Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

Published: June 19, 2018 doi: 10.3791/57862
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 1, 1, 2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children's Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

En ikke-merket, ikke-radio-isotopanrikning metode for DNA polymerase korrekturlesing og en DNA reparasjon analysen ble utviklet ved hjelp av høy oppløsning MALDI-TOF massespektrometri og en single nukleotid forlengelsen strategi. Analysen viste seg å være svært spesifikke, enkel, rask og lett å utføre for korrekturlesing og reparere patcher kortere enn 9-nukleotider.

Abstract

Vedlikehold av genomet og sin trofaste replikering er avgjørende for bevaring av genetisk informasjon. For å vurdere Hi-Fi replikering, har vi utviklet en enkel ikke-merket og ikke-radio-isotopanrikning metoden bruker en matrix-assistert laser desorpsjon ionization med tid-av-fly (MALDI-TOF) masse massespektrometri (MS) analyse for en korrekturlesing studie. Her, en DNA polymerase [f.eks Klenow fragmentet (KF) av Escherichia coli DNA polymerase jeg (pol jeg) i denne studien] i nærvær av alle fire dideoxyribonucleotide triphosphates brukes til å behandle en primer-mal tosidig. Den feilaktige primeren deretter korrekturlese extended og utsatt for MALDI-TOF MS. Produktene er preget av masse endring av primer til single nukleotid varianter. Viktigst, kan en korrekturlesing også fastsettes for interne enkelt uoverensstemmelser, men på ulik effektivitet. Uoverensstemmelser ligger på 2-4-nukleotider (nt) fra 3 slutten var effektivt korrekturlese av pol jeg, og en konflikt på 5 nt primer terminalen viste bare en delvis korreksjon. Ingen korrektur oppstod for interne uoverensstemmelser i 6-9 nt fra primer 3 slutten. Denne metoden kan også brukes på DNA reparasjon analyser (f.eks vurdere en base-lesjon reparasjon av substrater for endo V reparasjon veien). Grunning som inneholder 3 nest siste deoxyinosine (dI) lesjoner kan rettes ved pol jeg. Faktisk nest siste T-jeg, G-jeg og A-jeg underlag hadde deres siste 2 dI inneholder nukleotider forbrukeravgift av pol jeg før du legger til en riktig ddN 5'-monofosfat (ddNMP) mens nest siste C-jeg uoverensstemmelser ble tolerert av pol I, slik at primeren utvides uten reparere, demonstrere den sensitivitet og oppløsning av MS analysen for å måle DNA-reparasjon.

Introduction

Korrekturlesing funksjonene til DNA polymerases utryddelse er avgjørende for å sikre nøyaktig gjengivelse av genetisk informasjon som må overføres til avkom1,2,3,4, 5,6,7. Å kunne vurdere bidrag av polymerase korrekturlesing exonucleases ville avklare mekanismer ivaretakelse genetisk stabilitet.

Radioisotop merking og gel-baserte analyser i kombinasjon med densitometric analyser av autoradiograms eller fosfor tenkelig8,9,10 har tradisjonelt blitt brukt til å oppdage korrekturlesing aktiviteten av DNA polymerases. Mens funksjonelle, er disse analyser arbeidskrevende, dyrt og ikke mottakelig for høy gjennomstrømming formater. I tillegg lider radioisotopes sikkerhetsforholdene inkludert avfallshåndtering. Alternativt er korrekturlesing aktiviteter analysert av fluorometric teknikker. For eksempel kan 2-aminopurine (2-AP) bli innlemmet i utvidelse produkter under i vitro polymerase korrekturlesing analyser for å produsere en fluorescerende signal11,12. Dessverre lider disse tilnærmingene en lav spesifisitet, siden 2-AP kan koble med både thymine og cytosine. Nyere tilnærmingsmåtene er en følsom G-quadrapleksbilder-baserte selvlysende slå-på sonde for et utvalg 3 - 5' exonuclease analysen13 samt en enkeltvis-merket fluorescerende sonde for et utvalg korrekturlesing analysen som overvinner blant den nevnte ulemper14. Entusiasme for metodene fluorometric er redusert for en bestemt merkingen av DNA underlag.

Derimot en MALDI-TOF MS for DNA analyse har vært ansatt i PinPoint analysen, hvor primer forlengelsen reaksjonene med umerkede 4 ddNTPs kan brukes til å identifisere polymorfismer på en gitt locus15,16,17 og har iverksatt mye kliniske applikasjoner for mutasjon oppdagelser og kreft diagnostiserer18. Bruker disse grunnleggende prinsippene, har vi opprettet en etikett-fri analysen for i vitro fastsettelse av DNA polymerase korrekturlesing aktiviteten utnytte høy oppløsning, høy spesifisitet og høy gjennomstrømming potensialet i MALDI-TOF MS. bruke E. coli DNA polymerase jeg Klenow fragmenter som en modell enzym, dideoxyribonucleotide triphosphates (ddNTPs) som underlag kan ta en "snapshot" korrekturlesing produkter etter en single nukleotid utvidelse via MALDI-TOF MS (figur 1).

Likeledes, denne metoden også utviklet for en DNA reparasjon analysen der primere med 3 nest siste dI lesjoner er utsatt for en pol jeg reparer analysen som imiterer endo V nicked reparasjon mellomprodukter. Mens helt ikke forstått, er endo V reparasjon veien det eneste reparasjon systemet kjent for å ansette pol jeg korrekturlesing exonuclease aktivitet for lesjon excision19,20. Bruker MALDI-TOF MS, vi viser en klart definert reparasjon oppdatering der dI kan kreditert av pol jeg når forekommer i 2 siste nt av primer før du legger til den riktige complemented nukleotid.

For studier av korrekturlesing og DNA-reparasjon, denne metoden er raskere og mindre arbeidskrevende enn tidligere metoder og tilleggsinformasjon mot mekanisme og funksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. primer/mal forberedelse

  1. Utforme primere/maler med balansert G + C innhold mellom 40% og 60% som en sekvensering eller PCR primer design. Bruke primere 18 til 21 nt for en passende avspenning og bedre MS signaler.
  2. Utformingsmal ved å sette 50 ° C minimum smelter temperatur for dobbeltsidig regionen med minst 7 nt 5'-henging skille signalene mellom primer og malen.
    Merk: For eksempel av underlaget P21/T28 i tabell 1, 21-nt primer er sammenkoblet med en 28-nt-mal. Alternativ: bruk av alternativ nukleinsyrer som nuclease-resistente phosphorothioate obligasjoner erstatte de siste 4 phosphodiester obligasjonene på 3 slutten av malen kan forhindre eventuell interferens ved en uspesifisert 3' slutten degradering av maler ( f.eks, T28S4 i tabell 1), men dette vil legge noen kostnader for malen utarbeidelse.
  3. Bruke standard avsalte oligonucleotides uten ytterligere rensing er tilfredsstillende for denne studien. Bruke oligonucleotide primere/maler i en konsentrasjon av 100 pmol/µL i H2O som en aksje og lagre den på 20 ° C. Sjekk kvaliteten og renhet primere og maler ved å kjøre oligonucleotides på MALDI-TOF MS (trinn 4-7) å sikre unike peak signaler og et godt signal til støyforhold.
  4. Bestem de relative MALDI-TOF MS signal intensiteter (trinn 7) lik molar primerne av relevante sekvenser i reaksjonen for kalibrering og konsentrasjon normalisering (figur 2).

2. korrekturlesing reaksjoner

Merk: Samme korrekturlesing reaksjon tilstanden og protokollen gjelder en DNA-reparasjon av A-jeg, G-jeg, C-jeg, og T-jeg.

  1. Bruke T-G mellom substrat P21/T28 for korrektur i tabell 1 som et eksempel, fortynne primer P21 og malen T28 til 12,5 pmol/µL med H2O; deretter overføre 12 µL av utvannet primer og 12 µL av malen utvannet til en 1.5-mL sterilisert microcentrifuge tube.
    Merk: Mal/primer blanding er tilstrekkelig for 2 reaksjoner; proporsjonalt øke volumet av reagensene tilsvarende for flere reaksjoner.
  2. Lukk røret tett. Inkuber det i 30 min i en dekket 65 ° C vannbad, etterfulgt av 30 min i et 37-° C vannbad, og til slutt på is å sikre et riktig avspenning.
  3. Slik 1.5-mL sterilisert microcentrifuge legge til 8 µL av primer og mal blanding (50 pmol), 2 µL av 10 x korrekturlesing reaksjon buffer, 4 µL av 4 ddNTPs mix (2 mM av hver 4 dNTPs) og H2O opp til 18 µL. Flick røret å blande.
    Merk: 1 x korrekturlesing reaksjon buffer inneholder 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol og 10 mM Tris-HCl (pH 7.9 ved 25 ° C). Se Tabellen for materiale for den kommersielle kilden til 10 x korrekturlesing reaksjon buffer. Siste konsentrasjonen av hver ddNTP i reaksjonen er 0,1 mM.
  4. Fortynne DNA polymerase i iskalde 1 x korrekturlesing reaksjon buffer ønsket konsentrasjonen [f.eksslik 1.5-mL microcentrifuge legge 4 µL av 1 x korrekturlesing reaksjon buffer og 1 µL av 5-U Klenow utvalg fra en kommersiell kilde (bord av Materials)]. Lagre utvannet enzymet på is til alle tider.
    Merk: Mengden utvannet DNA polymerase er tilstrekkelig for 2 reaksjoner; proporsjonalt øke volumet av enzymer tilsvarende for flere reaksjoner. En mengde 2.0 µL, som inneholder 2.0 enheter av Klenow utvalg, kan stavekontrollere mer enn halvparten av 50 pmol av T-G terminalen P21/T28 i 5 minutter.
  5. Prewarm microcentrifuge røret med underlaget mix fra trinn 2.3 til ønskede reaksjonen temperatur (f.eks, vanligvis 37 ° C Klenow utvalg og 25 ° C i T4 DNA polymerase). Deretter overføre 2.0 µL av utvannet DNA polymerase fra trinn 2.4 til prewarmed substrat blandingen og flick røret å blande innholdet.
  6. Sentrifuge rør med enzym og underlaget for et par sekunder på 3200 x g ved romtemperatur å spinne ned komponentene av reaksjoner. Øyeblikkelig overføre reaksjonen til en oppvarming blokk eller et vannbad ved ønsket inkubasjon temperatur som i trinn 2.5.
  7. Avslutte reaksjonen
    1. Legge til en lik antall bufrede fenol, bland det med vortexing for et par sekunder og sentrifuge det i en microcentrifuge på 3200 x g ved omgivelsestemperatur i 5 min.
      1. Overføre den vandige fasen til en ren microcentrifuge rør og legge til en lik mengde kloroform, bland det med vortexing for et par sekunder og sentrifuger den i en microfuge på 3200 x g ved omgivelsestemperatur for 3 min. overføre den vandige fasen til en ren microfuge rør og cubate det på 95 ° C i 5 min; deretter plassere den på is.
        Advarsel: Fenol og kloroform er farlige kjemikalier. Håndtering og avfall avhending bør følge institusjonelle forskrifter.
    2. Alternativt bruke en syre slukke protokollen. For dette, legge 2 µL av 1 M HCl å stoppe reaksjonen på is 6 min, og deretter legge 0,64 µL av 1 M diethanolamine (DEA) å nøytralisere pH reaksjonsblandingen å ruge det ved 95 ° C i 5 min; deretter plassere den på is.

3. harpiks tillegg å eliminere Salt forurensning

  1. Ved hjelp av harpiks scoop fra den kommersielle avsalte kit (se Tabell for materiale), ta tilstrekkelig harpiks å dekke gropene av 384-smilehull, 6-mg harpiks smilehull plate.
  2. Fordele harpiks i alle gropene jevnt (6 mg/smilehull) ved skraping øverst på platen. Gjenopprette eventuelt overskytende resin og erstatte den i flasken.
  3. Overføre siste reaksjon produktene fra steg 2,7 fra microfuge rør til en 384-vel plate. Dispensere 16 µL av H2O å fortynne siste reaksjon produktene i hver brønn og forsegle platen og sentrifuge fjerne bobler.
  4. Fjern forseglingen, slå 384-vel platen med reaksjon produktene opp ned for å dekke harpiks fylt smilehull platen.
  5. Snu den godt-å-smilehull plater sandwich og nøye la harpiks slippe inn i 384-vel plate (Husk 384-vel platen er flush mot metall pinnen på harpiks fylt smilehull plate).
  6. Fjerne smilehull platen på toppen, forsegle 384-vel platen inneholder blandinger av reaksjon produktene og harpiks, kort sentrifuge det 3200 x g fjerne bobler og plassere den på et rotator i minst 15 min ved romtemperatur for avsalte innholdet.
  7. Etter harpiks opprydding, sentrifuge 384-vel platen 3200 x g i 5 min komprimere harpiks til bunnen av brønnene.

4. Overfør reaksjon produkter til en matrise-Chip

  1. Angi utvalg platene i nanoliter dispenser (nanodispenser, se Tabellen for materiale).
  2. Sette matrix chip (se Tabell for materiale) og 384-vel plate fra delen 3.7 i tilsvarende skuffen.
  3. Bruke nanodispenser for å se reaksjonen produktene til chip; Trykk på RUN knappen på berøringsskjermen av nanodispenser å starte.
  4. Avmerkingsboksen automatisk bildet av de prøve stedene som inneholder metning informasjon på skjermen for å sikre flekkete volumet på chip er rundt 5-10 nL. Gjenta den prøven småblødninger Hvis volumet er utilstrekkelig.

5. oppsett analysen informasjonen på massespektrometri

  1. Forberede en fil i XLS-format som inneholder forventede signal informasjonen for import. For eksempel bruke innstillingen for "P21_T28.xls" (tabell 2) for korrekturlesing reaksjon P21/T28 i trinn 2, 3 og 4.
  2. Opprette og definere en ny analysen i brukerprogrammet (se Tabell for materiale) ved å høyreklikke Import analysen gruppe i Designer-Format og velg XLS-filen (f.eks"P21_T28.xls" fra trinn 5.1).
  3. Etablere den mål analyse plate via Kunde: prosjekt: Plate alternativet treet til venstre på skjermen ved å høyreklikke toppen av treet og gi det et navn (f.eks"CTT20171201" representerer analysen koden og dato).
  4. Velg 384-vel plate og trykk OK; tomme plater vises.
  5. Velg passende analysen (f.eksP21_T28) på venstre side av skjermen.
  6. Tilordne valgte analysen (f.eksP21_T28) for hver prøve oppdaget prøveposisjon på chip ved å markere brønnen og høyreklikke for å velge Legge til pleksisett.
  7. Forberede en arbeider over alle testene på chip i XLSX format uten overskrift (f.eks, 1201.xlsx i tabell 3). Importere den arbeider liste via alternativet Legg til ny eksempelprosjekt .
  8. Tilordner testen arbeider listen (f.eksfra 1201.xlsx) til hver posisjon til P21_T28 analysen og velg ved å høyreklikke.

6. MALDI-TOF MS operasjon

  1. Koble den masse spectrometer til chip bruke brukerprogrammet (se Tabell for materiale).
  2. Velg standardinnstillingen på høyre side av skjermen.
  3. Fyll ut analysen navnet fra trinn 5.3 (f.eksCTT20171201), chip ID på hjørnet av chip, og lagre innstillingene.
  4. Starte MS kontroll programmet (se Tabell for materiale).
  5. Trykk Inn/ut og ta ut platen speider. Plasser flekkete chip fra trinn 4.4 på speider platen og trykk Inn/ut for flekkete brikken å gå inn i masse spectrometer.
  6. Klikk Hent av brukerprogrammet (se Tabell for materiale) å starte massespektrometri og hente data.

7. dataanalyse

  1. Åpne programmet for dataanalyse (se Tabell for materiale).
  2. Bla gjennom konsolltreet av databasen i øvre venstre hjørne og velg brikke-IDen fra trinn 6.3. Åpne datafilen på høyre side av skjermen.
  3. Klikk ikonet spektrum for å vise mass spekteret. Hvis du vil beskjære et bestemt utvalg av m/z, høyreklikk for å velge Tilpassningsdialogen og klikk på x-aksen i det nye vinduet og sette ønsket øvre og nedre grensen og trykk OK for å vise det angitte området av spekteret.
  4. Eksportere spekteret for journalføring ved å høyreklikke eksportere.
    Merk: Med en skala på 1600 bredde/1200-enheten er en rimelig størrelse for data inspeksjon på en dataskjerm.
    1. Velg filtypen JPEG, klikk på målet, velg Bla platen (f.eksflash-disk E:), skriver du inn filnavnet (f.eks1201-1.jpg) og klikk deretter på Eksporter.
  5. For data kvantifisering, Bruk markøren og klikk på toppen å vise toppen høyden på øverste venstre hjørne.
    1. Alternativt skrive ut en eksportert JPEG-fil og måle peak høyden med en linjal manuelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Maler og primer:

Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, lik molar syntetisk oligonucleotide maler og primere relevante sekvenser fra kommersielle kilder ble sjekket for renhet og kvalitet (figur 3A, Merk signalene matchet utpekte massen og lav bakgrunnen) samt for forholdet mellom topp intensiteten og analytt massen (figur 2A). Topp høydene ble målt og beregnet (figur 2B) for MS data normalisering.

Reaksjon tilstand og masse spectra:

Bruk av enkelt base primer forlengelsen reaksjoner kombinert med MALDI-TOF MS for genotyperingteknologi har tidligere vist seg å være mulig ved hjelp av standard ddNTPs terminatorer17. Korrekturlesing analysen ved hjelp av standard ddNTPs ligner en singleplex reaksjonen av genotyperingteknologi, men er mye enklere og lett å utføre for å få rent og pålitelige resultater.

Til MS spectra dekket alle signaler fra både primere og maler (Figur 3). Riktig design av primer og maler generert en godt atskilt signal profil for både malene og primerne (Figur 3). Ifølge m/z verdien, signaler fra maler og deres ikke-spesifikk delvis nedbrytningsprodukter (m/z > 7000) var frisk adskilt fra umake primerne og korrekturlese produkter (m/z < 7000 i Figur 3). Eventuelt innføre nuclease motstandsdyktig phosphorothioate obligasjoner erstatte de siste 4 phosphodiester obligasjonene på 3 slutten av malen (tabell 1; T28S4/P21) kan redusere ikke-spesifikk mal hydrolyse (Figur 3 g, d27).

I fravær av dNTPs, KF har en robust 3-exonuclease og er i stand til nedverdigende både primer og malen i vitro21. Som de opprinnelige 4 dNTPs hindrer tillegg av 4 ddNTPs en 3 slutten degradering av KF (Figur 3 c og 3E). Likeledes legger filtypen for en nukleotid av 3-økt stabilitet til primer. Bruke pol jeg korrekturlesing forhold som tidligere beskrevet20 med 10 U (46 pmol) KF, mer enn 80% av 50-pmol feil substrater ble korrigert i 5 min (Figur 3 c, 3Eog 3 G).

Mellomprodukter og mekanisme analyse:

MALDI-TOF MS oppløsning kan være så fin som 1, dalton; faktisk kan alle underlag, produkter og mellomprodukter med masse endringer i reaksjonen løses i samme MS spektrum av det merkede området. For eksempel i en terminal T-G mismatch, ble G endestasjonen primer korrigert med innlemmelse av ddA med en m/z forskjell bare 32. Så en m/z forskjell kan lett identifiseres på MS spektrum i en m/z spenner fra 5000 til 7000 (figur 4A). Endring av hver individuelle signal kan beregnes ved å summere opp alle signaler fra umake primer, excision mellomprodukter, og Korrekturles produkter som 100%. For eksempel i T-G korrekturlesing reaksjonen var korrigert produktet i forhold til excision produktet 23% versus 17% 5 minutter, 31% versus 18% 10 minutter og 69% versus 14% 20 minutter (figur 4A).

Når en nest siste T-G konflikt finnes i primer, 2 siste nt bør kreditert etterfulgt av en ddA tillegg å fullføre korreksjon. Faktisk de riktige produktene økt med tiden fra 12% 5 minutter, 28% 10 minutter, 45% 20 minutter av reaksjonen. I tillegg var to former for excision produkter for en nest siste T-G korrektur, 1-nt excision middels og 2-nt excision produkter, lett løses (figur 4B).

Korrekturlesing kinetics med enkelt dNTP:

For E. coli DNA pol I ddNTPs er ikke egnet underlag og bør betraktes som hemmere22. Alternativt vil bruke en enkelt "korrekt" dNTP i korrekturlesing reaksjonen i stedet også undertrykke uspesifisert 3 - 5' exonuclease aktivitet og generering av single nukleotid forlengelsen produktene egnet til MS analyse (figur 5B). Korrekturlesing hastigheten fra reaksjoner som inneholder en enkelt dCTP er omtrent to ganger høyere enn reaksjoner som inneholder de 4 ddNTPs (figur 5A, 5Bog 5 C). Dermed gir bruk av en enkelt "korrekt" dNTP i korrekturlesing analysen et bedre resultat uten hemmende effekten av ddNTPs. Denne tilnærmingen bør gi større følsomhet for korrekturlesing av kinetic analyser.

Korrekturlesing av interne uoverensstemmelser:

MS korrekturlesing analyser bruker KF for interne uoverensstemmelser og identifikasjon av korrekturlese produkter er enkel (dvs.den korrekturlesing exonuclease avgifter nukleotider fra 3 slutten til interne misforholdet primerne), etterfulgt av den tillegg av matchet ddNMP til den excision produkter via polymerase funksjonen genererer korrekturlese produkter kortere enn primer substrater (figur 6). En klar trend korrekturlesing effektivitet ble observert, der KF effektivt korrekturlese uoverensstemmelser i sist, nest siste, 3rd og 4th nukleotider fra 3 slutten primerne (figur 6; Mm1, 2, 3 og 4). Samsvarer på 5 nt fra 3 slutten av primer ble korrigert delvis med < 15% av feil rettelsen og > 15% av primer viste en utvidelse uten korrekturlesing (figur6; MM5). KF mislyktes å korrekturlese uoverensstemmelser på 6, 7, 8 og 9 nt fra 3 slutten av primer (figur 6; MM6, 7, 8 og 9) men utvidet en betydelig andel av underlag (figur 6; PE av MM6, 7, 8 og 9).

Reparasjon av deoxyinosine leksjonen:

I E. colibehandles hovedsakelig deoxyinosine i DNA av endo V repair pathway20,23. Endo V starter reaksjonen ved et snitt på andre phosphodiester bånd 3' av dI lesjonen. Strand pause generert antas å bli brukt av pol jeg for en påfølgende lesjon excision og DNA resynthesis24. Denne fremgangsmåten ble brukt til å teste pol jeg reparer underlag som inneholder dI på 3 nest siste området (tabell 1; Et-jeg, C-I, G-jeg, og T-jeg) å bekrefte denne hypotesen. Reparasjon av 3 nest siste dI tilsvarer for korrekturlesing av nest siste T-G misforholdet (figur 4B og 6. Mm2 oppføring), der 2 siste nt bør være fjernet etterfulgt av et tillegg på en riktig ddNMP å fullføre reparasjonen. MS mønstre tydelig viste pol jeg korrigert heteroduplexes a-jeg, G-jeg, og T-jeg, men med ulik effektivitet (figur 7; RP signaler). Men C-jeg substrat var ildfaste til pol jeg reparer (tabell 1 og figur 7 d og 7E; svært lav RP) og vist primer utvidelsen i stor grad (figur 7 d; PE signal).

