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Biochemistry

एक न्यूक्लियोटाइड विस्तार और मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का उपयोग कर ठीक करना और डीएनए मरंमत परख

Published: June 19, 2018 doi: 10.3791/57862
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 1, 1, 2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children's Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

डीएनए पोलीमरेज़ ठीक करने के लिए एक गैर-लेबल, गैर-रेडियो-isotopic विधि और एक डीएनए रिपेयर की परख उच्च संकल्प मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री और एक एकल न्यूक्लियोटाइड विस्तार रणनीति का उपयोग करके विकसित किया गया था । परख के लिए बहुत विशिष्ट, सरल, तेजी से साबित कर दिया है, और आसान ठीक करने के लिए प्रदर्शन और मरंमत 9 से कम पैच-न्यूक्लियोटाइड ।

Abstract

जीनोम और उसके वफादार प्रतिकृति के रखरखाव आनुवंशिक जानकारी के संरक्षण के लिए सर्वोपरि है । उच्च निष्ठा प्रतिकृति का आकलन करने के लिए, हम एक सरल गैर लेबल और गैर-रेडियो-isotopic विधि का उपयोग कर एक मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption ionization समय की उड़ान के साथ (मालदी-तोफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण के लिए एक ठीक अध्ययन के लिए विकसित किया है । यहां, एक डीएनए पोलीमरेज़ [उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में ई कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ मैं (पोल मैं) के Klenow टुकड़ा (KF) सभी चार dideoxyribonucleotide triphosphates की उपस्थिति में एक बेमेल प्राइमर-टेंपलेट द्वैध प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है । बेमेल प्राइमर तो है ठीक/विस्तारित और मालदी-तोफ एमएस के अधीन । उत्पादों के एक न्यूक्लियोटाइड रूपांतरों के लिए नीचे प्राइमर के बड़े पैमाने पर परिवर्तन द्वारा प्रतिष्ठित हैं । महत्वपूर्ण बात, एक ठीक भी आंतरिक एकल बेमेल के लिए निर्धारित किया जा सकता है, हालांकि अलग क्षमता पर । बेमेल 2-4 पर स्थित-न्यूक्लियोटाइड (nt) से 3 ' अंत में मैं पॉल द्वारा कुशलतापूर्वक ठीक कर रहे थे, और 5 nt में एक बेमेल प्राइमर टर्मिनस से केवल एक आंशिक सुधार दिखाया । प्राइमरी 3 ' अंत से 6-9 nt पर स्थित आंतरिक बेमेल के लिए कोई ठीक नहीं हुई । इस विधि भी डीएनए मरंमत परख के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, इंडो वी मरंमत मार्ग के लिए सब्सट्रेट्स के एक आधार घाव की मरंमत का आकलन) । 3 ' अंत deoxyinosine (डि) घावों युक्त प्राइमरों मैं पॉल द्वारा ठीक किया जा सकता है । दरअसल, अंत टी आई, जी मैं, और एक-मैं सब्सट्रेट उनके पिछले 2 dI-युक्त न्यूक्लियोटाइड मैं एक सही ddN 5 '-मोनोफोस्फेट (ddNMP), जबकि अंत सी मैं बेमेल मैं पॉल द्वारा सहन किया गया था जोड़ने से पहले मैं, की अनुमति प्राइमर के बिना बढ़ाया जा रहा था मरंमत, संवेदनशीलता और एमएस परख के लिए डीएनए मरंमत के उपाय के संकल्प का प्रदर्शन ।

Introduction

डीएनए प्रतिकृति के दौरान डीएनए polymerases की ठीक कार्य आनुवंशिक जानकारी है कि संतान को हस्तांतरित करने की जरूरत के उच्च निष्ठा सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है1,2,3,4, 5,6,7. पोलीमरेज़ ठीक exonucleases के योगदान का आकलन करने में सक्षम होने के नाते आनुवंशिक स्थिरता की सुरक्षा तंत्र स्पष्ट होगा ।

रेडियो आइसोटोप लेबलिंग और जेल-आधारित परख densitometric विश्लेषण के साथ संयोजन में autoradiograms या फास्फोरस इमेजिंग8,9,10 पारंपरिक रूप से डीएनए की गतिविधि को ठीक करने का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है polymerases । जबकि कार्यात्मक, इन परख श्रमसाध्य, महंगी हैं, और उच्च प्रवाह प्रारूपों के लिए उत्तरदाई नहीं है । इसके अलावा, radioisotopes अपशिष्ट निपटान सहित सुरक्षा के मुद्दों को भुगतना । वैकल्पिक रूप से, ठीक गतिविधियों fluorometric तकनीकों द्वारा विश्लेषण किया गया है । उदाहरण के लिए, 2-aminopurine (2-एपी) में इन विट्रो पोलीमरेज़ एक फ्लोरोसेंट संकेत11,12का उत्पादन करने के लिए परख ठीक करने के दौरान विस्तार उत्पादों में शामिल किया जा सकता है । दुर्भाग्य से, इन दृष्टिकोण एक कम विशिष्टता से ग्रस्त हैं, के बाद से 2-एपी दोनों thymine और cytosine के साथ जोड़ी कर सकते हैं । अधिक हाल के दृष्टिकोण एक संवेदनशील जी quadruplex-आधारित luminescent स्विच-जांच पर एक पोलीमरेज़ 3 '-5 ' exonuclease परख13 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक पोलीमरेज़ ठीक परख है कि कुछ पर काबू के लिए एक अकेले लेबल फ्लोरोसेंट जांच के रूप में शामिल aforementioned कमियां14। इन fluorometric तरीकों के लिए उत्साह डीएनए सब्सट्रेट के विशिष्ट लेबलिंग की आवश्यकता के कारण कम है ।

इसके विपरीत, डीएनए विश्लेषण के लिए एक मालदी-तोफ एमएस में नियोजित किया गया है, जहां लेबल के साथ प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं 4 ddNTPs एक दिया लोकस15,16,17 में बहुरूपताओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और व्यापक रूप से उत्परिवर्तन का पता लगाने और कैंसर के निदान के लिए नैदानिक अनुप्रयोगों में अपनाया गया है18। इन बुनियादी सिद्धांतों का प्रयोग, हम एक लेबल के लिए नि: शुल्क परख बनाया है इन विट्रो में डीएनए का निर्धारण पोलीमरेज़ को ठीक करने के उच्च संकल्प, उच्च विशिष्टता, और उच्च प्रवाह क्षमता का दोहन मालदी-तोफ MS. E का उपयोग कर गतिविधि । कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ मैं एक मॉडल एंजाइम के रूप में टुकड़ा Klenow, dideoxyribonucleotide triphosphates (ddNTPs) सब्सट्रेट के रूप में न्यूक्लियोटाइड-तोफ MS (चित्रा 1) के माध्यम से एक एकल मालदी विस्तार के बाद उत्पादों को ठीक करने का एक "स्नैपशॉट" ले सकते हैं ।

इसी तरह, इस विधि भी एक डीएनए की मरंमत परख जहां 3 ' अंत dI घावों युक्त प्राइमरों के लिए विकसित किया गया एक पोल मैं परख जो इंडो V निक मरंमत मध्यवर्ती नकल की मरंमत के अधीन हैं । हालांकि पूरी तरह से समझ में नहीं, इंडो वी मरंमत मार्ग ही मरंमत के लिए पॉल मैं घाव के लिए exonuclease गतिविधि ठीक करना काम ज्ञात प्रणाली है19,20। मालदी का प्रयोग-तोफ एमएस, हम एक स्पष्ट रूप से परिभाषित मरंमत पैच दिखाने जहां dI पॉल द्वारा उत्पादेड किया जा सकता है मैं जब सही पूरित न्यूक्लियोटाइड जोड़ने से पहले प्राइमर के पिछले 2 nt में होने वाली ।

ठीक करने और डीएनए की मरंमत के अध्ययन के लिए, इस विधि तेजी से और पिछले तरीकों की तुलना में कम श्रमसाध्य है और तंत्र और समारोह के प्रति अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है ।

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Protocol

1. प्राइमर/

  1. डिजाइन प्राइमर/४०% और ६०% के बीच एक अनुक्रमण या पीसीआर प्राइमरी डिजाइन के रूप में एक संतुलित जी + C सामग्री के साथ टेंपलेट्स । एक उपयुक्त एनीलिंग और बेहतर एमएस संकेतों के लिए 18 से 21 nt के प्राइमरों का प्रयोग करें ।
  2. ५० ° c की स्थापना के द्वारा टेम्पलेट डिजाइन डुप्लेक्स क्षेत्र के लिए न्यूनतम पिघलने के तापमान के साथ कम से 7 nt 5 '-के बीच संकेतों को अलग करने के लिए, प्राइमर और टेम्पलेट.
    नोट: उदाहरण के लिए, के लिए सब्सट्रेट P21/T28 में तालिका 1, 21-nt प्राइमर एक 28-nt टेम्पलेट के साथ युग्मित है । विकल्प: इस तरह के nuclease के रूप में वैकल्पिक न्यूक्लिक एसिड का उपयोग-प्रतिरोधी phosphorothioate बांड के लिए पिछले 4 phosphodiester बांड की जगह पर टेंपलेट के 3 ' अंत में एक गैर विशिष्ट ' 3 के अंत में गिरावट के द्वारा संभव हस्तक्षेप रोक सकता है टेंपलेट्स ( उदाहरणके लिए, 1 तालिकामें T28S4), हालांकि इस टेंपलेट तैयार करने के लिए कुछ लागत जोड़ देगा ।
  3. बिना किसी आगे की शुद्धि के मानक लवण oligonucleotides का प्रयोग इस अध्ययन के लिए संतोषजनक है. एक शेयर के रूप में १०० pmol/µ एल की एकाग्रता में oligonucleotide प्राइमरों/टेंपलेट्स का प्रयोग करें और इसे-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । गुणवत्ता और प्राइमरों की शुद्धता की जांच करें और मालदी-तोफ एमएस (कदम 4-7) पर oligonucleotides चल रहा द्वारा अद्वितीय पीक संकेतों और शोर अनुपात करने के लिए एक अच्छा संकेत सुनिश्चित करने के लिए टेंपलेट्स ।
  4. सापेक्ष मालदी-तोफ MS संकेत तीव्रता (चरण 7) अंशांकन और एकाग्रता सामान्यीकरण (चित्रा 2) के लिए प्रतिक्रिया में प्रासंगिक दृश्यों के बराबर दाढ़ प्राइमरों का निर्धारण.

2. प्रतिक्रियाओं को ठीक करना

नोट: एक ही ठीक प्रतिक्रिया हालत और प्रोटोकॉल एक डीएनए की मरंमत के लिए लागू होता है, मैं, जी मैं, सी मैं, और टी मैं ।

  1. एक उदाहरण के रूप में 1 तालिका में ठीक करने के लिए सब्सट्रेट P21/T28 के एक टी-जी बेमेल का उपयोग करना, पतला प्राइमर P21 और टेम्पलेट T28 को १२.५ pmol/µ एल के साथ एच2ओ; उसके बाद पतला प्राइमरी के 12 µ l का अंतरण और पतला टेम्पलेट के 12 µ l को एक १.५-एमएल निष्फल microcentrifuge ट्यूब पर ।
    नोट: टेंपलेट/प्राइमर मिश्रण की राशि 2 प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त है; आनुपातिक कई प्रतिक्रियाओं के लिए तदनुसार reएजेंट की मात्रा में वृद्धि ।
  2. ट्यूब को कसकर बंद करें । यह एक कवर ६५-° c पानी स्नान में 30 मिनट के लिए, एक ३७-° c पानी स्नान में 30 मिनट के बाद, और अंत में बर्फ पर एक उचित एनीलिंग सुनिश्चित करने के लिए मशीन ।
  3. To a १.५-मिलीलीटर निष्फल microcentrifuge tube, प्राइमर और टेम्पलेट मिक्स के 8 µ एल जोड़ें (५० pmol), 2 µ एल की 10x ठीक करना प्रतिक्रिया बफर, 4 µ एल के 4 ddNTPs मिश्रण (प्रत्येक 4 dNTPs के 2 मिमी), और एच2ओ अप करने के लिए 18 µ एल. झटका ट्यूब मिश्रण करने के लिए.
    नोट: 1x ठीक करने की प्रतिक्रिया बफर ५० मिमी NaCl, 10 मिमी MgCl2, 1 मिमी dithiothreitol, और 10 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ७.९ पर 25 डिग्री सेल्सियस) शामिल हैं । 10x ठीक करने की प्रतिक्रिया बफर के वाणिज्यिक स्रोत के लिए सामग्री की तालिका देखें । प्रतिक्रिया में प्रत्येक ddNTP के अंतिम एकाग्रता ०.१ मिमी है ।
  4. बर्फ में डीएनए पोलीमरेज़ पतला-ठंडा 1x प्रतिक्रिया बफर वांछित एकाग्रता के लिए [उदाहरणके लिए, एक १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब करने के लिए, जोड़ें 4 µ के एल 1x ठीक करने की प्रतिक्रिया बफर और 1 µ एल के 5-U Klenow पोलीमरेज़ के एक वाणिज्यिक स्रोत से (तालिका सामग्री)]. हर समय बर्फ पर पतला एंजाइम की दुकान ।
    नोट: पतला डीएनए पोलीमरेज़ की मात्रा 2 प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त है; अनुपात में कई प्रतिक्रियाओं के लिए तदनुसार एंजाइमों की मात्रा में वृद्धि. Klenow पोलीमरेज़ की २.० इकाइयों युक्त २.० µ एल का एक खंड, 5 मिनट में P21 टी-जी टर्मिनल बेमेल T28 के ५० pmol के आधे से अधिक को ठीक कर सकते हैं ।
  5. वांछित प्रतिक्रिया तापमान के लिए २.३ कदम से सब्सट्रेट मिश्रण के साथ microcentrifuge ट्यूब गर्म (जैसे, आमतौर पर ३७ Klenow पोलीमरेज़ के लिए डिग्री सेल्सियस और टी-4 डीएनए पोलीमरेज़ के लिए 25 डिग्री सेल्सियस). फिर २.० µ से पतला डीएनए पोलीमरेज़ के एल स्थानांतरण चरण २.४ से गरम सब्सट्रेट मिश्रण करने के लिए और अपने सामग्री मिश्रण करने के लिए ट्यूब झटका.
  6. एक कुछ सेकंड के लिए एंजाइम और सब्सट्रेट के साथ ट्यूबों परिवेश के तापमान पर ३,२०० x g के लिए नीचे प्रतिक्रियाओं के घटकों स्पिन । तुरंत एक हीटिंग ब्लॉक या चरण २.५ में के रूप में वांछित मशीन तापमान पर एक पानी के स्नान के लिए प्रतिक्रिया हस्तांतरण ।
  7. प्रतिक्रिया समाप्त
    1. बफर phenol के एक समान मात्रा जोड़ें, यह कुछ सेकंड के लिए भंवर द्वारा मिश्रण है, और यह 5 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर ३,२०० x g पर एक microcentrifuge में केंद्रापसारक ।
      1. एक स्वच्छ microcentrifuge ट्यूब करने के लिए जलीय चरण स्थानांतरण और क्लोरोफॉर्म के एक बराबर मात्रा में जोड़ने के लिए, यह कुछ सेकंड के लिए भंवर से मिश्रण है और यह एक microfuge में ३,२०० x g पर परिवेश के तापमान पर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक । एक स्वच्छ microfuge ट्यूब करने के लिए जलीय चरण हस्तांतरण और में यह 5 मिनट के लिए ९५ ° c पर cubate; फिर इसे बर्फ पर लगाएं ।
        सावधानी: Phenol और क्लोरोफॉर्म में खतरनाक केमिकल होते हैं । हैंडलिंग और अपशिष्ट निपटान संस्थागत नियमों का पालन करना चाहिए ।
    2. वैकल्पिक रूप से, एक एसिड शमन प्रोटोकॉल का उपयोग करें । इसके लिए, 1 मीटर एचसीएल के 2 µ एल जोड़ें 6 मिनट के लिए बर्फ पर प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, तो 1 मीटर diethanolamine (डीईए) के ०.६४ µ एल जोड़ने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के पीएच बेअसर और यह 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर मशीन; फिर इसे बर्फ पर लगाएं ।

3. राल के अलावा नमक प्रदूषण को खत्म करने

  1. वाणिज्यिक साल्टिंग किट से राल स्कूप का उपयोग ( सामग्री की मेजदेखें), ३८४ के डिम्पल को कवर करने के लिए पर्याप्त राल ले-डिंपल, 6-मिलीग्राम राल डिंपल प्लेट.
  2. सभी डिम्पल समान रूप से भर में राल वितरित (6 मिलीग्राम/डिंपल) प्लेट के ऊपर से भर नोच कर । किसी भी अतिरिक्त राल पुनर्प्राप्त करें और इसे बोतल में बदलें ।
  3. २.७ कदम से अंतिम प्रतिक्रिया उत्पादों microfuge ट्यूबों से एक ३८४-अच्छी तरह से प्लेट स्थानांतरण । 16 एच2के µ एल वितरण एक अच्छी तरह से अंतिम प्रतिक्रिया उत्पादों को पतला और फिर प्लेट सील और यह किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए केंद्रापसारक ।
  4. सील निकालें, रिएक्शन प्रॉडक्ट्स के साथ ३८४-वेल प्लेट को उल्टा करके राल-भरी डिंपल प्लेट को ढक दें ।
  5. अच्छी तरह से-डिंपल प्लेट्स सैंडविच पर बारी और ध्यान से ३८४-अच्छी तरह से थाली में राल ड्रॉप जाने (३८४ अच्छी तरह से थाली राल भरा डिंपल प्लेट पर धातु खूंटी के खिलाफ फ्लश है सुनिश्चित हो) ।
  6. शीर्ष पर डिंपल प्लेट को हटा दें, ३८४-अच्छी तरह से प्रतिक्रिया उत्पादों और राल के मिश्रण युक्त प्लेट सील, संक्षेप में यह ३,२०० एक्स जी पर केंद्रापसारक किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए और यह एक रोटेटर पर जगह के लिए कमरे के तापमान पर अपनी सामग्री को नमक के लिए कम से 15 मिनट ।
  7. राल सफाई के बाद, 5 मिनट के लिए ३,२०० एक्स जी में ३८४ अच्छी तरह से प्लेट केंद्रापसारक कुओं के नीचे करने के लिए राल कॉंपैक्ट ।

4. स्थानांतरण प्रतिक्रिया उत्पाद एक मैट्रिक्स चिप के लिए

  1. nanoliter मशीन में नमूना प्लेट सेट (nanodispenser, सामग्री की मेजदेखें) ।
  2. मैट्रिक्स चिप रखो ( सामग्री की मेजदेखें) और ३८४-ठीक इसी ट्रे में धारा ३.७ से थाली ।
  3. nanodispenser काम करने के लिए चिप के लिए प्रतिक्रिया उत्पादों हाजिर; स्टार्ट करने के लिए nanodispenser के टच स्क्रीन पर RUN बटन को पुश करें ।
  4. चिप पर समग्र देखा मात्रा सुनिश्चित करने के लिए स्क्रीन पर संतृप्ति जानकारी युक्त नमूना स्थानों की स्वचालित कब्जा कर लिया छवि की जांच करें 5-10 nL के आसपास है । यदि वॉल्यूम अपर्याप्त है, तो नमूना खोलना दोहराएं ।

5. स्थापना मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर परख जानकारी

  1. आयात करने के लिए प्रत्याशित संकेत जानकारी युक्त. xls प्रारूप में एक फ़ाइल तैयार करें । उदाहरण के लिए, की सेटिंग का उपयोग करें "P21_T28. xls" (तालिका 2) P21/T28 के चरण 2, 3, और 4 में की अशुद्धि प्रतिक्रिया के लिए ।
  2. बनाएं और आवेदन कार्यक्रम में एक नया परख परिभाषित ( सामग्री की मेजदेखें) द्वारा सही डिजाइनर प्रारूप में आयात परख समूह पर क्लिक करके और. xls फ़ाइल का चयन करें (जैसे, "P21_T28. xls" ५.१ कदम से) ।
  3. ग्राहक के माध्यम से लक्ष्य परख प्लेट स्थापित : परियोजना: प्लेट विकल्प पेड़ स्क्रीन के बाईं ओर पर सही पेड़ के ऊपर क्लिक करके और यह एक फ़ाइल नाम दे (जैसे, "CTT20171201" परख कोड और तारीख का प्रतिनिधित्व करता है) ।
  4. ३८४-अच्छी तरह से प्लेट प्रकार का चयन करें और ठीकदबाएँ; एक रिक्त प्लेट दिखाई देगी ।
  5. स्क्रीन के बाईं ओर उपयुक्त परख (उदा., P21_T28) का चयन करें ।
  6. चयनित परख निरुपित (उदाहरणके लिए, P21_T28) चिप पर अच्छी तरह से प्रकाश डाला और राइट क्लिक Plex जोड़ेंका चयन करने के द्वारा प्रत्येक नमूना देखा नमूना स्थिति के लिए ।
  7. कोई हैडर के साथ चिप पर सभी परीक्षणों के एक काम की सूची तैयार (जैसे, 3 तालिकाके 1201. xlsx) । नए नमूना प्रोजेक्ट जोड़ें विकल्प के माध्यम से कार्य सूची आयात करें ।
  8. कार्य सूची में परीक्षण असाइन करें (उदाहरणके लिए, 1201. xlsx से) P21_T28 परख की प्रत्येक स्थिति के लिए और राइट-क्लिक करके चुनें ।

६. मालदी-तोफ MS शस्त्रक्रिया

  1. आवेदन कार्यक्रम का उपयोग कर चिप के लिए जन स्पेक्ट्रोमीटर लिंक ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. स्क्रीन के दाईं ओर डिफ़ॉल्ट सेटिंग का चयन करें ।
  3. ५.३ कदम से परख नाम में भरें (जैसे, CTT20171201), चिप के कोने में चिप आईडी, और सेटिंग्स को बचाने के ।
  4. एमएस नियंत्रण कार्यक्रम शुरू ( सामग्री की मेजदेखें) ।
  5. में/बाहर बटन दबाएँ और स्काउट प्लेट बाहर ले. स्काउट प्लेट पर कदम ४.४ से देखा चिप प्लेस और जन स्पेक्ट्रोमीटर में प्रवेश करने के लिए देखा चिप के लिए /बाहर बटन दबाएँ ।
  6. जन स्पेक्ट्रोमेट्री शुरू करने और डेटा प्राप्त करने के लिए आवेदन कार्यक्रम के मोल बटन ( सामग्री की तालिकादेखें) पर क्लिक करें ।

7. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा विश्लेषण के लिए प्रोग्राम खोलें ( सामग्री तालिकादेखें) ।
  2. ऊपरी बाएँ कोने पर डेटाबेस के पेड़ को ब्राउज़ करें और ६.३ कदम से चिप आईडी का चयन. स्क्रीन के दाईं ओर डेटा फ़ाइल खोलें ।
  3. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम प्रदर्शित करने के लिए स्पेक्ट्रम आइकन पर क्लिक करें. एम/जेड की एक विशिष्ट श्रेणी फसल के लिए, अनुकूलन संवाद का चयन करने के लिए राइट-क्लिक करें और एक्स-अक्ष पर नई विंडो क्लिक करें और वांछित ऊपरी और निचली सीमा सेट और स्पेक्ट्रम की निर्दिष्ट सीमा को दिखाने के लिए ठीक दबाएँ ।
  4. निर्यातराइट-क्लिक करके रिकॉर्ड रखने के लिए स्पेक्ट्रम निर्यात करें ।
    नोट: १,६०० चौड़ाई/1200 इकाई के पैमाने का उपयोग कर एक कंप्यूटर स्क्रीन पर डेटा निरीक्षण के लिए एक उचित आकार है ।
    1. JPEG फ़ाइल प्रकार का चयन करें, गंतव्यपर क्लिक करें, ब्राउज़ डिस्क का चयन करें (उदा., फ़्लैश डिस्क ई:), फ़ाइल का नाम लिखें (उदा., 1201 -1. jpg), और फिर निर्यातपर क्लिक करें ।
  5. डेटा quantitation के लिए, कर्सर का उपयोग करें और चोटी पर क्लिक करने के लिए ऊपरी बाएं हाथ के कोने पर चोटी ऊंचाई दिखाओ ।
    1. वैकल्पिक रूप से, किसी निर्यात की गई JPEG फ़ाइल को मुद्रित करें और मापनी के साथ पीक ऊंचाई को मैंयुअली मापने करें ।

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Representative Results

टेंपलेट्स और प्राइमर:

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करना, समान दाढ़ सिंथेटिक oligonucleotide टेंपलेट्स और प्रासंगिक वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त दृश्यों के प्राइमर उनकी शुद्धता और गुणवत्ता के लिए जांच की गई (आंकड़ा 3ए; संकेत नोट नामित जन मिलान और कम पृष्ठभूमि) और साथ ही पीक तीव्रता और analyte मास (चित्रा 2a) के बीच संबंधों के लिए । पीक हाइट्स मापा गया और MS डेटा सामान्यीकरण के लिए (चित्रा b) परिकलित की गई ।

रिएक्शन कंडीशन और मास स्पेक्ट्रा:

एकल आधार प्राइमर विस्तार मालदी के साथ युग्मित प्रतिक्रियाओं के उपयोग के लिए genotyping के लिए एम सी तोफ पहले मानक ddNTPs टर्मिनेटर17का उपयोग कर व्यवहार्य हो दिखाया गया है । ठीक मानक ddNTPs का उपयोग परख genotyping के एक singleplex प्रतिक्रिया के समान है, लेकिन बहुत सरल और बहुत आसान करने के लिए स्वच्छ और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन ।

एमएस स्पेक्ट्रा दोनों प्राइमरों और टेंपलेट्स (चित्रा 3) से उत्पंन सभी संकेतों को कवर किया । प्राइमरों और टेम्पलेट्स के उचित डिजाइन दोनों टेम्पलेट्स और प्राइमरों (चित्रा 3) के लिए एक अच्छी तरह से अलग संकेत प्रोफ़ाइल उत्पन्न. m/z मान, टेंपलेट्स और उनके गैर विशिष्ट आंशिक ह्रास उत्पादों (m/z > ७,०००) से संकेतों के अनुसार अच्छी तरह से बेमेल प्राइमरों और ठीक उत्पादों से अलग किया गया (m/z < ७,००० चित्रा 3में) । यदि आवश्यक हो, nuclease प्रतिरोधी phosphorothioate बांड शुरू करने के लिए टेंपलेट के 3 ' अंत में पिछले 4 phosphodiester बांड की जगह (1 तालिका; T28S4/P21) गैर-विशिष्ट टेम्पलेट hydrolysis (चित्रा 3g; d27) को कम कर सकते हैं ।

dNTPs के अभाव में, KF एक मजबूत 3 '-exonuclease है और दोनों प्राइमर और इन विट्रो मेंटेम्पलेट अपमानजनक करने में सक्षम है21. देशी 4 dNTPs की तरह, 4 ddNTPs के अलावा KF (चित्रा 3 सी और 3E) द्वारा एक ' ३ अंत गिरावट रोकता है । इसी तरह, 3 ' के एक न्यूक्लियोटाइड विस्तार-समाप्त होता है प्राइमर को बढ़ाकर स्थिरता कहते हैं । पोल का प्रयोग मैं शर्तों को ठीक करने के रूप में पहले 10 यू (४६ pmol) KF, ५०-pmol बेमेल सब्सट्रेट के ८०% से अधिक के साथ20 वर्णित 5 मिनट (चित्रा 3सी, 3E, और 3 जी) में सही थे ।

माध् यमिक तथा ǒ लेषण:

मालदी-तोफ MS रेसोलुशन 1 डाल्टन के रूप में ठीक हो सकता है; दरअसल, प्रतिक्रिया में बड़े पैमाने पर परिवर्तन के साथ सभी सब्सट्रेट, उत्पादों, और मध्यवर्ती चयनित श्रेणी के एक ही एमएस स्पेक्ट्रम में हल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, किसी टर्मिनल T-G बेमेल में, प्राइमरी टर्मिनस में बेजोड़ g को केवल ३२ के एक m/z अंतर के साथ डीडीए के निगमन के साथ सही किया गया था । इस तरह के एक एम/जेड अंतर आसानी से एक एम में एमएस स्पेक्ट्रम पर पहचाना जा सकता है/५,००० से ७,००० (चित्रा 4a) । प्रत्येक व्यक्ति के संकेत के परिवर्तन बेमेल प्राइमर, उत्पाद शुल्क मध्यवर्ती, और १००% के रूप में ठीक उत्पादों से सभी संकेतों संक्षेप द्वारा गणना की जा सकती है । उदाहरण के लिए, टी-जी की प्रतिक्रिया में सुधार, उत्पाद उत्पाद के सापेक्ष ठीक हो गया पर 17% बनाम 23% था 5 मिनट, 31% बनाम 10 मिनट में 18%, और ६९% बनाम 14% पर 20 मिनट (आंकड़ा 4a) ।

जब एक अंत टी-जी बेमेल प्राइमर में मौजूद है, तो पिछले 2 nt में सुधार को पूरा करने के लिए एक डीडीए के अलावा इसके बाद एक्साइज किया जाना चाहिए । दरअसल, सही उत्पादों 5 मिनट में 12% से समय के साथ वृद्धि हुई, 10 मिनट में 28%, प्रतिक्रिया के 20 मिनट में ४५% करने के लिए । इसके अलावा, एक अंत T-G को ठीक करने के लिए उत्पाद उत्पाद के दो रूपों, 1-nt उत्पाद शुल्क मध्यवर्ती और 2-nt उत्पाद उत्पादों, आसानी से हल कर रहे थे (आंकड़ा 4B) ।

एकल dNTP के साथ कैनेटीक्स की शु:

ई. कोलाई डीएनए के लिए मैं पोल, ddNTPs उपयुक्त सब्सट्रेट नहीं कर रहे हैं और अवरोधकों के रूप में माना जाना चाहिए22. वैकल्पिक रूप से, का उपयोग कर एक ' सही ' dNTP के बजाय ठीक प्रतिक्रिया में भी गैर विशिष्ट 3 '-5 ' exonuclease गतिविधि और एकल न्यूक्लियोटाइड विस्तार एमएस विश्लेषण (चित्रा 5B) के लिए उपयुक्त उत्पादों की पीढ़ी को दबा देगा । एक एकल dCTP युक्त प्रतिक्रियाओं से प्राप्त की ठीक दर 4 ddNTPs (चित्रा 5, 5B, और 5C) युक्त प्रतिक्रियाओं की तुलना में दो गुना अधिक है । इस प्रकार, ठीक परख में एक ' सही ' dNTP का उपयोग ddNTPs के निरोधात्मक प्रभाव के बिना एक बेहतर परिणाम पैदावार । यह दृष्टिकोण काइनेटिक विश्लेषण को ठीक करने के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता प्रदान करना चाहिए ।

आंतरिक बेमेल की ठीक करना:

एमएस ठीक करने के लिए KF का उपयोग परख आंतरिक बेमेल और ठीक करना उत्पादों की पहचान कर रहे है (यानी, ठीक exonuclease उत्पाद न्यूक्लियोटाइड 3 ' अंत से प्राइमरों के आंतरिक मेल के लिए), पीछा पोलीमरेज़ समारोह के माध्यम से उत्पाद के उत्पाद के लिए मिलान ddNMP के अलावा प्राइमरी सब्सट्रेट (चित्रा 6) की तुलना में कम ठीक उत्पादों पैदा । दक्षता को ठीक करने का एक स्पष्ट रुझान देखा गया, जहां KF कुशलता से अंतिम, अंत, 3rd और 4वें न्यूक्लियोटाइड को प्राइमरों के 3 ' अंत (चित्रा 6पर बेमेलता ठीक करना; MM1, 2, 3, और 4) । 3 ' प्राइमर के अंत से 5 nt में मिलान बेमेल सुधार के < 15% के साथ आंशिक रूप से सही किया गया, और > प्राइमर के 15% (चित्रा6 ) को ठीक करने के बिना एक विस्तार दिखाया; MM5) । KF 6, 7, 8 में तैनात बेमेल को ठीक करने में विफल रहा है, और 9 nt प्राइमर के अंत से (6 चित्रा; MM6, 7, 8, और 9) लेकिन अभी भी सब्सट्रेट का एक महत्वपूर्ण अनुपात बढ़ाया (चित्रा 6; MM6, 7, 8, और 9) के पीई ।

deoxyinosine घावों की मरंमत:

ई. कोलाईमें, डीएनए में deoxyinosine मुख्य रूप से इंडो वी मरंमत मार्ग20,23द्वारा संसाधित है । इंडो वी dI घावों के दूसरे phosphodiester बॉण्ड 3 ' पर एक चीरा द्वारा प्रतिक्रिया शुरू होता है । कतरा तोड़ उत्पंन माना जाता है के लिए मैं एक बाद घाव उत्पाद और डीएनए24संश्लेषण के लिए पॉल द्वारा इस्तेमाल किया जाएगा । इस प्रक्रिया के लिए मैं 3 ' अंत साइट (1 तालिकामें dI युक्त सब्सट्रेट मरंमत परीक्षण करने के लिए लागू किया गया था; ए-i, सी-आई, जी आई, और टी आई) को इस परिकल्पना को मान्य करना. 3 ' अंत dI की मरंमत अंत टी जी बेमेल की ठीक करने के अनुरूप है (चित्रा 4B और 6; MM2 प्रविष्टि), जिसमें अंतिम 2 nt सुधार को पूरा करने के लिए एक सही ddNMP के एक अतिरिक्त के बाद निकाला जाना चाहिए । एमएस पैटर्न स्पष्ट रूप से पोल मैं एक के heteroduplexes सही दिखाया मैं, जी मैं, और टी मैं, हालांकि विभिंन क्षमता के साथ (चित्रा 7; आरपी सिग्नल) । हालांकि, सी-मैं सब्सट्रेट मैं दुर्दम्य (1 तालिका और चित्रा 7d और 7E; बहुत कम RP) और एक काफी हद तक प्राइमर विस्तार का प्रदर्शन किया (संख्या 7dके लिए) था; पीई सिग्नल) ।

Figure 1
चित्रा 1 . परख ठीक करने के लिए मॉडल प्रणाली । एक बेमेल प्राइमर annealed था के रूप में एक टर्मिनल मेल (बोल्ड) बनाने टेम्पलेट के लिए संकेत दिया । डीएनए पोलीमरेज़ के exonuclease का पता लगाने और एक उत्पाद शुल्क के गठन बेमेल न्यूक्लियोटाइड को दूर करेगा । एक डीएनए पोलीमरेज़ और चार ddNTPs की उपस्थिति में, आबकारी उत्पाद पिछले बेमेल साइट के लिए एक एकल आधार पूरक द्वारा बढ़ाया है । जब मालदी-तोफ के अधीन, बेमेल प्राइमर के बीच मास में अंतर, उत्पाद उत्पाद, और ठीक करना उत्पादों को हल किया जा सकता है । (यह आंकड़ा सु एट अल से अनुकूलित है । 25 अनुमति के साथ.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . पीक तीव्रता आणि oligonucleotide मास. आठ oligonucleotides 17 से 24 nt के लिए T28 के 3 ' अंत (तालिका 1) के पूरक अनुक्रम के साथ परीक्षण किया गया । (क) ४० में प्रत्येक oligonucleotide के ५० pmol का एक मिश्रण-µ एल समाधान एक एमएस विश्लेषण के अधीन था । (ख) 17 nt की पीक ऊंचाई को परिकलन के लिए १००% के रूप में उपयोग किया गया था । प्रत्येक oligonucleotide के सापेक्ष संकेत तीव्रता छह दृढ़ संकल्पों का औसत था और त्रुटि पट्टियां 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । (यह आंकड़ा सु एट अल से अनुकूलित है । 25 अनुमति के साथ.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . विभिंन डिजाइन टेंपलेट का प्रभाव । P21 प्राइमर के साथ अलग टेम्पलेट्स के साथ एक टर्मिनल टी जी बेमेल बनाने प्रतिक्रियाओं का आकलन किया गया था. ठीक परख 10 यू के साथ प्रदर्शन किया था (४३ pmol) Klenow पोलीमरेज़, ५० pmol सब्सट्रेट, और 4 ddNTPs 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर. (क) यह पैनल एक P21/T32 टी-जी सब्सट्रेट एंजाइम के बिना दिखाता है । (ख) इस पैनल के एक P21/T32 टी-एक सब्सट्रेट द्वारा 3 ' exonuclease की कमी Klenow के एक प्राइमर विस्तार से पता चलता है । पीई = प्राइमर विस्तार उत्पाद । (ग) इस पैनल P21/T32 T-G सब्सट्रेट का एक ठीक से पता चलता है । पीपी = उत्पाद को ठीक करना; d26, d27, d28 = 3 ' अंत-नीचा खाके । (घ) यह पैनल एक P21/T28 टी जी सब्सट्रेट एंजाइम के बिना दिखाता है । (ङ) इस पैनल P21/T28 T-G सब्सट्रेट का एक ठीक से पता चलता है । पीपी = उत्पाद को ठीक करना; d26, d27 = 3 ' अंत-नीचा खाके । (च) यह पैनल एक P21/T28S4 टी जी सब्सट्रेट एंजाइम के बिना दिखाता है । (छ) इस पैनल P21/T28S4 T-g सब्सट्रेट का एक ठीक से पता चलता है । पीपी = उत्पाद को ठीक करना; EP = उत्पाद शुल्क; d27 = टेंपलेट गिरावट द्वारा उत्पाद । (यह आंकड़ा सु एट अल से अनुकूलित है । 25 अनुमति के साथ) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . उत्पाद उत्पादों और अशुद्धि जांच उत्पादों के लिए समय पाठ्यक्रम विश्लेषण । ठीक परख 2 यू (८.६ pmol) KF और ५० pmol सब्सट्रेट के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित के साथ प्रदर्शन किया गया । संकेत समय पर प्रतिक्रियाएं बुझती थीं । (a) यह पैनल एक 3 ' टर्मिनल टी जी बेमेल की एक ठीक करने से पता चलता है; EP = उत्पाद शुल्क को ठीक करना; d18 और d19 = अतिरिक्त उत्पाद शुल्क द्वारा उत्पादों; पीपी = उत्पादों को ठीक करना; P21 = बेमेल प्राइमर । (B) यह पैनल 3 '-अंत T-G बेमेल का एक शु ' क दिखाता है; ेि-1 = एक्साइज इंटरमीडिएट; EP-2 = उत्पाद शुल्क को ठीक करना; d18 = अतिरिक्त उत्पाद शुल्क के आधार पर; पीपी = उत्पादों को ठीक करना; P21 = बेमेल प्राइमर; Na = सोडियम आयन बाध्य न्यूक्लियोटाइड. (यह आंकड़ा सु एट अल से अनुकूलित है । 25 अनुमति के साथ.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . एक एकल dNTP बनाम 4 ddNTPs के साथ प्रतिक्रिया को ठीक करना । ठीक परख ०.१ यू (०.४३ pmol) KF और ५० pmol सब्सट्रेट के साथ प्रदर्शन के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया । संकेत समय पर प्रतिक्रियाएं बुझती थीं । (क) इस पैनल 4 ddNTPs के साथ एक 3 ' टर्मिनल जी-जी बेमेल की एक ठीक से पता चलता है; EP = उत्पाद शुल्क को ठीक करना; paper = reसंश्लेषण उत्पादों की अशुद्धि जांच; P21G = बेमेल प्राइमर । (ख) इस पैनल dCTP के साथ एक 3 ' टर्मिनल जी-जी बेमेल की एक ठीक करने से पता चलता है; paper = reसंश्लेषण उत्पादों की अशुद्धि जांच; P21G = बेमेल प्राइमर । (C) सुधार का स्तर तीन निर्धारणों का औसत है और त्रुटि पट्टियां 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । Na+ = सोडियम आयन बाउंड न्यूक्लियोटाइड. (यह आंकड़ा सु एट अल से अनुकूलित है । 25 अनुमति के साथ.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 . आंतरिक बेमेल की शु. ठीक करने की परख 2 U (८.६ pmol) Klenow पोलीमरेज़ और ३७ ° c में ५० pmol सब्सट्रेट के लिए 20 मिनट के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित के साथ प्रदर्शन किया गया । खाली = एक MM1 सब्सट्रेट के एंजाइम रिक्त । MM1 = a P21/T28 T-G सब्सट्रेट; आंतरिक बेमेल के साथ MM9 = सब्सट्रेट करने के लिए MM2, संख्या 3 ' अंत करने के लिए तुलना में मेल की स्थिति से संकेत मिलता है. P21 = बेमेल प्राइमरों; PR = उत्पाद को ठीक करना; पीई = विस्तारित प्राइमरों; d19 और d20 = अतिरिक्त उत्पाद शुल्क द्वारा उत्पादों, संख्या न्यूक्लियोटाइड के आकार का प्रतिनिधित्व करते हैं । (यह आंकड़ा सु एट अल से अनुकूलित है । 25 अनुमति के साथ.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 . 3 ' अंत deoxyinosine घावों की मरंमत । मरंमत परख 2 यू Klenow पोलीमरेज़ और ३७ डिग्री सेल्सियस में ५० pmol सब्सट्रेट के साथ प्रदर्शन किया गया के रूप में प्रोटोकॉल चरण २.३ में वर्णित है । संकेत समय पर प्रतिक्रियाएं बुझती थीं । इन पैनलों (क) टी मैं सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रियाओं को दिखाने; (ख) जी मैं सब्सट्रेट; (ग) एक-I सब्सट्रेट; और (घ) सी मैं सब्सट्रेट । आरपी = मरंमत उत्पादों; EP = उत्पाद शुल्क; पीई = प्राइमर विस्तार उत्पादों, Na+ = सोडियम आयन adducts । (ङ) टी के लिए सुधार के स्तर मैं, जी मैं, और एक-मैं तीन दृढ़ संकल्पों के औसत थे और त्रुटि पट्टियां 1 मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । सी के लिए सुधार के स्तर-मैं दो दृढ़ संकल्प के औसत थे । (यह आंकड़ा सु एट अल से अनुकूलित है । 25 अनुमति के साथ.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Substrates दृश्यों सुधार दक्षता (pmol)
P21/T32 3 '-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA १७.३
5 '-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG
P21/T28 3 '-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA १८.४
5 '-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG
P21/T28S4 3 '-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA २२.९
MM1 5 '-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG
MM2 3 '-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA १३.५
5 '-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA
MM3 3 '-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA १६.९
5 '-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA
MM4 3 '-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA १५.१
5 '-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA
MM5 3 '-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA ४.२
5 '-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA
Rmi 3 '-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA < ०.५ *
5 '-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA
MM7 3 '-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA < ०.५
5 '-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA
MM8 3 '-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA < ०.५
5 '-TACCAGTCAGGACATTGGGAA
MM9 3 '-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA < ०.५
5 '-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA
ए-I 3 '-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT ८.२
5 '-TGGTCGCTGGGGAATAIG
C-I 3 '-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT १.०
5 '-TGGTCGCTGGGGAATAIG
जी-I 3 '-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT १५.४
5 '-TGGTCGCTGGGGAATAIG
T-I 3 '-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT १६.६
5 '-TGGTCGCTGGGGAATAIG

तालिका 1. Klenow टुकड़ा द्वारा सब्सट्रेट और सुधार दक्षता को ठीक करना. इस तालिका 3 ' पर बोल्ड 4-न्यूक्लियोटाइड से पता चलता है phosphorothioate संशोधनों वाले टेंपलेट के अंत में । बेमेल आधार जोड़े बोल्ड में हैं । ठीक परख 2 यू के साथ प्रदर्शन किया गया (८.६ pmol) Klenow पोलीमरेज़, ५० pmol सब्सट्रेट, और 4 ddNTPs पर ३७ ° c 10 मिनट के लिए. * ये मान ठीक करने के स्तर के लिए निचली सीमाएं हैं क्योंकि पृष्ठभूमि शोर < 1% के सटीक अनुमानों को रोकता है । कुल सामूहिक संकेतों मनाया । (यह आंकड़ा सु एट अल से अनुकूलित है । 25 अनुमति के साथ.)

ही शब्द SNP_ID 2nd-PCRP 1st-PCRP AMP_LEN UP_CONF MP_CONF Tm PcGC PWARN UEP_DIR UEP_MASS UEP_SEQ EXT1_CALL EXT1_MASS
W1 iPLEX T28 ना ना ना ना ना ना ना एफ ८५२४.५४ ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA
W1 iPLEX P21 ना ना ना ना ना ना ना एफ ६४९५.२४ TACCAGTCAGGACGTTGGGAA

तालिका 2. T28_P21. xlsx फ़ाइल । सेटिंग का उपयोग चित्रा 3d, 3E, 4a, और 5 एके लिए किया गया था ।

1201-1
1201-2
1201-3
1201-4
1201-5
1201-6
1201-7

तालिका 3. 1201. xlsx फ़ाइल । सेटिंग चित्रा 4aमें 7 प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया गया था.

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Discussion

यह अध्ययन एक कदम दर कदम ठीक वर्णित गतिविधि परख चुना वाणिज्यिक उपकरण द्वारा विश्लेषण ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग मालदी-तोफ MS । प्रमुख लाभ शामिल है कि प्राइमर और टेम्पलेट लेबल स्वतंत्र और प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं, प्रयोगों डिजाइनिंग में अधिक से अधिक लचीलापन के लिए अनुमति. एक धारा-चूने का पूरा प्रसंस्करण 30 को ठीक करने की प्रक्रिया को ठीक करने के लिए 3 ज सहित 4 एच, ले जाएगा और उनकी सफाई, जबकि मालदी-तोफ एमएस विश्लेषण के aforementioned प्रोटोकॉल का उपयोग कर 1 h को पूरा करने के लिए लेता है । इस विधि के प्राथमिक दोष सब्सट्रेट की राशि परख के लिए आवश्यक है । मजबूत संकेतों और लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए, हम एक 20-µ l प्रतिक्रिया में डीएनए सब्सट्रेट के ५० pmol का इस्तेमाल किया; इस प्रकार, डीएनए की मात्रा radiolabeled डीएनए प्रयोगों के साथ की तुलना में बहुत अधिक है8,9,10. वॉल्यूम और नमूना आकार को कम करने और एमएस आपरेशन ठीक ट्यूनिंग आवश्यक सब्सट्रेट की राशि कम कर सकते हैं.

वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त सिंथेटिक oligonucleotides किसी भी आगे की शुद्धि या उपचार के बिना सीधे ठीक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तथापि, मालदी-तोफ MS द्वारा डीएनए की शुद्धता और गुणवत्ता की जांच करना उचित है । phosphorothioate बांड के लिए टेंपलेट (तालिका 1) के 3 ' अंत में पिछले 4 phosphodiester बांड की जगह शुरू किए गए गैर-टेंपलेट कतरा (आंकड़ा 3 जी) के विशिष्ट गिरावट को कम करने के लिए हालांकि एक नमूना प्रति उच्च कीमत पर । दिलचस्प है, टेंपलेट और प्राइमर डीएनए से संकेत अच्छी तरह से आकार में अपने मतभेदों के आधार पर एमएस द्वारा अलग किया जा सकता है; इस प्रकार, इस phosphorothioate संशोधन की आवश्यकता नहीं है । चित्रा 3Eमें, उदाहरण के लिए, प्राइमरी P21 एक्सटेंशन के सभी संभावित उत्पाद और अशुद्धि जांच और पुनर्संश्लेषण 22 nt (m/z < ७,०००) से कम थे, जबकि टेंपलेट T28 से सभी क्षरण अंश 24 nt (m/z > ७,००० से अधिक थे ). चित्रा 4a में परिणाम एक ही P21/T28 द्वैध से थे चित्रा 3Eमें उन के रूप में सेट । एम के एक बढ़े हुए विंडो/z 6000-7000 टेंपलेट से किसी भी संकेत मिले बिना केवल प्राइमर डीएनए से संकेत दिखाता है ।

एक ddNMP विस्तार के साथ प्राइमरों का उपयोग करने की रणनीति को बहुत ही स्थिर साबित हुआ, और, इस प्रकार, ddNMP युक्त उत्पादों ठीक परख के लिए अच्छा संकेतक हैं । उत्पाद शुल्क उत्पादों के लिए ddNMP के अलावा ' रोक सकता है ' विश्लेषण के लिए राज्य में उत्पादों की अशुद्धि जांच तुरंत बाद उत्पाद । वैकल्पिक रूप से, ठीक exonuclease की गैर-विशिष्ट hydrolytic गतिविधि को दबाने के लिए 4 ddNTPs के बजाय एक ही सही dNTP (figure 5B) का उपयोग करना भी व्यवहार्य है ।

एक मानक phenol/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रक्रिया के साथ प्रतिक्रियाओं को रोकने के बाद से प्रतिक्रिया समाप्ति के लिए सबसे अच्छा साधन साबित हो, एक कदम में, यह प्रतिक्रियाओं को भी किसी भी प्रोटीन हस्तक्षेप को दूर करते हुए बंद कर दिया जा करने के लिए सक्षम बनाता है । वैकल्पिक रूप से, एसिड शमन, जो स्वचालन के लिए उत्तरदायी है, तो एक चरण जुदाई के बिना गैर धातु alkaline द्वारा बेअसर, भी विश्वसनीय परिणाम का प्रदर्शन किया. सोडियम आयन adducts (Na+ चित्रा 4, 5, और 7में) चिंता का विषय है क्योंकि वे पृष्ठभूमि में वृद्धि और संकेत भेदभाव जटिल कर सकते हैं । स्वच्छ राल का एक उचित उपयोग ऐसे हस्तक्षेप को कम कर सकते हैं; फिर भी, जब इस तरह के adducts मौजूद हैं, वे आम तौर पर उनके माता-पिता के सापेक्ष बहुत छोटे चोटियों है संकेत, और इस संपत्ति के लिए उन दोनों के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (चित्रा 4, 5, और 7). आम तौर पर, सोडियम adducts की चोटी ऊंचाई प्रमुख चोटियों के लिए आनुपातिक था; गणना में सोडियम adducts का समावेशन या अपवर्जन ठहराव परिणामों को काफी प्रभावित नहीं करता था । इसलिए, ठहराव के लिए, हम केवल गणना के लिए प्रमुख पीक ऊंचाई का उपयोग किया ।

ठीक प्रयोगों वर्णित यहां आंतरिक बेमेल का लाभ लिया26 KF के exonuclease डोमेन विभाजन परख के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए और विस्तृत डीएनए पोलीमरेज़ मैं क्षमता को कुशलता से ऊपर से मेल को ठीक करना से 4 nt ऊपर से ऊपर प्राइमर 3 '-अंत (चित्रा 5, MM1-4) संभवतः आधार के कारण प्राइमर-टेंपलेट जंक्शनों में स्थिरता बांधना27। इसके अलावा, इस अध्ययन में भी अंत deoxyinosine घावों युक्त प्राइमरों का इस्तेमाल एक पोल मैं इंडो V-निक मरंमत मध्यवर्ती की मरंमत का अध्ययन । परिणाम से पता चला कि टी मैं एक-मैं और जी से अधिक कुशलता से मरंमत की थी, मैं; हालांकि, सी-मैं मैं दुर्दम्य (1 तालिका और चित्रा 7) की मरंमत के लिए किया गया था । इन परिणामों की पुष्टि करें कि एक मालदी-तोफ एमएस विश्लेषण ठीक करने के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है और विभिंन लघु पैच डीएनए मरंमत28 अपने उच्च संकल्प के कारण परख ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम कार्यात्मक जीनोमिक्स (ताइपे, ताइवान) और उनके तकनीकी समर्थन के लिए NRPB Pharmacogenomics लैब (ताइपे, ताइवान) के लिए NCFPB एकीकृत कोर सुविधा का धंयवाद । इस काम के लिए ताइवान हेल्थ फाउंडेशन (एल आई ए से अनुसंधान अनुदान का समर्थन किया गया. एल) और विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइपे, ताइवान, ROC [सबसे 105-2320-b-002-047] वी के लिए-याओ हू, [सबसे 105-2628-b-002 -051-MY3] कांग के लिए यी र, और [ सर्वाधिक-105-2320-B-002-051-MY3] for लिआंग-In Lin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligonucleotides Mission Biotech (Taiwan)
phosphorothioate modified oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Taiwan)
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs, MA M0210L
Klenow fragment (3'→5' exo-) New England Biolabs, MA M0212L
NEBuffer 2.1 (10X) New England Biolabs, MA B7202S
2', 3' ddATP Trilink Biotechnologies, CA N4001
2', 3' ddGTP Trilink Biotechnologies, CA N4002
2', 3' ddTTP Trilink Biotechnologies, CA N4004
2', 3' ddCTP Trilink Biotechnologies, CA N4005
dATP, dGTP, dCTP, dTTP set Clubio, Taiwan CB-R0315
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA #01509
MassARRAY Agena Bioscience, CA
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA #10145
Clean Resin Tool Kit Agena Bioscience, CA #08040

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References

  1. Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
  2. Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
  3. Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
  4. Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
  5. Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
  6. Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
  7. Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
  8. Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
  9. Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
  10. Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
  11. Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
  12. Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).
  13. Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
  14. Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
  15. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  16. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
  17. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
  18. Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
  19. Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
  20. Lee, C. C., et al. The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
  21. Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
  22. Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
  23. Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
  24. Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
  25. Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
  26. Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
  27. Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
  28. Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).

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जैव रसायन अंक १३६ डीएनए पोलीमरेज़ ठीक करना डीएनए मरम्मत मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिंगल न्यूक्लियोटाइड एक्सटेंशन dideoxyribonucleotide ट्राइफॉस्फेट डीएनए बेमेल डीएनए प्रतिकृति त्रुटि
एक न्यूक्लियोटाइड विस्तार और मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का उपयोग कर ठीक करना और डीएनए मरंमत परख
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Su, K. Y., Goodman, S. D., Lai, H. M., Yen, R. S., Hu, W. Y., Cheng, W. C., Lin, L. I., Yang, Y. C., Fang, W. H. Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57862, doi:10.3791/57862 (2018).

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