Summary
En icke-märkt, icke-radio-isotopiska metod för DNA-polymeras korrekturläsning och en DNA reparation analys utvecklades med hjälp av högupplösta MALDI-TOF masspektrometri och en enda nukleotid förlängning strategi. Analysen visade sig vara mycket specifika, enkel, snabb och lätt att utföra för korrekturläsning och reparera patchar kortare än 9-nukleotider.
Abstract
Underhåll av genomet och dess trogna replikering är avgörande för att bevara genetisk information. För att bedöma HiFi replikering, vi har utvecklat en enkel icke-märkt och icke-radio-isotopiska metoden använder en matris-assisted laser desorption jonisering med time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) analys för en korrekturläsning studie. Här, en DNA-polymerase [t.ex. Klenow fragmentet (KF) av Escherichia coli DNA-polymerase jag (pol jag) i denna studie] i närvaro av alla fyra dideoxyribonucleotide-trifosfater används för att bearbeta en omaka primer-mall duplex. Felmatchade primern är sedan korrekturläsa och utökade och utsätts för MALDI-TOF MS. Produkterna kännetecknas av massa ändringen av primern ner till enda nukleotid variationer. Ännu viktigare, kan en korrekturläsning också bestämmas för interna enda missmatchningar, om än vid olika effektivitetsvinster. Missmatchningar ligger på 2-4-nukleotider (nt) från 3' slutet var effektivt korrekturläsa av pol jag, och en obalans på 5 nt från primer slutstationen visade endast en delvis korrigering. Ingen korrekturläsning uppstod för interna oförenligheter ligger på 6-9 nt från primer 3' slutet. Denna metod kan också tillämpas på DNA reparation analyser (t.ex. bedömningen av en base-lesion reparation av substrat för endo V reparation vägen). Primers som innehåller 3' näst sista deoxyinosine (dI) lesioner kan rättas av pol jag. Ja, näst sista T-I, G-I, och A-jag substrat hade sin sista 2 dI-innehållande nukleotider censurerade av pol jag innan du lägger till en rätt ddN 5'-monofosfat (ddNMP) medan näst sista C-jag missmatchningar tolererades av pol I, så att primern förlängas utan reparation, visar känslighet och upplösning av MS test för att mäta DNA-reparation.
Introduction
DNA-polymerases under DNA-replikation korrekturläsning funktioner är avgörande för hög trohet av genetisk information som behöver överföras till avkomman1,2,3,4, 5,6,7. Att kunna bedöma bidragen av polymeras korrekturläsning exonucleases skulle klargöra mekanismerna skydda genetiska stabilitet.
Radioisotop märkning och gel-baserade analyser i kombination med Densitometrisk analyser av autoradiograms eller fosfor imaging8,9,10 har traditionellt använts för att upptäcka korrekturläsning aktivitet av DNA polymeraser. Medan funktionell, finns dessa analyser mödosamma, dyra och inte mottaglig för hög genomströmning format. Dessutom lider radioisotoper säkerhetsfrågor inklusive bortskaffande av avfall. Alternativt, korrekturläsning aktiviteter har analyserats av fluorometric tekniker. 2-aminopurine (2-AP) kan exempelvis ingå i tillägget produkter under in vitro- polymeras korrekturläsning analyser för att producera en fluorescerande signal11,12. Tyvärr lider dessa synsätt en låg specificitet, eftersom 2-AP kan parkoppla med både tymin och cytosin. Nyare metoder innehålla en känslig G-quadruplex-baserade självlysande påsättning sond för ett polymeras 3' - 5' exonuclease assay13 samt en ensamma-märkt fluorescerande sond för ett polymeras korrekturläsning analys som övervinner några av de ovan nämnda nackdelarna14. Entusiasm för dessa fluorometric metoder minskas på grund av behovet av särskilda märkning av DNA substrat.
Däremot en MALDI-TOF MS för DNA-analys har varit anställd i PinPoint-analysen, där primer filändelsen reaktionerna med omärkt 4 ddNTPs kan användas för att identifiera polymorfismer vid en viss locus15,16,17 och allmänt har antagits i kliniska tillämpningar för mutation upptäckter och cancer diagnoser18. Med dessa grundläggande principer, har vi skapat en etikett-gratis test för in vitro- bestämning av DNA-polymeras korrekturläsning aktivitet som utnyttjar hög upplösning, hög specificitet och hög genomströmning potential av MALDI-TOF MS. med E. coli DNA-polymeras som jag Klenow fragmentet som en modell enzym, dideoxyribonucleotide trifosfater (ddNTPs) som substrat kan ta en ”ögonblicksbild” av korrekturläsning produkter efter en enda nukleotid förlängning via MALDI-TOF MS (bild 1).
Likaså utvecklades denna metod också för en DNA reparation analys där primers innehållande 3' näst sista dI lesioner utsätts för en pol jag reparera assay som härmar endo V nicked reparation intermediärer. Medan inte helt klarlagda, är endo V reparation stigen bara reparera systemet känt att anställa pol jag korrekturläsning exonuclease aktivitet för lesionen excision19,20. Använda MALDI-TOF MS, vi visar en klart definierad lagningslapp där dI kan vara censurerade av pol I när som förekommer i de sista 2 nt av primer innan du lägger den rätta kompletteras nukleotid.
För att studera korrekturläsning och DNA-reparation, denna metod är snabbare och mindre arbetskrävande än tidigare metoder och ger ytterligare information mot mekanism och funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer/mall förberedelse
- Utforma primers/mallar med en balanserad G + C innehåll mellan 40% och 60% som en sekvensering eller PCR primer design. Använda primers 18 till 21 nt för en lämplig glödgning och bättre MS signaler.
- Utforma mallen genom att ställa in 50 ° C som den lägsta smälttemperaturen för regionen duplex med minst 7 nt av 5'-överhäng att separera signalerna mellan grundfärgens och mallen.
Obs: till exempel för substratet P21/T28 i tabell 1, 21-nt primern är parkopplad med en 28-nt-mall. Alternativ: användning av alternativa nucleic syror såsom nuclease-resistenta phosphorothioate obligationer att ersätta de 4 sista phosphodiester obligationerna i 3' slutet av mallen kan förhindra eventuell inblandning av en icke-specifik 3' slutet degradering av mallar ( e.g., T28S4 i tabell 1), även om detta kommer att lägga vissa kostnader för mallen beredning. - Använder standard desalted oligonukleotider utan ytterligare rening är tillfredsställande för denna studie. Använda oligonukleotiden primers/mallar med en koncentration på 100 pmol/µL i H2O som en stock och lagra den på-20 ° C. Kontrollera kvalitet och renhet av primers och mallar genom att köra oligonukleotider på MALDI-TOF MS (steg 4-7) att säkerställa unika peak signaler och en bra signal-brus-förhållande.
- Fastställa de relativa MALDI-TOF MS signal intensitet (steg 7) lika molar primers av relevanta sekvenser i reaktionen för kalibrering och koncentration normalisering (figur 2).
2. korrekturläsning reaktioner
Obs: Samma korrekturläsning reaktion skick och protokoll gäller en DNA-reparation av A-I, G-c-jag och T-jag.
- Använda en T-G obalans av substrat P21/T28 för korrekturläsningen i tabell 1 som exempel, späd primern P21 och mall T28 till 12,5 pmol/µL med H2O; sedan överföra 12 µL utspädd primer och 12 µL utspädda mallen till ett 1,5 mL steriliserat mikrocentrifug rör.
Obs: Mängden mall/primer mix räcker för 2 reaktioner; proportionellt öka volymen av reagenser med detta för flera reaktioner. - Stäng röret ordentligt. Inkubera det i 30 min i en täckt 65-° C vattenbad, följt av 30 min i ett 37-° C-vattenbad, och slutligen på is för att säkerställa en korrekt glödgning.
- Till ett 1,5 mL steriliserat mikrocentrifug rör, tillsätt 8 µL av primer och mall mix (50 pmol), 2 µL 10 x korrekturläsning reaktion buffert, 4 µL av 4 ddNTPs mix (2 mM av varje 4 dNTP) och H2O upp till 18 µL. Svep röret att blanda.
Obs: 1 x korrekturläsning reaktion bufferten innehåller 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM Ditiotreitol och 10 mM Tris-HCl (pH 7,9 vid 25 ° C). Se Tabell för material för den kommersiella källan 10 x korrekturläsning reaktion buffert. Den slutliga koncentrationen av varje ddNTP i reaktionen är 0,1 mM. - Späd ut DNA-polymeras iskall 1 x korrekturläsning reaktion buffert till önskad koncentration [t.ex., i en 1,5 mL mikrocentrifug rör, tillsätt 4 µL av 1 x korrekturläsning reaktion buffert och 1 µL 5-U Klenow polymeras från en kommersiell källa (tabell för Materials)]. Lagra enzymet utspädda på isen hela tiden.
Obs: Mängden utspädda DNA-polymeras räcker för 2 reaktioner; proportionellt öka volymen av enzymer med detta för flera reaktioner. En volym av 2.0 µL, som innehåller 2,0 enheter med Klenow polymeras, kan korrekturläsa mer än hälften av 50 pmol av T-G terminal inkompatibla P21/T28 i 5 min. - Prewarm mikrocentrifug röret med substrat mix från steg 2,3 till önskad reaktion temperatur (t.ex., vanligtvis 37 ° C för Klenow polymeras och 25 ° C för T4 DNA-polymeras). Sedan överför 2.0 µL av den utspädda DNA-polymerasen från steg 2,4 till förvärmd substrat blandningen och svep röret för att blanda innehållet.
- Centrifugera rören med enzym och substrat för några sekunder vid 3,200 x g vid rumstemperatur att snurra ner komponenterna i reaktionerna. Omedelbart överföra reaktion vid ett värmeblock eller vattenbad vid önskad inkubation temperatur som i steg 2.5.
-
Avsluta reaktionen
- Tillsätt en motsvarande volym av buffrad fenol, blanda det genom vortexa för några sekunder och centrifugera det i en mikrocentrifug vid 3,200 x g vid omgivande temperatur under 5 minuter.
- Överföra vattenfasen till en ren mikrocentrifug rör och tillsätt en motsvarande volym av kloroform, blanda det med vortexa under några sekunder och centrifugera det i en microfuge vid 3,200 x g vid omgivningstemperatur för 3 min. överföra vattenfasen till en ren mikrofugrör och i cubate det vid 95 ° C i 5 min; Placera det på is.
Varning: Fenol och kloroform är farliga kemikalier. Hantering och avfall avfallshantering bör följa institutionella föreskrifter.
- Överföra vattenfasen till en ren mikrocentrifug rör och tillsätt en motsvarande volym av kloroform, blanda det med vortexa under några sekunder och centrifugera det i en microfuge vid 3,200 x g vid omgivningstemperatur för 3 min. överföra vattenfasen till en ren mikrofugrör och i cubate det vid 95 ° C i 5 min; Placera det på is.
- Alternativt använda en syra dämpar protokoll. För detta, tillsätt 2 µL av 1 M HCl stoppa reaktionen på is i 6 min, sedan lägga 0.64 µL av 1 M dietanolamin (DEA) för att neutralisera pH-värdet i reaktionsblandningen och inkubera det vid 95 ° C i 5 min; Placera det på is.
- Tillsätt en motsvarande volym av buffrad fenol, blanda det genom vortexa för några sekunder och centrifugera det i en mikrocentrifug vid 3,200 x g vid omgivande temperatur under 5 minuter.
3. harts förutom att eliminera Salt kontaminering
- Med hjälp av harts scoop från den kommersiella avsaltning kit (se Tabell för material), ta tillräcklig harts att täcka gropar av 384-dimple, 6 mg harts dimple plattan.
- Fördela massan över alla gropar jämnt (6 mg/dimple) genom att skrapa över toppen av plattan. Återställa eventuella överskott harts och ersätta det i flaskan.
- Överföra slutliga reaktionsprodukterna från steg 2,7 från microfuge rören till en plattan med 384 brunnar. Dispensera 16 µL av H2O att späda ut de slutliga reaktionsprodukterna i varje brunn och sedan täta plattan och centrifugera för att ta bort eventuella bubblor.
- Ta bort förseglingen, vänd 384-väl plattan med reaktionsprodukterna uppochned för att täcka harts fyllda dimple plattan.
- Vänd väl-att-dimple plattor smörgås och försiktigt låta kådan släppa till plattan med 384 brunnar (vara säker på plattan med 384 brunnar är spola mot metall pinnen på harts fyllda dimple plattan).
- Ta bort dimple plattan ovanpå, försegla 384-väl plattan som innehåller blandningar av reaktionsprodukterna och kåda, kort Centrifugera det 3,200 x g att ta bort eventuella bubblor och placera den på en rotator för minst 15 minuter vid rumstemperatur för avsaltning dess innehåll.
- Efter harts rensningen, Centrifugera 384-väl plattan vid 3,200 x g i 5 min till kompakt kådan till botten av brunnarna.
4. över reaktionsprodukter till en Matrix Chip
- Ställa in provet plattorna i nliter dispensern (nanodispenser, se Tabell för material).
- Put matrix chip (se Tabell av material) och 384-väl plattan från avsnitt 3.7 i motsvarande fack.
- Använda nanodispenser för att upptäcka reaktionsprodukterna till chip; Tryck på knappen Kör på pekskärmen av nanodispenser att starta.
- Kontrollera den automatisera tagna bilden av de prov som innehåller mättnad information på skärmen för att säkerställa den övergripande fläckig volymen på chip är runt 5-10 nL. Upprepa de prov spotting om volymen är otillräcklig.
5. installationsprogrammet Assay informationen på masspektrometri
- Förbereda en fil i .xls-format som innehåller den förväntade Signalinformation för import. Till exempel använda inställningen av ”P21_T28.xls” (tabell 2) för korrekturläsning reaktionen av P21/T28 i steg 2, 3 och 4.
- Skapa och definiera en ny analys i programmet (se Tabell för material) genom att högerklicka på Import Assay gruppen i Designer Format och välj .xls-filen (t.ex., ”P21_T28.xls” från steg 5.1).
- Fastställa det mål assay plattan via Kund: projekt: plattan alternativet trädet på vänster sida av skärmen genom att högerklicka på toppen av trädet och ge den ett filnamn (t.ex., ”CTT20171201” representerar assay kod och datum).
- Välj plattan med 384 brunnar och tryck på OK. en blank nummerplåt visas.
- Välj en lämplig analys (t.ex., P21_T28) på vänster sida av skärmen.
- Tilldela den valda analysen (t.ex., P21_T28) för varje prov som fläckig provposition på chip genom att markera brunnen och högerklicka för att välja Lägg till Plex.
- Förbereda en arbetande lista över alla tester på chip i .xlsx format med ingen header (t.ex., 1201.xlsx i tabell 3). Importera den arbetande lista via alternativet Lägg till nytt prov projekt .
- Tilldela varje position P21_T28 analysens testet i listan arbetar (t.ex., från 1201.xlsx) och välja genom att högerklicka.
6. MALDI-TOF MS drift
- Länka masspektrometer till chip med hjälp av programmet (se Tabell för material).
- Välj standardinställningen på höger sida av skärmen.
- Fyll i namnet assay från steg 5.3 (t.ex., CTT20171201), chip ID i hörnet av chipet, och spara inställningarna.
- Starta kontrollprogrammet MS (se Tabell för material).
- Tryck på knappen Och utcheckning och ta ut scout plattan. Placera det fläckig chipet från steg 4,4 på scout plattan och tryck på knappen Utcheckning för fläckig chip ange masspektrometer.
- Klicka på knappen förvärva av programmet (se Tabell för material) för att starta masspektrometri och uppkopplingstyp.
7. dataanalys
- Öppna programmet för dataanalys (se Tabell för material).
- Titta igenom trädet av databasen på det övre vänstra hörnet och välj chip ID från steg 6.3. Öppna datafilen på höger sida av skärmen.
- Klicka på ikonen spektrum för att Visa masspektrum. Om du vill beskära ett visst intervall av m/z, högerklicka för att markera Anpassning dialogrutan och klicka på x-axeln i det nya fönstret och ange önskad övre och nedre gränsen och tryck OK för att visa det angivna intervallet av spektrumet.
- Exportera spektrumet för registerhållning genom att högerklicka på Exportera.
Obs: Med hjälp av en skala av 1 600 bredd/1.200 enhet är en rimlig storlek för uppgiftskontroll på en datorskärm.- Välj vilken JPEG-fil, klicka på Destination, Välj Bläddra skivan (t.ex.,-skiva E:), skriv filnamnet (t.ex., 1201-1.jpg) och klicka sedan på Exportera.
- För data kvantitering, Använd markören och klicka på topp att Visa topphöjden på övre vänstra hörnet.
- Alternativt, Skriv ut en exporterade JPEG-filen och mäta peak höjden med en linjal manuellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mallar och grundfärger:
Använda proceduren presenteras här, lika molar syntetiska oligonukleotiden mallar och primers av relevanta sekvenser från kommersiella källor kontrollerades för sin renhet och kvalitet (figur 3A; Obs signalerna matchade utsedda massan och den låg bakgrunden) samt för förhållandet mellan maximal intensitet och analyt massan (figur 2A). De toppar mättes och beräknas (figur 2B) för MS datanormalisering.
Reaktion villkor och massa spectra:
Användning av enda bas primer filändelsen reaktioner kombination med MALDI-TOF MS för genotypning har tidigare visat sig vara genomförbart med standard ddNTPs terminators17. Korrekturläsning analysen använder standard ddNTPs liknar en singleplex reaktion av genotypning men är mycket enklare och mycket lätt att utföra för att få rent och pålitligt resultat.
MS spektra omfattas alla de signaler som genereras från både grundfärger och mallar (figur 3). Den ordentlig designen av primers och mallar genereras en väl separerade signal profil för både mallar och primers (figur 3). Enligt värdet m/z, signaler från mallar och deras icke-specifik partiell nedbrytningsprodukter (m/z > 7,000) var väl åtskilda från inkompatibla primers och korrekturläsa produkter (m/z < 7.000 i figur 3). Om nödvändigt, att införa nuclease resistenta phosphorothioate obligationer för att ersätta de 4 sista phosphodiester obligationerna i 3' slutet av mallen (tabell 1; T28S4/P21) kan minska icke-specifik mall hydrolys (figur 3 g; d27).
I avsaknad av dNTP, KF har en robust 3'-exonuclease och kan försämra både primer och den mall in vitro-21. Som de infödda 4 dNTP förhindrar tillägg av de 4 ddNTPs en 3' slutet degradering av KF (figur 3 c och 3E). Likaså lägger en en nukleotid-tillägget 3'-änden ökad stabilitet på primern. Använda pol jag korrekturläsning villkor som tidigare beskrivs20 med 10 U (46 pmol) KF, mer än 80% av de 50-pmol omaka substratesna korrigerades i 5 min (figur 3 c, 3Eoch 3 G).
Intermediärer och mekanism analys:
MALDI-TOF MS upplösning kan vara lika bra som 1 dalton; faktiskt kan alla substrat, produkter och mellanprodukter med massa ändringar i reaktionen lösas i samma MS spektrum i det markerade området. Till exempel en terminal T-G felmatchning korrigerades felmatchade G på primer terminus med inkorporeringen av utvecklingsagendan från Doha med en m/z skillnad på bara 32. Sådan en m/z skillnad kan lätt identifieras på MS spektrumet i en m/z varierar från 5 000 till 7 000 (figur 4A). Ändringen av varje enskild signal kan beräknas genom att summera alla signaler från den inkompatibla primern, excision intermediärer, och korrekturläsa produkter som 100%. Till exempel i T-G korrekturläsning reaktionen var den korrigera produkten i förhållande till produktens excision 23% jämfört med 17% på 5 min, 31% jämfört med 18% vid 10 min och 69% jämfört med 14% på 20 min (figur 4A).
När en näst sista T-G obalans är närvarande i primern, de sista 2 nt bör vara censurerade följt av en ddA tillägg att slutföra korrigering. Faktiskt rätt produkter ökade med tiden från 12% efter 5 min, 28% på 10 min, 45% vid 20 min reaktion. Dessutom var två former av excision produkter för en näst sista T-G korrekturläsning, 1-nt excision mellanliggande och 2-nt excision produkterna, enkelt matchas (figur 4B).
Korrekturläsning kinetik med enda dNTP:
För E. coli DNA pol, ddNTPs är inte lämpliga substrat och bör betraktas som hämmare22. Alternativt undertrycka använda en enda 'rätt' dNTP i korrekturläsning reaktionen istället också ospecifika 3' - 5' exonuclease aktivitet och generering av enda nukleotid förlängning produkter lämpliga för MS analys (figur 5B). Den korrekturläsning räntesats som erhållits från reaktioner som innehåller en enda dCTP är cirka två gånger högre än reaktioner som innehåller de 4 ddNTPs (figur 5A, 5Boch 5 C). Således, användning av en enda 'rätt' dNTP i korrekturläsning analysen ger ett bättre resultat utan de hämmande effekterna av ddNTPs. Denna strategi bör ge större känslighet för korrekturläsning kinetiska analyser.
Korrekturläsning av interna avvikelser:
MS korrekturläsning analyser med KF för interna missmatchningar och korrekturläsa Produktidentifikationen är enkla (dvs.den korrekturläsning exonuclease punktskatter nukleotider från slutet 3' till den inre obalansen av primers), följt av den tillägg av matchade ddNMP till den excision produkter via den polymeras funktionen generera korrekturläsa produkter kortare än de primer substratesna (figur 6). En tydlig trend för korrekturläsning effektivitet observerades, där KF effektivt korrekturläsa missmatchningar på sist, näst sista, 3rd och 4th nukleotider från 3' ände primers (figur 6. MM1, 2, 3 och 4). Glapp på 5 nt från 3' ände primern korrigerades delvis med < 15% av mismatch korrigering och > 15% av primern visade en förlängning utan korrekturläsning (figur6. MM5). KF misslyckades att korrekturläsa missmatchningar placerad vid 6, 7, 8 och 9 nt från 3' ände primern (figur 6. MM6, 7, 8 och 9) men ändå utökat en betydande andel av substrat (figur 6. PE av MM6, 7, 8 och 9).
Reparation av deoxyinosine lesion:
I E. colibehandlas deoxyinosine i DNA främst av endo V reparation väg20,23. Endo V initierar reaktionen genom ett snitt på den andra phosphodiester bond 3' av dI lesionen. Strand bryta genereras tros användas av pol I för en efterföljande lesion excision och DNA resynthesis24. Detta förfarande användes för att testa pol jag reparera substrat som innehåller dI på 3' näst sista plats (tabell 1; En-c-I, G-jag och T-jag) att validera denna hypotes. Reparation av den näst sista dI 3' är jämförbar med korrekturläsningen av den näst sista T-G obalansen (figur 4B och 6; Mm2 intrade), där de sista 2 nt bör bort följt av ett tillägg av en rätt ddNMP att slutföra reparationen. MS mönster visade tydligt pol jag korrigerade heteroduplexer av A-I, G-jag och T-jag, om än med olika effektivitetsvinster (figur 7. RP signaler). Dock C-jag substrat var refraktära mot den pol som jag reparera (tabell 1 och figur 7 d och 7E; mycket låg RP) och visat tillägget primer i stor utsträckning (figur 7 d; PE-signal).
Figur 1 . Modell för korrekturläsning analys. En omaka primer var glödgas som anges till en mall som bildar en terminal obalans (fetstil). Korrekturläsning exonuclease DNA-polymeras skulle upptäcka och ta bort den avvikande nukleotid bildar en excision produkt. I närvaro av en DNA-polymeras och fyra ddNTPs förlängs excision produkten med en enda bas som komplement till den föregående inkompatibla platsen. När de utsätts för MALDI-TOF, kan skillnaden i massa mellan inkompatibla primer, excision produkterna och korrekturläsa produkterna lösas. (Denna siffra är anpassade från Su o.a. 25 med tillstånd.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Maximal intensitet och oligonukleotiden mass. Åtta oligonukleotider från 17 till 24 nt med sekvenser kompletterande 3' ände T28 (tabell 1) testades. (A) A blandning av 50 pmol för varje oligonukleotiden i 40-µL lösningar utsattes för en MS-analys. (B), topphöjd 17 nt användes som 100% för beräkningen. Den relativa signalintensitet för varje oligonukleotiden var genomsnittet av sex bestämningar och felstaplar representera 1 standardavvikelse. (Denna siffra är anpassade från Su o.a. 25 med tillstånd.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Effekten av olika malldesign. Korrekturläsning reaktioner bedömdes med P21 primern bildar en terminal T-G obalans med olika mallar. Korrekturläsning analysen utfördes med 10 U (43 pmol) Klenow polymeras, 50 pmol substrat och 4 ddNTPs vid 37 ° C i 5 min. (A) denna panel visar ett P21/T32 T-G substrat utan enzym. (B) denna panel visar en primer förlängning av ett P21/T32 T-A substrat av 3' exonuclease bristfällig Klenow. PE = primer filändelsen produkt. (C) i denna panel visas en korrekturläsning av P21/T32 T-G substrat. PP = korrekturläsning produkt; D26, d27, d28 = 3' slutet-degraderad mall. (D), denna panel visar ett P21/T28 T-G substrat utan enzym. (E) i denna panel visas en korrekturläsning av P21/T28 T-G substrat. PP = korrekturläsning produkt; D26, d27 = 3' slutet-degraderad mall. (F) panelen visar ett P21/T28S4 T-G substrat utan enzym. (G) i denna panel visas en korrekturläsning av P21/T28S4 T-G substrat. PP = korrekturläsning produkt; EP = excision produkter; D27 = mall nedbrytning biprodukt. (Denna siffra är anpassade från Su o.a. 25 med tillåtelse). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Tid kursen analys för excision och korrekturläsning produkter. Korrekturläsning analyser utfördes med 2 U (8,6 pmol) KF och 50 pmol substrat som beskrivs i protokollet. Reaktionerna var härdas på den angivna tider. (A) i denna panel visas en korrekturläsning av en 3' terminal T-G obalans; EP = korrekturläsning excision produkt; D18 & d19 = överskott excision biprodukter. PP = korrekturläsning produkter; P21 = inkompatibla primer. (B) i denna panel visas en korrekturläsning av en 3'-näst sista T-G obalans; EI-1 = excision mellanliggande; EP-2 = korrekturläsning excision produkter; D18 = överskott excision biprodukt; PP = korrekturläsning produkter; P21 = inkompatibla primer; Na = natrium ion bunden nukleotider. (Denna siffra är anpassade från Su o.a. 25 med tillstånd.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Korrekturläsning reaktion med 4 ddNTPs kontra en enda dNTP. Korrekturläsning analyser utfördes med 0,1 U (0,43 pmol) KF och 50 pmol substrat som beskrivs i protokollet. Reaktionerna var härdas på den angivna tider. (A) i denna panel visas en korrekturläsning av en 3' terminal G-G obalans med 4 ddNTPs; EP = korrekturläsning excision produkt; PP = korrekturläsning resynthesis produkter; P21G = inkompatibla primer. (B) i denna panel visas en korrekturläsning av en 3' terminal G-G obalans med dCTP; PP = korrekturläsning resynthesis produkter; P21G = inkompatibla primer. (C) korrigeringen nivåer är genomsnittet av tre bestämningar och felstaplar representera 1 standardavvikelse. Na+ = natrium ion bunden nukleotider. (Denna siffra är anpassade från Su o.a. 25 med tillstånd.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Korrekturläsning interna oförenligheter. Korrekturläsning analyser utfördes med 2 U (8,6 pmol) Klenow polymeras och 50 pmol substrat i 37 ° C i 20 min som beskrivs i protokollet. Blank = enzym tom av en MM1 substrat. MM1 = ett P21/T28 T-G substrat; Mm2 till MM9 = substrat med interna oförenligheter, siffrorna anger matchningsfel position i förhållande till 3' slutet. P21 = inkompatibla grundfärger; PR = korrekturläsa produkter; PE = utökade grundfärger; D19 och d20 = överskott excision biprodukter, siffrorna representerar storleken på nukleotider. (Denna siffra är anpassade från Su o.a. 25 med tillstånd.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 . Reparation av 3' näst sista deoxyinosine lesioner. Reparation analyser utfördes med 2 U Klenow polymeras och 50 pmol substrat i 37 ° C enligt protokollet steg 2,3. Reaktionerna var härdas på den angivna tider. Dessa paneler Visa reaktioner med (A), T-jag substratet; (B), G-jag substratet; (C) A-jag substratet; och (D), C-jag substrat. RP = reparera produkter; EP = excision produkter; PE = primer filändelsen produkter, Na+ = natrium ion addukter. (E) korrigeringen nivåer för T-I, G-I, och A-jag var genomsnittet av tre bestämningar och felstaplar representera 1 standardavvikelse. Korrigering nivåerna för C-jag var medelvärdet av två bestämningar. (Denna siffra är anpassade från Su o.a. 25 med tillstånd.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Substrat | Sekvenser | Korrigering effektivitet (pmol) | |
| P21/T32 | 3'-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 17,3 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 18,4 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28S4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 22,9 | |
| MM1 | 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | ||
| MM2 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 13,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA | |||
| NMP | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 16,9 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA | |||
| MM4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 15,1 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA | |||
| MM5 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 4.2 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA | |||
| MM6 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5* | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA | |||
| MM7 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA | |||
| MM8 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACATTGGGAA | |||
| MM9 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA | |||
| A-JAG | 3'-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT | 8,2 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| C-JAG | 3'-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT | 1.0 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| G-JAG | 3'-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT | 15,4 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| T-JAG | 3'-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT | 16,6 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
Tabell 1. Korrekturläsning substrat och korrigering effektivitet av Klenow fragmentet. Den här tabellen visar de djärva 4-nukleotiderna i 3'-slutet av mallen som innehåller phosphorothioate ändringar. Felmatchade basparen är i fetstil. Korrekturläsning analyserna utfördes med 2 U (8,6 pmol) Klenow polymeras, 50 pmol substrat och 4 ddNTPs vid 37 ° C i 10 min. * dessa värden är de lägsta gränserna för korrekturläsning nivå eftersom bakgrund buller förhindrar korrekta skattningar av < 1% av den totala massa signaler observerats. (Denna siffra är anpassade från Su o.a. 25 med tillstånd.)
| VÄL | SIKT | SNP_ID | 2: A-PCRP | 1ST-PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | TM | PcGC | PWARN | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_CALL | EXT1_MASS |
| W1 | iPLEX | T28 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 8524.54 | ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | |||
| W1 | iPLEX | P21 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 6495.24 | TACCAGTCAGGACGTTGGGAA | |||
Tabell 2. T28_P21.xlsx fil. Inställningen användes för figur 3D, 3E, 4Aoch 5A.
| 1201-1 |
| 1201-2 |
| 1201-3 |
| 1201-4 |
| 1201-5 |
| 1201-6 |
| 1201-7 |
Tabell 3. 1201.xlsx fil. Inställningen användes för 7 reaktioner i figur 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie beskrivs en steg för steg korrekturläsning aktivitet assay analyseras av valda kommersiella instrumentet (se Tabell för material) med MALDI-TOF MS. De stora fördelarna inkluderar att primer och mallen är etikett gratis och enkelt att utföra, vilket möjliggör större flexibilitet i utformningen av experiment. En ström-lime komplett bearbetning av 30 korrekturläsning tester skulle ta 4 h, inklusive 3 h för att manuellt utföra korrekturläsning reaktionerna och deras rensning, medan de MALDI-TOF MS analyser med hjälp av ovan nämnda protokollet tar 1 timme att slutföra. Den främsta nackdelen med denna metod är mängden substrat behövs för analysen. För att få starka signaler och konsekventa resultat, använde vi 50 pmol DNA substrat i en 20-µL reaktion; Således, mängden DNA är mycket högre än med radioaktivt märkt DNA experiment8,9,10. Att minska volymerna och urvalets storlek och finjustering MS operationen kan sänka mängden substrat krävs.
Syntetiska oligonukleotider erhållits från kommersiella källor kan användas för korrekturläsning studien direkt utan ytterligare rening eller behandling. Det är dock lämpligt att kontrollera renhet och kvalitet av DNA av MALDI-TOF MS. Phosphorothioate obligationer infördes för att ersätta de sista 4 phosphodiester obligationerna i 3' slutet av mallen (tabell 1) att minska icke-specifik nedbrytningen av mallen strand (figur 3 g), om än till en högre kostnad per prov. Intressant, kan signalerna från mallen och primer DNA väl separeras genom MS enligt deras skillnader i storlek; således behövs inte denna phosphorothioate ändring. I figur 3E, exempelvis alla möjliga produkter tillägget primer P21 korrekturläsning excision och resynthesis var mindre än 22 nt (m/z < 7,000), medan alla nedbrytning fragment från mall T28 var större än 24 nt (m/z > 7.000 ). Resultaten i figur 4A var från den samma P21/T28 duplex som de i figur 3E. Ett utvidgat fönster av m/z 6.000-7.000 visar endast signaler från primern DNA utan några störande signaler från mallen.
Strategin att använda primers med filnamnstillägget ddNMP visat sig vara mycket stabil, och således ddNMP som innehåller produkter är goda indikatorer för korrekturläsning analysen. Tillägg av ddNMP excision produkter kunde 'frysa' korrekturläsning produkterna i tillståndet för analys omedelbart efter excision. Alternativt är använda en enda rätta dNTP (figur 5B) istället för 4 ddNTPs för att undertrycka ospecifika hydrolytiska aktiviteten av den korrekturläsning exonuclease också möjligt.
Stoppa reaktionerna med en standard fenol/kloroform extraktionsmetod visat sig vara de bästa medlen för reaktion uppsägning sedan, i ett steg, det gör att reaktionerna på stoppas samtidigt också avlägsna protein störningar. Alternativt, syra dämpar, som är mottagliga för automation, då neutraliseras av icke-metall alkaliska utan en fasseparation, visade också tillförlitliga resultat. Natrium ion addukter (Na+ i figur 4, 5och 7) är av intresse eftersom de kan öka bakgrunden och komplicera den signal diskrimineringen. En korrekt användning av ren kådan kan minska dessa störningar; ännu, även när sådana addukter är närvarande, de har normalt mycket mindre toppar i förhållande till deras överordnade-signal och den här egenskapen kan användas att skilja mellan dem (figur 4, 5och 7). Allmänhet, topphöjden av natrium addukter stod i proportion till de stora topparna; inbegripandet eller uteslutandet av natrium addukter i beräkningen inte påtagligt påverkade resultaten kvantifiering. Därför för kvantifiering använde vi den stora topphöjden endast för beräkningen.
De korrekturläsning experiment som beskrivs här utnyttjade interna oförenligheter att demonstrera vikten av exonuclease domänpartitionen haltbestämning av KF26 och detaljerad DNA-polymerasen jag kapacitet att effektivt korrekturläsa en felmatchning vid upp till 4 nt uppströms från primer 3'-slutet (figur 5, MM1 - 4) möjligen på grund av bas-ihopkoppling stabilitet vid primer-mall korsningar27. Denna studie använde dessutom också primers som innehåller näst sista deoxyinosine lesioner för att studera en pol jag reparera av endo V-nicked reparation intermediärer. Resultaten visade att T-jag reparerades mer effektivt än A-jag och G-jag; dock C-jag var refraktära mot den pol som jag reparera (tabell 1 och figur 7). Dessa resultat bekräftar att en MALDI-TOF MS-analys kan vara mycket användbart för korrekturläsning och olika kort-patch DNA-reparation-analyser28 på grund av dess hög upplösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar de NCFPB integrerade Core Facility för funktionell genomik (Taipei, Taiwan) och NRPB farmakogenomik Lab (Taipei, Taiwan) för deras tekniska support. Detta arbete stöds av forskningsanslag från stiftelsen Taiwan hälsa (L-I.L.) och ministeriet för vetenskap och teknik, Taipei, Taiwan, ROC [mest 105-2320-B-002-047] för Wei-Yao Hu, [mest 105-2628-B-002-051-MY3] för Kang-Yi Su och [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] för Liang-i Lin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
