Summary
Se desarrolló un método no etiquetados, radio-isotópico para la corrección de la polimerasa de la DNA y un ensayo de reparación del ADN mediante espectrometría de masas MALDI-TOF alta resolución y una estrategia de extensión de un solo nucleótido. El ensayo demostró ser muy específico, simple, rápido y fácil de realizar para corregir y reparar los parches menor 9 nucleótidos.
Abstract
El mantenimiento del genoma y su fiel replicación es fundamental para conservar la información genética. Para evaluar la replicación de alta fidelidad, hemos desarrollado un simple no etiquetados y método radio-isotópica con una ionización de desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF) de tiempo de vuelo total análisis de espectrometría (MS) para un estudio de revisión. Aquí, una polimerasa de ADN [por ejemplo, el fragmento de Klenow (KF) de polimerasa de la DNA de Escherichia coli I (pol I) en este estudio] en presencia de los cuatro trifosfatos de dideoxyribonucleotide se utiliza para procesar un duplex cartilla-plantilla. La cartilla es entonces revisado/ampliado y sometida a MS de MALDI-TOF. Los productos se distinguen por el cambio de masa de la cartilla a las variaciones de un solo nucleótido. Lo importante, una corrección también puede ser determinado por desajustes individuales internos, aunque a diferentes eficiencias. Situado en 2-4-nucleótidos (nt) desde el extremo 3' de desajustes fueron eficientemente corregido por pol I, y un desajuste en el 5 nt de la terminal de cartilla demostró solamente una corrección parcial. Sin corrección se produjo de desajustes internos ubicados en 6-9 nt desde el extremo 3' del primer. Este método puede aplicarse también al análisis de reparación de ADN (por ejemplo, evaluando una reparación de la lesión de base de sustratos para la vía de reparación endo V). Cartillas que contienen 3' penúltimo deoxyinosine (dI) lesiones podrían corregirse por pol I. De hecho, penúltima T-I, G-I y A-sustratos tuvieron su último 2 nucleótidos que contienen dI suprimido por pol I antes de agregar un correcta ddN 5'-monofosfato (ddNMP) al penúltimo C-desajustes fueron tolerados por pol I, permitiendo que la cartilla para extenderse sin reparación, demostrando que la sensibilidad y la resolución de la Sra. de ensayo para medir la reparación del ADN.
Introduction
Las funciones de corrección de polimerasas de la DNA durante la replicación del ADN son esenciales para asegurar la alta fidelidad de la información genética que debe ser transferido a la progenie1,2,3,4, 5,6,7. Ser capaz de evaluar las contribuciones de polimerasa corrección situados aclara los mecanismos de salvaguarda de la estabilidad genética.
Etiquetado de radioisótopo y ensayos de gel en combinación con análisis densitométricos del fósforo de8,9,10 autoradiograms tradicionalmente se han utilizado para detectar actividad de corrección de ADN polimerasas. Mientras que funcional, estos ensayos son laboriosos, costosos y no susceptibles de formatos de alto rendimiento. Además, radioisótopos sufren problemas de seguridad, incluyendo la eliminación de residuos. Por otra parte, actividades de corrección han sido analizadas por técnicas fluorométrica. Por ejemplo, 2-aminopurina (AP-2) puede ser incorporado en productos de la extensión durante en vitro polimerasa corrección ensayos para producir una señal fluorescente11,12. Lamentablemente, estos enfoques sufren de una baja especificidad, ya que 2-AP puede emparejarse con la timina y citosina. Enfoques más recientes incluyen una sensible basada en G-quadruplex luminiscente encendido Sonda para una polimerasa 3' - 5' exonucleasa ensayo13 así como una sonda fluorescente etiquetado individualmente para una polimerasa corrección ensayo que supera algunas de las inconvenientes ya mencionados14. Entusiasmo por estos métodos fluorométrico es disminuido debido a la necesidad de que el etiquetado específico de substratos DNA.
Por el contrario, se ha empleado un MALDI-TOF MS para el análisis de ADN en el ensayo de punta, donde las reacciones de extensión de la cartilla con 4 ddNTPs pueden utilizarse para identificar polimorfismos en un locus dado15,16,17 y ha sido adoptado ampliamente en aplicaciones clínicas para la detección de la mutación y diagnósticos de cáncer de18. Usando estos principios básicos, hemos creado un ensayo libre de etiqueta para la determinación en vitro de ADN polimerasa corrección actividad aprovechando la alta resolución, alta especificidad y alto rendimiento potencial de uso de MALDI-TOF MS. E. coli DNA polimerasa I Klenow fragmento como enzima modelo, dideoxyribonucleotide trifosfatos (ddNTPs) como sustratos pueden tomar una "instantánea" de revisión de productos después de un nucleótido simple extensión mediante MALDI-TOF MS (figura 1).
Además, este método fue desarrollado también para un ensayo de reparación del ADN en cartillas que contienen 3' penúltimo dI las lesiones son sometidas a un pol que reparar ensayo que imita endo V Mellado reparación intermedios. Mientras que no completamente entendida, la vía de reparación endo V es el único sistema de reparación a emplear la pol I corrección actividad exonucleasa por lesión supresión19,20. Mediante MALDI-TOF MS, mostramos un parche de reparación claramente definidos donde dI puede ser suprimido por pol que cuando ocurre en los 2 últimos nt de la cartilla antes de agregar el nucleótido correcto complementa.
Para el estudio de revisión y reparación del ADN, este método es más rápido y menos laborioso que los anteriores métodos y proporciona información adicional hacia el mecanismo y función.
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Protocol
1. plantilla de cartilla de preparación
- Diseño de primers/plantillas con un equilibrado contenido de G + C entre 40% y 60% como en una secuencia o un diseño de la cartilla PCR. Usar primers de 18 a 21 nt para mejor señales de MS y un recocido adecuado.
- Diseño de la plantilla mediante el establecimiento de 50 ° C la mínima temperatura para la región duplex con al menos 7 de fusión nt de proyección 5' para separar las señales entre la cartilla y la plantilla.
Nota: por ejemplo, para el substrato P21/T28 en la tabla 1, el primer de 21 nt se empareja con una plantilla de 28-nt. Opción: el uso de los ácidos nucleicos alternativos tales como nucleasa resistente fosfotioato bonos para reemplazar los 4 últimos enlaces fosfodiéster en el extremo 3' de la plantilla puede prevenir posibles interferencias por una degradación inespecífica 3' final de las plantillas ( por ejemplo,, T28S4 en la tabla 1), aunque esto añadirá algún costo para la preparación de la plantilla. - Utilizando oligonucleótidos desaladas estándar sin más purificación es satisfactoria para este estudio. Uso de oligonucleótidos iniciadores/plantillas en una concentración de 100 pmol/μl de H2O como un stock y almacenar a-20 ° C. Compruebe la calidad y pureza de las cartillas y las plantillas mediante la ejecución de los oligonucleótidos en MALDI-TOF MS (pasos 4-7) para las señales de pico único y una buena relación señal a ruido.
- Determinar las intensidades relativas de señal MS MALDI-TOF (paso 7) de los cebadores molares igual de las secuencias correspondientes en la reacción para la normalización de la calibración y la concentración (figura 2).
2. reacciones de corrección
Nota: La misma condición de reacción corrección y Protocolo se aplica a una reparación de la DNA de la A-I, G-I, C-I y T-I.
- Usando un desajuste de la T G de sustrato P21/T28 para la corrección en la tabla 1 como un ejemplo, diluir P21 la cartilla y la plantilla T28 a 12.5 pmol/μl con H2O; Luego traslado 12 μl del primer diluido y 12 μl de la plantilla diluida a un tubo de 1,5 mL estériles microcentrífuga.
Nota: La cantidad de mezcla de plantilla/imprimación es suficiente para 2 reacciones; aumentar proporcionalmente el volumen de los reactivos por consiguiente para reacciones múltiples. - Cierre el tubo herméticamente. Incubar por 30 min en cubierto 65 ° C baño de agua, seguido por 30 min en un baño de 37 ° C y finalmente en hielo para un recocido correcto.
- A un tubo de microcentrífuga esterilizada de 1,5 mL, añadir 8 μl de cebador y el tubo para mezclar la película mezcla de plantilla (50 pmol), 2 μl de 10 x corrección tampón de reacción, 4 μL de mezcla de 4 ddNTPs (2 mM de cada 4 dNTPs) y H2O hasta 18 μL..
Nota: 1 x corrección tampón de reacción contiene 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, Ditiotreitol 1 mM y 10 mM Tris-HCl (pH 7.9 a 25 ° C). Vea la Tabla de materiales para la fuente comercial de 10 x buffer de reacción de corrección. La concentración final de cada ddNTP en la reacción es de 0,1 mM. - Diluir la polimerasa de la DNA en la helada 1 x buffer de reacción para la concentración deseada de corrección [por ejemplo, a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, añadir 4 μL de 1 x corrección reacción tampón y 1 μl de polimerasa de Klenow 5 U de un origen comercial (tabla de Materials)]. Almacenar la enzima diluida en hielo en todo momento.
Nota: La cantidad de ADN polimerasa diluida es suficiente para 2 reacciones; aumentar proporcionalmente el volumen de las enzimas por consiguiente para reacciones múltiples. Un volumen de 2.0 μL, que contiene 2,0 unidades de polimerasa de Klenow, puede corregir más de la mitad de 50 pmol de T-G terminal incompatible P21/T28 en 5 minutos. - Precaliente el tubo de microcentrífuga con la mezcla de sustrato del paso 2.3 a la temperatura de reacción deseada (por ejemplo, normalmente a 37 ° C para que la polimerasa de Klenow y 25 ° C para la polimerasa de la DNA de T4). Luego transferir 2.0 μL de la polimerasa de ADN diluida del paso 2.4 a la mezcla de sustrato precalentado y flick el tubo para mezclar su contenido.
- Centrifugar los tubos con la enzima y el substrato durante unos segundos a 3.200 x g a temperatura ambiente a la desactivación de los componentes de las reacciones. Transferir inmediatamente la reacción a un bloque de calentamiento o baño de agua a la temperatura deseada de la incubación como en el paso 2.5.
-
Terminar la reacción
- Añadir un volumen igual de fenol tamponado, mezclar con un vórtex durante unos segundos y centrifugar en una microcentrífuga a 3.200 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Transferir la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga limpio y añadir un volumen igual de cloroformo, mezclar con un vórtex durante unos segundos y centrifugar en una microcentrífuga a 3.200 x g a temperatura ambiente por 3 minutos transferir la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga limpio y en cubate a 95 ° C por 5 min; luego coloque en el hielo.
PRECAUCIÓN: Fenol y cloroformo son productos químicos peligrosos. Eliminación de residuos y manejo debe seguir regulaciones institucionales.
- Transferir la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga limpio y añadir un volumen igual de cloroformo, mezclar con un vórtex durante unos segundos y centrifugar en una microcentrífuga a 3.200 x g a temperatura ambiente por 3 minutos transferir la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga limpio y en cubate a 95 ° C por 5 min; luego coloque en el hielo.
- Como alternativa, utilizar un ácido apagando el protocolo. Para ello, añadir 2 μl de 1 M de HCl para detener la reacción en hielo por 6 min, luego añadir 0.64 μl de 1 M de dietanolamina (DEA) para neutralizar el pH de la mezcla de reacción e incubar a 95 ° C por 5 min; luego coloque en el hielo.
- Añadir un volumen igual de fenol tamponado, mezclar con un vórtex durante unos segundos y centrifugar en una microcentrífuga a 3.200 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
3. resina además de eliminar la contaminación de sal
- Con la cucharada de resina de la desalinización comercial kit (véase la Tabla de materiales), tomar suficiente resina para cubrir las hendiduras de la placa de resina 384-hoyuelo, 6 mg.
- Distribuir uniformemente la resina a través de las hendiduras (6 mg/hoyuelo) por raspado en la parte superior de la placa. Recuperar cualquier exceso de resina y vuelva a colocarla en la botella.
- Transferencia de los productos de la reacción final de paso 2.7 de los tubos de microcentrífuga a una placa de 384 pozos. Añada 16 μl de H2O para diluir los productos de la reacción final en cada pozo y sellar la placa y centrifugar para eliminar las posibles burbujas.
- Retire el sello, gire la placa de 384 pocillos con los productos de reacción boca abajo para cubrir la placa llena de resina.
- Voltee el sándwich de placas de bien a hoyuelo y cuidadosamente deje que la resina caiga en la placa de 384 pozos (Asegúrese de que la placa de 384 pozos quede al ras de la clavija de metal de la placa de relleno de resina).
- Quitar la placa en la parte superior, sellar la placa de 384 pocillos que contienen las mezclas de los productos de reacción y de la resina, brevemente la centrífuga a 3.200 x g para eliminar las posibles burbujas y colocar en un agitador durante al menos 15 min a temperatura ambiente para su contenido de la desalación.
- Después de la limpieza de resina, centrifugar la placa de 384 pozos a 3.200 x g durante 5 min compactar la resina en el fondo de los pozos.
4. transferencia de productos de la reacción a un Chip Matrix
- Fijar las placas de muestra en el depósito del nanoliter (nanodispenser, ver la Tabla de materiales).
- Puesto que la matriz de la viruta (véase la Tabla de materiales) y la placa de 384 pozos de sección 3.7 en la bandeja correspondiente.
- Utilice el nanodispenser para ver los productos de reacción a la viruta; Presione el botón Ejecutar en la pantalla táctil de la nanodispenser para empezar.
- Control de la imagen capturada automatizada de los puntos de muestra que contiene información de saturación en la pantalla para el volumen general de manchado en el chip está alrededor de 5-10 nL. Repetir la observación de la muestra si el volumen es insuficiente.
5. configuración de la información análisis de la espectrometría de masas
- Preparar un archivo en formato .xls que contiene la información de la señal esperada para la importación. Por ejemplo, utilice el ajuste de "P21_T28.xls" (tabla 2) para la reacción corrección de P21/T28 en los pasos 2, 3 y 4.
- Crear y definir un nuevo ensayo en el programa de aplicación (véase la Tabla de materiales) por clic Importación ensayo grupo diseñador formato y seleccione el archivo .xls (e.g., "P21_T28.xls" en el paso 5.1).
- Establecer el objetivo ensayo placa mediante el árbol de la opción de Cliente: proyecto: placa en el lado izquierdo de la pantalla haciendo clic en la parte superior del árbol y dándole un nombre de archivo (por ejemplo, "CTT20171201" representa el código de ensayo y la fecha).
- Seleccione el tipo de placa de 384 pozos y pulse OK; una placa en blanco aparecerá.
- Seleccionar el análisis apropiado (por ejemplo, P21_T28) en el lado izquierdo de la pantalla.
- Asignar el ensayo seleccionado (por ejemplo, P21_T28) para cada muestra manchado posición muestra en el chip resaltando el pozo y clic derecho para seleccionar Añadir Plex.
- Prepare una lista de trabajo de todas las pruebas en el chip en formato .xlsx con ningún encabezado (por ejemplo, 1201.xlsx de la tabla 3). Importar el trabajo lista mediante la opción de Añadir nuevo proyecto muestra .
- Asignar la prueba en la lista de trabajo (p. ej., de 1201.xlsx) a cada posición de la prueba de P21_T28 y elija haciendo clic derecho.
6. uso de MALDI-TOF MS operación
- Vincular el espectrómetro de masas con el chip con el programa de aplicación (véase la Tabla de materiales).
- Seleccione la configuración predeterminada en el lado derecho de la pantalla.
- Rellene el nombre de ensayo de paso 5.3 (p. ej., CTT20171201), chip de identificación en la esquina de la viruta y guardar la configuración.
- Iniciar el programa de control de MS (véase la Tabla de materiales).
- Presione el botón In/Out y sacar la placa del explorador. Coloque la ficha manchada de paso 4.4 en la placa del explorador y presione el botón In/Out para el chip manchado entrar en el espectrómetro de masas.
- Clic en el botón de la adquisición del programa de aplicación (véase la Tabla de materiales) para iniciar la espectrometría de masas y adquirir datos.
7. Análisis de datos
- Abrir el programa para el análisis de datos (véase Tabla de materiales).
- Examinar el árbol de la base de datos en la esquina superior izquierda y seleccione el ID del chip de paso 6.3. Abra el archivo de datos en el lado derecho de la pantalla.
- Haga clic en el icono de espectro para visualizar el espectro de masas. Para recortar una gama específica de m/z, haga clic para seleccionar el Cuadro de diálogo de personalización y en la nueva ventana haga clic en eje x y establecer el límite superior e inferior deseado y pulse OK para mostrar el rango especificado del espectro.
- Exportación el espectro de registros pulsando exportar.
Nota: Utilizando una escala de la unidad ancho/1.200 1.600 es un tamaño razonable para inspección de datos en una pantalla de ordenador.- Seleccione el tipo de archivo JPEG, haga clic en destino, seleccione Examinar disco (por ejemplo, flash disco E:), escriba el nombre del archivo (p. ej., 1201-1.jpg) y luego haga clic en exportar.
- Para la cuantificación de datos, utilizar el cursor y haga clic en el pico a la altura del pico en la esquina superior izquierda.
- También puede imprimir un archivo JPEG exportado y medir la altura con una regla manualmente.
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Representative Results
Plantillas y cartillas:
Utilizando el procedimiento presentado aquí, igual plantillas molar oligonucleótidos sintéticos y cebadores de secuencias relevantes obtenidas de fuentes comerciales fueron comprobados por su pureza y calidad (Figura 3A; nota que las señales de emparejar la masa señalada y el bajo fondo) así como para la relación entre la intensidad máxima y la masa de analito (figura 2A). Las alturas de pico fueron medidas y calculan (figura 2B) para la normalización de datos de MS.
Espectros de la condición y masa de la reacción:
El uso de la cartilla base solo reacciones de extensión juntada con MS de MALDI-TOF para la genotipificación se ha demostrado previamente para ser factible usar terminadores de ddNTPs estándar17. El ensayo de corrección utilizando ddNTPs estándar es similar a una reacción singleplex de genotipado pero es mucho más simple y muy fácil de realizar para obtener resultados limpios y confiables.
Los espectros de MS cubrieron todas las señales que se generan a partir de cebadores y plantillas (figura 3). El diseño apropiado de las cartillas y las plantillas genera un perfil de señal bien separados para las plantillas y los cebadores (figura 3). Según el valor de m/z, señales de plantillas y de sus productos de degradación parcial no específicos (m/z > 7.000) bien se separaron de los cebadores no coincidentes y revisar productos (m/z < 7.000 en la figura 3). Si es necesario, introducir fosfotioato nucleasa resistente bonos para reemplazar los 4 últimos enlaces fosfodiéster en el extremo 3' de la plantilla (tabla 1; T28S4/p21) puede reducir la hidrólisis no específica plantilla (figura 3; d27).
En la ausencia de dNTPs, KF tiene una sólida 3'-exonucleasa y es capaz de degradar la cartilla y la plantilla en vitro21. Como los nativos 4 dNTPs, la incorporación de 4 ddNTPs evita una degradación 3' final por KF (figura 3 y 3E). Asimismo, una una extensión de nucleótidos de los extremos 3' añade mayor estabilidad a la cartilla. Con pol corrección condiciones como ya describí20 con 10 U (46 pmol) KF, más del 80% de los sustratos 50-pmol Lencería desconjunta fueron corregido en 5 minutos (figura 3, 3Ey 3 G).
Productos intermedios y el análisis del mecanismo:
Resolución de MALDI-TOF MS puede ser tan fino como 1 dalton; de hecho, todos los sustratos, productos y productos intermedios con los cambios de masa en la reacción pueden resolverse en el mismo espectro de MS de la gama seleccionada. Por ejemplo, en un desajuste de la terminal T-G, la G no coinciden en el término de primer fue corregido con la incorporación de Doha con una diferencia de m/z de sólo 32. Tal una diferencia de m/z puede ser fácilmente identificada en el espectro de MS en un rango de m/z de 5.000 a 7.000 (Figura 4A). El cambio de cada señal individual puede ser calculado mediante la suma de todas las señales de la cartilla no coinciden, la supresión de intermediarios y revisar productos como 100%. Por ejemplo, en la reacción de revisión T-G, el producto corregido en relación con el producto de la escisión fue 23% versus 17%, a 5 min, 31% versus 18% en 10 min y 69% versus 14% en 20 min (Figura 4A).
Cuando está presente en la cartilla, los 2 últimos un penúltimo desajuste T G nt se debe suprimir seguido de una adición de PDD para completar la corrección. De hecho, los productos correctos aumentaron con el tiempo de 12% a los 5 min, 28% a los 10 min, a 45% en 20 min de la reacción. Además, dos formas de productos de supresión para una T-G penúltima revisión, los productos de supresión intermedio y 2-nt 1 nt supresión, eran fácilmente resoluble (Figura 4B).
Corrección cinética con dNTP sola:
Para pol de e. coli ADN, ddNTPs no son sustratos adecuados y pueden considerarse como inhibidores de la22. Alternativamente, usando una sola dNTP 'correcto' en la reacción de corrección en lugar de otro también suprime no específica actividad de exonucleasa 3' - 5' y la generación de productos de la extensión de un solo nucleótido adecuados para análisis de MS (figura 5B). La tasa de corrección obtenida de reacciones que contengan un dCTP solo es alrededor de dos veces mayor que las reacciones que contienen los 4 ddNTPs (figura 5A, 5By 5C). Así, el uso de un único dNTP 'correcto' en el ensayo de revisión da como resultado mejor sin los efectos inhibitorios de ddNTPs. Este enfoque debe proporcionar una mayor sensibilidad para corrección análisis cinéticos.
Corrección de desajustes internos:
MS corrección ensayos con KF para desajustes internos y la identificación de productos corregir son simples (es decir, la corrección exonucleasa accisas nucleótidos del extremo 3' para el desajuste interno de los iniciadores), seguido por el adición de ddNMP emparejado a la supresión productos a través de la generación de función polimerasa revisar productos más cortos que los sustratos de la cartilla (figura 6). Se observó una clara tendencia de corrección de eficiencia, donde KF eficiente corregir desajustes en la última, penúltima, 3rd y 4th nucleótidos del extremo 3' de los cebadores (figura 6; 1, 2, 3 y 4). Uniones mal hechas en 5 nt desde el extremo 3' de la cartilla fueron corregidas parcialmente con < 15% de corrección de la discrepancia y > 15% de la cartilla demostró una extensión sin corrección (figura6; MM5). KF no se pudo corregir desajustes en 6, 7, 8 y 9 nt desde el extremo 3' de la cartilla (figura 6; MM6, 7, 8 y 9) extendido pero aún una importante proporción de sustratos (figura 6; PE de MM6, 7, 8 y 9).
Reparación de lesión deoxyinosine:
En e. coli, deoxyinosine en el ADN se procesa principalmente por el endo V reparación vía20,23. V Endo inicia la reacción por una incisión en el segundo enlace fosfodiéster 3' de la lesión de dI. La rotura del filamento generada se cree para ser utilizado por pol para una supresión de la lesión posterior y ADN resíntesis24. Este procedimiento se aplicó para probar pol reparar sustratos que contengan dI en el 3' penúltimo sitio (tabla 1; Un-I, C-I, G-I y T-I) para validar esta hipótesis. La reparación del 3' penúltimo dI es análoga a la corrección del penúltimo desajuste T G (Figura 4B y 6; Entrada mm2), en el que los 2 últimos nt debe ser quitado seguido de una adición de un ddNMP correcto para completar la reparación. Patrones de MS mostraron claramente pol corregí heterodúplex de la A-I, G-I y T-, aunque con diferentes eficiencias (figura 7; Señales de RP). Sin embargo, el C-I sustrato era refractario a la pol reparar (tabla 1 y figura 7 y 7E; RP muy baja) y demostró la extensión de la cartilla en gran medida (figura 7; Señal de PE).
Figura 1 . Sistema para corrección de ensayo modelo. Una cartilla fue recocida como se indica a una plantilla formando un desajuste terminal (negrita). Corrección exonucleasa de la ADN polimerasa sería detectar y eliminar los nucleótidos no coinciden formando un producto de la supresión. En presencia de una ADN polimerasa y los cuatro ddNTPs, el producto de la supresión se prolonga por una única base complementaria al anterior sitio no coinciden. Cuando se someten a MALDI-TOF, la diferencia de masa entre la cartilla no coinciden, los productos de escisión y los productos corregir puede resolver. (Esta figura es una adaptación de Su et al. 25 con permiso.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Intensidad máxima y oligonucleótidos Massachusetts Ocho oligonucleótidos de 17 a 24 nt con secuencias complementarias al extremo 3' del T28 (tabla 1) fueron probados. (A) A mezcla de 50 pmol de cada oligonucleótido en soluciones de 40 μl se sometió a un análisis de MS. (B) la altura máxima de 17 nt fue utilizado como 100% para el cálculo. La intensidad relativa de cada oligonucleótido fue el promedio de seis determinaciones y las barras de error representan 1 desviación estándar. (Esta figura es una adaptación de Su et al. 25 con permiso.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Efecto del diseño de plantilla diferentes. Reacciones de corrección se evaluaron con la cartilla de P21 formando un desajuste T-G terminal con diferentes plantillas. El ensayo de la revisión se realizó con 10 U (43 pmol) Klenow polimerasa 50 pmol sustrato y 4 ddNTPs a 37 ° C por 5 min (A) este panel muestra un sustrato P21/T32 T-G sin enzima. (B) este panel muestra una extensión de la cartilla de un substrato de P21/T32 T-A por 3' exonucleasa deficiente Klenow. PE = producto de extensión de la cartilla. (C) este panel muestra una corrección del sustrato P21/T32 T-G. PP = producto de corrección; D26, d27, d28 = plantilla degradadas por el extremo 3'. (D) este panel muestra un sustrato P21/T28 T-G sin enzima. (E) este panel muestra una corrección del sustrato P21/T28 T-G. PP = producto de corrección; D26, d27 = plantilla degradadas por el extremo 3'. (F) este panel muestra un sustrato P21/T28S4 T-G sin enzima. (G) este panel muestra una corrección del sustrato P21/T28S4 T-G. PP = producto de corrección; EP = productos de escisión; D27 = subproducto de degradación de plantilla. (Esta figura es una adaptación de Su et al. 25 con permiso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Curso Análisis de tiempo para productos de excisión y corrección de textos. Revisión de los ensayos se realizaron con 2 U (8.6 pmol) KF y 50 pmol sustratos como se describen en el protocolo. Las reacciones se apagó en el indicado veces. (A) este panel muestra una corrección de un 3' terminal desajuste T G; EP = corrección de la supresión producto; D18 y d19 = subproductos de la supresión del exceso; PP = productos de corrección; P21 = cartilla no coinciden. (B) este panel muestra una corrección de un desequilibrio de T G 3'-penúltimo; EI-1 = supresión intermedia; EP-2 = corrección de la supresión de productos; D18 = subproducto de la supresión del exceso; PP = productos de corrección; P21 = cartilla no coinciden; Na = sodio ion enlazado nucleótidos. (Esta figura es una adaptación de Su et al. 25 con permiso.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Corrección de la reacción con 4 ddNTPs versus un dNTP solo. Revisión de los análisis fueron realizados con 0.1 U (0,43 pmol) KF y 50 pmol sustratos como se describen en el protocolo. Las reacciones se apagó en el indicado veces. (A) este panel muestra una corrección de un 3' terminal G G desajuste con 4 ddNTPs; EP = corrección de la supresión producto; PP = corrección de resíntesis de productos; P21G = cartilla no coinciden. (B) este panel muestra una corrección de un 3' terminal G G desajuste con dCTP; PP = corrección de resíntesis de productos; P21G = cartilla no coinciden. (C) la corrección de los niveles son el promedio de tres determinaciones y las barras de error representan 1 desviación estándar. Na+ = sodio ion enlazado nucleótidos. (Esta figura es una adaptación de Su et al. 25 con permiso.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Corrección de desajustes internos. Revisión análisis fueron realizados con polimerasa de Klenow de (8.6 pmol) de U 2 y 50 pmol sustratos en 37 ° C durante 20 min como se describe en el protocolo. En blanco = blanco de enzima de un sustrato de 1. 1 = un sustrato P21/T28 T-G; Mm2 a MM9 = sustratos con desajustes internos, los números indican la posición de desequilibrio en relación con el extremo 3'. P21 = cartillas no coincidentes; PR = corregir productos; PE = cartillas extendidos; D19 y d20 = derivados de exceso de la supresión, los números representan el tamaño de los nucleótidos. (Esta figura es una adaptación de Su et al. 25 con permiso.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 . Reparación de 3' penúltimo deoxyinosine lesiones. Ensayos de reparación se realizaron con 2 U Klenow polimerasa y 50 pmol sustratos en 37 ° C como se describe en el paso 2.3 de protocolo. Las reacciones se apagó en el indicado veces. Estos paneles muestran reacciones con (A) T-I sustrato; (B) G-I sustrato; (C) A-I sustrato; y (D) C-I sustrato. RP = reparación de productos; EP = productos de escisión; PE = productos de extensión de la cartilla, Na+ = sodio ion aductos. (E) la corrección de los niveles de T-I, G-I y A-fuera el promedio de tres determinaciones y las barras de error representan 1 desviación estándar. Los niveles de corrección para la C-fuera el promedio de dos determinaciones. (Esta figura es una adaptación de Su et al. 25 con permiso.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Sustratos de | Secuencias de | Eficacia de la corrección (pmol) | |
| P21/T32 | 3'-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 17.3 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 18.4 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28S4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 22.9 | |
| NMR | 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | ||
| MM2 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 13.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA | |||
| MM3 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 16.9 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA | |||
| MM4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 15.1 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA | |||
| MM5 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 4.2 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA | |||
| MM6 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5* | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA | |||
| MM7 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA | |||
| MM8 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACATTGGGAA | |||
| MM9 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA | |||
| A-YO | 3'-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT | 8.2 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| C-I | 3'-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT | 1.0 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| G-I | 3'-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT | 15.4 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| T-ME | 3'-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT | 16.6 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
Tabla 1. Corrección de sustratos y la eficacia de la corrección por el fragmento de Klenow. Esta tabla muestra el bold 4-nucleótidos en el extremo 3' de la plantilla que contiene fosfotioato modificaciones. Los pares de bases están en negrita. La corrección de los análisis fueron realizados con polimerasa de Klenow de (8.6 pmol) de U 2, 50 pmol sustrato y 4 ddNTPs a 37 ° C durante 10 minutos * estos valores son los límites más bajos para el nivel de corrección porque el ruido de fondo impide estimaciones precisas de < 1% de la señales de masa total observadas. (Esta figura es una adaptación de Su et al. 25 con permiso.)
| BIEN | PLAZO | SNP_ID | 2 º-PCRP | 1 º-PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | TM | PcGC | PWARN | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_CALL | EXT1_MASS |
| W1 | iPLEX | T28 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 8524.54 | ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | |||
| W1 | iPLEX | P21 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 6495.24 | TACCAGTCAGGACGTTGGGAA | |||
Tabla 2. Archivo de T28_P21.xlsx. El ajuste fue utilizado para la figura 3D, 3E, 4Ay 5A.
| 1201-1 |
| 1201-2 |
| 1201-3 |
| 1201-4 |
| 1201-5 |
| 1201-6 |
| 1201-7 |
Tabla 3. archivo de 1201.xlsx. El ajuste fue utilizado para reacciones de 7 en la Figura 4A.
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Discussion
Este estudio describe un ensayo de actividad corrección paso a paso por el instrumento comercial solicitado (ver la Tabla de materiales) utilizando MS de MALDI-TOF. Las principales ventajas son que la cartilla y la plantilla son etiqueta gratuito y fácil de realizar, lo que permite una mayor flexibilidad en el diseño de experimentos. Una corriente-cal completa procesamiento de 30 corrección pruebas llevaría h 4, incluyendo 3 h para realizar manualmente las corrección de las reacciones y su limpieza, mientras que los análisis de MALDI-TOF MS utilizando el protocolo ya mencionado toma 1 hora para completar. El principal inconveniente de este método es la cantidad de sustrato requerido para el ensayo. Para obtener las señales fuertes y consistentes resultados, hemos utilizado 50 pmol de sustrato de DNA en una reacción de 20 μl; por lo tanto, la cantidad de ADN es mucho mayor que con radiactivos ADN experimentos8,9,10. Reducción de los volúmenes y tamaño de la muestra y ajustar la operación de MS pueden disminuir la cantidad de sustrato requerido.
Oligonucleótidos sintéticos obtenidos de fuentes comerciales pueden utilizarse para el estudio revisión directamente sin más purificación o tratamiento. Sin embargo, es recomendable comprobar la pureza y calidad del ADN por MALDI-TOF MS. Los bonos fosfotioato fueron introducidos para sustituir el último 4 enlaces fosfodiéster en el extremo 3' de la plantilla (tabla 1) para reducir la degradación no específicos de la cadena (figura 3), aunque a un mayor coste por muestra. Curiosamente, las señales de la plantilla y el ADN de la cartilla pueden ser bien separadas por MS en virtud de sus diferencias en tamaño; por lo tanto, no se requiere esta modificación fosfotioato. En la figura 3E, por ejemplo, todos los productos posibles de la extensión de la cartilla P21 corrección escisión y resíntesis fueron menos de 22 nt (m/z < 7.000), mientras que todos los fragmentos de la degradación de plantilla T28 fueron mayores a 24 nt (m/z > 7.000 ). Los resultados en la Figura 4A se fueron de la misma P21/T28 duplex como en la figura 3E. Una ventana ampliada de m/z 6.000-7.000 muestra sólo las señales de la cartilla de ADN sin ninguna señal de confusión de la plantilla.
La estrategia de usar cebadores con una extensión de ddNMP resultó para ser muy estable, y, así, productos que contienen ddNMP son buenos indicadores para el análisis de la corrección. La adición de ddNMP a los productos de escisión podría 'congelar' los productos de corrección en el estado para su análisis inmediatamente posterior supresión. Alternativamente, también es factible usar un dNTP correcta única (figura 5B) en lugar de 4 ddNTPs para suprimir la actividad hidrolítica no específicos de la corrección exonucleasa.
Detener las reacciones con un procedimiento de extracción estándar de fenol/cloroformo demostró para ser el mejor medio para la terminación de la reacción puesto que, en un solo paso, que permite las reacciones que se detenga mientras también eliminar cualquier interferencia de proteína. Por otra parte, ácido amortiguamiento, siendo susceptible de automatización, luego neutralizado por el no metal alcalino sin una separación de fase, también demostró resultados fiables. Aductos de ión sodio (Na+ en la figura 4, 5y 7) son motivo de preocupación ya que pueden aumentar el fondo y complicar la discriminación de la señal. Un buen uso de la resina limpia puede reducir tal interferencia; sin embargo, incluso cuando tales aducciones están presentes normalmente tienen picos mucho más pequeños en relación con su padres-señal y esta propiedad puede utilizarse para distinguir entre ellos (figura 4, 5y 7). Generalmente, la altura máxima de sodio aductos fue proporcional a los picos principales; la inclusión o exclusión de sodio aductos en el cálculo no afectó significativamente los resultados de la cuantificación. Por lo tanto, para la cuantificación, se utilizó la altura del pico principal sólo para el cálculo.
Los experimentos de corrección descritos aquí tomaron ventaja de desajustes internos que demuestran la importancia de la exonucleasa partición de dominio análisis de KF26 y polimerasa de la DNA detallada I capaces de corregir eficazmente el desequilibrio en hasta 4 nt upstream del primer 3' extremo (figura 5, 1 - 4) posiblemente debido a la estabilidad de bases en la plantilla primer enlaces27. Además, este estudio también utiliza cartillas que contienen las lesiones deoxyinosine penúltimo para estudiar un pol que reparo de endo Mellado V reparación intermedios. Los resultados mostraron que T-estaba reparado más eficientemente que A- y G-I; sin embargo, C-era refractario a la pol reparar (tabla 1 y figura 7). Estos resultados confirman que un análisis por MALDI-TOF MS puede ser muy útil para la corrección y corto-patch varios ensayos de reparación de la DNA28 debido a su alta resolución.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos la instalación integrada de base de NCFPB genómica funcional (Taipei, Taiwan) y el laboratorio de farmacogenómica de la NRPB (Taipei, Taiwán) por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Fundación de salud de Taiwán (L-I.L.) y el Ministerio de ciencia y tecnología, Taipei, Taiwán, ROC [más 105-2320-B-002-047] para Hu Yao Wei, [más 105-2628-B-002-051-MY3] Kang-Yi Su y [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] para en Liang Lin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
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