Summary
非標識、ラジオ-同位体 DNA ポリメラーゼの校正と DNA 修復アッセイ法は高分解能 MALDI-TOF 質量分析法および単一のヌクレオチドの拡張戦略を使用して開発されました。アッセイは、非常に特定、簡単、迅速かつ簡単に校正を実行し、修復するパッチ 9-ヌクレオチドより短いを証明しました。
Abstract
ゲノムとその忠実なレプリケーションのメンテナンスは、遺伝情報を節約するため重要です。忠実度の高いレプリケーションを評価するには、ラジオ-同位体比を用いたマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間 (MALDI-TOF) 質量分析法 (MS) 分析校正に関すると単純な非標識を開発しました。ここでは、DNA ポリメラーゼ [例えばエシェリヒア属大腸菌DNA ポリメラーゼの Klenow のフラグメント (KF) 私 (ポル私) 本研究で] すべての 4 dideoxyribonucleotide 三リン酸塩の存在下で不一致プライマー テンプレート二重の処理に使用します。不一致のプライマーは校正/拡張し、MALDI-TOF MS を受けます。製品は、単一のヌクレオチドのバリエーションにプライマーの質量の変化によって区別されます。重要なは、校正も決定できます内部単一不一致の異なる効率ではあります。3' 末端から 2-4-ヌクレオチド (nt) にある不一致が効率的に、pol で校正し、5 での不一致のプライマーの末端から nt を示した部分の補正のみ。プライマー 3' 末端から 6-9 nt にある内部不一致のため校正なかった。このメソッドは、DNA 修復アッセイ (例えば遠藤 V 修復経路のための基板のベース病巣修復の評価) にも適用できます。3' 終わりから二番目 deoxyinosine (dI) 病変を含むプライマーは、pol によって正されるかもしれない私。確かに、最後から二番目の T-私は、G-、私と -私基板があった最後の 2 ・ ディ ・含むヌクレオチド切除 pol で私、正しい ddN 5'-モノリン酸 (ddNMP) を追加する前に最後から二番目の C 中-私の不一致はポルで容認されたなし拡張するプライマーをできるように私修復、DNA 修復を測定するアッセイの感度と MS の分解能を発揮します。
Introduction
DNA の複製の時に DNA ポリメラーゼの校正関数子孫1,2,3,4に転送する必要があります遺伝情報の高忠実性を確保するために不可欠です。 5,6,7。Exonucleases の校正のポリメラーゼの貢献を評価することができるという遺伝的安定性の保護メカニズムを明らかにするでしょう。
放射性同位元素標識と autoradiograms または蛍光イメージング8,9,10のデンシトメトリーの分析と組み合わせてゲルに基づく試金 DNA の校正活動を検出する使用されている伝統的ポリメラーゼ。中機能、これらの試金は骨の折れる、高価、高スループットの形式に従わないです。さらに、放射性廃棄物処理を含む安全上の問題に苦しみます。また、蛍光法による校正活動を分析されています。などによる 2-アミノプリン (2 AP) は体外ポリメラーゼ蛍光信号11,12を生成するアッセイを校正中に拡張製品に組み込むことができます。残念ながら、2 AP はシトシンとチミンとペアすることができますので、これらのアプローチは低特異性と苦しみます。最近のアプローチにはいくつかを克服してアッセイを校正のポリメラーゼのため単独でラベルの蛍光プローブと同様に、3'-5' エキソヌクレアーゼ アッセイ13敏感 G ベースから発光スイッチにプローブ ポリメラーゼにはが含まれます、前述の欠点の14。Dna の特定の分類のため必要があるのためこれらの蛍光メソッドのための熱意は低下します。
対照的に、DNA 解析の MALDI-TOF MS は、PinPoint アッセイ、ラベルのない 4 ddNTPs のプライマー拡張反応を与えられた軌跡15,16,17遺伝子多型を識別するために使用できますで採用されている、突然変異の検出の臨床アプリケーションで採用されているがん診断18。これらの基本原則を使用して、我々 は校正活動の高解像度、高い特異性と MALDI-TOF さんを利用した大腸菌の高スループット能力を悪用する DNA ポリメラーゼの体外定量ラベル無料アッセイを作成しています。大腸菌基板は、単一のヌクレオチドの拡張を介してMALDI-TOF MS (図 1) 後製品を校正の「スナップショット」取ることができるモデルの酵素、dideoxyribonucleotide 三リン酸塩 (ddNTPs) として私 Klenow の断片 DNA ポリメラーゼ。
同様に、この法を開発した DNA 修復アッセイを含む 3' 終わりから二番目・ ディ ・病変が修復 pol にさらされるプライマーがどの模倣遠藤 V 傷修復中間体を分析します。完全には理解されて、遠藤 V 修復経路は病変切除19,20の exonuclease の作業を校正私 pol を採用する知られている唯一の修復システムです。MALDI-TOF MS を使用するを示す明確に定義された修復パッチによってポル ・ ディを摘出することができます私は、最後の 2 で発生した場合正しい補完ヌクレオチドを追加する前にプライマーの nt。
校正と DNA 修復の研究のため、このメソッドは、高速で、従来よりも少ない骨の折れる、メカニズムと機能に対する追加情報を提供します。
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Protocol
1. プライマー/テンプレートの準備
- シーケンスまたは PCR のプライマー デザインのように 60% と 40% の間のバランスの取れた G + C コンテンツを持つプライマー/テンプレートを設計します。18、21 のプライマーを使用して適切なアニーリングをおよびよりよい MS 信号のための nt。
- 最低少なくとも 7 二重地域の融点 50 ° C を設定して、テンプレートをデザイン テンプレートとプライマー信号を分離する 5' 突出部分の nt。
注: たとえば、基板表 1に P21/T28、21 nt プライマーと共に 28 nt テンプレート。オプション: テンプレートの 3' 端に最後の 4 のリン酸ジエステル結合を置換するヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート結合など代替の核酸の使用テンプレート (の非特異的 3' 端分解による誤動作を防ぐことができます。例えば、表 1に T28S4)、テンプレートの準備のためのいくつかのコストが追加されます。 - さらに精製することがなく標準脱塩オリゴヌクレオチドを使用しては、この研究のため満足です。在庫として 100 pmol/μ L H2O での濃度のオリゴヌクレオチドのプライマー/テンプレートを使用し、-20 ° C で保存MALDI-TOF MS (手順 4 ~ 7) ユニークなピーク信号と、良好な信号対雑音比を確保するためのオリゴヌクレオチドを実行して、品質とプライマーおよびテンプレートの純度を確認してください。
- 校正と濃度の正規化 (図 2) の反応に関連するシーケンスの等しいモル プライマーの相対的な MALDI-TOF MS 信号強度 (ステップ 7) を決定します。
2. 反応の校正
注: 同じ校正反応条件とプロトコル A の DNA 修復に適用されます-私は、G-私は、C-私と T-私。
- P21 のプライマーおよびテンプレート T28 H2O; 12.5 pmol/μ L に希釈例として表 1の校正用基板 P21/T28 T G が一致を使用して、1.5 mL 滅菌遠心チューブに希釈プライマーの 12 μ L と 12 μ L の希釈のテンプレートを転送します。
注: テンプレート/プライマー ミックスの量は 2 反応には十分試薬の量も比例して増えます複数の反作用のため。 - チューブをしっかりと閉じます。37 ° C 水お風呂で 30 分続いて、カバー 65 ° C の水風呂で 30 分間インキュベートし、最終的に適切なアニーリングように氷の上。
- 1.5 mL 滅菌遠心チューブ、プライマーの 8 μ L を追加し、テンプレート ミックス (50 pmol)、2 μ L 反応バッファー、4 ddNTPs ミックス (各 4 dNTPs の 2 mM) と H2O 18 μ L. までの 4 μ L を校正 x 10 のフリックを混在させる管。
注: 1 x 校正反応バッファーには、10 mM トリス-HCl (pH 7.9 25 ° c)、1 mM ジチオトレイトール 10 mM MgCl250 mM NaCl が含まれています。反応バッファーを校正 x 10 の商業のソースの材料の表を参照してください。各 ddNTP 反応の最終濃度は、0.1 mM です。 - 校正希望の濃度に反応バッファー x 冷たい 1 の DNA ポリメラーゼを希釈 [例えば、1.5 mL 遠心チューブに校正反応バッファーと 1 μ L 商業ソースから 5 U Klenow ポリメラーゼの x 1 の 4 μ L を追加 (テーブルのMaterials)]。すべての回で氷に希釈した酵素を保存します。
注: 希釈した DNA ポリメラーゼの量が 2 反応には十分酵素の量も比例して増えます複数の反作用のため。Klenow ポリメラーゼの 2.0 ユニットを含む、2.0 μ L のボリュームは T G ターミナル不一致 P21/T28 5 分の 50 pmol の半分以上を校正できます。 - ステップ 2.3 から望ましい反作用の温度 (例えば、通常 37 ° C Klenow ポリメラーゼと T4 DNA ポリメラーゼの 25 ° C) に基板ミックスと遠心チューブを prewarm します。Prewarmed 基板の混合物にステップ 2.4 から 2.0 μ L の希釈の DNA ポリメラーゼを転送し、その内容をミックスするチューブをフリックします。
- 反応の部品を回転させる常温 3,200 x g で数秒間酵素と基質とチューブを遠心します。暖房のブロックまたは 2.5 の手順と必要な潜伏温水浴への反応をすぐに転送します。
-
反応を停止させます
- バッファリングされたフェノールの等しい量を追加、ボルテックスによって、数秒間それをミックス、5 分間常温 3,200 × g で遠心機で遠心分離機します。
- きれいな遠心管に水相を転送しクロロホルムの等しい量を追加、きれいおよび microfuge の管と水相を転送 3 分常温 3,200 x g でおよび microfuge のいくつかの秒と遠心分離機のボルテックスでそれをミックスcubate で 95 ° C、5 分。氷の上に置きます。
注意: フェノールおよびクロロホルムは、有害化学物質です。処理、廃棄物処理は、制度上の規則に従う必要があります。
- きれいな遠心管に水相を転送しクロロホルムの等しい量を追加、きれいおよび microfuge の管と水相を転送 3 分常温 3,200 x g でおよび microfuge のいくつかの秒と遠心分離機のボルテックスでそれをミックスcubate で 95 ° C、5 分。氷の上に置きます。
- また、プロトコルを急冷酸を使用します。このため、反作用を停止し、6 分間氷の上 1 M ジエタノールアミン (DEA) 反応混合物の pH を中和し 5 分; 95 ° C でインキュベートの 0.64 μ L を追加し 1 M HCl の 2 μ L を追加します。氷の上に置きます。
- バッファリングされたフェノールの等しい量を追加、ボルテックスによって、数秒間それをミックス、5 分間常温 3,200 × g で遠心機で遠心分離機します。
3. 樹脂添加塩の汚染を除去するために
- 商業脱塩から樹脂スクープを使用してキット (材料の表を参照してください)、384 ディンプル、6 mg 樹脂ディンプル プレートの窪みをカバーする十分な樹脂を取る。
- すべての窪みの樹脂を均等に分散 (6 mg/ディンプル) によってプレートの上部をこするします。任意の余分な樹脂を回復し、ボトルでそれを置き換えます。
- 384 ウェル プレート microfuge の管からの 2.7 段階から最終反応生成物を転送します。16 μ H2O 各ウェルの最終反応生成物を希釈し、プレート シールし、遠心分離機の任意の気泡を取除くためにそれを分配します。
- 384 ウェル プレート カバー樹脂充てんディンプル プレート逆さまに反応生成物をオンに、シールを削除します。
- まあ-ディンプル プレート サンドイッチを裏返してドロップ 384 ウェル プレートに樹脂を慎重にさせる (384 ウェル プレートが樹脂で満たされたディンプル プレートの金属のペグに対して必ず)。
- 上ディンプル プレートを取り外して、反応生成物の混合物を含む 384 ウェル プレート シール、樹脂、簡単に任意の泡を削除し、その内容を脱塩のため室温で少なくとも 15 分間回転子に配置 3,200 × g で遠心。
- ガレージの掃除の後で井戸の底に樹脂をコンパクトに 5 分間、3,200 x g 384 ウェル プレートを遠心します。
4. マトリックス チップに反応生成物を転送します。
- ナノリッター ディスペンサーのサンプル板を設定 (nanodispenser、材料の表を参照してください)。
- マトリックス チップ (材料の表を参照) を入れて、対応するトレイにセクション 3.7 から 384 ウェル プレート。
- チップ; 反応生成物のスポットに nanodispenser を動作します。開始する nanodispenser のタッチ スクリーンの実行ボタンを押します。
- チップの全体的な斑点を付けられたボリュームを確保するのには、画面の彩度情報を含むサンプル スポットの自動キャプチャした画像の周りはチェック 5 10 nL。ボリュームが十分な場合は、サンプルのスポッティングを繰り返します。
5. セットアップ法質量分析法について
- インポートの予想される信号情報を含む .xls 形式のファイルを準備します。たとえば、手順 2、3、および 4 で P21/T28 の校正の反応に"P21_T28.xls"(表 2) の設定を使用します。
- 作成し、アプリケーションの新しいアッセイを定義 (材料の表を参照してください) でデザイナーの形式でインポートの試金グループを右クリックし、.xls ファイルを (例えば5.1 のステップから"P21_T28.xls") を選択します。
- ツリーの最上部を右クリックし、ファイル名を与えることによって、ターゲットのアッセイ プレートを介して画面の左側にある顧客: プロジェクト: プレートオプション ツリーを確立 (例えば、"CTT20171201"分析コードと日付を表します)。
- 384 ウェル プレートの種類を選択し、 [ok]をクリックしてくださいブランク プレートが表示されます。
- 画面の左側にある適切な試金 (例えばP21_T28) を選択します。
- 井戸を強調表示し、プレックスの追加を選択します右クリックによってチップのサンプル位置を発見の各サンプルに対して選択した試金 (例えばP21_T28) を割り当てます。
- (例えば表 3の 1201.xlsx) ヘッダー無しで .xlsx 形式でチップ上のすべてのテストの作業リストを準備します。作業リスト経由で新しいサンプル プロジェクトの追加オプションをインポートします。
- P21_T28 試金の各位置に (例えば、1201.xlsx から) 作業] の一覧でテストを割り当てるしを右クリックして選択します。
6. MALDI-TOF MS 操作
- アプリケーション プログラムを使用してチップに質量分析計をリンク (材料の表を参照してください)。
- 画面の右側にある既定の設定を選択します。
- ステップ 5.3 (例えばCTT20171201)、チップ ID チップの端からアッセイ名を入力し、設定を保存します。
- MS の制御プログラムを起動 (材料の表を参照してください)。
- スカウト プレートを/アウトボタンを押して取り出してください。スカウト プレート ステップ 4.4 から斑点を付けられたチップを置き、質量分析計を入力する斑点を付けられたチップの/アウト] ボタンを押します。
- アプリケーション プログラムの取得ボタンをクリックして (参照材料表) 質量分析法を開始し、データを取得します。
7. データ解析
- データ分析のためのプログラムを開く (材料の表を参照してください)。
- 左上隅にあるデータベースのツリーを参照し、ステップ 6.3 からチップの ID を選択します。画面の右側にある上のデータ ファイルを開きます。
- 質量スペクトルを表示するスペクトルのアイコンをクリックします。M/z の特定の範囲をトリミングするには、カスタマイズ ダイアログを選択、新しいウィンドウで [ x 軸] をクリックして、目的の上限と下限の制限を設定およびスペクトルの指定された範囲を表示する[ok]を押して右クリックします。
- エクスポートを右クリックして記録のスペクトルをエクスポートします。
注: 1,600 幅/1,200 単位のスケールを使用して、コンピューターの画面上のデータの検査の合理的なサイズです。- JPEG ファイルの種類を選択して、宛先をクリックして、参照ディスク(例えば、フラッシュ ディスク e:) を選択、(例えば1201-1.jpg この)、ファイル名を入力、[エクスポート] をクリックします。
- データ定量、カーソルを使用して、左上隅にピーク高さを表示するピークにクリックします。
- または、エクスポートされた JPEG ファイルをプリント アウトし、手動で定規でピーク高さを測定します。
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Representative Results
テンプレートとプライマー:
示す手順を使用してここで、モルの合成オリゴヌクレオチド テンプレートを等しいし、商業ソースから得られた関連する配列のプライマーはその純度と品質 (図 3 a; 信号は、指定質量を一致するメモでチェックされました。・低バック グラウンドだけでなく、ピーク強度と試料の質量 (図 2 a) の関係。ピークの高さは、測定し、MS データの正規化 (図 2 b) を算出します。
反応条件と質量スペクトル:
ジェノタイピングの MALDI-TOF MS と相まって単一基本プライマー拡張反応の使用は、標準的な ddNTPs ターミネータ17を使用して可能であること示されている以前。標準 ddNTPs を用いた校正試験は遺伝子型の singleplex 反応に似ていますが、はるかに簡単、クリーンで信頼性の高い結果を得ることを実行する非常に簡単です。
MS スペクトルは、プライマーと (図 3) のテンプレートから生成されるすべての信号をカバーしました。プライマーとテンプレートの適切な設計には、テンプレートとプライマー (図 3) の両方に十分に分離信号プロファイルが生成されます。M/z 値に従ってテンプレートおよびその非固有部分分解物 (m/z > 7,000) からの信号は不一致のプライマーから分離されも、製品 (図3 m/z < 7,000) を校正します。必要に応じて、テンプレート (表 1の 3' 末端で最後 4 のリン酸ジエステル結合を置換する社債ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートを導入T28S4/P21) 加水分解非固有のテンプレート (図 3; d27) を減らすことができます。
DNTPs の不在、KF は、堅牢な 3'-エキソヌクレアーゼ、プライマーと21の in vitroテンプレートの両方を低下させることができます。ネイティブ 4 dNTPs のようは、4 ddNTPs の追加は、KF (図 3と3 e) による 3' 端劣化を防止できます。同様に、3' 端の 1 つのヌクレオチドの拡張は、プライマーに高められた安定性を追加します。Pol を使用して前述の条件を校正前述 10 U20 (46 pmol) KF、以上 50 pmol 一致しない基板の 80% (図 3 3 e、 3 G) 5 分で修正されました。
中間体と機構解析:
MALDI-TOF MS の解像度は、1 人のドルトン; することができます大丈夫確かに、基板・製品中間体反応の質量変化では、選択範囲の同じ MS スペクトルで解決できます。たとえば、ターミナル T G 不一致がプライマーの末端に不一致の G を m/z 差だけ 32 ddA 定款を修正しました。このようなの m/z の違いは、7,000 (図 4 a) に 5,000 m/z の MS スペクトルで容易に識別できます。それぞれ個々 の信号の変化は不一致のプライマー、切除中間体からすべての信号を合計することで計算できるし、100% 製品を校正します。たとえば、T G 校正反応で切除製品を基準にして補正された製品は 5 分で 17%対23%、10 分で 18%対31%、69%対14 %20 分 (図 4 a) でだった。
最後から二番目の T G 不一致が入門、最後 2 の存在後で補正を完了する ddA 加算 nt を切除する必要があります。確かに、正しい製品は時間を 5 分で 12%、10 分で 28% から反応の 20 分で 45% と増加。さらに、切除から 2 番目 T G の校正、1 nt 切除中間および 2 nt 切除等の製品の 2 つの形式は容易に解決可能 (図 4 b) だった。
単一の dNTP と組み込んだ動態を校正します。
エシェリヒア属大腸菌DNA ポルの私、ddNTPs 基板は、阻害剤22としてみなすべきであります。また、校正の反応の単一の '正しい' dNTP を使用して代わりにもを抑制する非特異的 3'-5' エキソヌクレアーゼ活性と MS 解析 (図 5 b) に適した単一のヌクレオチドの拡張製品の世代。単一 dCTP を含む反応から得られた校正率は 4 ddNTPs (図 5 a 5 b、 5 C) を含む反応に比べて約 2 倍。したがって、校正のアッセイで単一の '正しい' dNTP の使用は ddNTPs の抑制効果なしより良い結果を生成します。このアプローチは、速度論的解析を校正に高い感度を提供する必要があります。
内部の不一致の校正。
MS の内部不一致と校正製品の識別が簡単な KF を使用してアッセイを校正 (すなわち、校正の exonuclease プライマーの内部不一致に 3' 末端からヌクレオチドを切り取る)、続いて、切除製品経由で生成するポリメラーゼ関数に一致した ddNMP の追加は、プライマー基板 (図 6) より短い製品を校正します。KF は効率的に最後、最後から 2 番、3rd (図 6のプライマーの 3' 端から 4番目ヌクレオチドで不一致を校正、校正効率の明確な傾向が認められました。MM1、2、3、および 4)。5 で不一致不整合修正の < 15% (図6;を校正することがなく拡張を示した入門 > 15% とプライマーの 3' 端から nt が部分的に修正されました。MM5)。KF は 6、7、8、および 9 の位置の不一致を校正に失敗しました (図 6のプライマーの 3' 末端から ntMM6、7、8、および 9)、まだ拡張基板 (図 6の大きな割合を占めてPE の MM6、7、8、および 9)。
Deoxyinosine 病変を修復します。
エシェリヒア属大腸菌の DNA の deoxyinosine は主に遠藤 V 修復経路20,23によって処理されます。遠藤 V は、2 番目のリン酸ジエステル結合・ ディ ・病変の 3' で切開して反応を開始します。生成された鎖切断がポルによって使用されると考えられているその後病変切除と DNA 再合成24の私。この手順を行ったポル 3' 終わりから二番目サイト (テーブル 1でディを含む培地を修復をテスト-私は、C-私は、G-、私と T-私) この仮説を検証します。3「最後から二番目 dI の修復最後から二番目の T G 不一致 (図 4 bと6校正に似ていますMM2 エントリ)、最後の 2 nt 必要がありますに修復を完了する正しい ddNMP の付加によって続いて削除します。MS パターンは明らかに A の heteroduplexes を修正しました pol を示した-私は、G-、私と T-私、とはいえ、異なる効率 (図 7。RP 信号)。ただし、C-私基板修理 pol に抵抗性であった (表 1と図 7と7 e; 非常に低い RP) に大きな範囲 (図 7; プライマー拡張を示したとPE 信号)。
図 1.アッセイの校正用システムをモデル化します。ターミナルの不一致 (太字) を形成、テンプレートに示されているように、不一致プライマーがアニール。DNA ポリメラーゼの exonuclease の校正は検出され、不一致のヌクレオチド切除製品を成形を削除します。DNA ポリメラーゼと 4 つの ddNTPs の存在下で切除製品は前の一致しないサイトを補完するもの一つのベースで拡張されます。MALDI-TOF を受けるときは、不一致のプライマー、切除製品校正製品の質量の違いが解決できます。(この図は、Suらから適応25アクセス許可。)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.ピーク強度とオリゴヌクレオチド マサチューセッツ州8 オリゴヌクレオチド 17 から 24 が T28 の 3' 末端に相補的な配列を持つ nt (表 1) を調べた。40 μ L ソリューション内各オリゴヌクレオチドの 50 pmol の A (A) 混合物は質量分析を受けた。17 のピーク高さ (B) nt は、100% として計算に使われました。各オリゴヌクレオチドの相対的な信号強度は六つの測定の平均値と誤差の範囲は、1 の標準偏差を表します。(この図は、Suらから適応25アクセス許可。)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.さまざまなテンプレートのデザインの影響。校正の反応は、異なるテンプレートを使ってターミナル T G 不一致を形成する P21 プライマーで評価されました。校正の試金 10 の U (43 pmol) Klenow ポリメラーゼ 50 pmol 基板と 5 分 (A) このパネルの 37 ° C で 4 ddNTPs 酵素なし P21/T32 T G 基板が表示されます実行されました。(B) このパネルで P21/T32 T A 基板のプライマー拡張 3' エキソヌクレアーゼ欠乏 Klenow。PE プライマー拡張製品を =。(C) このパネルは、P21/T32 T G 基板の校正を示しています。PP = 校正製品;d26、d27、d28 = 3' 端劣化テンプレート。(D) このパネルは、酵素なし P21/T28 T G 基板を示しています。(E) このパネルは、P21/T28 T G 基板の校正を示しています。PP = 校正製品;d26、d27 = 3' 端劣化テンプレート。(F) このパネルは、酵素なし P21/T28S4 T G 基板を示しています。(G) このパネルは、P21/T28S4 T G 基板の校正を示しています。PP = 校正製品;EP = 切除製品;d27 テンプレート分解副産物を =。(この図は、Suらから適応25権限を持つ)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.切除製品の校正製品コース分析の時間します。2 U と校正のアッセイを行った (8.6 pmol) KF ととして 50 pmol 基板プロトコルで説明します。反応した焼入れで示された回。(A) 3' ターミナル T G 不一致; の校正、このパネルが表示されますEP = 校正切除製品;d18 ・ d19 = 過剰切除副産物。PP = 校正製品;P21 不一致プライマーを =。(B) 3'-最後から二番目の T G 不一致; の校正、このパネルが表示されます。EI 1 = 切除中間;EP 2 = 校正切除製品;d18 = 過剰切除副産物。PP = 校正製品;P21 = 不一致プライマー;Na ナトリウム イオン結合ヌクレオチドを =。(この図は、Suらから適応25アクセス許可。)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.4 ddNTPs との反応を校正対単一 dNTP 。0.1 U 校正アッセイを行った (0.43 pmol) KF ととして 50 pmol 基板プロトコルで説明します。反応した焼入れで示された回。(A) 3' ターミナル G G とのミスマッチ 4 ddNTPs; の校正、このパネルが表示されますEP = 校正切除製品;PP = 校正の再合成製品;P21G = 不一致のプライマー。(B) 3' ターミナル G G とのミスマッチ dCTP; の校正、このパネルが表示されます。PP = 校正の再合成製品;P21G = 不一致のプライマー。(C) 補正レベル 3 測定の平均値、誤差の範囲は、1 の標準偏差を表します。Na+ = ナトリウム イオン結合ヌクレオチド。(この図は、Suらから適応25アクセス許可。)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.内部の不一致の校正します。校正の試金はプロトコルで説明するよう 2 U (8.6 pmol) Klenow ポリメラーゼと 20 分の 37 ° C で 50 pmol 基板行った。空白 = MM1 基板の酵素空白。MM1 = P21/T28 T G 基板;MM9 に mm 2 = 基板内部の不一致で数字は 3 の ' 端の位置の不一致。P21 = 不一致プライマー;PR = 校正製品;PE = 拡張プライマー;d19 と d20 = 過剰切除副産物のヌクレオチドのサイズを数字で表します。(この図は、Suらから適応25アクセス許可。)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7.3「最後から二番目の deoxyinosine 病変の修復します。2 U Klenow ポリメラーゼと 37 ° C で 50 pmol 基板修復アッセイを行ったプロトコル手順 2.3 で説明しました。反応した焼入れで示された回。これらのパネルは、T (A) と反応を示す-私基板;(B) G-私基板;(C)-私基板;(D) C-私基板。RP = 修理製品。EP = 切除製品;PE プライマー拡張製品、Na+を = = ナトリウム イオンの付加します。T (E) 補正レベル-私は、G-、-私が 3 つの測定の平均値と誤差の範囲は、1 の標準偏差を表します。C 補正レベル-私は 2 つの決定を平均しました。(この図は、Suらから適応25アクセス許可。)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 基板 | シーケンス | 補正効率 (pmol) | |
| P21/T32 | 3'-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 17.3 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 18.4 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28S4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 22.9 | |
| MM1 | 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | ||
| MM2 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 13.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA | |||
| MM3 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 16.9 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA | |||
| MM4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 15.1 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA | |||
| MM5 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 4.2 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA | |||
| MM6 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5* | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA | |||
| MM7 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA | |||
| MM8 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACATTGGGAA | |||
| MM9 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA | |||
| A-私 | 3'-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT | 8.2 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| C-私 | 3'-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT | 1.0 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| G-私 | 3'-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT | 15.4 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| T-私 | 3'-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT | 16.6 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
テーブル 1。Klenow のフラグメントによって基板と補正効率を校正します。この表は、ホスホロチオエート変更を含むテンプレートの 3' 終わりに太字の 4 ヌクレオチドを示します。ミスマッチ塩基対は、太字です。2 U (8.6 pmol) Klenow ポリメラーゼ、50 pmol 基板、37 ° C で 10 分間で 4 ddNTPs と校正のアッセイを行った * これらの値は、バック グラウンド ノイズ防止の < 1% を正確に見積もる校正レベルの下限、観測された総質量信号。(この図は、Suらから適応25アクセス許可。)
| まぁ | 用語 | SNP_ID | 第 2 回 PCRP | 第 1 回 PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | Tm | レベル | PWARN | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_CALL | EXT1_MASS |
| W1 | iPLEX | T28 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 8524.54 | ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | |||
| W1 | iPLEX | P21 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 6495.24 | TACCAGTCAGGACGTTGGGAA | |||
表 2。T28_P21.xlsx ファイル。設定は図 3 D、 3 e 4 a、 5 aに使用されました。
| 1201-1 |
| 1201-2 |
| 1201-3 |
| 1201-4 |
| 1201-5 |
| 1201-6 |
| 1201-7 |
表 3。1201.xlsx ファイル。設定は、図 4 aの 7 反応の使用されました。
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Discussion
本研究は商業の選ばれた器械を用いてステップバイ ステップ校正活性を説明 (材料の表を参照してください) MALDI-TOF MS を使用しています。主要な利点がありますプライマーとテンプレートが無料で簡単に行うには、ラベルである実験の設計の柔軟性を可能にします。ストリーム-石灰 30 校正テストの処理は、校正の反応を手動で実行するため 3 時間を含む 4 時間を取るだろうし、MALDI-TOF MS 解析を前述のプロトコルを使用している間、彼らのクリーンアップを完了する 1 時間を取る完全です。このメソッドの主な欠点は、アッセイに必要な基板の量です。強力な信号と一貫性のある結果を得るためには、20 μ L 反応; 50 pmol DNA 基板を使用したがって、DNA の量は放射性標識 DNA 実験8,9,10よりはるかに高い。ボリュームとサンプル サイズを削減し、MS 操作の微調整は必要な基板の量を下げることができます。
商業ソースから得られる総合的なオリゴヌクレオチドは、更なる精製や治療なしで直接校正の研究に使用できます。ただし、純度と MALDI-TOF 質量分析法による DNA の品質をチェックすることをお勧めします。ホスホロチオエート結合は、サンプルあたりのコストが高いとはいえ、テンプレートの繊維 (図 3) の非固有の劣化を少なくテンプレート (表 1) の 3' 終わりに最後の 4 のリン酸ジエステル結合を置き換えるに導入されました。興味深いことに、テンプレートとプライマー DNA から信号することができますも区切って MS サイズでの違いのおかげでしたがって、このホスホロチオエート変更は必要ありません。図 3Eでたとえば、プライマー P21 拡張と校正の切除と再合成のすべての可能な製品が 22 未満 nt (m/z < 7,000)、T28 のテンプレートからのすべての分解フラグメント中 24 より大きいされた nt (m/z > 7,000).図 4 aの結果では、同じ P21/T28 二重図 3Eと設定から。M/z 6,000-7,000 の拡大ウィンドウは、テンプレートからの信号を交絡なしプライマー DNA からの信号のみを示しています。
拡張子が ddNMP のプライマーを使用しての戦略は非常に安定する証明した、したがって、ddNMP を含む製品は、校正の試金のための良い指標です。切除製品に ddNMP を追加可能性があります '凍結' 校正製品解析の状態ですぐに後切除。また、校正の exonuclease の非固有の加水分解活性を抑制する 4 ddNTPs の代わりに単一の正しい dNTP (図 5 b) を使用可能です。
標準フェノール/クロロホルム抽出法で反応を停止するので、1 つのステップでそれを有効にまた任意のタンパク質の干渉を除去しながら停止する反応反応終了の最良の手段であることが分かった。また、焼入、非金属相分離せずアルカリで中和し、オートメーション、影響を受けやすいが、酸も信頼性の高い結果を示した。ナトリウム イオン付加体 (図 4 5、および7の Na+ ) が懸念されるので背景を増加でき、信号の分離を複雑にします。きれいな樹脂の適切な使用は、そのような干渉を減らすことができます。まだ、でもときそのような物は付加体があれば、彼らは通常彼らの親信号に対してはるかに小さいピークを持っている、(図 4 5、および7) それらを区別するためにこのプロパティを使用できます。一般的には、ナトリウムのピーク高さの付加; 主要なピークに比例しました。包含または除外のナトリウム付加体計算では定量化結果が著しく影響しませんでした。したがって、定量化, 我々 は計算についてだけ主要なピークの高さを使用します。
記載されている校正実験はここで利点を取った、exonuclease の重要性を示すための内部不一致のドメイン パーティション アッセイ KF26および詳細な DNA ポリメラーゼの私での不一致を効率的に校正する能力を4 nt の上流、プライマー 3' 末端 (図 5MM1 - 4) プライマー テンプレート接合27でベース ペアリングの安定性に起因します。さらに、この調査では、ポル ・遠藤 V 傷修復中間体の修復を勉強するのにも最後から二番目の deoxyinosine 病変を含むプライマーが使用。その結果, T-私は A よりもより効率的に修復された-I と G-;ただし、C-私はポルを修復する難治性 (表 1と図 7)。これらの結果は MALDI-TOF MS 分析校正と様々 な短いパッチの非常に役に立つことを確認 DNA 修復アッセイ28高解像度のため。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
機能ゲノム学 (台湾台北) とテクニカル サポートのための NRPB ファーマコゲノミクス研究室 (台湾)、NCFPB 統合中核施設に感謝しますこの作品は、台湾健康財団 (L ロス) と省科学技術、台北、台湾、中華民国 [最も 105-2320-B-002-047] 魏八尾胡錦濤に対してからの研究補助金によって支えられた [最も 105-2628-B-002-051-MY3] - カンイー Su と [MOST-105-2320-B-002-051-MY3] 梁でリンの。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
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