Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

Published: June 19, 2018 doi: 10.3791/57862
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 1, 1, 2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children's Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

وضع أسلوب غير المسمى، والنظائر المشعة في الراديو غير لتصحيح التجارب المطبعية بوليميراز الدنا ومقايسة إصلاح الحمض النووي استخدام الاستبانة TOF استخدام الطيف الكتلي واستراتيجية تمديد النوكليوتيدات واحدة. ثبت الفحص أن تكون محددة، وبسيطة، وسريعا جداً، وسهلة لإجراء لتصحيح التجارب المطبعية، وإصلاح بقع أقصر من 9-النيوكليوتيدات.

Abstract

صيانة الجينوم والنسخ المتماثل المؤمنين به أمر بالغ الأهمية للحفاظ على المعلومات الجينية. تقييم النسخ المتماثل عالية الدقة، قمنا بتطوير بسيط غير المسماة والنظائر المشعة في الراديو غير أسلوب استخدام تاين الامتزاز ليزر ساعد مصفوفة مع الوقت للطيران (استخدام-TOF) الشامل تحليل الطيف (مللي ثانية) لدراسة تصحيح التجارب المطبعية. هنا، بوليميراز الدنا [مثلاً الجزء كلينوو (KF) من الإشريكيّة القولونية دنا بوليميريز أنا (بول أنا) في هذه الدراسة] حضور جميع تريفوسفاتيس ديديوكسيريبونوكليوتيدي الأربعة يتم استخدامها لمعالجة الوجهين قالب التمهيدي غير متطابقة. هو ثم صحح/تمديد التمهيدي غير متطابقة وإخضاعها ل TOF استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد. المنتجات تتميز بالتغيير الشامل للتمهيدي وصولاً إلى الاختلافات النوكليوتيدات واحدة. الأهم من ذلك، تصحيح التجارب المطبعية يمكن أيضا تحديد لعدم التطابق واحد الداخلية، لو على الكفاءات المختلفة. عدم التطابق الموجود في 2-4-النيوكليوتيدات (nt) من نهاية 3 ' كانت كفاءة تدقيق ببول أنا، وعدم تطابق في 5 nt من المحطة التمهيدي أظهر تصحيح جزئي فقط. تصحيح التجارب المطبعية لا حدث لعدم التطابق الداخلية الواقعة في الإقليم الشمالي 6-9 من التمهيدي 3 ' نهاية. يمكن أيضا تطبيق هذا الأسلوب لفحوصات إصلاح الحمض النووي (مثلاً، تقييم إصلاح قاعدة الآفة من ركائز لمسار إصلاح إندو الخامس). يمكن تصحيح الإشعال تحتوي على 3 ' آفات ما قبل الأخيرة ديوكسيينوسيني (دي) عن طريق بول أنا. في الواقع، تي قبل الأخيرة-الأول، ز-الأول، و A-أنا ركائز كان الأخير 2 النيوكليوتيدات المحتوية على دي اقتطعت بول أنا قبل إضافتها الشبكة الداخلية صحيحة 5 '-الأدينوزين (دنمب) بينما ج قبل الأخيرة-أنا عدم التطابق قد تتغاضى عن بول الأول، يسمح الدليل التمهيدي تمديدها دون إصلاح، مما يدل على حساسية والقرار من مرض التصلب العصبي المتعدد الاعتداء على قياس إصلاح الحمض النووي.

Introduction

تصحيح التجارب المطبعية وظائف [بولمرس] الحمض النووي من خلال تكرار الحمض النووي ضرورية لضمان الدقة العالية للمعلومات الوراثية التي تحتاج إلى نقلها إلى ذرية1،2،،من34، 5،،من67. التمكن من تقييم إسهامات بوليميريز تصحيح التجارب المطبعية اكسونوكليسيس أن توضح آليات حماية الاستقرار الوراثي.

تصنيف النظائر المشعة وفحوصات على أساس جل في تركيبة مع التحليلات دينسيتوميتريك أوتوراديوجرامس أو الفوسفور التصوير8،،من910 تقليديا قد استخدمت للكشف عن النشاط تصحيح التجارب المطبعية للحمض النووي [بولمرس]. بينما الوظيفية، هذه فحوصات شاقة ومكلفة وغير قابلة لتنسيقات الفائق. وبالإضافة إلى ذلك، تعاني النظائر المشعة مسائل السلامة، بما في ذلك التخلص من النفايات. وبدلاً من ذلك، أنشطة التدقيق قد تم تحليلها باستخدام تقنيات فلوروميتريك. على سبيل المثال، 2-أمينوبوريني (2-AP) يمكن إدراجها في منتجات ملحق أثناء بوليميراز في المختبر على تصحيح التجارب المطبعية فحوصات لإنتاج إشارة فلورسنت11،12. لسوء الحظ، تعاني هذه النهج نوعية منخفضة، منذ 2-AP يمكن إقران مع الثايمين والسيتوزين. تشمل نهج أكثر حداثة حساسة ز-كوادروبليكس-تعتمد الإنارة التبديل في تحقيق بوليميراز 3 '-5' [ااكسونوكلس] مقايسة13 ، فضلا عن تحقيق فلورسنت المسمى منفردة بوليميريز تصحيح التجارب المطبعية المقايسة أن يتغلب على بعض 14من العيوب المذكورة آنفا. الحماس لهذه الأساليب فلوروميتريك يتناقص بسبب الحاجة إلى وسم معين من ركائز الحمض النووي.

على النقيض من ذلك، استخدام TOF "مرض التصلب العصبي المتعدد" لتحليل الحمض النووي قد استخدمت في التحليل تحديد، حيث يمكن استخدام ردود الفعل تمديد التمهيدي غير مسمى دنتبس 4 تحديد مجمع الأشكال المتعددة في موضع معين15،،من1617 و وقد اعتمدت على نطاق واسع في التطبيقات السريرية للطفرة المكتشفة وتشخيص السرطان18. باستخدام هذه المبادئ الأساسية، وقد أنشأنا مقايسة خالية من التسمية للبت في المختبر بوليميراز الدنا تصحيح التجارب المطبعية نشاط استغلال عالية الدقة، وخصوصية عالية، وإمكانات الفائق للسيدة TOF استخدام استخدام هاء القولونية بوليميراز الدنا أنا كلينوو تجزئتها إنزيم نموذج، ديديوكسيريبونوكليوتيدي تريفوسفاتيس (ddNTPs) كما يمكن أن تتخذ ركائز "لقطة" لتصحيح التجارب المطبعية المنتجات بعد النوكليوتيدات واحدة ملحق عن طريق استخدام TOF MS (الشكل 1).

وبالمثل، هذا الأسلوب أيضا نمواً مقايسة إصلاح الحمض النووي حيث تحتوي على 3 ' الآفات دي قبل الأخيرة تتعرض لبول يمكنني إصلاح أجهزة الإشعال الاعتداء الذي يقلد إندو الخامس رصدت إصلاح وسيطة. بينما غير مفهومة تماما، مسار إصلاح إندو الخامس هو نظام إصلاح الوحيد المعروف لتوظيف pol أنا تصحيح التجارب المطبعية [ااكسونوكلس] نشاط للآفة الختان19،20. استخدام MS استخدام TOF، علينا إظهار تصحيح إصلاح محددة بوضوح حيث يمكن أن اقتطعت بول دي أنا عندما تحدث في الماضي 2 nt الدليل التمهيدي قبل إضافة النوكليوتيدات تستكمل الصحيح.

للدراسة لتصحيح التجارب المطبعية وإصلاح الحمض النووي، هذا الأسلوب أسرع وأقل مشقة من الأساليب السابقة ويوفر معلومات إضافية صوب إليه ودالة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-"إعداد" التمهيدي/قالب

  1. تصميم كبسولة تفجير/قوالب ذات محتوى G + C متوازنة بين 40% و 60% كما هو الحال التسلسل أو التصميم التمهيدي PCR. استخدام كبسولة تفجير من 18 إلى 21 nt للصلب مناسبة وإشارات MS أفضل.
  2. تصميم القالب بتعيين 50 درجة مئوية كأدنى ذوبان درجة الحرارة في المنطقة المزدوجة مع مالا يقل عن 7 nt 5 '--المتراكمة لفصل الإشارات بين التمهيدي والقالب.
    ملاحظة: على سبيل المثال، للركيزة P21/T28 في الجدول 1، 21-nt التمهيدي هو يقترن قالب 28-nt. الخيار: استخدام الأحماض النووية البديلة مثل سندات فوسفوروثيواتي نوكلاس المقاوم لاستبدال السندات phosphodiester آخر 4 في 3 'نهاية القالب يمكن منع أي تداخل محتمل بتدهور نهاية غير محددة 3' القوالب ( مثل، T28S4 في الجدول 1)، وعلى الرغم من أن هذا سيضيف بعض التكاليف لإعداد قالب.
  3. باستخدام معيار النوكليوتيد ديسالتيد دون أي مزيد من تنقية غير مرضية لهذه الدراسة. استخدام اليغنوكليوتيد الإشعال/قوالب بتركيز 100 pmol/ميليلتر في ح2س أسهم وتخزينها في-20 درجة مئوية. التحقق من جودة ونقاء الإشعال وقوالب بتشغيل النوكليوتيد TOF استخدام MS (الخطوات 4-7) لضمان إشارات ذروة فريدة من نوعها وإشارة جيدة لنسبة الضوضاء.
  4. تحديد كثافة إشارة TOF استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد النسبي (الخطوة 7) من الإشعال المولى متساوية من التسلسلات ذات الصلة كرد فعل للتطبيع والمعايرة وتركيز (الشكل 2).

2-تصحيح التجارب المطبعية ردود الفعل

ملاحظة: نفس حالة رد فعل تصحيح التجارب المطبعية والبروتوكول تنطبق على إصلاح الحمض النووي (أ)-الأول، ز-الأول، ج-أنا، و T--أنا.

  1. استخدام عدم تطابق T-ز من الركازة P21/T28 للتدقيق في الجدول 1 على سبيل مثال، يؤدي إلى تمييع التمهيدي P21 وقالب T28 إلى 12.5 pmol/ميليلتر مع ح2س؛ قم بنقل 12 ميليلتر من التمهيدي المخفف وميليلتر 12 قالب المخفف لأنبوب 1.5 مل معقمة ميكروسينتريفوجي.
    ملاحظة: مقدار قالب/التمهيدي مزيج غير كافية لردود الفعل 2؛ متناسب مع زيادة حجم المواد الكاشفة تبعاً لذلك لردود فعل متعددة.
  2. أغلق الأنبوب محكم. تبني عليه لمدة 30 دقيقة في تغطية 65 ° ج حمام مائي، تليها في حمام مائي 37 ° C، و 30 دقيقة، وأخيراً على الجليد التأكد من الصلب السليم.
  3. أنبوب 1.5 مل معقمة ميكروسينتريفوجي، إضافة 8 ميليلتر من التمهيدي وقالب مزيج (50 بمول)، 2 ميليلتر من 10 × التدقيق رد فعل المخزن المؤقت, 4 ميليلتر دنتبس 4 ميكس (2 مم لكل دنتبس 4)، وح2س ما يصل إلى 18 ميليلتر. نفض الغبار على أنبوب لمزيج.
    ملاحظة: 1 x تصحيح التجارب المطبعية رد فعل المخزن المؤقت يحتوي على 50 مم كلوريد الصوديوم و 10 ملم مجكل2، ديثيوثريتول 1 مم، 10 مم تريس-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). انظر الجدول للمواد التجارية مصدر 10 x تصحيح التجارب المطبعية رد فعل المخزن المؤقت. تركيز كل دنتب في رد الفعل النهائي 0.1 ملم.
  4. تمييع بوليميراز الدنا في المثلج 1 x تصحيح التجارب المطبعية رد فعل المخزن المؤقت إلى التركيز المطلوب [مثلاً، إضافة إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي، ميليلتر 4 1 x تصحيح التجارب المطبعية رد فعل المخزن المؤقت و 1 ميليلتر من بوليميراز كلينوو 5-U من مصدر تجاري (الجدول من Materials)]. تخزين الإنزيم المخفف على الجليد في جميع الأوقات.
    ملاحظة: كمية المخفف دنا بوليميريز كافية لردود الفعل 2؛ متناسب مع زيادة حجم الإنزيمات تبعاً لذلك لردود فعل متعددة. يمكن أن يوازن بين حجم ميليلتر 2.0، التي تحتوي على وحدات 2.0 من بوليميراز كلينوو، أكثر من نصف بمول 50 من T-ز المحطة الطرفية غير متطابقة P21/T28 في 5 دقائق.
  5. بريوارم أنبوب ميكروسينتريفوجي مع مزيج الركيزة من الخطوة 2، 3 درجة حرارة التفاعل المطلوب (مثلاً، عادة 37 درجة مئوية بوليميراز كلينوو و 25 درجة مئوية بوليميراز الدنا T4). ثم نقل ميليلتر 2.0 من بوليميريز الحمض المخفف من الخطوة 2، 4 إلى خليط الركيزة بريوارميد ونفض الغبار على أنبوب لخلط محتوياته.
  6. الطرد المركزي هذه الأنابيب مع الإنزيم والركيزة لبضع ثوان في 3,200 س ز في درجة حرارة الغرفة تدور أسفل العناصر المكونة لردود الفعل. نقل على الفور رد فعل على كتلة تدفئة أو حمام مائي في درجة حرارة الحضانة المطلوب كما هو الحال في الخطوة 2، 5.
  7. إنهاء رد فعل
    1. إضافة وحدة تخزين متساوية من الفينول مخزنة ومزجها فورتيكسينج لبضع ثوان، والطرد المركزي أنه في ميكروسينتريفوجي في 3,200 س ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      1. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي نظيفة وإضافة وحدة تخزين متساوية من كلوروفورم، مزيج من فورتيكسينج لثوان قليلة وأجهزة الطرد المركزي في [ميكروفوج] في 3,200 س ز في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 3 نقل المرحلة المائية نظيفة [ميكروفوج] أنابيب وفي كوبيت أنه عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ ثم وضعه على الجليد.
        تنبيه: الفينول كلوروفورم والمواد الكيميائية الخطرة. التخلص من النفايات ومعالجة ينبغي اتباع الأنظمة المؤسسية.
    2. بدلاً من ذلك، استخدام حمض تبريد البروتوكول. لهذا، إضافة 2 ميليلتر من 1 M HCl للتوقف عن رد فعل على الجليد لمدة 6 دقائق، ثم أضف 0.64 ميليلتر من 1 م الديثانولامين (إدارة مكافحة المخدرات) لتحييد الرقم الهيدروجيني لخليط رد فعل واحتضان أنه عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ ثم وضعه على الجليد.

