opsin farvning er placeret nederst og identificeret som de ventrale retinal. Fordi nethinden er fra en højre øje, den tidsmæssige Pol er placeret 90° mod uret fra den dorsale pol og den nasale Pol er placeret 90° med uret fra den dorsale pole. (D) et eksempel på en nethinden dissekeret fra en venstre øje, der er blevet immunostained til at mærke s-opsin og afbildet med en Texas rødt filter (595 nm). Nedskæringer i denne nethinden er vilkårlige, da den topografiske orientering bestemmes af s-opsin gradient. (E) resultaterne af digitalt rekonstruere nethinden i D med Retistruct. Bemærk, at s-opsin gradient ikke er justeret korrekt fordi nethinden ikke er roteret af den brugerdefinerede kode. (F) resultaterne af roterende nethinden i D med den brugerdefinerede kode. Nethinden er roteret således at den højeste koncentration af s-opsin farvning er placeret nederst og identificeret som de ventrale retinal. Fordi nethinden er fra en venstre øje, den nasale Pol er placeret 90° mod uret fra den dorsale pol og den tidsmæssige Pol er placeret 90° med uret fra den dorsale pole. D: dorsale, V: ventrale, T: tidsmæssige, N: nasal. Skalere barer = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 4: sammenligning af to primære s-opsin antistoffer i mærkning s-opsin kegler. (A) A nethinden farves med ged anti-s-opsin primære antistof (Se Tabel af materialer). (B) andre nethinden af samme mus farves med kanin anti-s-opsin primære antistof (Se Tabel af materialer). (C) en repræsentativ region (0,1 x 0,1 mm2) fra en nethinden farves med ged anti-s-opsin primære antistof. Billede taget på en epifluorescerende mikroskop på 40 X forstørrelse. (D) A repræsentative region (0,1 x 0,1 mm2) fra en nethinden farves med kanin anti-s-opsin (Se Tabel af materialer), en primær antistof alternativ. Billedet blev taget på en epifluorescerende mikroskop på 40 X forstørrelse. (E) begge antistoffer mærke det samme antal s-kegle ydre segmenter, fordi der er ingen signifikant forskel i antallet af immunopositive s-kegler, der er plettet af ged anti-s-opsin og kanin anti-s-opsin på nogen af de testede retinal særheder (n = 2; ANAVA med post hoc Bonferroni test; p > 0,05). Skalere barer = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: en visuel guide til ved hjælp af Retistruct software til at rekonstruere nethinder immunostained med s-opsin. (A) A nethinden åbnede i Retistruct med den synlige kontur og en "rive" tilføjet. Point i "Tåre" er angivet med overlejrede hvide pile. Alle udskæringer i denne nethinden er vilkårlige, som ingen bestemt vartegn blev brugt til at markere retinal orientering under dissektion. Vigtige knapper er skitseret i rød. (B) en nethinden med alle "tårer" tilføjet og dorsale nethinden identificeret med "D" på kanten af nethinden. Bemærk, at knappen "Rekonstruere nethinden" er nu synlig. Vigtige knapper er skitseret i rød. (C) processen med at rekonstruere en nethinden. Den polar plot af rekonstruerede nethinden vises til højre, viser, at lindre nedskæringer i cyan (blå pile overlejret for at afklare cut steder). (D) det endelige resultat af kører en nethinden gennem Retistruct. Den oprindelige wholemount nethinden forbliver på venstre og den rekonstruerede nethinden vises til højre. Lindre nedskæringerne er synlige i cyan (hvide pile overlejret for at afklare cut steder). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: den overlegne rectus muskel og årehinden revne kan bruges til at nøjagtigt orientere mus nethinden. En polar plot af vinklerne fremstillet af enten overlegen rectus muskel lindre nedskæringer eller plexus revne nedskæringer i nethinder, der er blevet rekonstrueret med Retistruct. Lindre nedskæringer blev identificeret på s-opsin immunostained rekonstrueret nethinder og deres steder var i forhold til placeringen af s-opsin gradient. Ved hjælp af brugerdefinerede MATLAB kode til præcist rotere nethinder, så den højeste koncentration af s-opsin farvning er placeret ventrally, ægte dorsale (90° for overlegne rectus), true nasal (0° for nasal plexus fissur) og true tidsmæssige (180° for tidsmæssige choroidea fissur) blev fastsat for hver nethinden. Værdien af hver enkelt lindre cut vinkel blev fastsat i ImageJ og en gennemsnitlig vinkel blev beregnet for hver lindre skære type. Superior rectus muskel nedskæringer identificeret den dorsale pol på 96.3 ± 4,3 ° (n = 11). Den nasale plexus revne identificeret den nasale pol på 6,7 ± 5,8 ° og den tidsmæssige plexus revne identificeret den tidsmæssige pol på 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Dyb vartegn | Hornhinde brænde placering | Pol på nethinden identificeret | Eksperimentel anvendelse |
| Superior Rectus | Dorsale | Dorsale | Live eller faste |
| Nasal plexus revne | Dorsale | Nasal | Live eller faste |
| Tidsmæssige plexus revne | Dorsale | Tidsmæssige | Live eller faste |
| S-opsin Gradient | Ingen | Dorsal, ventrale, Nasal, tidsmæssige | Fast |
Tabel 1: Dyb vartegn, pol på nethinden de identificere, og om de kan bruges til live eller faste væv.
Discussion
Der har været nogen omfattende, standardiseret protokol til bestemmelse og mærkning orientering af isolerede mus nethinden i anatomiske rum. Protokollen detaljeret her forsøg på at udfylde dette tomrum ved at standardisere og beskriver, hvordan du bruger dybe anatomiske landemærker som referencepunkter til pålideligt at identificere retinal orientering. Det har vist sig at de dybe anatomiske landemærker i denne protokol giver en mere nøjagtig og pålidelig metode til orientere mus nethinden end overfladiske vartegn såsom hornhinde burns22. Således, undersøgelser, der har påberåbt sig hornhinde burns for retinal orientering kan have haft større fejl i orientering end undersøgelser, der har påberåbt sig vartegn såsom rectus muskler og plexus revne. Denne uoverensstemmelse fremhæver behovet for og betydningen af denne standardiseret protokol med hensyn til fortolkning af resultater og sammenligninger mellem undersøgelser, der afhænger af nøjagtige retinal orientering. Alt i alt vil en standardiseret protokol give en fælles metode for vision forskere til at følge, hvilket eliminerer tilstedeværelsen af en forstyrrende variabel i dataopsamling, der kan opstå ved brug af ikke-standardiseret metoder til identifikation af retinal orientering.
De metoder, der præsenteres her er let gentagelig og gælder for mange typer af eksperimentelle protokoller. Faktisk er en af de største fordele ved denne protokol dens tilpasningsevne. Fordi plexus revne, s-opsin udtryk og rectus muskel vartegn er alle blevet fundet pålideligt identificere retinal orientering22 kan den milepæl, der passer bedst til de eksperimentelle parametre vælges til at optimere dataopsamling (tabel 1). Derudover metoder af dissektion kan kombineres for at yderligere klarlægge orienteringen af nethinden. For eksempel plexus revne nedskæringer kan kombineres med s-opsin Immunhistokemi for at orientere alle fire pæle af nethinden: nasal og tidsmæssige halvkugle kan identificeres af plexus revne nedskæringer, og s-opsin Immunhistokemi kan identificere ventrale og dorsale halvkugler. Endnu, tilpasningsevne af denne protokol kan være begrænset af tid-følsomme karakter af fysiologi eksperimenter. Fordi den tid, det tager at identificere et vartegn, lave en hornhinde brænde og udføre en lindre cut kunne resultere i væsentlige vævsdød i ex vivo eksperimenter, kan nogle af disse dissektion metoder være mindre end optimal. Heldigvis, når en dissector er blevet bekendt med enten plexus revne eller overlegen rectus muskel dissektion metode, til at identificere de dybe vartegn og gøre den lindre nedskæringer hurtigt blive en del af rutinen dissektion og tilføjer ikke væsentligt til længden af dissektion. Selv om vi erkender at trin detaljeret her kan tilføje på tid til meget tidsfølsomme eksperimenter, foreslår vi at bruge s-opsin gradient for post hoc retinal orientering når levedygtighed af væv er ikke længere et problem (figur 3 ). Farvning nethinden for s-opsin er en effektiv måde at orientere nethinden, som det kan identificere alle fire polakker: s-opsin farvning opdeler nethinden i dorsal og ventral polakker og giver mulighed for identifikation af den nasale og tidsmæssige poler afhængigt af, om nethinden er fra en højre eller venstre øjet (figur 3). Vi mener derfor, denne protokol leverer en pålidelig og repeterbare sæt af metoder til præcis retinal orientering, der kan opfylde enhver eksperimentelle parametre.