Figure 1
Figur 1 . Modell system for korrekturlesing av analysen. En umake primer var herdet som angitt i en mal danner en terminal konflikt (fet). Korrekturlesing exonuclease av DNA polymerase ville oppdage og fjerne den feilaktige nukleotid danner en excision produkt. I nærvær av en DNA-utvalg og fire ddNTPs, er excision produktet utvidet av én base utfyllende til det forrige umake området. Når de utsettes for MALDI-TOF, kan forskjellen i masse umake primer, excision produktene og korrekturlese produktene være løst. (Dette tallet er tilpasset fra Su et al. 25 med tillatelse.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Topp intensitet og oligonucleotide Mass Åtte oligonucleotides fra 17 til 24 nt med sekvenser komplementære til 3 slutten av T28 (tabell 1) ble testet. (A) A blanding av 50 pmol av hver oligonucleotide i 40-µL løsninger ble utsatt for en MS analyse. (B) topp høyde 17 nt ble brukt som 100% for beregning. Forhold signal intensiteten for hver oligonucleotide var gjennomsnittet av seks bestemmelser feilfeltene representerer 1 standardavvik. (Dette tallet er tilpasset fra Su et al. 25 med tillatelse.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Effekten av ulike malutforming. Korrekturlesing reaksjoner ble vurdert med P21 primer danner en terminal T-G konflikt med ulike maler. Korrekturlesing analysen ble utført med 10 U (43 pmol) Klenow utvalg, 50 pmol substrat, og 4 ddNTPs ved 37 ° C i 5 min. (A) dette panelet viser et P21/T32 T-G substrat uten enzym. (B) dette panelet viser en primer forlengelse av en P21/T32 T-A substrat av 3 exonuclease mangelfulle Klenow. PE = primer utvidelse produkt. (C) dette panelet viser en korrekturlesing av P21/T32 T-G underlaget. PP = korrekturlesing produktet; d26, d27, d28 = 3 slutten opprettholdes mal. (D) dette panelet viser et P21/T28 T-G substrat uten enzym. (E) dette panelet viser en korrekturlesing av P21/T28 T-G underlaget. PP = korrekturlesing produktet; d26, d27 = 3 slutten opprettholdes mal. (F) dette panelet viser et P21/T28S4 T-G substrat uten enzym. (G) dette panelet viser en korrekturlesing av P21/T28S4 T-G underlaget. PP = korrekturlesing produktet; EP = excision produkter; D27 = malen fornedrelse biprodukt. (Dette tallet er tilpasset fra Su et al. 25 med tillatelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Gang løpet analyse for excision produkter og korrekturlesing produkter. Korrekturlesing analyser ble utført med 2 U (8,6 pmol) KF og 50 pmol underlag som beskrevet i protokollen. Reaksjonene ble slukket på angitt tid. (A) dette panelet viser en korrekturlesing til en 3 terminal T-G feil; EP = korrekturlesing excision produktet; d18 & d19 = overflødig excision biprodukter; PP = korrekturlesing produkter; P21 = primer. (B) dette panelet viser en korrekturlesing til en 3-nest siste T-G feil; EI-1 = excision mellomliggende; EP-2 = korrekturlesing excision produkter; d18 = overflødig excision biprodukt; PP = korrekturlesing produkter; P21 = primer; Na = natrium ion bundet nukleotider. (Dette tallet er tilpasset fra Su et al. 25 med tillatelse.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Korrekturlesing reaksjon med 4 ddNTPs mot en enkelt dNTP. Korrekturlesing analyser ble utført med 0,1 U (0.43 pmol) KF og 50 pmol underlag som beskrevet i protokollen. Reaksjonene ble slukket på angitt tid. (A) dette panelet viser en korrekturlesing av 3 terminal G-G ikke samsvar med 4 ddNTPs; EP = korrekturlesing excision produktet; PP = korrekturlesing resynthesis produkter; P21G = primer. (B) dette panelet viser en korrekturlesing av 3 terminal G-G ikke samsvar med dCTP; PP = korrekturlesing resynthesis produkter; P21G = primer. (C) korreksjon er gjennomsnittet av tre bestemmelser og feilfeltene representerer 1 standardavvik. Na+ = natrium ion bundet nukleotider. (Dette tallet er tilpasset fra Su et al. 25 med tillatelse.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Korrekturlesing av interne uoverensstemmelser. Korrekturlesing analyser ble utført med 2 U (8,6 pmol) Klenow utvalg og 50 pmol underlag i 37 ° C i 20 minutter som beskrevet i protokollen. Tomme = enzym tom av en MM1 substrat. Mm1 = en P21/T28 T-G substrat; Mm2 til MM9 = underlag med interne uoverensstemmelser, tallene feil posisjon i forhold til 3 slutten. P21 = primere; PR = korrekturlese produkter; PE = utvidet primere; D19 og d20 = overflødig excision biprodukter, numrene representerer størrelsen på nukleotider. (Dette tallet er tilpasset fra Su et al. 25 med tillatelse.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 . Reparasjon av 3 nest siste deoxyinosine lesjoner. Reparasjon analyser ble utført med 2 U Klenow utvalg og 50 pmol underlag i 37 ° C som beskrevet i protokollen trinn 2.3. Reaksjonene ble slukket på angitt tid. Disse skjermbildene viser reaksjoner med (A) T-jeg substrat; (B) G-jeg substrat; (C) A-jeg substrat; og (D) C-jeg substrat. RP = reparasjon produkter; EP = excision produkter; PE = primer utvidelse produkter, Na+ = natrium ion addukter. (E) korreksjon nivåer for T-jeg, G-jeg og A-jeg var gjennomsnittet av tre bestemmelser og feilfeltene representerer 1 standardavvik. Korreksjon nivåene for C-jeg var gjennomsnittet av to bestemmelser. (Dette tallet er tilpasset fra Su et al. 25 med tillatelse.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Underlag Sekvenser Korreksjon effektivitet (pmol)
P21/T32 3-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 17.3
5-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG
P21/T28 3-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 18.4
5-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG
P21/T28S4 3-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 22,9
MM1 5-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG
MM2 3-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 13.5
5-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA
MM3 3-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 16,9
5-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA
MM4 3-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 15.1
5-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA
MM5 3-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 4.2
5-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA
MM6 3-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA < 0.5*
5-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA
MM7 3-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA < 0,5
5-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA
MM8 3-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA < 0,5
5-TACCAGTCAGGACATTGGGAA
LMX 3-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA < 0,5
5-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA
A-JEG 3-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT 8.2
5-TGGTCGCTGGGGAATAIG
C-JEG 3-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT 1.0
5-TGGTCGCTGGGGAATAIG
G-JEG 3-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT 15,4-tommers
5-TGGTCGCTGGGGAATAIG
T-JEG 3-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT 16.6
5-TGGTCGCTGGGGAATAIG

Tabell 1. Korrekturlesing underlag og korrigering effektivitet av Klenow fragment. Denne tabellen viser de fet 4-nukleotider etter 3-malen som inneholder phosphorothioate endringer. Base parene er i fet skrift. De korrekturlesing analyser ble utført med 2 U (8,6 pmol) Klenow utvalg, 50 pmol substrat og 4 ddNTPs ved 37 ° C i 10 min. * disse verdiene er lavere grensene for korrekturlesing nivå fordi bakgrunnsstøyen hindrer nøyaktig anslag over < 1% av den totale masse signaler observert. (Dette tallet er tilpasset fra Su et al. 25 med tillatelse.)

VEL BEGREPET SNP_ID 2-PCRP 1-PCRP AMP_LEN UP_CONF MP_CONF TM PcGC PWARN UEP_DIR UEP_MASS UEP_SEQ EXT1_CALL EXT1_MASS
W1 iPLEX T28 NA NA NA NA NA NA NA F 8524.54 ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA
W1 iPLEX P21 NA NA NA NA NA NA NA F 6495.24 TACCAGTCAGGACGTTGGGAA

Tabell 2. T28_P21.xlsx fil. Innstillingen gjelder figur 3D, 3E, 4Aog 5A.

1201-1
1201-2
1201-3
1201-4
1201-5
1201-6
1201-7

Tabell 3. 1201.xlsx fil. Innstillingen ble brukt for 7 reaksjoner i figur 4A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne studien beskrevet en trinnvis korrekturlesing aktiviteten analysen analysert av valgt kommersielle instrument (se Tabell for materiale) bruker MALDI-TOF MS. De store fordelene inkluderer at primer og malen er etiketten gratis og enkel å utføre, slik at større fleksibilitet i å designe eksperimenter. En stream-lime fullført behandling av 30 korrekturlesing tester vil ta 4 h, inkludert 3 h for å manuelt utføre korrekturlesing reaksjonene og deres opprydding, mens MALDI-TOF MS analyser ved hjelp av nevnte protokollen tar 1 time å fullføre. Den viktigste ulempen med denne metoden er mengden av underlaget kreves for analysen. For å oppnå sterke signaler og konsistente resultater, brukte vi 50 pmol av DNA underlaget i en 20-µL reaksjon; Dermed er mengden av DNA mye høyere enn med radiolabeled DNA eksperimenter8,9,10. Redusere volumer og utvalgsstørrelsen og finjustering MS operasjonen kan redusere mengden av underlaget kreves.

Syntetisk oligonucleotides fra kommersielle kilder kan brukes for korrekturlesing studien direkte uten ytterligere rensing eller behandling. Men anbefales det å sjekke renhet og kvaliteten på DNA av MALDI-TOF MS. Phosphorothioate båndene ble introdusert for å erstatte de siste 4 phosphodiester obligasjonene på 3 slutten av malen (tabell 1) redusere uspesifisert nedbrytning av malen strand (Figur 3 g), om enn på en høyere kostnad per prøve. Interessant, kan signalene fra malen og primer DNA være frisk adskilt av MS i kraft av deres forskjeller i størrelse; Dermed er phosphorothioate endringen ikke nødvendig. I figur 3E, for eksempel alle mulige produkter primer P21 forlengelsen korrekturlesing excision og resynthesis var mindre enn 22 nt (m/z < 7000), mens alle fornedrelse fragmenter fra malen T28 var større enn 24 nt (m/z > 7000 ). Resultatene i figur 4A var fra den samme P21/T28 dobbeltsidig angitt som i figur 3E. En forstørret vinduet m/z 6000-7000 viser bare signaler fra primer DNA uten noen forvirrende signaler fra malen.

Strategien for å bruke primere med filtypen ddNMP viste seg for å være meget stabil, og dermed ddNMP inneholder produkter er gode indikatorer for korrekturlesing analysen. Tillegg av ddNMP excision produkter kan "fryse" korrekturlesing produktene i staten for analyse umiddelbart etter excision. Alternativt er bruke en enkelt riktig dNTP (figur 5B) i stedet for 4 ddNTPs for å undertrykke uspesifisert hydrolytisk aktiviteten til den korrekturlesing exonuclease også mulig.

Stoppe reaksjonene med en standard fenol/kloroform utvinning prosedyre viste seg for å være det beste middel for reaksjon oppsigelse siden, i ett trinn, det gjør reaksjonene stoppes samtidig fjerne protein forstyrrelser. Alternativt viste syre slukke, som er mottakelig for automatisering, så nøytralisert av ikke-metall alkaliske uten en fase separasjon, også pålitelige resultater. Natrium ion addukter (Na+ i Figur 4, 5og 7) er av bekymring, siden de kan øke bakgrunnen og komplisere signal diskriminering. Riktig bruk av rene harpiks kan redusere slike forstyrrelser; Likevel, selv når slike addukter finnes, de har normalt mye mindre topper i forhold til deres overordnede-signal, og denne egenskapen kan brukes til å skille mellom dem (Figur 4, 5og 7). Generelt, topp høyden av natrium addukter ble proporsjonal med store toppene; inkluderingen eller utelatelsen av natrium addukter i beregningen ikke betydelig påvirke kvantifisering resultatene. Derfor for kvantifisering brukte vi store topp høyden for beregningen.

Korrekturlesing eksperimenter beskrevet her tok fordel av interne uoverensstemmelser til å demonstrere viktigheten av exonuclease domenet partisjon analysen av KF26 og detaljert DNA polymerase jeg muligheten til å effektivt korrekturlese misforholdet på opp 4 nt oppstrøms fra primer 3-slutten (figur 5, MM1 - 4) sannsynligvis base-sammenkobling stabilitet i primer-mal veikryss27. Dessuten, brukt denne studien også primere med nest siste deoxyinosine lesjoner for å studere en pol jeg reparasjon av endo V-nicked reparasjon intermediater. Resultatene viste at T-jeg ble reparert mer effektivt enn A-jeg og G-jeg; men C-jeg var ildfaste til pol jeg reparer (tabell 1 og figur 7). Disse resultatene bekrefter at en MALDI-TOF MS analyse kan være svært nyttig for korrekturlesing og ulike kort-patch DNA reparasjon søk28 på grunn av dens høy oppløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker NCFPB integrert kjerne anlegget for funksjonell genomforskning (Taipei, Taiwan) og NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) for deres teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra Taiwan Health Foundation (L-Il) og departementet for vitenskap og teknologi, Taipei, Taiwan, ROC [mest 105-2320-B-002-047] for Wei-Yao Hu, [mest 105-2628-B-002-051-MY3] for Kang-Yi Su og [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] for Liang-i Lin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligonucleotides Mission Biotech (Taiwan)
phosphorothioate modified oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Taiwan)
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs, MA M0210L
Klenow fragment (3'→5' exo-) New England Biolabs, MA M0212L
NEBuffer 2.1 (10X) New England Biolabs, MA B7202S
2', 3' ddATP Trilink Biotechnologies, CA N4001
2', 3' ddGTP Trilink Biotechnologies, CA N4002
2', 3' ddTTP Trilink Biotechnologies, CA N4004
2', 3' ddCTP Trilink Biotechnologies, CA N4005
dATP, dGTP, dCTP, dTTP set Clubio, Taiwan CB-R0315
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA #01509
MassARRAY Agena Bioscience, CA
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA #10145
Clean Resin Tool Kit Agena Bioscience, CA #08040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
  2. Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
  3. Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
  4. Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
  5. Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
  6. Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
  7. Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
  8. Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
  9. Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
  10. Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
  11. Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
  12. Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).
  13. Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
  14. Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
  15. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  16. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
  17. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
  18. Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
  19. Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
  20. Lee, C. C., et al. The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
  21. Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
  22. Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
  23. Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
  24. Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
  25. Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
  26. Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
  27. Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
  28. Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).

Tags

Biokjemi problemet 136 DNA polymerase korrekturlesing DNA-reparasjon MALDI-TOF massespektrometri single nukleotid forlengelsen dideoxyribonucleotide trifosfat DNA mismatch DNA replikasjonsfeil
Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Su, K. Y., Goodman, S. D., Lai, H.… More

Su, K. Y., Goodman, S. D., Lai, H. M., Yen, R. S., Hu, W. Y., Cheng, W. C., Lin, L. I., Yang, Y. C., Fang, W. H. Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57862, doi:10.3791/57862 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter