Summary
Eine nicht beschriftet, nicht-Radio-Isotopen Methode zur DNA-Polymerase Korrekturlesen und eine DNA-Reparatur-Assay wurde mithilfe von hochauflösenden MALDI-TOF-Massenspektrometrie und eine Einzel-Nukleotid-Erweiterung-Strategie entwickelt. Der Test erwies sich als zu sehr spezifischen, einfache, schnelle und einfach durchzuführen, für das Korrekturlesen und reparieren kürzer als 9-Nukleotide patches.
Abstract
Die Wartung des Genoms und seine treuen Replikation ist von größter Bedeutung für die Erhaltung der genetischen Information. Um High-Fidelity-Replikation zu bewerten, haben wir eine einfache, nicht beschriftet und nicht-Radio-Isotopen-Methode mit einer Matrix-assisted Laser Desorption ionisation mit Time-of-Flight (MALDI-TOF) Masse Massenspektrometrie (MS)-Analyse für ein Lektorat Studie. Hier, eine DNA-Polymerase [z. B. das Klenow-Fragment (KF) von Escherichia coli DNA-Polymerase ich (Pol ich) in dieser Studie] in Anwesenheit aller vier Dideoxyribonucleotide Triphosphate wird verwendet, um eine nicht übereinstimmende Grundierung-Vorlage Maisonette verarbeiten. Die nicht übereinstimmende Grundierung ist dann erweitert/Korrekturlesen und MALDI-TOF MS unterzogen. Die Produkte zeichnen sich durch die Massenänderung der Grundierung auf Einzel-Nukleotid-Variationen. Wichtig ist, kann eine Korrektur auch für interne einzelnen Fehlanpassungen, wenn auch mit unterschiedlicher Effizienz ermittelt werden. Fehlanpassungen gelegen in 2-4-Nukleotide (nt) von 3'-Ende waren effizient Korrekturlesen von Pol ich, und ein Missverhältnis bei 5 nt von der Grundierung Endstation zeigte nur eine partielle Korrektur. Keine Korrektur erfolgte für interne Konflikte am 6-9 nt vom Primer 3' Ende. Diese Methode kann auch zur DNA-Reparatur-Assays (z. B. Beurteilung eine Basis-Läsion Reparatur von Substraten für den Endo V Reparatur Weg) angewendet werden. Primer mit 3' vorletzten Deoxyinosine (dI) Läsionen durch Pol korrigiert werden könnte ich. In der Tat vorletzten T-I, G-I und A-ich Substrate hatte ihre letzte 2 dI-haltigen Nukleotide herausgeschnitten von Pol ich vor dem Hinzufügen eines richtigen DdN 5'-Monophosphate (DdNMP) beim vorletzten C-ich Diskrepanzen wurden toleriert, von Pol I, so dass die Grundierung ohne erweitert werden Reparatur, zeigen, dass die Empfindlichkeit und Auflösung der MS Test zur Messung der DNA-Reparatur.
Introduction
Die Korrekturlesen Funktionen von DNA-Polymerasen während der DNA-Replikation sind Voraussetzung für High-Fidelity der genetischen Information, die auf Nachkommen1,2,3,4übertragen werden muss, 5,6,7. Um die Beiträge der Polymerase Korrekturlesen exonucleasen beurteilen würde die Mechanismen, die Sicherung der genetischen Stabilität klären.
Kennzeichnung von Radioisotopen und Gel-basierte Assays in Kombination mit densitometrische Analysen von Autoradiograms oder Phosphor bildgebenden8,9,10 haben traditionell verwendet, um Korrekturlesen Tätigkeit der DNA zu erkennen Polymerasen. Während funktionell, sind diese Tests aufwändig, teuer und Hochdurchsatz-Formate nicht zugänglich. Darüber hinaus leiden Radioisotope Sicherheitsfragen einschließlich Entsorgung. Alternativ haben Korrekturlesen Aktivitäten fluorometrisch Techniken analysiert wurde. Zum Beispiel kann 2-Aminopurine (2-AP) Erweiterungsprodukte bei in-vitro- Polymerase Korrekturlesen Assays um ein Fluoreszenzsignal11,12produzieren integriert werden. Leider leiden diese Ansätze eine geringe Spezifität, da 2-AP mit Thymin und Cytosin koppeln kann. Neuere Ansätze beinhalten einer sensible G-Quadruplex-basierte lumineszierenden einschalten Sonde für eine Polymerase 3' - 5' Exonuclease Assay13 sowie einzeln beschriftet fluoreszierende Sonde für eine Polymerase Korrekturlesen Assay, die einige der überwindet die genannten Nachteile14. Begeisterung für diese fluorometrischen Methoden wird aufgrund der Notwendigkeit, die spezifische Kennzeichnung von DNA-Substrate vermindert.
Im Gegensatz dazu beschäftigt ein MALDI-TOF MS für DNA-Analysen in PinPoint-Assay, wo die Grundierung Erweiterung Reaktionen mit unbeschrifteten 4 Ddntp können zur Polymorphismen bei einem bestimmten Locus15,16,17 zu identifizieren und verbreitet in der klinischen Anwendung bei Mutation Erkennungen und Krebs diagnostiziert18. Mit diesen Grundprinzipien, schufen wir einen markierungsfreie Assay zur in-vitro- Bestimmung der DNA-Polymerase Korrekturlesen Tätigkeit nutzen die hohe Auflösung, hohe Spezifität und Hochdurchsatz-Potenzial der MALDI-TOF MS. mit E. coli DNA-Polymerase ich Klenow als ein Modell-Enzym, Dideoxyribonucleotide Triphosphate (DdNTPs Fragment) wie Substrate können eine "Momentaufnahme" Korrekturlesen Produkte nach ein Einzel-Nukleotid-Erweiterung über MALDI-TOF MS (Abbildung 1).
Ebenso wurde diese Methode auch entwickelt für einen DNA-Reparatur-Assay wo assay Primer mit 3' vorletzten dI Läsionen ein Pol ausgesetzt sind, die ich reparieren, welche Mimik Endo V geklaut Reparatur Zwischenprodukte. Zwar nicht vollständig verstanden, ist der Endo V Reparatur Weg das einzige Reparatursystem bekannt, dass der Pol ich Korrekturlesen Exonuclease Tätigkeit für Läsion Exzision19,20beschäftigen. Mit MALDI-TOF MS, wir zeigen einen klar definierten Reparatur-Patch wo dI von Pol herausgeschnitten werden, kann ich in den letzten 2 auftritt nt die Grundierung vor der Zugabe der richtigen ergänzt Nukleotid.
Für die Studie der Korrekturlesen und DNA-Reparatur diese Methode ist schneller und weniger aufwändig als bisherige Methoden und bietet zusätzliche Informationen zum Mechanismus und Funktion.
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Protocol
(1) Primer/Vorlage Vorbereitung
- Entwerfen Sie Grundierungen/Vorlagen mit einem ausgewogenen G + C-Gehalt zwischen 40 % und 60 % wie in einem Sequenzierung oder PCR besser gekleideteres Design. Verwenden Sie Primer von 18 bis 21 nt für eine entsprechende glühen und bessere MS-Signale.
- Designvorlage von 50 ° C einstellen, als das Minimum, die Schmelztemperatur der duplex Region mit mindestens 7 nt des 5'-Überhangs, die Signale zwischen den Primer und die Vorlage zu trennen.
Hinweis: zum Beispiel für das Substrat P21/T28 in Tabelle 121-nt-Grundierung mit einer 28-nt-Vorlage paart. Option: die Verwendung von alternativen Nukleinsäuren wie Nuklease-resistente Phosphorothioat Anleihen, die letzten 4 Phosphodiester-Anleihen am 3' Ende der Vorlage zu ersetzen kann mögliche Störungen durch eine unspezifische 3' Ende Abbau der Vorlagen ( verhindern z.B., T28S4 in Tabelle 1), obwohl dies einiges an Kosten für die Erstellung der Vorlage hinzufügen. - Mit standard entsalzten Oligonukleotide ohne weitere Reinigung genügt für diese Studie. Verwenden Sie Oligonukleotid Primer/Vorlagen, bei einer Konzentration von 100 Pmol/µL in H2O als Lager und bei-20 ° c Lagern Überprüfen Sie die Qualität und Reinheit der Zündkapseln und Vorlagen durch Ausführen der Oligonukleotide auf MALDI-TOF MS (Schritte 4 bis 7), einzigartige Gipfel Signale und ein gutes Signal Rauschabstand zu gewährleisten.
- Bestimmen Sie die relative MALDI-TOF MS Signalintensitäten (Schritt 7) der gleiche molare Primer der entsprechenden Sequenzen in der Reaktion für die Kalibrierung und Konzentration Normalisierung (Abbildung 2).
2. Reaktionen Korrekturlesen
Hinweis: Die gleichen Korrekturlesen Reaktion Zustand und das Protokoll gilt für eine DNA-Reparatur von A-I, G-I, C-I und T-ich.
- Mit einem T-G-Mismatch des Substrats P21/T28 für das Korrekturlesen in Tabelle 1 als Beispiel, verdünnen Sie Grundierung P21 und Vorlage T28 12,5 Pmol/µL mit H2O; dann übertragen Sie 12 µL verdünnter Grundierung und 12 µL der verdünnten Vorlage auf einen 1,5 mL sterilisiert Microcentrifuge Schlauch.
Hinweis: Die Höhe der Vorlage/Primer Mischung ist ausreichend für 2 Reaktionen; erhöhen Sie die Lautstärke der Reagenzien anteilig entsprechend für mehrere Reaktionen. - Verschließen Sie das Röhrchen fest. 30 min in einem überdachten 65 ° C-Wasserbad, gefolgt von 30 min in einem 37 ° C-Wasserbad inkubieren und schließlich auf dem Eis um eine korrekte Glühen zu gewährleisten.
- Zu einem 1,5 mL sterilisiert Microcentrifuge Schlauch hinzufügen 8 µL des Primers und Vorlage Mischung (50 Pmol), 2 µL 10 x Korrekturlesen Reaktion Puffer, 4 µL 4 DdNTPs Mix (2 mM von jedem 4 dNTPs) und H2O bis 18 µL. Flick das Rohr zu mischen.
Hinweis: 1 X Korrekturlesen Reaktion Puffer enthält 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol, und 10 mM Tris-HCl (pH 7,9 bei 25 ° C). Sehen Sie die Tabelle der Materialien für die kommerzielle Quelle 10 x Korrekturlesen Reaktion Puffer. Die letztendliche Konzentration an jedem DdNTP in der Reaktion ist 0,1 mM. - DNA-Polymerase im eiskalten 1 x Korrekturlesen Reaktion Puffer auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen [z. B.zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 4 µL 1 x Korrekturlesen Reaktion Puffer und 1 µL 5-U Klenow Polymerase aus kommerziellen Quellen hinzufügen (Tabelle der Materials)]. Speichern Sie das verdünnte Enzym auf Eis zu allen Zeiten.
Hinweis: Die Höhe der verdünnten DNA-Polymerase ist ausreichend für 2 Reaktionen; erhöhen Sie die Lautstärke der Enzyme anteilig entsprechend für mehrere Reaktionen. Einem Volumen von 2,0 µL, mit 2,0 Einheiten der Klenow Polymerase kann mehr als die Hälfte der 50 Pmol T-G terminal nicht übereinstimmende P21/T28 in 5 min Korrektur gelesen. - Prewarm den Microcentrifuge Schlauch mit der Substrat-Mischung aus Schritt 2.3 auf die gewünschte Reaktionstemperatur (z.B. in der Regel 37 ° C für Klenow Polymerase und 25 ° C für T4-DNA-Polymerase). Dann die vorgewärmte Substratmischung 2.0 µL verdünnter DNA-Polymerase aus Schritt 2.4 übermitteln und flick das Rohr um den Inhalt zu mischen.
- Zentrifugieren Sie die Rohre mit Enzym und Substrat für ein paar Sekunden bei 3.200 x g bei Umgebungstemperatur, die Komponenten der Reaktionen zu spinnen. Reaktion auf einem Heizblock oder einem Wasserbad bei der gewünschten Inkubationstemperatur wie in Schritt 2.5 sofort zu übertragen.
-
Die Reaktion zu beenden
- Fügen Sie ein gleiches Volumen an gepufferten Phenol, mischen Sie es für ein paar Sekunden durch aufschütteln und in einem Microcentrifuge bei 3.200 x g bei Umgebungstemperatur für 5 min zentrifugieren.
- Übertragen der wässrigen Phase zu einem sauberen Microcentrifuge Schlauch und fügen Sie ein gleiches Volumen von Chloroform, mischen Sie es durch Vortexen für ein paar Sekunden und Zentrifuge in einer Microfuge bei 3.200 x g bei Umgebungstemperatur für 3 min. Transfer die wässrige Phase zu einem sauberen Microfuge Schlauch und in cubate es bei 95 ° C für 5 min; dann legen Sie es auf dem Eis.
Achtung: Phenol und Chloroform sind gefährliche Chemikalien. Handhabung und Entsorgung sollten institutionelle Regelungen befolgen.
- Übertragen der wässrigen Phase zu einem sauberen Microcentrifuge Schlauch und fügen Sie ein gleiches Volumen von Chloroform, mischen Sie es durch Vortexen für ein paar Sekunden und Zentrifuge in einer Microfuge bei 3.200 x g bei Umgebungstemperatur für 3 min. Transfer die wässrige Phase zu einem sauberen Microfuge Schlauch und in cubate es bei 95 ° C für 5 min; dann legen Sie es auf dem Eis.
- Alternativ können Sie eine Säure abschrecken Protokoll. Hierzu fügen Sie 2 µL 1 M HCl zu stoppen die Reaktion für 6 min auf Eis, dann fügen Sie 0,64 µL 1 M Diethanolamin (DEA) zu neutralisieren den pH-Wert des Reaktionsgemisches und inkubieren Sie es bei 95 ° C für 5 min; dann legen Sie es auf dem Eis.
- Fügen Sie ein gleiches Volumen an gepufferten Phenol, mischen Sie es für ein paar Sekunden durch aufschütteln und in einem Microcentrifuge bei 3.200 x g bei Umgebungstemperatur für 5 min zentrifugieren.
(3) Harz zusätzlich zu Salz Verschmutzung beseitigen
- Mit dem Harz schöpfen aus der kommerziellen Entsalzung kit (siehe die Tabelle der Materialien), nehmen Sie genügend Harz die Grübchen der 384-Grübchen, 6 mg Harz Grübchen Platte abdecken.
- Das Harz in die Grübchen gleichmäßig verteilen (6 mg/Grübchen) durch Kratzen am oberen Rand der Platte. Kein überschüssiges Harz zu erholen und in der Flasche zu ersetzen.
- Übertragen Sie die endgültige Reaktionsprodukte von Schritt 2.7 aus Microfuge-Rohre zu einem 384-Well-Platte. Verzichten Sie 16 µL H2O verdünnen die endgültige Reaktionsprodukte in jede Vertiefung der Dichtplatte und Zentrifugieren, um alle Luftblasen zu entfernen.
- Entfernen Sie die Dichtung, drehen Sie die 384-Well-Platte mit den Reaktionsprodukten kopfüber auf die Grübchen Harz gefüllten Teller abdecken.
- Das Brunnen-Grübchen Platten Sandwich umdrehen und sorgfältig das Harz in die 384-Well-Platte fallen lassen (unbedingt die 384-Well-Platte ist bündig mit den Metall Stöpsel auf dem Grübchen Harz gefüllten Teller).
- Entfernen Sie die Grübchen an der Spitze, die 384-Well-Platte mit den Mischungen der Reaktionsprodukte zu versiegeln und Harz, Zentrifugieren Sie es kurz bei 3.200 x g, entfernen alle Luftblasen und legen Sie es auf einem Rotator für mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur für Entsalzung seinen Inhalt.
- Zentrifugieren Sie nach der Reinigung Harz 384-Well-Platte bei 3.200 x g für 5 min um das Harz auf den Boden der Näpfchen zu komprimieren.
4. Einbringung Reaktionsprodukte in einem Matrix-Chip
- Setzen die Musterplatten im Nanoliter Dispenser (Nanodispenser, siehe die Tabelle der Materialien).
- Setzen Sie die Matrix chip (siehe die Tabelle der Materialien) und 384-Well-Platte aus Abschnitt 3.7 in das entsprechende Fach.
- Die Nanodispenser um die Reaktionsprodukte auf den Chip vor Ort zu betreiben; Drücken Sie laufen auf dem Touchscreen der Nanodispenser zu starten.
- Check das automatisierte aufgenommene Bild der Probe Spots mit Sättigung Informationen auf dem Bildschirm, um das Gefleckte Gesamtvolumen auf dem Chip zu gewährleisten um ist ca. 5-10 nL. Wiederholen Sie die Probe Schmierblutungen wenn das Volumen nicht ausreicht.
5. Einstellung der Assay-Informationen über die Massenspektrometrie
- Bereiten Sie eine Datei im XLS-Format mit den erwarteten Signalinformationen für den Import. Beispielsweise verwenden Sie die Einstellung des "P21_T28.xls" (Tabelle 2) für das Korrekturlesen Reaktion der P21/T28 in Schritte 2, 3 und 4.
- Erstellen und definieren einen neuen Assay im Anwendungsprogramm (siehe die Tabelle der Materialien) durch die Import-Assay-Gruppe im Designer-Format mit der rechten Maustaste und wählen Sie die XLS-Datei (z.B."P21_T28.xls" aus Schritt 5.1).
- Der Ziel-Assay Platte über den Kunden: Projekt: Platte Option Baum auf der linken Seite des Bildschirms zu etablieren, durch Rechtsklick auf die Spitze des Baumes und geben sie einen Dateinamen ein (z.B."CTT20171201" steht für die Test-Code und das Datum).
- Wählen Sie den 384-Well-Platte, und drücken Sie "OK"; eine leere Platte erscheint.
- Wählen Sie den entsprechenden Assay (z.B.P21_T28) auf der linken Seite des Bildschirms.
- Weisen Sie des ausgewählten Tests (z.B.P21_T28) für jede Probe Probenposition auf dem Chip durch Hervorhebung des Brunnens und der rechten Maustaste wählen Sie Hinzufügen Plexentdeckt.
- Bereiten Sie eine funktionierende Liste aller Tests auf dem Chip im xlsx-Format ohne Header (z.B. 1201.xlsx von Tabelle 3). Importieren der Arbeit Liste über die Option Neues Probe-Projekt hinzufügen .
- Weisen Sie den Test in der Arbeitsliste (z.B.von 1201.xlsx) an jeder Position des P21_T28 Assays und wählen Sie mit der rechten Maustaste.
6. MALDI-TOF MS Betrieb
- Das Massenspektrometer an den Chip mit dem Anwendungsprogramm zu verknüpfen (siehe die Tabelle der Materialien).
- Wählen Sie die Standardeinstellung auf der rechten Seite des Bildschirms.
- Der Assay-Name aus Schritt 5.3 (z.B.CTT20171201), Chip-ID an der Ecke des Chips, füllen Sie aus und speichern Sie die Einstellungen.
- Starten Sie das MS-Kontrolle-Programm (siehe die Tabelle der Materialien).
- Die In/Out -Taste drücken und Herausnehmen der Scout-Platte. Platzieren Sie den gefleckten Chip aus Schritt 4.4 auf den Scout-Teller und drücken Sie die Taste In/Out für den gefleckten Chip das Massenspektrometer eingeben.
- Klicken Sie die Schaltfläche " Acquire " des Anwendungsprogramms (siehe die Tabelle der Materialien) zum Starten der Massenspektrometrie und Daten zu erwerben.
7. die Datenanalyse
- Öffnen Sie das Programm für die Datenanalyse (siehe Tabelle der Materialien).
- Durchsuchen Sie die Struktur der Datenbank in der oberen linken Ecke und wählen Sie die Chip-ID Schritt 6.3. Öffnen Sie die Datendatei auf der rechten Seite des Bildschirms.
- Klicken Sie auf das Spektrum-Symbol um das Massenspektrum anzuzeigen. Um einen bestimmten Bereich von m/Z zu beschneiden, per Rechtsklick auswählen Dialogfeld "Anpassung" und im neuen Fenster klicken auf der X-Achse und legen Sie die gewünschte obere und untere Begrenzung und drücken "OK" um den angegebenen Bereich des Spektrums zu zeigen.
- Das Spektrum für Aufzeichnungen mit der rechten Maustaste exportierenzu exportieren.
Hinweis: Mit einer Skala von 1.600 Breite/1.200-Einheit ist eine vernünftige Größe für die Inspektion der Daten auf einem Computer-Bildschirm.- Wählen Sie die JPEG-Datei, klicken Sie auf Ziel, wählen Sie Durchsuchen Disc (z. B.flash Disk E:), geben Sie den Namen der Datei (z. B.1201-1.jpg) und klicken Sie dann auf exportieren.
- Verwenden Sie für Daten-Quantifizierung den Cursor, und klicken Sie auf den Gipfel der Peakhöhe in der oberen linken Ecke zeigen.
- Alternativ drucken Sie eine exportierte JPEG-Datei und Messen Sie die Peakhöhe manuell mit einem Lineal.
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Representative Results
Vorlagen und Grundierungen:
Mithilfe des Verfahrens präsentiert hier gleich molare synthetisches Oligonukleotid-Vorlagen und Primer der entsprechenden Sequenzen aus kommerziellen Quellen gewonnen wurden überprüft, für Reinheit und Qualität (Abbildung 3A; beachten Sie, dass die Signale die angegebene Masse abgestimmt und dem niedrigen Hintergrund) als auch für die Beziehung zwischen der Peak-Intensität und die Masse des Analyten (Abbildung 2A). Die Peak-Höhen wurden gemessen und berechnet (Abbildung 2 b) für die MS-Daten-Normalisierung.
Reaktion Zustand und Masse Spektren:
Die Verwendung von einheitlichen Basis Primer Extension Reaktionen gekoppelt mit MALDI-TOF MS für die Genotypisierung nachweislich vorher mit standard DdNTPs Terminatoren17durchführbar. Der Korrekturlesen Assay mit standard DdNTPs ist ähnlich wie eine Singleplex Reaktion der Genotypisierung aber ist viel einfacher und sehr einfach durchzuführen, um saubere und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten.
Die MS Spektren bedeckt alle Signale von Grundierungen und Vorlagen (Abbildung 3). Die richtige Gestaltung der Zündkapseln und Vorlagen erzeugt ein gut getrennten Signal-Profil für die Vorlagen und die Primer (Abbildung 3). Nach m/Z-Wert Signale von Vorlagen und deren unspezifische Teilabbau Produkte (m/Z > 7.000) wurden gut von den nicht übereinstimmenden Primer getrennt und Korrekturlesen Produkte (m/Z < 7.000 in Abbildung 3). Ggf. Einführung Nuklease beständig Phosphorothioat Anleihen, ersetzen Sie die letzten 4 Phosphodiester-Anleihen am 3' Ende der Vorlage (Tabelle 1; T28S4/P21) können unspezifische Vorlage Hydrolyse (Abbildung 3, d27) reduzieren.
In Ermangelung von dNTPs KF hat eine robuste 3' Exonuclease und ist in der Lage, erniedrigende die Grundierung und die Vorlage in-vitro-21. Wie die native 4 dNTPs verhindert das Hinzufügen von 4 DdNTPs einen 3'-Ende-Abbau durch KF (Abbildung 3 und 3E). Ebenso verleiht eine ein Nukleotid-Erweiterung der 3'-enden erhöhten Stabilität die Grundierung. Mit Pol ich Korrekturlesen Bedingungen wie zuvor beschrieben20 mit 10 U (46 Pmol) KF, mehr als 80 % der 50-Pmol nicht übereinstimmende Substrate in 5 min (Abbildung 3, 3E, und 3 G) korrigiert wurden.
Zwischenprodukte und Mechanismus-Analyse:
MALDI-TOF MS Auflösung kann so fein wie 1 Dalton sein; in der Tat sind alle Substrate, Produkte und Zwischenprodukte mit Massenänderungen an der Reaktion in der gleichen MS-Spektrum des ausgewählten Bereichs lösbar. Beispielsweise wurde in einem terminal T-G-Mismatch, die nicht übereinstimmende G an der Endstation Grundierung mit dem Einbau des DdA mit einem m/Z-Unterschied von nur 32 korrigiert. So ein m/Z-Unterschied kann leicht auf dem MS-Spektrum in ein m/Z-Bereich von 5.000 bis 7.000 (Abb. 4A) identifiziert werden. Die Änderung der jedes einzelne Signal errechnet werden, indem alle Signale aus der nicht übereinstimmenden Primer, Exzision Zwischenprodukten, aufsummieren und Korrekturlesen Produkte als 100 %. Beispielsweise war das korrigierte Produkt bezogen auf die Exzision Produkt in die T-G-Korrekturlesen-Reaktion, 23 % gegenüber 17 % bei 5 min, 31 % im Vergleich zu 18 % bei 10 min und 69 % im Vergleich zu 14 % bei 20 min (Abb. 4A).
Wann ist ein vorletzten T-G-Konflikt in die Grundierung, die letzten 2 nt sollte herausgeschnitten werden, gefolgt von einem DdA Ergänzung um die Korrektur zu vervollständigen. In der Tat erhöht die richtigen Produkte mit der Zeit von 12 % bei 5 min, 28 % bei 10 min, um 45 % bei 20 min der Reaktion. Darüber hinaus wurden zwei Formen der Exzision Produkte für einen vorletzten T-G Korrekturlesen, die 1-nt Exzision zwischen- und 2-nt Exzision Produkte leicht lösbaren (Abbildung 4 b).
Kinetik mit einzelnen dNTP Korrekturlesen:
Für E. Coli DNA-Pol I, DdNTPs sind nicht geeignete Substrate und als Inhibitoren22anzusehen. Alternativ wird mit einer einzigen "richtigen" dNTP Korrekturlesen Reaktion stattdessen auch unspezifische 3' - 5'-Exonuclease-Aktivität und die Generierung von Einzel-Nukleotid Erweiterungsprodukte geeignet für MS-Analyse (Abb. 5 b) unterdrückt. Die Korrektur von Reaktionen, die mit einem einzigen dCTP erhalten beträgt etwa doppelt so hoch als Reaktionen mit den 4 DdNTPs (Abbildung 5A, 5 bund 5 C). Somit ergibt sich die Verwendung einer einzigen "korrekt" dNTP im Lektorat Test ein besseres Ergebnis ohne die hemmende Wirkung von DdNTPs. Dieser Ansatz sollte mehr Sensibilität für das Korrekturlesen kinetischer Analysen liefern.
Korrekturlesen von internen Konflikten:
MS Korrekturlesen Assays mit KF für interne Konflikte und die Identifikation der Korrektur gelesen Produkte einfach sind (d. h., das Korrekturlesen Exonuclease beschneidet Nukleotide aus dem 3'-Ende der internen Diskrepanz der Primer), gefolgt von der Zugabe von aufeinander abgestimmten DdNMP, die Exzision Produkte über die Polymerase Funktion generieren Korrekturlesen Produkte kürzer als die Grundierung Substrate (Abbildung 6). Ein klarer Trend Korrekturlesen Effizienz wurde beobachtet, wo KF effizient Diskrepanzen bei der letzten, vorletzten, 3rd und 4th Nukleotide von 3' Ende der Primer (Abbildung 6, Korrekturlesen, MM1, 2, 3 und 4). Fehlanpassungen bei 5 nt aus der 3'-Ende des Primers wurden teilweise korrigiert mit < 15 % der Fehlanpassung Korrektur und > 15 % des Primers zeigte eine Verlängerung ohne Korrekturlesen (Abbildung6; MM5). KF gegen Fehlanpassungen bei 6, 7, 8 und 9 positioniert Korrektur nt aus der 3'-Ende des Primers (Abbildung 6; MM6, 7, 8 und 9) verlängert aber immer noch einen erheblichen Anteil der Substrate (Abbildung 6; PE von MM6, 7, 8 und 9).
Reparatur von Deoxyinosine Läsion:
In E. Coliwird Deoxyinosine in der DNA in erster Linie durch die Endo V Reparatur Weg20,23verarbeitet. Endo-V initiiert die Reaktion durch einen Einschnitt in die zweite Phosphodiester-Bond 3' dI Läsion. Die Strang Pause erzeugt wird geglaubt, um von Pol verwendet werden ich für eine spätere Läsion Exzision und DNA-Resynthese24. Dieses Verfahren wurde angewendet, um testen Pol ich repariere Substrate mit dI an die 3' vorletzten Seite (Tabelle 1; Ein-I, C-I, G-I und T-ich) um diese Hypothese zu überprüfen. Die Reparatur der vorletzten dI 3' entspricht das Korrekturlesen der vorletzten T-G-Mismatch (Abbildung 4 b und 6; Mm2-Eintrag), in dem die letzten 2 nt sollte entfernt gefolgt durch eine Zugabe von einem richtigen DdNMP um die Reparatur abzuschließen. MS-Muster zeigte deutlich Pol ich korrigiert Heteroduplexes von A-I, G-I und T-ich, wenn auch mit unterschiedlichen Wirkungsgraden (Abbildung 7; RP-Signale). Jedoch die C-ich Substrat war refraktär gegenüber den Pol ich reparieren (Tabelle 1 und Abbildung 7 und 7E; sehr niedrigen RP) und demonstriert die Primer-Erweiterung zu einem großen Teil (Abbildung 7; PE-Signal).
Abbildung 1 . System für das Korrekturlesen Assay Modell. Eine nicht übereinstimmende Grundierung wurde geglüht, wie zu einer Vorlage bildet ein terminal Missverhältnis (Fett) angegeben. Der DNA-Polymerase Exonuclease Korrekturlesen würde erkennen und entfernen die nicht übereinstimmende Nukleotid bilden eine Exzision Produkt. In Anwesenheit einer DNA-Polymerase und vier DdNTPs ist die Exzision Produkt durch eine einzelne Unterseite Ergänzung zu dem bisherigen nicht übereinstimmende Standort erweitert. Bei der MALDI-TOF ausgesetzt, kann die Differenz in der Masse die nicht übereinstimmende Grundierung, die Exzision-Produkte und die Korrektur gelesen Produkte gelöst werden. (Diese Zahl ist von Su Et al. 25 mit freundlicher Genehmigung) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Peak-Intensität und Oligonukleotid Mass Acht Oligonukleotide von 17 bis 24 nt mit Sequenzen komplementär zu den 3'-Ende des T28 (Tabelle 1) wurden getestet. (A) A Mischung aus 50 Pmol jedes Oligonukleotid in 40 µL Lösungen wurde ein MS-Analyse unterzogen. (B) die Scheitelhöhe von 17 nt wurde als 100 % für die Berechnung verwendet. Die relative Signalstärke für jeden Oligonukleotid wurde der Durchschnitt der sechs Bestimmungen und die Fehlerbalken darzustellen 1 Standardabweichung. (Diese Zahl ist von Su Et al. 25 mit freundlicher Genehmigung) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Wirkung der verschiedenen Vorlagenentwurf. Korrekturlesen Reaktionen wurden mit dem P21-Primer bilden ein terminal T-G-Konflikt mit verschiedenen Vorlagen bewertet. Der Korrekturlesen Assay wurde mit 10 U (43 Pmol) Klenow Polymerase durchgeführt 50 Pmol Substrat und 4 DdNTPs bei 37 ° C für 5 min. (A) dieses Panel zeigt ein P21/T32 T-G-Substrat ohne Enzym. (B) dieses Panel zeigt eine Grundierung Erweiterung eines P21/T32-T-A-Substrats durch 3' Exonuclease mangelhaft Klenow. PE = Grundierung Erweiterungsprodukt. (C) zeigt dieses Panel ein Korrekturlesen des Substrats P21/T32 T-G. PP = Korrekturlesen Produkt; D26, d27, d28 = 3' Ende abgebaut Vorlage. (D) dieses Panel zeigt ein P21/T28 T-G-Substrat ohne Enzym. (E) zeigt das Panel ein Korrekturlesen des Substrats P21/T28 T-G. PP = Korrekturlesen Produkt; D26 d27 = 3' Ende abgebaut Vorlage. (F) dieses Panel zeigt ein P21/T28S4 T-G-Substrat ohne Enzym. (G) zeigt dieses Panel ein Korrekturlesen des Substrats P21/T28S4 T-G. PP = Korrekturlesen Produkt; EP = Exzision Produkte; D27 = Vorlage Abbau Nebenprodukt. (Diese Zahl ist von Su Et al. 25 mit freundlicher Genehmigung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Kurs-Analyse für Exzision und Korrekturlesen Produkte Zeit. Lektorat Tests wurden durchgeführt, mit 2 U (8,6 Pmol) KF und 50 Pmol Substraten wie beschrieben in das Protokoll. Die Reaktionen waren abgeschreckt zu den o.g. Zeiten. (A) dieses Panel zeigt ein Korrekturlesen 3' terminal T-G Mismatch; EP = Korrekturlesen Exzision Produkt; D18 & d19 = überschüssige Exzision Nebenprodukte; PP = Lektorat Produkte; P21 = nicht übereinstimmende Grundierung. (B) zeigt das Panel ein Korrekturlesen 3'-vorletzten T-G Mismatch; EI-1 = Exzision Mittelstufe; EP-2 = Korrekturlesen Exzision Produkte; D18 = überschüssige Exzision Nebenprodukt; PP = Lektorat Produkte; P21 = nicht übereinstimmende Grundierung; Na = Natrium-Ionen gebunden Nukleotide. (Diese Zahl ist von Su Et al. 25 mit freundlicher Genehmigung) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Korrekturlesen Reaktion mit 4 DdNTPs im Vergleich zu eine einzelne dNTP. Lektorat Tests wurden durchgeführt mit 0,1 U (0,43 Pmol) KF und 50 Pmol Substraten wie beschrieben in das Protokoll. Die Reaktionen waren abgeschreckt zu den o.g. Zeiten. (A) dieses Panel zeigt ein Korrekturlesen 3' terminal G-G Mismatch mit 4 Ddntp; EP = Korrekturlesen Exzision Produkt; PP = Korrekturlesen Resynthese Produkte; P21G = nicht übereinstimmende Grundierung. (B) zeigt das Panel ein Korrekturlesen 3' terminal G-G Mismatch mit dCTP; PP = Korrekturlesen Resynthese Produkte; P21G = nicht übereinstimmende Grundierung. (C) die Korrektur Ebenen sind der Durchschnitt der drei Feststellungen und die Fehlerbalken darzustellen 1 Standardabweichung. Na+ = Natrium-Ionen gebunden Nukleotide. (Diese Zahl ist von Su Et al. 25 mit freundlicher Genehmigung) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Korrekturlesen von internen Konflikten. Korrekturlesen Assays wurden mit 2 U (8,6 Pmol) Klenow Polymerase und 50 Pmol Substrate in 37 ° C für 20 Minuten durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben. Leer = Enzym Blank von einem MM1 Substrat. MM1 = P21/T28 T-G Substrat; Mm2, MM9 = Substrate mit internen Konflikten, die Zahlen geben die Diskrepanz nicht Position in Bezug auf 3' Ende. P21 = nicht übereinstimmende Primer; PR = Korrektur gelesen Produkte; PE = erweiterte Primer; D19 und d20 = überschüssige Exzision Nebenprodukte, die Zahlen stehen für die Größe von Nukleotiden. (Diese Zahl ist von Su Et al. 25 mit freundlicher Genehmigung) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 . Reparatur von 3' vorletzten Deoxyinosine Läsionen. Reparatur-Assays wurden mit 2 U Klenow Polymerase und 50 Pmol Substrate in 37 ° C durchgeführt, wie im Protokoll Schritt 2.3 beschrieben. Die Reaktionen waren abgeschreckt zu den o.g. Zeiten. Diese Tafeln zeigen Reaktionen mit (A) T-ich Substrat; (B) G-ich Substrat; (C) A-ich Substrat; und (D) C-ich Substrat. RP = Produkte zu reparieren; EP = Exzision Produkte; PE = Grundierung Erweiterungsprodukte, Na+ = Natrium-Ionen-Addukte. (E) die Korrektur Ebenen für T-I, G-I und A-ich den Durchschnitt der drei Feststellungen und die Fehlerbalken darzustellen 1 Standardabweichung. Die Korrekturstufen für C-ich war der Durchschnitt der zwei Bestimmungen. (Diese Zahl ist von Su Et al. 25 mit freundlicher Genehmigung) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Substrate | Sequenzen | Korrektur-Effizienz (Pmol) | |
| P21/T32 | 3'-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 17.3 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 18,4 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28S4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 22,9 | |
| MM1 | 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | ||
| LMS | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 13.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA | |||
| MM3 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 16,9 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA | |||
| MM4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 15.1 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA | |||
| MM5 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 4.2 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA | |||
| MM6 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 * | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA | |||
| MM7 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA | |||
| MM8 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACATTGGGAA | |||
| MM9 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA | |||
| A-ICH | 3'-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT | 8.2 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| C-ICH | 3'-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT | 1.0 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| G-ICH | 3'-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT | 15.4 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| T-ICH | 3'-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT | 16.6 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
Tabelle 1. Korrekturlesen von Substraten und Korrektur-Effizienz durch Klenow Fragment. Diese Tabelle zeigt die kühnen 4-Nukleotiden am 3'-Ende der Vorlage mit Phosphorothioat Änderungen. Die nicht übereinstimmende Basenpaare sind fett gedruckt. Das Lektorat Tests wurden durchgeführt, mit 2 U (8,6 Pmol) Klenow Polymerase, 50 Pmol Substrat und 4 DdNTPs bei 37 ° C für 10 min. * diese Werte sind die Untergrenzen für das Korrekturlesen Niveau, da die Geräuschkulisse genaue Schätzungen von < 1 % verhindert die gesamte Masse Signale beobachtet. (Diese Zahl ist von Su Et al. 25 mit freundlicher Genehmigung)
| GUT | BEGRIFF | SNP_ID | 2.-PCRP | 1.-PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | TM | PcGC | PWARN | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_CALL | EXT1_MASS |
| W1 | iPLEX | T28 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 8524.54 | ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | |||
| W1 | iPLEX | P21 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 6495.24 | TACCAGTCAGGACGTTGGGAA | |||
Tabelle 2: T28_P21.xlsx Datei. Die Einstellung diente zur Abbildung 3D, 3E, 4Aund 5A.
| 1201-1 |
| 1201-2 |
| 1201-3 |
| 1201-4 |
| 1201-5 |
| 1201-6 |
| 1201-7 |
Tabelle 3. 1201.xlsx Datei. Die Einstellung war für 7 Reaktionen in Abbildung 4Averwendet.
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Discussion
Diese Studie beschrieben einen Schritt für Schritt Korrekturlesen Tätigkeit Assay von der gewählten kommerziellen Instrument analysiert (siehe die Tabelle der Materialien) mit MALDI-TOF MS. Die großen Vorteile sind, dass die Grundierung und Vorlage Etikett kostenlos und einfach zu führen, ermöglicht größere Flexibilität bei der Versuchsplanung. Ein Stream-Kalk vollständige Verarbeitung von 30 Korrekturlesen Tests 4 h, 3 h beim manuellen Abgleich der Korrekturlesen Reaktionen einschließlich nehmen würde und deren Bereinigung, während die MALDI-TOF MS-Analysen unter Verwendung des genannten Protokolls dauert 1 Stunde in Anspruch. Der Hauptnachteil dieser Methode ist die Menge des Substrates zum Test erforderlich. Um starke Signale und konsistente Ergebnisse zu erhalten, haben wir 50 Pmol DNA Substrat in einem 20-µL-Reaktion verwendet. Somit ist die Menge an DNA viel höher als bei radioaktiven DNA-Experimente8,9,10. Reduziert das Volumen und die Größe der Stichprobe und die Feinabstimmung der MS-Betrieb können die Menge an Substrat erforderlich senken.
Synthetische Oligonukleotide stammen aus kommerziellen Quellen können für das Korrekturlesen Studium direkt ohne weitere Reinigung oder Behandlung verwendet werden. Es ist jedoch ratsam, die Reinheit und Qualität der DNA durch MALDI-TOF MS. Die Phosphorothioat Anleihen wurden eingeführt, um die letzten 4 Phosphodiester-Anleihen am 3' Ende der Vorlage (Tabelle 1), reduzieren Sie die unspezifische Verschlechterung des Teilprogramms Vorlage (Abbildung 3), wenn auch zu höheren Kosten pro Probe zu ersetzen. Interessanterweise können die Signale von der Vorlage und Grundierung DNA gut durch MS aufgrund ihrer Unterschiede in der Größe getrennt werden; Somit ist diese Modifikation Phosphorothioat nicht erforderlich. In Abbildung 3E, z. B. alle möglichen Produkte Grundierung P21 Erweiterung Korrekturlesen Exzision und Resynthese waren weniger als 22 nt (m/Z < 7.000), während die Abbau-Fragmente aus Vorlage T28 waren größer als 24 nt (m/Z > 7.000 ). Die Ergebnisse in Abbildung 4A wurden aus der gleichen P21/T28 duplex eingestellt wie in Abbildung 3E. Eine vergrößerte Fenster von 6.000-7.000 m/Z zeigt nur Signale aus dem Primer DNA ohne verwirrende Signale aus der Vorlage.
Die Strategie der Verwendung von Primer mit einer DdNMP Erweiterung erwies sich als sehr stabil, und so DdNMP enthaltende Produkte sind gute Indikatoren für das Korrekturlesen Assay. Die Zugabe von DdNMP zur Exzision Produkte könnte "das Korrekturlesen Produkte im Zustand für die Analyse sofort nach Exzision Einfrieren". Alternativ ist es auch möglich, mit einem einzigen richtigen dNTP (Abb. 5 b) statt 4 DdNTPs, um die unspezifische hydrolytische Aktivität der Exonuclease Korrekturlesen zu unterdrücken.
Stoppen die Reaktionen mit einem standard Phenol/Chloroform Extraktionsverfahren erwies sich als das beste Mittel für die Reaktion Kündigung da in einem Schritt, die Reaktionen beim Entfernen auch Interferenzen Protein gestoppt werden können. Alternativ hat Säure abschrecken, die Automatisierung, zugänglich ist, dann von nichtmetallischen ohne eine Phasentrennung Alkali neutralisiert, auch verlässliche Ergebnisse gezeigt. Natrium-Ion Addukte (Na+ in Abbildung 4, 5und 7) sind von Bedeutung, da sie Hintergrund zu erhöhen und die Signal-Diskriminierung erschweren. Eine ordnungsgemäße Verwendung der sauberen Harz kann solche Störungen reduzieren; noch, auch wenn solche Addukte sind vorhanden, sie haben in der Regel viel kleiner Gipfel im Verhältnis zu ihren Eltern-Signal, und diese Eigenschaft kann verwendet werden (Abbildung 4, 5und 7) unterschieden. In der Regel die Scheitelhöhe des Natriums Addukte war proportional zu den großen Gipfeln; die Einbeziehung oder den Ausschluss von Natrium Addukte die Berechnung keinen signifikanten Einfluss auf die Quantifizierung der Ergebnisse. Daher für die Quantifizierung verwendet wir die großen Scheitelhöhe nur für die Berechnung.
Das Korrekturlesen beschriebenen Experimente hier nutzten von internen Konflikten, zeigen die Bedeutung der Exonuclease Domänenpartition assay KF26 und die detaillierten DNA-Polymerase ich Fähigkeit, effizient das Missverhältnis bei Korrektur gelesen, bis 4 nt stromaufwärts vom Primer 3'-Ende (Abbildung 5, MM1 - 4) möglicherweise durch die Basis-Paarung Stabilität bei der Grundierung-Vorlage Kreuzungen27. Darüber hinaus verwendet diese Studie auch Primer mit vorletzten Deoxyinosine Läsionen ein Pol zu studieren, was ich von Endo V geklaut Reparatur Zwischenprodukte zu reparieren. Die Ergebnisse zeigten, dass T-Ich wurde repariert, effizienter als A-I und G-I; jedoch C-ich war refraktär gegenüber den Pol ich reparieren (Tabelle 1 und Abbildung 7). Diese Ergebnisse bestätigen, dass eine MALDI-TOF MS-Analyse sehr nützlich für Korrekturlesen und verschiedenen kurz-Patch DNA-Reparatur assays28 aufgrund seiner hohen Auflösung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken den NCFPB integrierte Core Facility für Functional Genomics (Taipei, Taiwan) und NRPB Pharmacogenomics Labor (Taipei, Taiwan) für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt von Forschungsstipendien aus Taiwan Health Foundation (L-i.l.) und das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taipei, Taiwan, ROC [die meisten 105-2320-B-002-047] für Hu Wei-Yao, [die meisten 105-2628-B-002-051-MY3] für Kang-Yi Su und] Most-105-2320-B-002-051-MY3] für Liang In Lin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
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