3-راتنج بالإضافة إلى القضاء على التلوث بالملح

  1. استخدام المجرفة الراتنج من الملحي التجاري كيت (انظر الجدول للمواد)، وتأخذ راتنج كافية لتغطية الدمامل لوحة الدمل راتنج 384-الدمل، 6 مغ.
  2. توزيع الراتنج عبر جميع الدمامل بشكل متساو (6 مغ/الدمل) بإلغاء عبر الجزء العلوي من اللوحة. استرداد أي راتنج الزائدة واستبداله في الزجاجة.
  3. نقل المنتجات النهائية في رد فعل من الخطوة 2.7 من الأنابيب [ميكروفوج] إلى لوحة 384-جيدا. الاستغناء عن 16 ميليلتر من ح2س لتمييع نواتج التفاعل النهائي في كل بئر ثم ختم اللوحة والطرد المركزي لإزالة أي فقاعات.
  4. إزالة الختم، وتشغيل لوحة 384-جيدا مع نواتج التفاعل رأسا على عقب لتغطية صفيحة مملوءة راتنج الدمل.
  5. اقلب ساندويتش لوحات جيدا الدمل وعناية ترك الراتنج إسقاط في لوحة 384-جيدا (تأكد من لوحة 384-جيدا تدفق ضد شماعة المعدنية على لوحة مملوءة راتنج الدمل).
  6. إزالة لوحة نقرة على أعلى، ختم 384-جيدا اللوحة التي تحتوي على خليط نواتج التفاعل والراتنج، بإيجاز الطرد المركزي في س 3,200 ز إزالة أي فقاعات ووضعه على دوار لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة الملحي محتوياته.
  7. بعد تنظيف الراتنج، الطرد المركزي لوحة 384-جيدا في س 3,200 ز لمدة 5 دقائق ضغط الراتنج إلى الجزء السفلي من الآبار.

4-نقل نواتج التفاعل إلى شريحة المصفوفة

  1. مجموعة لوحات العينة موزع نانولتر (نانوديسبينسير، انظر الجدول للمواد).
  2. وضع المصفوفة رقاقة (انظر الجدول للمواد) لوحة 384-جيدا من المقطع 3.7 في علبة المقابلة و.
  3. تعمل نانوديسبينسير على الفور رد فعل المنتجات إلى شرائح؛ اضغط على زر تشغيل على شاشة تعمل باللمس نانوديسبينسير لبدء.
  4. الاختيار الآلي الصورة التي تم التقاطها من البقع عينة تحتوي على معلومات تشبع على الشاشة للتأكد من حجم رصدت على الرقاقة حوالي 5-10 nL. كرر شاهد العينة إذا كانت وحدة التخزين غير كافية.

5-إعداد المعلومات المقايسة على الطيف الكتلي

  1. إعداد ملف في تنسيق.xls الذي يحتوي على المعلومات إشارة المتوقعة لاستيراد. على سبيل المثال، استخدم الإعداد "P21_T28.xls" (الجدول 2) لتصحيح التجارب المطبعية رد فعل P21/T28 في الخطوات 2 و 3 و 4.
  2. إنشاء وتعريف مقايسة جديدة في تطبيق البرنامج (انظر الجدول للمواد) زر الماوس الأيمن فوق المجموعة استيراد الفحص في "شكل مصمم" وحدد الملف.xls (مثلاً، "P21_T28.xls" من الخطوة 5، 1).
  3. وضع هدف المقايسة لوحة عن طريق شجرة الخيار العميل: المشروع: اللوحة على الجانب الأيسر من الشاشة بزر الماوس الأيمن فوق الجزء العلوي من الشجرة وإعطائها اسم ملف (مثلاً، "CTT20171201" يمثل رمز المقايسة والتاريخ).
  4. حدد نوع لوحة 384-جيدا واضغط موافق؛ وسوف تظهر لوحة فارغة.
  5. حدد التحليل المناسب (مثلاً، P21_T28) على الجانب الأيسر من الشاشة.
  6. تعيين التحليل المحدد (مثلاً، P21_T28) لكل عينة رصدت الموقف عينة على الرقاقة بتسليط الضوء على البئر والنقر بالزر الأيمن لتحديد إضافة من نوع Plex.
  7. إعداد قائمة عمل جميع الاختبارات على الرقاقة في تنسيق.xlsx مع لا رأس (مثلاً، 1201.xlsx من الجدول 3). استيراد عمل قائمة عن طريق الخيار إضافة مشروع نموذج جديد .
  8. تعيين الاختبار في قائمة العمل (مثلاً، من 1201.xlsx) لكل موقف من الإنزيم P21_T28 واختر بزر الماوس الأيمن.

