Summary
DNA polimeraz proofreading ve DNA onarım tahlil bir sigara etiketli ve radyo izotopik bir yöntem yüksek çözünürlüklü MALDI-TOF Kütle spektrometresi ve bir tek nükleotid uzantısı strateji kullanarak geliştirilmiştir. Tahlil çok özel, basit, hızlı ve kolay yazım denetleme için gerçekleştirmek ve tamir olmak için 9-nükleotit kısa yamalar kanıtladı.
Abstract
Genom ve onun sadık çoğaltma bakım genetik bilginin korunması için her şeyden önemlidir. Yüksek sadakat çoğaltma değerlendirmek için basit bir sigara etiketli geliştirdiğimiz ve radyo izotopik yöntemi bir matris yardımlı Lazer Desorpsiyon iyonlaşma zaman--uçuş ile (MALDI-TOF) kullanarak kütle spektrometresi (MS) analiz proofreading bir çalışma için. Burada, bir DNA polimeraz [Örneğin, Escherichia coli DNA polimeraz Klenow parçası (KF) ben (pol ben) Bu çalışmada] huzurunda tüm dört dideoxyribonucleotide trifosfatlar arasında eşleşmeyen astar şablonu çift yönlü işlemek için kullanılır. Eşleşmeyen astar sonra yazım denetimini/genişletilmiş ve MALDI-TOF MS için tabi. Ürünler tek nükleotid varyasyonları aşağı astar kitle değişikliği tarafından ayırt edilir. Önemlisi, bir yazım denetleme da iç tek uyuşmazlıklar için farklı verimliliği de olsa, belirlenebilir. 2-4-nükleotit (nt) 3' uçtan bulunan uyuşmazlıklar vardı verimli pol tarafından tashih ve 5'te bir uyumsuzluk astar terminus NT'den yalnızca kısmi bir düzeltmesi gösterdi. Hiçbir yazım denetleme için astar 3' sonundan itibaren 6-9 nt bulunan iç eşleşmeme durumu oluştu. Bu yöntem ayrıca DNA onarım deneyleri (yüzeylerde endo V onarım yolu için Bankası-lezyon onarımını değerlendirmekÖrneğin, ) uygulanabilir. 3' sondan bir önceki deoxyinosine (dı) lezyonlar içeren astar pol tarafından düzeltilmiş ben. Nitekim, sondan bir önceki T-ı, G-ben ve A-ben yüzeylerde vardı son 2 dI içeren nükleotit eksize pol tarafından ben bir doğru ddN 5'-monofosfattır (ddNMP) eklemeden önce sondan bir önceki C-ben uyuşmazlıkları pol tarafından tolere ben ilk olmadan genişletilmesi için izin , DNA tamiri ölçmek için duyarlılık ve kararlılık-in belgili tanımlık Bayan tahlil gösteren onarın.
Introduction
DNA polimeraz DNA ikileşmesi sırasında okuma fonksiyonları yüksek sadakat Döl1,2,3,4' eaktarılması gereken genetik bilgi sağlamak için gerekli olan, 5,6,7. Eksonükleazlar proofreading polimeraz katkıları değerlendirmek için güçlü olmak genetik istikrarı koruma mekanizmalarını açıklamak.
Radyoizotop etiketleme ve jel tabanlı deneyleri autoradiograms veya fosfor görüntüleme8,9,10 densitometric analizleri ile birlikte geleneksel olarak DNA'ın prova-okuma etkinliği tespit etmek için kullanılmıştır polimerazlar. Fonksiyonel, bu deneyleri zahmetli, pahalı ve yüksek üretilen iş biçimleri için müsait değil iken. Buna ek olarak, radioisotopes atık dahil olmak üzere güvenlik sorunları muzdarip. Alternatif olarak, prova-okuma etkinlikleri Fluorometrik tekniklerle analiz edilmiştir. Örneğin, 2-aminopurine (2-AP) vitro polimeraz deneyleri bir floresan sinyal11,12üretmek için yazım denetleme sırasında uzantılı ürünler dahil edilebilir. Ne yazık ki, 2-AP-ebilmek çift timin ve sitozin ile bu yana bu yaklaşımların bir düşük özgüllük acı. Daha yeni bir yaklaşım içerir bir hassas G-dörtlüsü tabanlı Işıksaçan anahtarı üzerinde prob bir polimeraz 3' - 5' eksonükleaz aktivitesi tahlil13 yanı sıra bazı üstesinden tahlil proofreading bir polimeraz için tek etiketli floresan sonda Yukarıda belirtilen sakıncaları14. Fluorometrik bu yöntemler için coşku belirli DNA yüzeylerde etiketleme için ihtiyaç nedeniyle azalır.
Buna ek olarak, bir MALDI-TOF MS DNA analizi için nerede astar uzantısı reaksiyonlar etiketlenmemiş 4 ddNTPs ile verilen locus15,16,17 polimorfizmleri tanımlamak için kullanılabilir belirlemekte tahlil istihdam ve mutasyon tespitleri için klinik uygulamalarında yaygın olarak benimsenmiştir ve kanser tanı18. Bu temel ilkelerini kullanarak, biz bir etiket içermeyen tahlil DNA polimeraz yüksek çözünürlük, yüksek özgüllük ve MALDI-TOF Bayan kullanma E. yüksek üretilen iş potansiyelini istismar etkinlik düzelti vitro belirlenmesi için oluşturduk coli DNA polimeraz ben Klenow parçası bir model enzim, dideoxyribonucleotide trifosfatlardan (ddNTPs) gibi yüzeylerde bir "anlık görüntü" bir tek nükleotid uzantısı üzerinden sonra MALDI-TOF MS (Şekil 1) ürünleri proofreading alabilir.
Aynı şekilde, bu yöntem aynı zamanda nerede hangi taklit eder endo arakladım V onarım ara ürün içeren 3' sondan bir önceki dI lezyonlar ı onarmak bir pol tabi olan astar tahlil bir DNA onarım tahlil için geliştirilmiştir. Değil tam olarak anlaşılmış olsa da, endo V onarım pol benimçalışanlarımdan eksonükleaz aktivitesi lezyonu eksizyonu19,20proofreading için bilinen tek tamir sistemi yoludur. MALDI-TOF MS kullanarak, biz açıkça tanımlanmış onarım yama nereye dI pol tarafından eksize göstermek ben ne zaman son 2 meydana gelen nt doğru çıkarılan nükleotit eklemeden önce astar.
Proofreading ve DNA tamiri çalışma için bu yöntem daha hızlı ve önceki yöntemlerine göre daha az zahmetli ve mekanizması ve işlev doğru ek bilgi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. astar/şablon hazırlama
- Astar/şablonlar % 40 ve % 60 olduğu gibi bir sıralama veya PCR astar tasarım arasında dengeli bir G + C içerik ile tasarlayın. 18-21 astar kullanmak için uygun bir tavlama ve daha iyi MS sinyalleri nt.
- Tasarım şablonu olarak erime sıcaklığı en az 7 ile çift yönlü bölge için en az 50 ° C ayarlayarak sinyalleri astar ve şablon arasında ayırmak için nt 5'-çıkıntısı.
Not: Örneğin, substrat P21/T28 Tablo1 için 21-nt astar 28-nt şablonu ile eşleştirilmiş olan. Seçenek: son 4 fosfodiester bağları sonunda 3' şablonu değiştirmek için nükleaz dayanıklı phosphorothioate tahvil gibi alternatif nükleik asitleri kullanımı mümkün bir non-spesifik 3' uç bozulması şablonları ( tarafından etkilenmemesi Örneğin, Tablo 1' deki T28S4), her ne kadar bu bazı maliyet şablonu hazırlama için ekler. - Standart desalted oligonucleotides daha fazla arıtma olmadan kullanarak bu çalışma için tatmin edici. H2O 100 pmol/µL bir konsantrasyon bir hisse senedi olarak, oligonükleotid astar/şablonlarını kullanın ve -20 ° C'de saklayın Kalite ve saflık astar ve şablonları MALDI-TOF benzersiz en yüksek sinyalleri ve iyi bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için MS (adım 4-7) oligonucleotides çalıştırarak denetlemek.
- Göreli MALDI-TOF MS sinyal yoğunluklarda (7. adım), kalibrasyon ve konsantrasyon normalleştirme (Şekil 2) için tepki olarak ilgili serilerini eşit molar astar belirlemek.
2. reaksiyonlar yazım denetleme
Not: Aynı prova-okuma reaksiyon durumu ve iletişim kuralı uygular a DNA onarım için-ben G-ben C-ı ve T-ben.
- Substrat P21/T28 bir T-G uyumsuzluk proofreading Tablo 1 örnek olarak kullanarak, astar P21 ve şablona 12,5 pmol/µL H2O ile T28 seyreltik; o zaman 12 µL seyreltilmiş astar ve 12 µL seyreltilmiş şablonunun 1.5 mL steril microcentrifuge tüp transferi.
Not: Şablon/astar mix 2 Tepkiler için yeterli miktarıdır; orantılı olarak buna göre reaktifleri hacmi artırmak için birden çok tepkiler. - Tüp sıkıca kapatın. 30 dk 30 dk içinde 37 ° C su banyosu, ardından bir kapalı 65 ° C su banyosu içinde için kuluçkaya ve nihayet on Ice düzgün bir tavlama emin olmak için.
- 1.5 mL steril microcentrifuge Tube 8 µL astar ekleyin ve şablon mix (50 pmol), proofreading tepki tampon, 4 ddNTPs mix (her 4 dNTPs 2 mM) ve H2O kadar 18 µL. 4 µL x 10 2 µL fiske karıştırmak için tüp.
Not: 1 x okuma reaksiyon arabellek 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol ve 10 mM Tris-HCl (pH 7,9 25 ° c) içerir. Ticari kaynak tepkisi arabellek proofreading x 10 için Malzemeler tablo görmek. Her ddNTP tepki olarak son konsantrasyonu 0,1 mM olduğunu. - DNA polimeraz tepki Arabellek istenen konsantrasyonu proofreading x buz gibi 1 seyreltik [Örneğin, 1.5 mL microcentrifuge tüp için eklemek 4 µL reaksiyon tamponu ve 5-U Klenow polimeraz ticari bir kaynaktan gelen 1 µL proofreading x 1'in (tablo, Materials)]. Seyreltilmiş enzim buz üzerinde her zaman depolar.
Not: Seyreltilmiş DNA polimeraz miktarı 2 Tepkiler için yeterlidir; orantılı olarak buna göre enzimler hacmi artırmak için birden çok tepkiler. Klenow polimeraz, 2.0 birimleri içeren 2.0 µL hacmi T-G terminal eşleşmeyen P21/T28 5 min içinde 50 pmol yarısından fazlası yazım denetimini. - Microcentrifuge tüp substrat karışımı ile 2.3 adımından istenilen reaksiyon ısısı (Örneğin, genellikle 37 ° C Klenow polimeraz ve T4 DNA polimeraz için 25 ° C) prewarm. O zaman seyreltilmiş DNA polimeraz 2.0 µL adımından 2.4 prewarmed substrat karışıma aktarın ve içeriğini karıştırmak için tüp hafifçe vur.
- Enzim ve substratı tüpler santrifüj kapasitesi 3200 x g tepkiler bileşenleri spin için ortam sıcaklığı, bir kaç saniye için. Hemen bir Isıtma blok veya olduğu gibi adım 2.5 istediğiniz kuluçka sıcaklığında su banyosu için tepki aktarın.
-
Reaksiyon sona erdirmek
- Tamponlu fenol eşit bir birim eklemek, bir kaç saniyeliğine vortexing tarafından mix ve 3200 x g 5 min için ortam sıcaklığında, microcentrifuge içinde santrifüj kapasitesi.
- Sulu faz bir temiz microcentrifuge tüp aktarmak ve kloroform eşit bir birim eklemek için birkaç saniye ve santrifüj 3200 x g 3 dakika süreyle ortam sıcaklığında, microfuge içinde bir temiz microfuge tüp ve içinde sulu faz Transfer için vortexing tarafından mix cubate bu 95 ° c 5 dakika; sonra buz üzerinde yerleştirin.
Dikkat: Fenol ve kloroform tehlikeli kimyasal maddelerdir. Kauçuk ve atık bertaraf kurumsal kuralları takip etmelidir.
- Sulu faz bir temiz microcentrifuge tüp aktarmak ve kloroform eşit bir birim eklemek için birkaç saniye ve santrifüj 3200 x g 3 dakika süreyle ortam sıcaklığında, microfuge içinde bir temiz microfuge tüp ve içinde sulu faz Transfer için vortexing tarafından mix cubate bu 95 ° c 5 dakika; sonra buz üzerinde yerleştirin.
- Alternatif olarak, iletişim kuralı Şoklama bir asit kullanın. Bunun için 6 dakika buzda reaksiyonu durdurmak, sonra 1 M diethanolamine (DEA) tepki karışımı pH nötralize ve 95 ° c 5 min için; kuluçkaya 0,64 µL eklemek için 1 M HCL 2 µL Ekle sonra buz üzerinde yerleştirin.
- Tamponlu fenol eşit bir birim eklemek, bir kaç saniyeliğine vortexing tarafından mix ve 3200 x g 5 min için ortam sıcaklığında, microcentrifuge içinde santrifüj kapasitesi.
3. reçine Ayrıca tuz kirlenme ortadan kaldırmak için
- Ticari desalting üzerinden reçine kepçe kullanarak ( Tablo reçetesigörmek) kit, 384-Gamze, 6-mg reçine çukur tabak gamze karşılamak için yeterli reçine al.
- Reçine tüm gamze dağıtabilmenizi (6 mg/gamze) plaka üstünde kazıma tarafından. Herhangi bir aşırı reçine yeniden elde etmek ve eski yerine koymak o şişede.
- Son reaksiyon ürünleri adımından 2.7 microfuge tüpler 384-şey plaka için transfer. Her şey son tepki ürünlerinde sulandırmak ve plaka mühür ve herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için santrifüj kapasitesi için H2O 16 µL dağıtmak.
- Mührü kaldır, 384-şey plaka baş aşağı reçine kaplı çukur tabak kapsayacak şekilde reaksiyon ürünleri ile dön.
- Peki çukur tabak sandviç üzerinde açmak ve dikkatle 384-şey plaka damla reçine izin (384-şey plaka reçine kaplı çukur tabak metal peg karşı aynı hizada olduğundan emin olun).
- Üst çukur tabağa kaldırmak, reaksiyon ürünleri karışımları içeren 384-şey plaka mühür ve reçine, kısaca 3200 x g herhangi bir kabarcıklar kaldırmak ve bir rotator içeriğini desalting için oda sıcaklığında en az 15 dakika yerleştirin, santrifüj kapasitesi.
- Reçine temizleme sonra santrifüj kapasitesi 384-şey plaka 3200 x g reçine kuyu dibine kompakt 5 min için de.
4. transfer reaksiyon ürünleri için bir matris çip
- Örnek plakaları nanoliter kabına ayarla (nanodispenser, Tablo reçetesigörmek).
- Yerine matrix çipi ( Tablo reçetesigörmek) ve karşılık gelen tepsi 3.7 bölümünde 384-şey plaka.
- Çip için reaksiyon ürünleri spot nanodispenser işletmek; Çalıştır düğmesini başlatmak için nanodispenser dokunmatik ekranda itin.
- Onay otomatik yakalanan çip genel Benekli cilt sağlamak için ekrandaki doygunluk bilgileri içeren örnek noktalar görüntüsüdür çevresinde 5-10 nL. Birim yetersiz ise örnek lekelenme yineleyin.
5. kurulumu kütle spektrometresi hakkında tahlil bilgi
- .Xls biçiminde almak için beklenen sinyal bilgilerini içeren bir dosya hazırla. Örneğin, 2, 3 ve 4 numaralı adımları P21/T28 proofreading tepki için "P21_T28.xls" (Tablo 2) ayarı kullanır.
- Oluşturmak ve yeni bir tahlil uygulama programı tanımlamak ( Tablo reçetesigörmek) tarafından Tasarımcı formatında içe aktarma tahlil grubu sağ tıklatıp .xls dosyasını (Örneğin, "P21_T28.xls"--dan adım 5.1) seçin.
- Hedef tahlil plaka üzerinden Müşteri: proje: plaka seçeneği ağacı ekranın sol tarafındaki ağaç üst sağ tıklatıp dosya ad vermek kurmak (Örneğin, "CTT20171201" temsil eden tarih ve tahlil kodu).
- 384-şey plaka türünü seçin ve Tamam'ıtıklatın; boş bir tabak-ecek gözükmek.
- Uygun tahlil (Örneğin, P21_T28) ekranın sol tarafında seçin.
- İyi vurgulama ve Parça eklemekseçmek için sağ örnek pozisyon çip tespit her örnek için seçili tahlil (Örneğin, P21_T28) atayın.
- Çip .xlsx biçiminde tüm testlerde hiçbir başlık (Örneğin, 1201.xlsx Tablo3) ile çalışan listesini hazırlamak. Çalışma listesi üzerinden Yeni örnek proje Ekle seçeneği alın.
- Çalışma liste (Örneğin, 1201.xlsx gelen) testinde P21_T28 tahlil her konuma atayabilir ve sağ tıklatarak seçin.
6. MALDI-TOF MS işlemi
- Kütle Spektrometre uygulama programı kullanarak çip bağlantı ( Tablo reçetesigörmek).
- Ekranın sağ tarafında kullanılan varsayılan ayarı seçin.
- Adım 5.3 (Örneğin, CTT20171201), chip ID çip, köşesinde tahlil adından doldurun ve ayarları kaydedin.
- MS denetim programını başlatmak ( Tablo reçetesigörmek).
- In/Out düğmesine basın ve izci plaka al. Benekli küçük parça--dan adım 4.4 izci plaka üzerine yerleştirin ve kütle spektrometre girmek benekli yongası için In/Out düğmesine basın.
- Uygulamanın program Al düğmesini tıklatın (kütle spektrometresi başlatmak ve veri almak için Tablo reçetesibakınız).
7. veri analizi
- Veri çözümlemeleri için programı açın (bkz. Tablo malzeme).
- Sol üst köşede veritabanına ağacına göz atmak ve 6,3 adımından çip kimliği seçin. Ekranın sağ tarafındaki veri dosyasını açın.
- Kitle tayfını görüntülemek için spektrum simgesini tıklatın. M/z belirli bir aralığını kırpmak için Özelleştirme iletişim seçin ve yeni pencerede x ekseni üzerinde tıklatın ve istenen alt ve üst sınırını ayarlamak ve spektrum belirtilen aralığını göstermek için Tamam tuşuna basın için sağ tıklatın.
- Spektrum kayıt vermesağ tıklatarak tutma için verin.
Not: 1.600 genişliği/1200 birim ölçeği kullanarak bir makul bir bilgisayar ekranında veri denetim boyutudur.- JPEG dosya türünü seçin, hedefüzerinde tıklatın, Gözat disk (Örneğin, flaş disk E:) seçeneğini seçin, dosya adını (Örneğin, 1201-1.jpg) yazın ve sonra ver' i tıklatın.
- Veri Nefelometri, imleci kullanın ve tepe tepe yükseklik üst sol köşede göstermek için tıklatın.
- Alternatif olarak, dışa aktarılan bir JPEG dosyası yazdırmak ve el ile bir cetvel ile en yüksek yükseklik ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şablonlar ve astar:
Burada, molar sentetik oligonükleotid şablonları eşit sunulan yordamını kullanarak ve astar ticari kaynaklardan elde edilen ilgili sıralarının kendi saflık ve kalite (Şekil 3A; sinyallerin belirlenmiş kitle eşleşen Not için kontrol edildi ve düşük arka plan) yanı sıra en yüksek yoğunluk ve analit kütle (Şekil 2A) arasındaki ilişki için. Tepe yükseklikleri (Şekil 2B) MS veri normalleştirme için hesaplanacak ve ölçüldü.
Reaksiyon koşul ve kütle spectra:
Tek temel astar uzantısı reaksiyonlar için Genotipleme MALDI-TOF MS ile birleştiğinde kullanımı daha önce standart ddNTPs sonlandırıcılar17kullanarak uygulanabilir olduğu gösterilmiştir. Standart ddNTPs kullanarak proofreading tahlil Genotipleme bir singleplex tepki benzer ama daha basit ve temiz ve güvenilir sonuçlar elde etmek için yapmak çok kolay.
MS spectra astar ve şablonlar (Şekil 3) üretilen tüm sinyaller kaplı. Astar ve şablonları uygun tasarım şablonları ve astar (Şekil 3) için bir iyi ayrılmış sinyal profil oluşturulan. M/z değerine göre şablonları ve belirsiz kısmi bozulma ürünleri (m/z > 7000) gelen sinyalleri de uyumsuz astar ayrıldı ve ürünleri (m/z < 7000 Şekil 3) tashih. Gerekirse, nükleaz dayanıklı phosphorothioate tanıtımı sonunda 3' şablonu (Tablo 1; son 4 fosfodiester bağları değiştirmek için bağlar T28S4/p21) belirsiz şablon hidroliz (Şekil 3 g; d27) azaltabilir.
DNTPs yokluğunda KF bir sağlam 3'-eksonükleaz aktivitesi vardır ve astar ve şablon vitro21aşağılayıcı yeteneğine sahiptir. Yerli 4 dNTPs gibi bir 3' uç bozulması KF (Şekil 3 c ve 3E) tarafından 4 ddNTPs eklenmesi önler. Aynı şekilde, bir 3' ucu bir nükleotit uzatılması astar artan istikrar ekler. Pol kullanarak ben koşulları daha önce proofreading20 10 U ile açıklanan (46 pmol) KF, daha 50-pmol uyumsuz yüzeylerde % 80'i 5 dk (Şekil 3 c, 3Eve 3 G) düzeltildi.
Ara ürün ve mekanizma Analizi:
MALDI-TOF MS çözünürlük 1 dalton iyi olabilir; Gerçekten de, tüm yüzeylerde, ürünleri ve ara ürün tepki kitle değişiklikler ile seçilen aralığın aynı MS spektrumunda çözülebilir. Örneğin, bir terminal T-G uyuşmazlıkla, astar terminus de uyumsuz G ddA birleşme sadece 32 m/z fark ile giderilmiştir. Böyle bir m/z fark kolayca 5.000 m/z bir aralıktan 7000 (Şekil 4A) için MS spektrumunda üzerinde tespit edilebilir. Her bireysel sinyal değişikliği eşleşmeyen astar, eksizyon ara ürün, gelen tüm sinyalleri toplayarak hesaplanır ve ürünleri % 100 olarak tashih. Örneğin, T-G prova-okuma reaksiyon eksizyon ürün göre düzeltilmiş ürün % 23 ve % 5 dk 17, 10 dk % 31 ve % 18 ve % 69 karşı %14 20 dk (Şekil 4A) oldu.
Ne zaman sondan bir önceki T-G uyuşmazlık mevcuttur astar, son 2 nt-var eksize düzeltmesini tamamlamak için bir ddA ek tarafından takip. Gerçekten de, doğru ürünleri 5 dk % 12, % 28 dk 10 saat %45 20 dk reaksiyon ile artmış. Buna ek olarak, eksizyon ürünler sondan bir önceki bir T-G, 1-nt eksizyon ara ve 2-nt eksizyon ürünleri proofreading için iki formları kolayca çözülebilir (Şekil 4B) vardı.
Kinetik tek dNTP ile yazım denetleme:
E. coli DNA pol için ben, ddNTPs uygun yüzeyler değildir ve inhibitörleri22kabul edilmelidir. Alternatif olarak, tek bir 'doğru' dNTP proofreading tepki olarak kullanarak yerine de belirsiz 3' - 5' eksonükleaz aktivitesi ve tek nükleotid uzantılı ürünler MS Analizi (Şekil 5B) için uygun nesil bastırır. Tek bir dCTP içeren tepkiler elde prova-okuma oranı 4 ddNTPs (Şekil 5A, 5Bve 5 C) içeren tepkiler yaklaşık iki kat daha yüksek olduğunu. Böylece, tek bir 'doğru' dNTP proofreading tahlil kullanımı ddNTPs inhibitör etkisi olmadan daha iyi bir sonuç verir. Bu yaklaşım için kinetik analizleri yazım denetleme büyük duyarlılık sağlamalıdır.
İç uyuşmazlıkları yazım denetleme:
MS deneyleri için iç uyuşmazlıkları ve redaksiyon ürün tanımlaması basit KF kullanarak yazım denetleme (yani, prova-okuma eksonükleaz 3' ucundan nükleotit astar iç uyuşmazlığı için excises), ardından polimeraz üreten fonksiyon eksizyon ürünler üzerinden için eşleşen ddNMP yanı sıra yazım denetimini ürünleri astar yüzeylerde (Şekil 6) kısa. Nerede KF tashih verimli uyuşmazlıkları son, sondan bir önceki, 3rd ve astar (Şekil 6; 3' bitiminden 4th nükleotit verimliliği proofreading net bir eğilim gözlendi MM1, 2, 3 ve 4). Eşleşmemesi 5'te 3' ucu astar NT'den düzeltildi kısmen uyuşmazlığı düzeltme < %15 ve % > 15 (Şekil6; yazım denetleme olmadan bir uzantısı gösterdi astar ile MM5). KF başarısız oldu 6, 7, 8 ve 9 konumlandırılmış uyuşmazlıkları yanlışlarını düzeltmek nt 3' sonundan itibaren astar (Şekil 6; Mm6, 7, 8 ve 9) ama yine yüzeylerde (Şekil 6; önemli bir bölümünü genişletilmiş PE MM6, 7, 8 ve 9).
Deoxyinosine lezyon tamiri:
E. coli, DNA'deoxyinosine öncelikle endo V onarım yolu20,23tarafından işlenir. Endo V ikinci fosfodiester bağı 3' dI lezyon adlı bir kesi ile reaksiyonu başlatır. Pol tarafından kullanılmak üzere oluşturulan strand sonu inanıyordu ben bir sonraki lezyonu eksizyonu ve DNA resynthesis24. Bu yordamı dI 3' sondan bir önceki sitesinde (Tablo 1; içeren yüzeylerde onarmak pol test uygulandı Bir-ben C-Ben G-ben ve T-ben) bu hipotez doğrulamak için. 3' sondan bir önceki dI tamiri sondan bir önceki T-G uyumsuzluğu (4B veanlamaya 6; yazım denetleme benzerdir Mm2 giriş), hangi son 2 nt-meli var olmak bir ek onarım tamamlamak için doğru bir ddNMP tarafından izlenen kaldırıldı. MS desen açıkça gösterdi pol heteroduplexes a düzeltildi-ben G-ben ve T-ben, farklı verimliliği de olsa (Şekil 7; RP sinyalleri). Ancak, C-ben substrat onarabilirim pol ateşe dayanıklı (Tablo 1 ve Şekil 7 d ve 7E; çok düşük RP) ve astar uzantısı büyük ölçüde (Şekil 7 d; PE sinyal).
Resim 1 . Model için tahlil yazım denetleme sistemi. Eşleşmeyen bir astar terminal uyuşmazlığı (kalın) oluşturan bir şablon belirtildiği gibi tavlanmış. DNA polimeraz eksonükleaz proofreading algılamak ve eşleşmeyen nükleotid eksizyon ürün şekillendirme kaldırmak. DNA polimeraz ve dört ddNTPs huzurunda eksizyon ürün tek Bankası önceki eşleşmeyen sitesine tamamlayıcı tarafından genişletilir. MALDI-TOF için tabi, kitle eşleşmeyen astar, eksizyon ürünleri ve redaksiyon ürünleri arasındaki farkı çözülmüş olabilir. (Bu rakam Su ve ark. adapte 25 izinle.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . En yüksek yoğunluk ve oligonükleotid Mass 24 17 sekiz oligonucleotides serileri 3' sonuna T28 tamamlayıcı ile nt (Tablo 1) test edildi. (A) A karışım-in her oligonükleotid 40-µL çözümlerinde 50 pmol bir MS analysis tabi. (B) 17 pik yüksekliği nt % 100 olarak hesaplama için kullanıldı. Her oligonükleotid göreli sinyal şiddeti altı tespitler ortalama oldu ve hata çubukları 1 Standart sapmayı temsil eder. (Bu rakam Su ve ark. adapte 25 izinle.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Çeşitli şablon tasarımı etkisi. Prova-okuma tepkiler farklı şablonlar ile terminal bir T-G uyuşmazlığı şekillendirme P21 astar ile değerlendirildi. Proofreading tahlil 50 pmol substrat ve 4 ddNTPs 5 dk. (A) Bu panel için 37 ° C'de gösterir P21/T32 T-G substrat enzim olmadan 10 U (43 pmol) Klenow polimeraz ile gerçekleştirildi. (B) Bu panel gösterir P21/T32 T-A substrat bir astar Uzantısı 3' eksonükleaz tarafından eksik Klenow. PE = astar uzantısı ürün. (C) Bu panel P21/T32 T-G substrat yazım denetleme gösterir. S = okuma ürün; D26, d27, d28 = 3' şablonu son bozulmuş. (D) Bu panel P21/T28 T-G substrat enzim olmadan gösterir. (E) Bu panel P21/T28 T-G substrat yazım denetleme gösterir. S = okuma ürün; D26, d27 = 3' şablonu son bozulmuş. (F) Bu panel P21/T28S4 T-G substrat enzim olmadan gösterir. (G) Bu panel P21/T28S4 T-G substrat yazım denetleme gösterir. S = okuma ürün; EP eksizyon ürünleri; = D27 şablon bozulması yan ürün =. (Bu rakam Su ve ark. adapte 25 izni ile). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Zaman ders analiz eksizyon ürünleri ve prova-okuma ürünleri için. Prova-okuma deneyleri 2 U ile gerçekleştirilen (8.6 pmol) KF ve 50 pmol yüzeylerde olarak açıklanan protokol. Tepkiler su, belirtilen kez. (A)Bu panel gösterir bir 3' terminal T-G uyumsuzluk; yazım denetleme EP = okuma eksizyon ürün; D18 & d19 aşırı eksizyon yan ürünleri; = S = okuma ürünler; P21 eşleşmeyen astar =. (B) Bu panel bir 3'-sondan bir önceki T-G uyumsuzluk yazım denetleme gösterir; EI-1 eksizyon ara; = EP-2 = okuma eksizyon ürünler; D18 aşırı eksizyon yan ürün; = S = okuma ürünler; P21 eşleşmeyen astar; = Na Sodyum iyon bağlı nükleotit =. (Bu rakam Su ve ark. adapte 25 izinle.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . 4 ddNTPs ile reaksiyonu yazım denetleme karşı bir tek dNTP. Prova-okuma deneyleri 0,1 U ile gerçekleştirilen (0.43 pmol) KF ve 50 pmol yüzeylerde olarak açıklanan protokol. Tepkiler su, belirtilen kez. (A)Bu panel gösterir bir 3' terminal G-G ile uyuşmazlığı 4 ddNTPs; yazım denetleme EP = okuma eksizyon ürün; S = okuma resynthesis ürünler; P21G uyumsuz astar =. (B) Bu panel bir 3' terminal G-G ile uyuşmazlığı dCTP yazım denetleme gösterir; S = okuma resynthesis ürünler; P21G uyumsuz astar =. (C) düzeltme düzeyleri üç tespitler ortalamasını ve hata çubukları 1 Standart sapmayı temsil. Na+ Sodyum iyon bağlı nükleotit =. (Bu rakam Su ve ark. adapte 25 izinle.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 . İç uyuşmazlıkları proofreading. İletişim kuralında tanımlandığı gibi proofreading deneyleri 2 U (8.6 pmol) Klenow polimeraz ve 50 pmol yüzeylerde 20 dk 37 ° C'de gerçekleştirilmiştir. Boş bir MM1 substrat enzim boş =. MM1 P21/T28 T-G substrat; = MM9 mm2 yüzeylerde = iç uyuşmazlıkları ile uyuşmazlığı konumuna göreli olarak 3' ucu sayıları gösterir. P21 eşleşmeyen astar; = PR = redaksiyon ürünler; PE = genişletilmiş astar; D19 ve d20 aşırı eksizyon yan ürünleri, = sayılar nükleotit boyutunu temsil eder. (Bu rakam Su ve ark. adapte 25 izinle.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 . 3' sondan bir önceki deoxyinosine lezyonlar tamiri. 2.3 Protokolü adımda anlatıldığı gibi onarım deneyleri 2 U Klenow polimeraz ve 50 pmol yüzeylerde 37 ° c ile gerçekleştirilmiştir. Tepkiler su, belirtilen kez. Bu paneller (A) T reaksiyon göstermek-ben substrat; (B) G-ben substrat; (C) A-ben substrat; ve (D) C-ben substrat. RP tamir ürünleri; = EP eksizyon ürünleri; = PE astar uzantılı ürünler, Na+ = = Sodyum iyon adducts. (E) düzeltme düzeyleri için T-ben G-ben ve A-üç tespitler ortalamasını yerinde ve hata çubukları 1 Standart sapmayı temsil eder. C için düzeltme düzeyleri-ortalama iki tayin edildi. (Bu rakam Su ve ark. adapte 25 izinle.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Yüzeylerde | Dizileri | Düzeltme verimlilik (pmol) | |
| P21/T32 | 3'-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 17,3 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 18,4 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28S4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 22,9 | |
| MM1 | 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | ||
| HIZLI | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 13,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA | |||
| MM3 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 16,9 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA | |||
| MM4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 15,1 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA | |||
| RMJ | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 4.2 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA | |||
| RMI | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5* | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA | |||
| MM7 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA | |||
| MM8 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACATTGGGAA | |||
| MM9 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA | |||
| A-BEN | 3'-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT | 8.2 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| C-BEN | 3'-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT | 1.0 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| G-BEN | 3'-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT | 15,4 inç | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| T-BEN | 3'-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT | 16,6 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
Tablo 1. Yüzeylerde ve düzeltme verimlilik Klenow parçası tarafından proofreading. Bu tablo kalın 4 nükleotit 3'-sonu phosphorothioate değişiklikler içeren şablonunu gösterir. Uyumsuz baz çifti kalın bulunmaktadır. Prova-okuma deneyleri 2 U (8.6 pmol) Klenow polimeraz, 50 pmol substrat ve 10 dakika süreyle 37 ° C'de 4 ddNTPs ile gerçekleştirilen * arka plan gürültü % < 1 doğru tahminler engellediği için bu değerler prova-okuma düzeyi için daha düşük limitler Toplam kitle sinyalleri görülmektedir. (Bu rakam Su ve ark. adapte 25 izinle.)
| İYİ | DÖNEM | SNP_ID | 2-PCRP | 1-PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | TM | PcGC | PWARN | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_CALL | EXT1_MASS |
| W1 | iPLEX | T28 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 8524.54 | ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | |||
| W1 | iPLEX | P21 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 6495.24 | TACCAGTCAGGACGTTGGGAA | |||
Tablo 2. T28_P21.xlsx dosyası. Ayarı şekil 3D, 3E, 4Ave 5Aiçin kullanıldı.
| 1201-1 |
| 1201-2 |
| 1201-3 |
| 1201-4 |
| 1201-5 |
| 1201-6 |
| 1201-7 |
Tablo 3. 1201.xlsx dosyası. Ayarı Şekil 4A7 reaksiyonlar için kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada bir adım adım prova-okuma etkinliği tahlil tarafından seçilen ticari araç analiz açıklanan ( Tablo reçetesigörmek) MALDI-TOF MS kullanarak. Büyük avantajı astar ve şablon etiketi gerçekleştirmek için ücretsiz ve kolay olduğunu deneyler tasarımı daha fazla esneklik için izin içerir. Bir akış-kireç tam işlem testleri proofreading 30 4 h 3 h proofreading reaksiyonlar el ile gerçekleştirmek için de dahil olmak üzere, alacağını ve onların Temizleme sırasında yukarıda belirtilen iletişim kuralı kullanılarak MALDI-TOF MS analizleri tamamlamak için 1 h alır. Bu yöntemin birincil dezavantajı tahlil için gerekli substrat miktarıdır. Güçlü sinyaller ve tutarlı sonuçlar elde etmek için biz DNA substrat 50 pmol 20 µL tepki olarak kullanılan; Böylece, DNA miktarı radiolabeled DNA deneyleri8,9,10ile daha yüksektir. Birimleri ve örnek boyutu azaltmak ve MS işlemi ince ayar gerekli substrat miktarını azaltabilirsiniz.
Ticari kaynaklardan elde edilen sentetik oligonucleotides prova-okuma çalışmaları doğrudan doğruya ezelî daha fazla arıtma veya tedavi için kullanılabilir. Ancak, saflık ve DNA MALDI-TOF MS tarafından kalitesini kontrol etmek için tavsiye edilir. Phosphorothioate tahvil örnek başına daha yüksek bir maliyet de olsa sonunda 3' şablonu iplikçik (Şekil 3 g), non-spesifik bozulması azaltmak için şablon (Tablo 1) son 4 fosfodiester bağları değiştirmek için kullanılmaya başlanmıştır. İlginçtir, şablon ve astar DNA gelen sinyalleri de MS tarafından sayesinde aralarındaki farklılıkları boyutunda ayrılabilir; Böylece, bu phosphorothioate değişiklik gerekli değildir. Şekil 3Eiçinde örneğin, astar P21 uzantısı ve prova-okuma eksizyon ve resynthesis tüm olası ürünleri daha az 22 edildi. nt (m/z < 7000), şablondan T28 bozulması parçaları ise 24 büyük nt (m/z > 7000 ). Şekil 4A sonuçlarında aynı P21/Şekil 3Ealanındakiyle ayarla T28 çift yönlü olduğunu. M/z 6.000-7.000 genişlemiş bir pencere sadece DNA astar şablonu'ndan herhangi bir karıştırıcı sinyaller olmadan gelen sinyalleri gösterir.
DdNMP uzantısıyla primerler kullanılarak stratejisi çok kararlı olduğu ortaya çıktı ve böylece, ddNMP içeren proofreading tahlil için iyi göstergeleri ürünlerdir. DdNMP eksizyonu ürünler ilavesi 'durumu analiz için prova-okuma ürünler hemen sonrası eksizyon dondurabilirsin'. Alternatif olarak, non-spesifik hydrolytic etkinliği okuma eksonükleaz bastırmak için 4 ddNTPs yerine bir tek doğru dNTP (Şekil 5B) kullanarak da mümkün olabilir.
Standart fenol/kloroform çıkarma yordamı ile tepkiler durdurma tek adımda, ayrıca herhangi bir protein parazit kaldırma sırasında durdurulması tepkiler sağlar beri tepki sonlandırma için en iyi yol olduğu ortaya çıktı. Alternatif olarak, metal olmayan bir faz ayrımı alkali tarafından etkisiz hale sonra Otomasyon için mükellef, Şoklama, asit de güvenilir sonuçlar gösterdi. Sodyum iyon adducts (Na+ Şekil 4, 5ve 7) beri onlar arka plan arttırmak ve sinyal ayrımcılık karmaşık hale endişe vardır. Temiz reçine doğru kullanımı böyle bir girişim azaltabilir; henüz, hatta ne zaman böyle adducts mevcut, onlar normalde üst sinyallerini göre çok daha küçük tepeler var ve bu Özellik (Şekil 4, 5ve 7) aralarında ayırt etmek için kullanılabilir. Genellikle, en yüksek yükseklik sodyum adducts için büyük tepeler; orantılı olduğunu içinde içerme veya dışlama sodyum adducts hesaplama miktar sonuçları önemli ölçüde etkilemedi. Bu nedenle, miktar için biz yalnızca hesaplama için büyük pik yüksekliği kullanılır.
Açıklanan proofreading deneyler burada avantaj aldı eksonükleaz önemini göstermek için iç uyuşmazlıkları etki alanı bölümü tahlil KF26 ve detaylı DNA polimeraz ben verimli uyuşmazlığı, yanlışlarını düzeltmek için yeteneği kadar 4 akıntıya karşı NT'den astar 3' uç (Şekil 5, MM1 - 4) astar şablonu kavşak27Bankası eşleştirme istikrar nedeniyle muhtemelen. Ayrıca, bu çalışma sondan bir önceki deoxyinosine lezyonlar içeren astar endo V-çentikli onarım Ortalayıcılar onarım pol çalışma için de kullanılır. Sonuçlar gösterdi o T-A daha verimli bir şekilde onarıldı-ben ve G-ben; Ancak, C-I onarmak pol ateşe dayanıklı (Tablo 1 ve Şekil 7). Bu sonuçlar bir MALDI-TOF MS analiz proofreading ve çeşitli kısa-yama için çok yararlı olabilir onaylamak DNA tamiri deneyleri28 yüksek çözünürlüğü nedeniyle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
İşlevsel Genomik (Taipei, Tayvan) ve teknik destek için NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Tayvan) için NCFPB entegre çekirdek tesis teşekkür ederiz. Bu eser Tayvan Sağlık Vakfı (L-I.L.) ve Bakanlığı Bilim ve teknoloji, Taipei, Tayvan, ROC [en 105-2320-B-002-047] Wei-Yao Hu için gelen araştırma hibe tarafından desteklenen [en 105-2628-B-002-051-MY3] Kang-Yi Su ve [için most-105-2320-b-002-051-my3] Liang bileşenini Lin için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