Som med enhver forandret retinale dissektion, er gyldigheden af metoden dissektion begrænset af nøjagtigheden af dissector og kvaliteten af det væv, der er blevet isoleret. Hvis alle væv er tabt under dissektion eller en nethinden er også mangled for nøjagtige genopbygningen, vil Retistruct og MATLAB program ikke kunne pålideligt rekonstruere eller orientere nethinden. Det er derfor vigtigt at praktisere metoden dissektion, før du bruger det for data-indsamling eksperimenter. Mens typerne af dissektioner forklaret her ikke er svært, må de praktiseres for at sikre repeterbarhed afdækning af retinale orientering med et bestemt vartegn. Derudover er det vigtigt, at den dissector praksis visuelt at identificere de anatomiske landemærker forud for begyndelsen dataindsamling for at sørge for, at den korrekte landmark bliver brugt. En måde at kontrollere rigtigheden af en særlig dissector er at gøre enten plexus revne nedskæringer eller overlegen rectus muskel nedskæringer og derefter sammenligne placeringen af udskæringer til s-opsin gradient, da det er en fast markør og er således ikke afhængig af nøjagtigheden af dissectio n. potentielle dissectors kan også sammenligne deres rekonstruerede nethinder til eksempler på rekonstruerede nethinder med nøjagtige landmark nedskæringer er vist i figur 1 og figur 2. Det væsentlige, en potentiel dissector skal udføre trinene i denne protokol for en bestemt dissektion type, uanset om det er den overlegne rectus muskel eller choroidea revne metode, og sammenligne resultaterne til s-opsin gradient at fastslå gyldigheden af en særlige dissector. Fordi hvis dissector er i tvivl om placeringen af skelsættende, kan det resultere i en forkert orientering af nethinden der vil som standard berøre dataindsamling og fortolkning.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Bretagne dag og Jessica Onyak for deres tekniske bistand og Dr. Liu for venligst at lade os bruge hans epifluorescerende mikroskop. Anerkendelser af støtte: NIH R15EY026255-01 og Karl Kirchgessner Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
| Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
| Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
| Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
| Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
| Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
| Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
| Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
| Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
| Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
| Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
| PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
| Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
| R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
| Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
| Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
| Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
| Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |
References
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
- Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina. Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).
- Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina. J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).
- Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).
- Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina. Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).
- Valiente-Soriano, F. J., et al. Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina. Front Neuroanat. 8, 131 (2014).
- Sabbah, S., et al. A retinal code for motion along the gravitational and body axes. Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).
- Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function. Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).
- Huberman, A. D., et al. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).
- Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Maiorano, N. A., Hindges, R. Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map. Nat Commun. 4, 1938 (2013).
- Hadj-Said, W., et al. Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).
- Tao, Y., et al. The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina. Sci Rep. 5, 18612 (2015).
- Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).
- Estevez, M. E., et al. Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision. J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses. J Vis Exp. (61), (2012).
- Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts. Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).
- Ortin-Martinez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
- Zhang, H., et al. The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice. J Ophthalmol. 2017, 9721362 (2017).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Wang, J., et al. Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. J Comp Neurol. 526 (11), (2018).
- Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup. Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).
- Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package. PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921 (2013).