6-استخدام-TOF تشغيل MS

  1. ربط مطياف كتلة إلى شرائح باستخدام برنامج التطبيق (انظر الجدول للمواد).
  2. حدد الإعداد الافتراضي في الجانب الأيمن من الشاشة.
  3. ملء اسم الإنزيم من الخطوة 5.3 (مثلاً، CTT20171201)، معرف الرقائق في الركن الرقاقة، وحفظ الإعدادات.
  4. ابدأ تشغيل برنامج مكافحة مرض التصلب العصبي المتعدد (انظر الجدول للمواد).
  5. اضغط على زر في الخارج وأخرج لوحة الكشفية. ضع رقاقة مرقط من الخطوة 4، 4 على لوح الكشفية واضغط على الزر في الخارج لرقاقة رصدت دخول مطياف كتلة.
  6. انقر فوق الزر الحصول على برنامج التطبيق (انظر الجدول للمواد) للبدء في الطيف الكتلي والحصول على البيانات اللازمة.

7-بيانات التحليل

  1. افتح البرنامج لتحليل البيانات (انظر الجدول للمواد).
  2. استعراض شجرة قاعدة بيانات في الزاوية اليسرى العليا وحدد معرف رقاقة من الخطوة 6.3. فتح ملف البيانات على الجانب الأيمن من الشاشة.
  3. انقر فوق رمز الطيف لعرض الطيف الشامل. للاقتصاص بمجموعة محددة من m/z، انقر بالزر الأيمن لتحديد الحوار التخصيص وفي نافذة جديدة انقر على المحور السيني وتعيين الحد الأعلى والأدنى المطلوب واضغط على موافق لإظهار نطاق محدد من الطيف.
  4. تصدير الطيف لحفظ بالنقر تصديرالسجلات.
    ملاحظة: استخدام مقياس 1,600 العرض/1,200 وحدة حجم معقول لفحص البيانات على شاشة كمبيوتر.
    1. حدد نوع ملف JPEG، انقر فوق الوجهة، حدد القرص تصفح (مثلاً، قرص فلاش e:)، اكتب اسم الملف (مثلاً، 1201-1.jpg)، ومن ثم انقر فوق تصدير.
  5. كوانتيتيشن البيانات، استخدم المؤشر وانقر فوق الذروة لإظهار ارتفاع الذروة في الركن الأيمن العلوي.
    1. وبدلاً من ذلك، طباعة ملف JPEG وقياس ارتفاع الذروة مع مسطرة يدوياً.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

القوالب وأجهزة الإشعال:

باستخدام الإجراء الذي قدم هنا، على قدم المساواة قوالب اليغنوكليوتيد الاصطناعية المولى وتم فحص كبسولة تفجير تسلسلات ذات الصلة التي تم الحصول عليها من مصادر تجارية للنقاء والجودة (الشكل 3 ألف؛ ملاحظة الإشارات مطابقة كتلة المعينة والخلفية منخفضة) فضلا عن العلاقة بين كثافة الذروة وكتلة أكثر (الشكل 2A). مرتفعات ذروة تم قياسها وحسابها (الشكل 2) لتطبيع البيانات MS.

رد فعل الشرط والجماهيري أطياف:

قد ثبت استخدام ردود الفعل تمديد التمهيدي قاعدة واحدة مقترنة باستخدام TOF مرض التصلب العصبي المتعدد للتنميط سابقا يكون من الممكن استخدام الوحدات الطرفية دنتبس القياسي17. الفحص تصحيح التجارب المطبعية باستخدام معيار دنتبس مماثل لفعل سينجليبليكس من التنميط لكن أبسط بكثير، ومن السهل جداً القيام به للحصول على نتائج نظيفة وموثوق بها.

مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف غطت جميع الإشارات المتولدة من الإشعال والقوالب (الشكل 3). التصميم الملائم للإشعال والقوالب التي تم إنشاؤها بملف تعريف إشارات منفصلة جيدا للقوالب والإشعال (الشكل 3). وفقا للقيمة m/z، إشارات من قوالب ومنتجات التحلل الجزئي غير محددة (m/z > 7,000) تم فصل جيدا من الإشعال غير متطابقة ويوازن بين المنتجات (m/z < 7,000 في الشكل 3). إذا لزم الأمر، إدخال فوسفوروثيواتي مقاومة نوكلاس سندات لاستبدال السندات phosphodiester آخر 4 في 3 ' نهاية القالب (الجدول 1؛ T28S4/P21) يمكن أن تقلل من التحلل قالب غير محددة (الشكل 3؛ d27).

في غياب دنتبس، KF قوة 3 '-[ااكسونوكلس] وقادر على التمهيدي والقالب في المختبر21المهينة. مثل دنتبس 4 الأصلية، يمنع إضافة دنتبس 4 3 ' نهاية تدهور فلس كويتي (الشكل 3 و 3E). وبالمثل، يضيف ملحق النوكليوتيدات واحدة 3 '-الغايات زيادة الاستقرار للتمهيدي. استخدام بول أنا تصحيح الأوضاع كما سبق وصف20 مع 10 يو (بمول 46) KF، أكثر من 80% ركائز 50-pmol غير متطابقة تم تصحيحها في 5 دقائق (الشكل 3، 3E، و الجيل الثالث 3g).

وسيطة وتحليل إليه:

يمكن أن يكون قرار استخدام TOF MS غرامة دالتون 1؛ في الواقع، يمكن حل كل ركائز ومنتجات وسيطة مع تغييرات جماعية في رد فعل في نفس الطيف مرض التصلب العصبي المتعدد من النطاق المحدد. على سبيل المثال، في عدم تطابق T-ز المحطة طرفية، تم تصحيح ز غير متطابقة في المحطة التمهيدي مع إدماج إدارة شؤون نزع السلاح مع وجود فرق m/z من 32 فقط. يمكن تحديد هذه فرق m/z سهولة على طيف مرض التصلب العصبي المتعدد في نطاق m/z من 5000 إلى 7000 (الشكل 4 أ). تغيير كل إشارة فردية يمكن أن تحسب بتلخيص جميع إشارات من التمهيدي غير متطابقة، وسيطة الختان، ويوازن بين المنتجات بنسبة 100%. على سبيل المثال، كان المنتج المصححة بالنسبة للمنتج الختان في رد فعل تصحيح التجارب المطبعية تي-ز، 23% مقابل 17% في 5 دقائق، 31% مقابل 18% في 10 دقيقة، ونسبة 69 في المائة مقابل 14% في 20 دقيقة (الشكل 4 أ).

عند عدم تطابق T-ز قبل الأخير موجود في التمهيدي، 2 الماضي ينبغي أن اقتطعت nt متبوعاً أجندة الدوحة للتنمية، بإضافة إلى إكمال التصحيح. والواقع أن زيادة المنتجات الصحيحة مع الوقت من 12% في دقيقة 5، 28% في 10 دقيقة، إلى 45 في المائة في 20 دقيقة من رد فعل. وباﻹضافة إلى ذلك، كانت أشكال اثنين من المنتجات الختان لما قبل الأخيرة T ز التدقيق, المنتجات الوسيطة و 2-nt الختان الختان 1-nt، قابل للحل بسهولة (الشكل 4 باء).

تصحيح التجارب المطبعية حركية مع دنتب واحد:

لبول كولاي الحمض النووي الأول، دنتبس ليست ركائز مناسبة، وينبغي أن تعتبر مثبطات22. بدلاً من ذلك، استخدام دنتب 'صحيح' واحدة في رد فعل تصحيح التجارب المطبعية بدلاً من ذلك سيتم أيضا قمع غير محددة 3 '-5' [ااكسونوكلس] نشاط وتوليد النوكليوتيدات واحدة ملحق المنتجات المناسبة لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد (الشكل 5 (ب)). معدل تصحيح التجارب المطبعية التي تم الحصول عليها من ردود الفعل التي تحتوي على دكتب واحد من أعلى حوالي مرتين من ردود الفعل التي تتضمن دنتبس 4 (الشكل 5Aو 5B وج 5). وهكذا، استخدام دنتب 'صحيح' واحد في مقايسة تصحيح التجارب المطبعية غلة نتيجة أفضل دون الآثار المثبطة دنتبس. وينبغي أن يتيح هذا النهج حساسية أكبر لتصحيح التجارب المطبعية تحليلات الحركية.

تصحيح التجارب المطبعية من الداخلية عدم التطابق:

مرض التصلب العصبي المتعدد تصحيح التجارب المطبعية فحوصات باستخدام KF لعدم التطابق الداخلية، وتحديد المنتجات البحوث واضحة (الوردات النيوكليوتيدات من النهاية 3 ' لعدم تطابق الداخلية كبسولة تفجيرأي، تصحيح التجارب المطبعية [ااكسونوكلس])، تليها إضافة دنمب المتطابقة إلى الختان المنتجات عن طريق توليد دالة بوليميريز يوازن بين المنتجات أقصر من ركائز التمهيدي (الشكل 6). لوحظ اتجاه واضح لتصحيح التجارب المطبعية الكفاءة، حيث صحح KF كفاءة عدم التطابق في الأخير وقبل الأخير، 3rd والنيوكليوتيداتال 4 من 3 ' نهاية الإشعال (الشكل 6؛ MM1، 2 و 3 و 4). يتطابق في 5 nt من 3 ' نهاية التمهيدي تم تصحيحها جزئيا مع < 15% لتصحيح عدم التوافق، و > 15% من التمهيدي وأظهرت تمديد دون تصحيح التجارب المطبعية (الشكل6؛ MM5). KF فشل تدقيق المتمركزة في 6، 7، 8، و 9 حالات عدم التطابق nt من 3 ' نهاية التمهيدي (الشكل 6؛ MM6، 7 و 8 و 9) مدد لكن لا تزال نسبة كبيرة من ركائز (الشكل 6؛ PE MM6، 7 و 8 و 9).

إصلاح الآفة ديوكسيينوسيني:

كولاي، فيه أساسا هو معالجة ديوكسيينوسيني في الحمض النووي قبل20،مسار إصلاح إندو الخامس23. V إندو يبدأ رد الفعل بشق في السندات phosphodiester الثانية 3 ' الآفة دي. ويعتقد حبلا الاستراحة التي تم إنشاؤها لاستخدامها من قبل بول أنا للختان الآفة اللاحقة والحمض النووي ريسينثيسيس24. وقد طبق هذا الإجراء لاختبار بول يمكنني إصلاح الركازات المحتوية على دي في 3 ' قبل الأخيرة موقع (الجدول 1؛ -الأول، ج-الأول، ز-الأول، و T--أنا) للتحقق من صحة هذه الفرضية. إصلاح دي قبل الأخير 3 ' مماثل لتصحيح التجارب المطبعية لعدم تطابق T-ز قبل الأخيرة (الشكل 4 باء و 6؛ دخول MM2)، 2 آخر nt ينبغي فيه إزالة متبوعاً بإضافة دنمب الصحيح لإكمال الإصلاح. أظهرت أنماط مرض التصلب العصبي المتعدد بوضوح بول صحح هيتيرودوبليكسيس أ-الأول، ز-الأول، و T--أنا، وأن كان ذلك بكفاءات مختلفة (الشكل 7؛ إشارات RP). ومع ذلك، C-أنا الركيزة كان الصهر إلى pol يمكنني إصلاح (الجدول 1 و الشكل 7 و 7E؛ RP منخفضة جداً) وأظهر الملحق التمهيدي إلى حد كبير (الشكل 7؛ إشارة PE).

Figure 1
الشكل 1 . نموذج النظام لتصحيح التجارب المطبعية المقايسة. وكان تعتيق تمهيدي غير متطابقة كما هو مبين في قالب تشكيل عدم تطابق المحطة طرفية (غامق). تصحيح التجارب المطبعية [ااكسونوكلس] بوليميريز الحمض النووي سوف كشف وإزالة النوكليوتيدات غير متطابقة تشكيل منتج ختان. حضور بوليميراز الدنا ودنتبس الأربعة، يتم توسيع المنتج الختان بقاعدة واحدة مكملة للموقع السابق غير متطابقة. عندما تعرض لاستخدام TOF، الفرق في الكتلة بين التمهيدي غير متطابقة والمنتجات الختان، ومنتجات البحوث يمكن حلها. (وهذا الرقم مقتبس من سو et al. 25 مع الإذن.) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . كثافة الذروة واليغنوكليوتيد ماساشوستس النوكليوتيد ثمانية من 17 إلى 24 nt مع تسلسل مكملة لنهاية 3 ' T28 (الجدول 1) تم اختبارها. (أ) بمزيج من بمول 50 من كل اليغنوكليوتيد في الحلول 40-ميليلتر تعرضت لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. (ب) ارتفاع ذروة 17 nt 100% للحساب. كثافة إشارة النسبي لكل اليغنوكليوتيد متوسط ستة قرارات وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري 1. (وهذا الرقم مقتبس من سو et al. 25 مع الإذن.) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . أثر تصميم قالب مختلف. تم تقييم ردود الفعل تصحيح التجارب المطبعية مع التمهيدي P21 تشكيل محطة تي-ز عدم تطابق مع قوالب مختلفة. أجرى الفحص تصحيح التجارب المطبعية مع بوليميراز كلينوو (بمول 43) يو 10، 50 pmol الركازة، ودنتبس 4 في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5 (أ) هذا الفريق يظهر الركازة P21/T32 ر-ز دون إنزيم. (ب) هذا الفريق يظهر ملحق التمهيدي من الركازة T-A P21/T32 قبل 3 ' [ااكسونوكلس] ناقصة كلينوو. PE = المنتج تمديد التمهيدي. (ج) يظهر هذا الفريق تصحيح التجارب المطبعية من الركازة P21/T32 ر-ز. PP = تصحيح التجارب المطبعية المنتج؛ d26، d27، d28 = 3 ' المتدهورة نهاية القالب. (د) هذا الفريق يظهر الركازة P21/T28 ر-ز دون الإنزيم. (ه) يظهر هذا الفريق تصحيح التجارب المطبعية من الركازة P21/T28 ر-ز. PP = تصحيح التجارب المطبعية المنتج؛ d26، d27 = 3 ' المتدهورة نهاية القالب. (و) هذا الفريق يظهر الركازة P21/T28S4 ر-ز دون الإنزيم. (ز) يظهر هذا الفريق تصحيح التجارب المطبعية من الركازة P21/T28S4 ر-ز. PP = تصحيح التجارب المطبعية المنتج؛ EP = منتجات الختان؛ d27 = قالب تدهور ثانوي. (وهذا الرقم مقتبس من سو et al. 25 مع إذن). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . وقت التحليل بالطبع للمنتجات الختان وتصحيح التجارب المطبعية المنتجات. وأجريت فحوصات تصحيح التجارب المطبعية مع 2 يو (8.6 pmol) KF وركائز pmol 50 المبينة في البروتوكول. أن ردود الفعل كانت مروي في أشير مرات. (أ) يظهر هذا الفريق تصحيح التجارب المطبعية لعدم 3 ' تطابق T-ز المحطة الطرفية؛ EP = تصحيح التجارب المطبعية الختان المنتج؛ d18 & d19 = الختان زائدة النواتج العرضية؛ PP = تصحيح التجارب المطبعية المنتجات؛ P21 = التمهيدي غير متطابقة. (ب) يظهر هذا الفريق تصحيح التجارب المطبعية لعدم تطابق T-ز 3 '-قبل الأخير؛ الصناعات الاستخراجية-1 = الختان المتوسط؛ الجيش الشعبي-2 = تصحيح التجارب المطبعية الختان المنتجات؛ d18 = ثانوي الختان الزائدة؛ PP = تصحيح التجارب المطبعية المنتجات؛ P21 = التمهيدي غير متطابقة؛ غ = النيوكليوتيدات ملزمة أيون الصوديوم. (وهذا الرقم مقتبس من سو et al. 25 مع الإذن.) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . تصحيح التجارب المطبعية الرد مع 4 دنتبس مقابل دنتب واحد. وأجريت فحوصات تصحيح التجارب المطبعية مع 0.1 يو (0.43 pmol) KF وركائز pmol 50 المبينة في البروتوكول. أن ردود الفعل كانت مروي في أشير مرات. (أ) يظهر هذا الفريق تصحيح التجارب المطبعية 3 ' المحطة الطرفية ز ز عدم التطابق مع دنتبس 4؛ EP = تصحيح التجارب المطبعية الختان المنتج؛ PP = تصحيح التجارب المطبعية ريسينثيسيس المنتجات؛ P21G = التمهيدي غير متطابقة. (ب) يظهر هذا الفريق تصحيح التجارب المطبعية 3 ' المحطة الطرفية ز ز عدم التطابق مع دكتب؛ PP = تصحيح التجارب المطبعية ريسينثيسيس المنتجات؛ P21G = التمهيدي غير متطابقة. (ج) التصحيح مستويات متوسط ثلاثة قرارات وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري 1. نا+ = النيوكليوتيدات ملزمة أيون الصوديوم. (وهذا الرقم مقتبس من سو et al. 25 مع الإذن.) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 . تصحيح التجارب المطبعية لعدم التطابق الداخلية- وأجريت فحوصات تصحيح التجارب المطبعية مع يو 2 (8.6 pmol) كلينوو بوليميريز وركائز pmol 50 في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة كما هو موضح في البروتوكول. فارغة = إنزيم فارغة من الركازة MM1. MM1 = الركازة P21/T28 ر-ز؛ MM2 إلى MM9 = ركائز مع عدم التطابق الداخلية، تشير الأرقام إلى موضع عدم تطابق نسبة 3 ' نهاية. P21 = كبسولة تفجير غير متطابقة؛ PR = منتجات البحوث؛ PE = كبسولة تفجير الموسعة؛ d19 و d20 = الختان زائدة النواتج الثانوية، تمثل الأرقام حجم النيوكليوتيدات. (وهذا الرقم مقتبس من سو et al. 25 مع الإذن.) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 . إصلاح 3 ' الآفات قبل الأخيرة ديوكسيينوسيني- وأجريت فحوصات إصلاح بوليميراز "كلينوو يو" 2 وركائز pmol 50 في 37 درجة مئوية كما هو موضح في الخطوة 2، 3 من البروتوكول. أن ردود الفعل كانت مروي في أشير مرات. هذه اللوحات وتظهر ردود الفعل مع (A) T--أنا الركازة؛ (ب) ز-أنا الركازة؛ (ج) أ-أنا الركازة؛ و (د) ج-أنا الركازة. RP = إصلاح المنتجات؛ EP = منتجات الختان؛ PE = التمهيدي توسيع المنتجات، نا+ = الصوديوم أيون أدوكتس. (ه) التصحيح مستويات ل T-الأول، ز-أنا، وألف-كان متوسط ثلاثة قرارات وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري 1. تصحيح مستويات ج-كان متوسط قرارات اثنين. (وهذا الرقم مقتبس من سو et al. 25 مع الإذن.) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ركائز تسلسل تصحيح الكفاءة (بمول)
P21/T32 3-تاتاتجتكاجتككتجكاكككتكاجكتجا 17.3
5-تاككاجتكاجاكجتججاج
P21/T28 3-أتجتكاجتككتجكاكككتكاجكتجا 18.4
5-تاككاجتكاجاكجتججاج
P21/T28S4 3-أتجتكاجتككتجكاكككتكاجكتجا 22.9
MM1 5-تاككاجتكاجاكجتججاج
MM2 3-أتجتكاجتككتجكاكككتكاجكتجا 13.5
5-تاككاجتكاجاكجتجججا
MM3 3-أتجتكاجتككتجكاكككتكاجكتجا 16.9
5-تاككاجتكاجاكجتجاا
MM4 3-أتجتكاجتككتجكاكككتكاجكتجا 15.1
5-تاككاجتكاجاكجتجاجا
MM5 3-أتجتكاجتككتجكاكككتكاجكتجا 4.2
5-تاككاجتكاجاكجتاجا
MM6 3-أتجتكاجتككتجكاكككتكاجكتجا < 0.5*
5-تاككاجتكاجاكجتكججا
بي أم إكس 3-أتجتكاجتككتجكاكككتكاجكتجا < 0.5
5-تاككاجتكاجاكجكتججا
بي أم دبليو 3-أتجتكاجتككتجكاكككتكاجكتجا < 0.5
5-تاككاجتكاجاكاتججا
MM9 3-أتجتكاجتككتجكاكككتكاجكتجا < 0.5
5-تاككاجتكاجاتجتججا
أ-أنا 3-أككاجكجاككككتاتاكاجتكات 8.2
5-تجتكجكتجججاتايج
ج-أنا 3-أككاجكجاككككتاتككاجتكات 1.0
5-تجتكجكتجججاتايج
ز--أنا 3-أككاجكجاككككتاتجكاجتكات مقاس 15.4 بوصة
5-تجتكجكتجججاتايج
T--أنا 3-أككاجكجاككككتاتكاجتكات 16.6
5-تجتكجكتجججاتايج

الجدول 1. تصحيح التجارب المطبعية ركائز وكفاءة تصحيح جراء الشظايا كلينوو. يظهر هذا الجدول 4-النيوكليوتيدات جريئة بنهاية 3 '--القالب الذي يحتوي على التعديلات فوسفوروثيواتي. قاعدة أزواج غير متطابقة بخط غامق. وأجريت فحوصات تصحيح التجارب المطبعية مع يو 2 (8.6 pmol) كلينوو بوليميريز و 50 pmol الركيزة دنتبس 4 في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10 * هذه القيم هي الحدود الدنيا لمستوى تصحيح التجارب المطبعية لأنه يمنع الضوضاء الخلفية تقديرات دقيقة < 1% من مجموع الإشارات الشامل ولاحظ. (وهذا الرقم مقتبس من سو et al. 25 مع الإذن.)

بئر مصطلح SNP_ID 2-بكرب 1-بكرب AMP_LEN UP_CONF MP_CONF الخرائط المواضيعية بكجك بورن UEP_DIR UEP_MASS UEP_SEQ EXT1_CALL EXT1_MASS
W1 القراءة T28 نا نا نا نا نا نا نا و 8524.54 أتجتكاجتككتجكاكككتكاجكتجا
W1 القراءة P21 نا نا نا نا نا نا نا و 6495.24 تاككاجتكاجاكجتججا

الجدول 2. الملف T28_P21.xlsx. تم استخدام الإعداد الشكل 3Dو 3E، 4A، 5A.

1201-1
1201-2
1201-3
1201-4
1201-5
1201-6
1201-7

الجدول 3. الملف 1201.xlsx. كان يستخدم الإعداد لردود الفعل 7 في الشكل 4A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ووصف هذه الدراسة تحليل نشاط تصحيح التجارب المطبعية خطوة بخطوة تحليلها بواسطة الأداة التجارية المختارة (انظر الجدول للمواد) باستخدام MS استخدام TOF. وتشمل المزايا الرئيسية أن التمهيدي والقالب هي التسمية مجانية وسهلة لإجراء، مما يسمح بمزيد من المرونة في تصميم التجارب. تيار جير كامل سيستغرق تجهيز 30 تصحيح الاختبارات ح 4، بما في ذلك 3 ح للقيام يدوياً بردود فعل تصحيح التجارب المطبعية وتحيط بهم تنظيف، بينما التحليلات TOF استخدام "مرض التصلب العصبي المتعدد" باستخدام البروتوكول المذكور ح 1 لإكمال. والعيب الرئيسي لهذا الأسلوب هو مقدار الركيزة اللازمة للفحص. للحصول على إشارات قوية ونتائج متسقة، استخدمنا pmol 50 من الركازة الحمض النووي في رد فعل 20-ميليلتر؛ وهكذا، كمية الحمض النووي أعلى بكثير من الحمض النووي راديولابيليد تجارب8،،من910. الحد من وحدات التخزين وحجم العينة وصقل عملية مرض التصلب العصبي المتعدد يمكن خفض كمية الركازة المطلوبة.

يمكن استخدام النوكليوتيد الاصطناعية التي تم الحصول عليها من مصادر تجارية لدراسة تصحيح التجارب المطبعية مباشرة دون أي مزيد من التنقية أو المعالجة. بيد أنه من المستحسن للتحقق من النقاء والجودة من الحمض النووي باستخدام TOF مرض التصلب العصبي المتعدد. وأدخلت سندات فوسفوروثيواتي لاستبدال السندات 4 phosphodiester الأخير في نهاية 3 ' القالب (الجدول 1) الحد من التدهور غير محددة حبلا قالب (الشكل 3)، أن كان ذلك بتكلفة أعلى للعينة. من المثير للاهتمام، الإشارات من القالب والتمهيدي الحمض النووي يمكن أن تكون أيضا مفصولة MS بحكم الخلافات بينهما في الحجم؛ وهكذا، هذا التعديل فوسفوروثيواتي غير مطلوب. في الشكل 3 أي، على سبيل المثال، كانت جميع المنتجات ممكن لتمديد التمهيدي P21، وتصحيح التجارب المطبعية الختان وريسينثيسيس أقل من 22 nt (m/z < 7,000)، بينما كل أجزاء التدهور من قالب T28 كانت أكبر من 24 nt (m/z > 7,000 ). وكانت النتائج في الشكل 4A من نفس P21/T28 المزدوجة تعيين كتلك الموجودة في الشكل 3E. يظهر إطار برنامج موسع من m/z 6,000-7,000 فقط إشارات من التمهيدي الحمض النووي دون أي التباس إشارات من القالب.

استراتيجية استخدام كبسولة تفجير بملحق دنمب أثبتت أنها مستقرة جداً، وهكذا، المنتجات المحتوية على دنمب مؤشرات جيدة للمقايسة تصحيح التجارب المطبعية. إضافة دنمب لمنتجات الختان يمكن أن 'تجميد' المنتجات تصحيح التجارب المطبعية في الدولة من أجل تحليل فورا بعد الختان. بدلاً من ذلك، استخدام دنتب صحيح مفردة (الشكل 5B) بدلاً من دنتبس 4 لقمع نشاط هيدروليكي غير محددة تصحيح التجارب المطبعية [ااكسونوكلس] أيضا عمليا.

وقف ردود الفعل مع إجراء استخراج قياسية فينول/كلوروفورم ثبت أن أفضل وسيلة لإنهاء رد فعل منذ ذلك الحين، في خطوة واحدة، وهي تمكن ردود الفعل على أن تتوقف أثناء أيضا إزالة أي تدخل من البروتين. وبدلاً من ذلك، حمض تسقيه، وقابلة للتشغيل الآلي للمكاتب، ثم أبطل مفعولها قبل غير المعدنية القلوية دون فصل مرحلة، كما بينت نتائج يمكن الاعتماد عليها. أدوكتس أيون الصوديوم (Na+ في الشكل 4و 5و 7) تشكل مصدر قلق نظراً لأنها يمكن أن تزيد الخلفية وتعقيد التمييز إشارة. يمكن أن تقلل استخدام سليم من الراتنج نظيفة مثل هذا التدخل؛ حتى الآن، وحتى عندما مثل adducts موجودة ولديهم عادة قمم أصغر بكثير بالنسبة للأصل-الإشارة، ويمكن استخدام هذه الخاصية للتمييز بينهما (الشكل 4و 5و 7). عموما، ذروة الذروة الصوديوم adducts كان متناسباً مع قمم الرئيسية؛ إدراج أو استبعاد الصوديوم adducts في الحساب لا يؤثر إلى حد كبير على نتائج القياس الكمي. ولذلك، للقياس الكمي، استخدمنا ذروة الذروة الرئيسية فقط للحساب.

تصحيح التجارب المطبعية التجارب الموصوفة هنا استغل من عدم التطابق الداخلية لإثبات الأهمية [ااكسونوكلس] قسم مجال الاعتداء KF26 وبوليميراز الدنا مفصلة أنا القدرة على كفاءة يوازن بين عدم التطابق في أعلى 4 nt المنبع من التمهيدي 3 '-النهاية (الشكل 5، MM1-4) ربما بسبب استقرار قاعدة الاقتران في تقاطعات التمهيدي-قالب27. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت هذه الدراسة أيضا الإشعال تحتوي على الآفات ديوكسيينوسيني قبل الأخير لدراسة بول يمكنني إصلاح لوسيطة إصلاح رصدت الخامس إندو. وأظهرت النتائج أن تي-أنا كان أصلح أكثر كفاءة من A-أنا وز-الأول؛ ومع ذلك، ج-كان الصهر إلى pol يمكنني إصلاح (الجدول 1 و الشكل 7). هذه النتائج تؤكد أن إجراء تحليل TOF استخدام "مرض التصلب العصبي المتعدد" يمكن أن تكون مفيدة جداً للتدقيق والتصحيح القصيرة مختلف فحوصات الحمض النووي إصلاح28 بسبب قرارها عالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر "مرفق الأساسية المتكاملة نكفبب" للجينوم الوظيفي (تايبيه، تايوان) ومختبر مواضيعها NRPB (تايبيه، تايوان) لتقديم الدعم التقني لهم. هذا العمل كان يدعمها منحا بحثية من مؤسسة الصحة تايوان (L-I.L.) ووزارة العلوم والتكنولوجيا، تايبيه، تايوان، جمهورية الصين [التي الأكثر 105-2320-ب-002-047] "هو جين تاو" ياو وي، [الأكثر 105-2628-ب-002-051-MY3] "سو" يي كانغ، و [ MOST-105-2320-B-002-051-MY3] للين ليانغ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligonucleotides Mission Biotech (Taiwan)
phosphorothioate modified oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Taiwan)
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs, MA M0210L
Klenow fragment (3'→5' exo-) New England Biolabs, MA M0212L
NEBuffer 2.1 (10X) New England Biolabs, MA B7202S
2', 3' ddATP Trilink Biotechnologies, CA N4001
2', 3' ddGTP Trilink Biotechnologies, CA N4002
2', 3' ddTTP Trilink Biotechnologies, CA N4004
2', 3' ddCTP Trilink Biotechnologies, CA N4005
dATP, dGTP, dCTP, dTTP set Clubio, Taiwan CB-R0315
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA #01509
MassARRAY Agena Bioscience, CA
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA #10145
Clean Resin Tool Kit Agena Bioscience, CA #08040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
  2. Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
  3. Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
  4. Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
  5. Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
  6. Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
  7. Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
  8. Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
  9. Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
  10. Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
  11. Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
  12. Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).
  13. Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
  14. Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
  15. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  16. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
  17. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
  18. Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
  19. Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
  20. Lee, C. C., et al. The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
  21. Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
  22. Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
  23. Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
  24. Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
  25. Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
  26. Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
  27. Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
  28. Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).

Tags

إصلاح الكيمياء الحيوية، العدد 136، دنا بوليميريز تصحيح التجارب المطبعية، الحمض النووي، TOF استخدام الطيف الكتلي، ملحق النوكليوتيدات واحدة، ديديوكسيريبونوكليوتيدي ثلاثي الفوسفات، وعدم تطابق الحمض النووي، والحمض النووي النسخ المتماثل خطأ
تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Su, K. Y., Goodman, S. D., Lai, H.… More

Su, K. Y., Goodman, S. D., Lai, H. M., Yen, R. S., Hu, W. Y., Cheng, W. C., Lin, L. I., Yang, Y. C., Fang, W. H. Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57862, doi:10.3791/57862 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter