Summary
Foi desenvolvido um método não-rotulados, não-rádio-isótopos para revisão de DNA polimerase e um ensaio de reparo de DNA usando espectrometria de massa MALDI-TOF de alta resolução e uma estratégia de extensão de nucleotídeo único. O ensaio provou ser muito específico, simples, rápida e fácil de executar para revisão e reparação patches menor que 9-nucleotídeos.
Abstract
A manutenção do genoma e sua replicação fiel é de suma importância para a conservação de informação genética. Para avaliar a replicação de alta fidelidade, nós desenvolvemos um simples não-rotulados e análise de espectrometria (MS) para um estudo de revisão de massa não-rádio-isótopos método usando uma ionização de dessorção do laser assistida por matriz com tempo-de-voo (MALDI-TOF). Aqui, uma DNA polimerase [por exemplo, o fragmento de Klenow (KF) de Escherichia coli DNA polimerase eu (pol eu) neste estudo] na presença de todos os quatro dideoxyribonucleotide trifosfatos é usado para processar um duplex de primeira demão-modelo incompatíveis. O primer incompatível é então estendido/revisado e submetido a MALDI-TOF MS. Os produtos distinguem-se pela variação da massa do primer até variações de nucleotídeo único. Importante, uma revisão pode também ser determinado para incompatibilidades única internas, embora a diferentes eficiências. Localizado em 2-4-nucleotídeos (nt) da extremidade 3' de incompatibilidades foram eficientemente revisado por pol eu, e um descompasso em 5 nt o terminus da primeira demão de mostrou apenas uma correção parcial. Nenhuma revisão ocorreu para incompatibilidades internas localizadas em 6-9 nt da extremidade 3' da primeira demão. Esse método também pode ser aplicado a ensaios de reparo do DNA (por exemplo, avaliar uma reparação da base-lesão de substratos para o caminho de reparação endo V). Cartilhas contendo 3' lesões penúltima deoxyinosine (dI) podem ser corrigidas por pol eu. Com efeito, penúltimo T-eu, G-eu e A-eu substratos tinham sua última 2 dI-contendo nucleotídeos extirpado por pol eu antes de adicionar um ddN correta 5'-monofosfato (ddNMP) enquanto o penúltimo C-eu incompatibilidades foram toleradas por pol eu, permitindo que o primer ser estendido sem reparação, demonstrando que a sensibilidade e a resolução do MS do ensaio para medir a reparação do DNA.
Introduction
As funções de revisão de polimerases de DNA durante a replicação do DNA são essenciais para garantir a alta fidelidade da informação genética que precisa ser transferido para progênie1,2,3,4, 5,6,7. Ser capaz de avaliar as contribuições da polimerase revisão se exonucleases gostaria de esclarecer os mecanismos para salvaguardar a estabilidade genética.
Radioisótopo rotulagem e ensaios baseados em gel em combinação com análises densitométricos do autoradiograms ou do fósforo de imagem8,9,10 tem sido tradicionalmente usados para detectar a atividade de revisão de DNA polimerases. Embora funcional, estes ensaios são trabalhoso, caro e não passível de formatos de alta produtividade. Além disso, radioisótopos sofrem de problemas de segurança, incluindo a eliminação de resíduos. Alternativamente, as atividades de revisão foram analisadas por técnicas fluorométrica. Por exemplo, 2-aminopurina (2-AP) pode ser incorporado em produtos de extensão durante a polimerase em vitro revisão ensaios para produzir um sinal fluorescente11,12. Infelizmente, essas abordagens sofrem uma baixa especificidade, desde 2-AP pode emparelhar com timina e citosina. Abordagens mais recentes incluem uma sensível baseados em G-quadruplex luminescente ligar sonda para um polymerase 3' - 5' exonuclease ensaio13 , bem como uma sonda fluorescente-etiquetadas individualmente para um polymerase revisão ensaio que supera alguns do desvantagens acima de14. Entusiasmo para esses métodos fluorométrica é diminuído devido à necessidade da rotulagem específica de substratos de DNA.
Em contraste, uma MALDI-TOF MS para análise de DNA tem sido utilizada no ensaio de PinPoint, onde as reações de extensão da primeira demão com 4 ddNTPs sem rótulo podem ser usadas para identificar polimorfismos em um determinado locus15,16,17 e foi adotado extensamente em aplicações clínicas para a detecção de mutações e câncer diagnostica18. Usando estes princípios básicos, nós criamos um rótulo livre ensaio para a determinação em vitro da DNA polimerase revisão atividade explorando a alta resolução, alta especificidade e potencial de alto rendimento de MALDI-TOF MS. usando o E. Coli DNA polimerase eu Klenow fragmento como uma enzima modelo, dideoxyribonucleotide trifosfatos (ddNTPs) como substratos podem tomar um "instantâneo" de revisão de produtos depois de um único nucleotídeo extensão através de MALDI-TOF MS (Figura 1).
Da mesma forma, este método também foi desenvolvido para um ensaio de reparo de DNA onde cartilhas contendo 3' penúltimo dI lesões são submetidas a uma pol que reparar o ensaio que imita endo V roubada reparação intermediários. Enquanto não são totalmente conhecidas, o caminho de reparação endo V é o único sistema de reparação conhecido para empregar o pol eu revisão atividade do exonuclease para excisão de lesão19,20. Usando o MALDI-TOF MS, mostramos um remendo de reparação claramente definidos onde dI pode ser extirpado por pol eu quando ocorrem no último 2 nt do primer antes de adicionar o nucleotídeo complementado correto.
Para o estudo de revisão e reparação do ADN, este método é mais rápido e menos trabalhoso do que métodos anteriores e fornece informações adicionais para o mecanismo e função.
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Protocol
1. modelo de primer/preparação
- Projetar primers/modelos com um conteúdo de G + C equilibrado entre 40% e 60% como em uma sequência ou projeto da primeira demão PCR. Use as primeiras demão de 18 a 21 nt para um recozimento apropriado e melhores sinais de MS.
- O modelo de design, definindo a 50 ° C como o mínimo de temperatura para a região de frente e verso pelo menos 7 de fusão nt de 5'-saliência para separar os sinais entre o primer e o modelo.
Nota: por exemplo, para o substrato P21/T28 na tabela 1, o primer 21-nt é emparelhado com um modelo 28-nt. Opção: o uso de alternativos ácidos nucleicos tais como resistente a nuclease phosphorothioate títulos para substituir a última 4 ligações fosfodiéster na extremidade 3' do modelo pode impedir a interferência possível, uma degradação de extremidade 3' não-específica dos modelos ( por exemplo,, T28S4 na tabela 1), embora isto irá adicionar algum custo para a preparação de modelo. - Usar o padrão oligonucleotides demolhados, sem qualquer outra purificação é satisfatória para este estudo. Uso do oligonucleotide cartilhas/modelos em uma concentração de 100 pmol / µ l em H2O como um estoque e armazená-lo a-20 ° C. Verificar a qualidade e a pureza das primeiras demão e modelos executando os oligonucleotides na MALDI-TOF MS (passos 4-7) para garantir o único pico sinais e um bom sinal à relação de ruído.
- Determine o relativo intensities de MALDI-TOF MS sinal (passo 7) dos primers molares iguais das sequências relevantes na reação para calibração e concentração normalização (Figura 2).
2. revisão de reações
Nota: O protocolo e a mesma condição de reação correcção aplica-se a uma reparação do ADN da-eu, G-eu, C-I e T-eu.
- Usando uma incompatibilidade de T-G de substrato P21/T28 para a revisão na tabela 1 , por exemplo, diluir a primeira demão P21 e modelo T28 para 12,5 pmol / µ l com H2O; Então transferi 12 µ l da primeira demão diluída e 12 µ l do modelo diluído para um tubo esterilizado microcentrifuga 1,5 mL.
Nota: A quantidade de mistura modelo/primer é suficiente para 2 reações; proporcionalmente, aumentar o volume dos reagentes conformemente para várias reações. - Feche o tubo firmemente. -Incubar durante 30 min num coberto-65 ° C banho de água, seguido por 30 min em um banho de água de 37 ° C e finalmente no gelo para garantir uma adequada recozimento.
- Para um tubo esterilizado microcentrifuga 1,5 mL, adicionar 8 µ l de primer e mistura de modelo (50 pmol), 2 µ l de 10 x revisão amortecedor da reação, 4 µ l de mistura de 4 ddNTPs (2 mM de cada 4 dNTPs) e H2O até 18 µ l. Agite o tubo para misturar.
Nota: 1 x revisão reação buffer que contém o 50mm NaCl, 10 mM MgCl2, ditiotreitol 1 mM e 10 mM Tris-HCl (pH 7.9 a 25 ° C). Consulte a Tabela de materiais da fonte comercial de 10 x revisão amortecedor da reação. A concentração final de cada ddNTP na reação é de 0,1 mM. - Diluir a DNA polimerase na gelada 1x tampão de reação para a concentração desejada de revisão [por exemplo, para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, adicionar 4 µ l de 1 x revisão amortecedor da reação e 1 µ l de polymerase de Klenow 5-U de uma fonte comercial (tabela de Materials)]. Armazene a enzima diluída no gelo em todos os momentos.
Nota: A quantidade de diluídos DNA polimerase é suficiente para 2 reações; proporcionalmente, aumentar o volume das enzimas em conformidade para várias reações. Um volume de 2,0 µ l, contendo 2,0 unidades de Klenow polimerase, pode revisar mais de metade dos 50 pmol de T-G terminal incompatíveis P21/T28 em 5 min. - Escaldar o tubo de microcentrifugadora com a mistura de substrato da etapa 2.3 para a temperatura de reação desejada (por exemplo, tipicamente 37 ° C para Klenow polimerase e 25 ° C para T4 DNA polimerase). Em seguida, transferir 2,0 µ l da DNA polimerase diluída de passo 2.4 para a mistura de substrato escaldadas e agite o tubo para misturar seu conteúdo.
- Centrifuga os tubos com enzima e substrato durante alguns segundos a 3.200 x g, à temperatura ambiente a girar para baixo os componentes das reações. Transferi imediatamente a reação a um bloco de aquecimento ou um banho de água à temperatura de incubação desejado como na etapa 2.5.
-
Terminar a reação
- Adicionar um volume igual de fenol tamponado, misture-o vortexing por alguns segundos e centrifugá-lo numa microcentrifuga a 3.200 x g, à temperatura ambiente por 5 min.
- Transferir a fase aquosa para um tubo de microcentrifugadora limpa e adicionar um volume igual de clorofórmio, misture-o pela utilização do Vortex durante alguns segundos e centrifugar em uma microcentrífuga a 3.200 x g, à temperatura ambiente por 3 min. transferir a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga limpos e em cubate que a 95 ° C por 5 min; Coloque-o no gelo.
Cuidado: Fenol e clorofórmio são produtos químicos perigosos. Eliminação de resíduos e manuseio deve seguir regulamentos institucionais.
- Transferir a fase aquosa para um tubo de microcentrifugadora limpa e adicionar um volume igual de clorofórmio, misture-o pela utilização do Vortex durante alguns segundos e centrifugar em uma microcentrífuga a 3.200 x g, à temperatura ambiente por 3 min. transferir a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga limpos e em cubate que a 95 ° C por 5 min; Coloque-o no gelo.
- Como alternativa, use um ácido extinguendo o protocolo. Para isso, adicionar 2 µ l de 1 M HCl para parar a reação no gelo por 6 min, em seguida, adicione 0,64 µ l de 1m dietanolamina (DEA) para neutralizar o pH da mistura de reação e incube-a 95 ° C por 5 min; Coloque-o no gelo.
- Adicionar um volume igual de fenol tamponado, misture-o vortexing por alguns segundos e centrifugá-lo numa microcentrifuga a 3.200 x g, à temperatura ambiente por 5 min.
3. resina além de eliminar a contaminação de sal
- Usando a colher de resina da dessalinização comercial kit (veja a Tabela de materiais), levar a resina suficiente para cobrir as ondulações da placa covinha 384-dimple, 6 mg de resina.
- Distribuir a resina entre todas as ondulações uniformemente (6 mg/covinha) por raspagem na parte superior da placa. Recuperar qualquer excesso de resina e substituí-lo na garrafa.
- Transferi os produtos da reacção final do passo 2.7 dos tubos de microcentrífuga para um placa de 384. Dispense a 16 µ l de H2O para diluir os produtos de reação final em cada poço e, em seguida, selar a placa e centrifugar para remover quaisquer bolhas.
- Remover o selo, vire a placa com os produtos de reação de cabeça para baixo para cobrir o prato cheio de resina covinha 384.
- Vire o sanduíche de placas bem-para-dimple e cuidadosamente, deixe a resina cair a placa de 384 (certifique-se de que a placa de 384 é rente o pino de metal no prato cheio de resina covinha).
- Retire a placa de covinha no topo, selar a placa 384 contendo as misturas dos produtos da reação e da resina, brevemente, centrifugue-a 3.200 x g para remover quaisquer bolhas e colocá-lo em rotacao pelo menos 15 min à temperatura ambiente para dessalinização de seu conteúdo.
- Após a limpeza da resina, centrifugar a placa de 384 a 3.200 x g por 5 min compactar a resina no fundo dos poços.
4. transferir produtos de reacção a um Chip Matrix
- Definir as placas de amostra no compartimento nanolitros (nanodispenser, consulte a Tabela de materiais).
- Colocar o chip matrix (consulte a Tabela de materiais) e a placa de 384 de seção 3.7 na bandeja do correspondente.
- Operar o nanodispenser para identificar os produtos de reação para o chip; Pressione o botão executar na tela de toque da nanodispenser para começar.
- Veja se a imagem capturada automatizada das manchas de amostra contendo informações de saturação na tela para garantir o volume global de manchado no chip está em torno de 5-10 nL. Repita a amostra manchar se o volume for insuficiente.
5. configurar as informações de ensaio sobre a espectrometria de massa
- Prepare um arquivo no formato. xls que contém as informações de sinal antecipado de importação. Por exemplo, use a configuração de "P21_T28.xls" (tabela 2) para a reação de correcção de P21/T28 nas etapas 2, 3 e 4.
- Criar e definir um novo ensaio no programa aplicativo (consulte a Tabela de materiais) pelo botão direito do mouse o Grupo de ensaio de importação no formato de Designer e selecione o arquivo. xls (por exemplo, "P21_T28.xls" da etapa 5.1).
- Estabelecer o alvo ensaio placa através da árvore de opção do Cliente: Projeto: placa no lado esquerdo da tela, clicando com o topo da árvore e dando-lhe um nome de arquivo (por exemplo, "CTT20171201" representa o código de ensaio e data).
- Selecione o tipo de placa 384 e prima Okey; uma placa em branco será exibida.
- Selecione o ensaio apropriado (por exemplo, P21_T28) no lado esquerdo da tela.
- Atribua o ensaio selecionado (por exemplo, P21_T28) para cada amostra, visto a posição da amostra no chip destacando o poço e botão direito do mouse para selecionar Adicionar Plex.
- Prepare uma lista de trabalho de todos os testes do chip no formato. xlsx com nenhum cabeçalho (por exemplo, 1201.xlsx do quadro 3). Importe o trabalho lista através da opção de Adicionar novo projeto de amostra .
- Atribuir o teste na lista de trabalho (por exemplo, de 1201.xlsx) para cada posição do ensaio do P21_T28 e escolha clicando.
6. MALDI-TOF MS operação
- Link o espectrômetro de massa para o chip usando o programa de aplicação (veja a Tabela de materiais).
- Selecione a configuração padrão no lado direito da tela.
- Preencha o nome de ensaio da etapa 5.3 (por exemplo, CTT20171201), ID do chip no canto do chip e salvar as configurações.
- Iniciar o programa de controle de MS (ver a Tabela de materiais).
- Pressione o botão de In/Out e retire a placa de escoteiro. Coloque o chip manchado da etapa 4.4 na chapa de escoteiro e pressione o botão de In/Out para o chip manchado entrar o espectrômetro de massa.
- Clique no botão de aquisição do programa aplicativo (consulte a Tabela de materiais) para iniciar a espectrometria de massa e aquisição de dados.
7. análise de dados
- Abra o programa para a análise de dados (consulte a Tabela de materiais).
- Procurar na árvore do banco de dados no canto superior esquerdo e selecione o ID da microplaqueta da etapa 6.3. Abra o arquivo de dados no lado direito da tela.
- Clique no ícone de espectro para exibir o espectro de massa. Para cortar um intervalo específico de m/z, botão direito do mouse para selecionar a Caixa de diálogo personalização e na nova janela, clique no eixo x e definir o limite superior e inferior desejado e pressione Okey para mostrar o intervalo especificado do espectro.
- Exporte o espectro para registos clicando em Exportar.
Nota: Usando uma escala de unidade de largura/1.200 1.600 é um tamanho razoável para inspeção de dados em uma tela de computador.- Selecione o tipo de arquivo JPEG, clique no destino, selecione Browse disco (por exemplo, disco flash e:), digite o nome do arquivo (por exemplo, 1201-1. jpg) e, em seguida, clique em Exportar.
- Para quantificação de dados, use o cursor e clique sobre o pico para mostrar a altura do pico no canto superior esquerdo.
- Alternativamente, imprima um arquivo JPEG exportado e medir a altura do pico com uma régua manualmente.
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Representative Results
Primers e modelos:
Usando o procedimento apresentado aqui, igual modelos molar do oligonucleotide sintéticas e primers de sequências relevantes obtidas de fontes comerciais foram verificadas por sua pureza e qualidade (Figura 3A; note que os sinais combinados a massa designada e o baixo fundo) bem como para a relação entre o pico de intensidade e a massa do analito (Figura 2A). As alturas de pico foram medidas e calculados (Figura 2B) para a normalização de dados do MS.
Espectros de condição e massa de reação:
O uso de reações de extensão única primeira demão base juntamente com MALDI-TOF MS para a genotipagem anteriormente mostrou ser viável usando ddNTPs padrão terminadores17. O ensaio de revisão usando ddNTPs padrão é semelhante a uma reação de singleplex de genotipagem, mas é muito mais simples e muito fácil de executar para obter resultados fiáveis e limpos.
Os espectros de MS coberto todos os sinais gerados a partir de ambos os primers e modelos (Figura 3). O projeto apropriado das primeiras demão e modelos gerados um perfil de sinal bem separados para ambos os modelos e os primers (Figura 3). De acordo com o valor de m/z, sinais de modelos e seus produtos de degradação parcial não-específica (m/z > 7.000) foram bem separados as primeiras demão incompatíveis e revisar produtos (m/z < 7.000 na Figura 3). Se necessário, introduzir phosphorothioate nuclease resistente títulos para substituir a última 4 ligações fosfodiéster na extremidade 3' do modelo (tabela 1; T28S4/P21) pode reduzir a hidrólise de modelo específico (Figura 3; d27).
Na ausência de dNTPs, KF tem um robusto 3'-do exonuclease e é capaz de degradar o primer e o modelo em vitro21. Como os nativos 4 dNTPs, a adição das 4 ddNTPs impede uma degradação de extremidade 3' por KF (Figura 3 e 3E). Da mesma forma, uma extensão de nucleotídeo um de 3'-extremidades adiciona estabilidade aumentada para a primeira demão. Usando pol condições de revisão, como já descrevi20 com 10 U (46 pmol) KF, mais de 80% de substratos a 50-pmol incompatível foram corrigidos em 5 min (Figura 3, 3Ee 3G).
Análise do mecanismo e intermediários:
MALDI-TOF MS resolução pode ser tão fina como 1 dalton; com efeito, todos os substratos, produtos e intermediários com alterações em massa na reação podem ser resolvidos no mesmo espectro MS do intervalo selecionado. Por exemplo, em uma terminal incompatibilidade T-G, o G incompatível no terminus da primeira demão foi corrigido com a incorporação de desenvolvimento de Doha, com uma diferença de m/z de apenas 32. Uma diferença tão m/z pode ser facilmente identificada no espectro do MS em uma escala de m/z de 5.000 a 7.000 (Figura 4A). A mudança de cada sinal individual pode ser calculada através da soma de todos os sinais do primer incompatível, excisão de intermediários e revisado produtos como 100%. Por exemplo, na reação de correcção do T-G, o produto corrigido em relação ao produto a excisão foi 23% contra 17% em 5 min, 31% contra 18% em 10 min e 69% contra 14% durante 20 min (Figura 4A).
Quando uma incompatibilidade de T-G a penúltima está presente no primer, os 2 últimos nt deve ser extirpado, seguido por uma adição de ddA para completar a correção. Com efeito, os produtos corretos aumentaram com o tempo de 12% em 5 min, 28% em 10 min, para 45% em 20 min da reação. Além disso, duas formas de produtos de excisão de um T-G penúltima revisão, produtos intermédios e 2-nt excisão 1-nt excisão, foram facilmente resolvível (Figura 4B).
Revisão de textos cinética com único dNTP:
Para pol de DNA de Escherichia coli , ddNTPs não são substratos adequados e devem ser considerados como inibidores22. Como alternativa, usar um único 'correto' dNTP na reação de correcção em vez disso também suprimirá específico atividade de exonuclease 3' - 5' e a geração de produtos de extensão de nucleotídeo único adequados para análise de MS (Figura 5B). A taxa de revisão, obtida a partir de reações que contém um único dCTP é cerca de duas vezes superior ao reações contendo os 4 ddNTPs (Figura 5A, 5Be 5C). Assim, o uso de um único dNTP 'correto' no ensaio de correcção produz um resultado melhor, sem os efeitos inibitórios de ddNTPs. Esta abordagem deve fornecer maior sensibilidade para análises cinéticas de revisão.
Revisão de incompatibilidades internas:
MS revisão ensaios usando KF para incompatibilidades internas e a identificação dos produtos revisou são simples (ou seja, a correcção do exonuclease excises nucleotídeos da extremidade 3' para a incompatibilidade interna dos primers), seguido do adição de ddNMP correspondente para a excisão produtos através da função de polimerase gerando revisar produtos mais curtos que os substratos da primeira demão (Figura 6). Foi observada uma tendência clara de eficiência de revisão, onde KF eficientemente corrigir incompatibilidades com a última, a penúltima, 3rd e 4th nucleotídeos da extremidade 3' dos primers (Figura 6; MM1, 2, 3 e 4). Mismatches em 5 nt da extremidade 3' do primer foram corrigidas parcialmente com < 15% de correção da incompatibilidade e > 15% do primer mostrou uma extensão sem revisão (Figura6; MM5). KF não conseguiu corrigir incompatibilidades posicionadas no 6, 7, 8 e 9 nt da extremidade 3' do primer (Figura 6; MM6, 7, 8 e 9) mas ainda estendido uma proporção significativa de substratos (Figura 6; PE do MM6, 7, 8 e 9).
Reparação da lesão de deoxyinosine:
Em e. coli, deoxyinosine no DNA principalmente é processado pelo caminho de reparação o endo V20,23. V Endo inicia a reação de uma incisão na segunda ligação fosfodiéster 3' da lesão dI. A ruptura de vertente gerada é acreditada para ser usado pela pol I para uma excisão de lesão subsequentes e DNA ressíntese24. Este procedimento foi aplicado para testar pol reparar substratos contendo dI no 3' penúltimo local (tabela 1; Um-eu, C-eu, G-I e T-eu) para validar essa hipótese. A reparação do 3' penúltimo dI é análoga para a revisão do penúltima incompatibilidade T-G (Figura 4B e 6; Entrada de mm2), em que os últimos 2 nt deve ser removido seguido pela adição de uma ddNMP correta para concluir o reparo. Padrões de MS mostraram claramente pol corrigi heteroduplexes da-eu, G-I e T-, embora com diferentes eficiências (Figura 7; Sinais RP). No entanto, o C-eu substrato foi refratário para reparar o pol (tabela 1 e Figura 7 e 7E; RP muito baixa) e demonstrou a extensão da primeira demão, em grande medida (Figura 7; Sinal de PE).
Figura 1 . Modelo de sistema para ensaio de revisão. Um primer incompatível foi recozido conforme indicado para um modelo formando uma incompatibilidade de terminal (em negrito). Revisão do exonuclease da DNA polimerase pode detectar e remover o nucleotídeo incompatível, formando um produto de excisão. Na presença de uma DNA polimerase e quatro ddNTPs, o produto da excisão é prorrogado por uma única base complementar ao anterior site incompatível. Quando submetido a MALDI-TOF, a diferença de massa entre o primer incompatível, os produtos de excisão e os produtos revisados pode ser resolvida. (Esta figura é uma adaptação de Su et al . 25 com permissão.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Pico de intensidade e oligonucleotide Mass. Oito oligonucleotides de 17 a 24 nt com sequências complementares à extremidade 3' do T28 (tabela 1) foram testados. (A) A mistura de 50 pmol de cada oligonucleotide em soluções de 40 µ l foi submetida a uma análise de MS. (B) a altura dos 17 nt foi usado como 100% para o cálculo. A intensidade de sinal relativo para cada do oligonucleotide foi a média de seis determinações e as barras de erro representam 1 desvio-padrão. (Esta figura é uma adaptação de Su et al . 25 com permissão.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Efeito de vários design de modelo. Revisão de reações foram avaliadas com o primer P21 formando uma incompatibilidade de G T terminal com diferentes modelos. O ensaio de revisão foi realizado com 10 U (43 pmol) Klenow polimerase 50 pmol de substrato e 4 ddNTPs a 37 ° C por 5 min. (A), este painel mostra um substrato P21/T32 T-G sem enzima. (B), este painel mostra uma extensão da primeira demão do substrato P21/T32 T-A do exonuclease 3' deficiente Klenow. PE = produto de extensão da primeira demão. (C) este painel mostra uma revisão do substrato P21/T32 T-G. PP = produto revisão; D26, d27, d28 = 3' modelo final degradado. (D), este painel mostra um substrato P21/T28 T-G sem enzima. (E) este painel mostra uma revisão do substrato P21/T28 T-G. PP = produto revisão; D26, d27 = 3' modelo final degradado. (F), este painel mostra um substrato P21/T28S4 T-G sem enzima. (G) este painel mostra uma revisão do substrato P21/T28S4 T-G. PP = produto revisão; EP = produtos de excisão; D27 = subproduto de degradação do modelo. (Esta figura é uma adaptação de Su et al . 25 com permissão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Curso de análise na hora de excisão e revisão de produtos. Revisão de ensaios foram realizado com 2 U (8.6 pmol) KF e 50 pmol substratos, como descreveram no protocolo. As reações foram extinguidas no indicado vezes. (A) este painel mostra uma revisão de uma incompatibilidade de T-G 3' terminal; EP = revisão de excisão de produto; D18 & d19 = subprodutos de excisão em excesso; PP = produtos de correcção; P21 = cartilha incompatível. (B) este painel mostra uma revisão de uma incompatibilidade de G T 3'-penúltima; EI-1 = excisão intermediário; EP-2 = revisão de excisão de produtos; D18 = subproduto de excisão em excesso; PP = produtos de correcção; P21 = cartilha incompatível; Na = sódio íon ligado nucleotídeos. (Esta figura é uma adaptação de Su et al . 25 com permissão.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Revisão de reação com 4 ddNTPs contra um único dNTP. Revisão de ensaios foram realizados com 0.1 U (0.43 pmol) KF e 50 pmol substratos, como descreveram no protocolo. As reações foram extinguidas no indicado vezes. (A) este painel mostra uma revisão de uma 3' terminal G-G incompatibilidade com 4 ddNTPs; EP = revisão de excisão de produto; PP = revisão de ressíntese de produtos; P21G = cartilha incompatível. (B) este painel mostra uma revisão de uma 3' terminal G-G incompatibilidade com dCTP; PP = revisão de ressíntese de produtos; P21G = cartilha incompatível. (C), a correção de níveis são a média de três determinações e as barras de erro representam 1 desvio-padrão. At+ = sódio íon ligado nucleotídeos. (Esta figura é uma adaptação de Su et al . 25 com permissão.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Revisão de incompatibilidades internas. Revisão de ensaios foram realizados com polymerase de Klenow 2 U (8.6 pmol) e 50 pmol substratos em 37 ° C por 20 min, conforme descrito no protocolo. Em branco = branco de enzima de um substrato de MM1. MM1 = um substrato P21/T28 T-G; Mm2 para MM9 = substratos com incompatibilidades internas, os números indicam a posição de incompatibilidade em relação à extremidade 3'. P21 = cartilhas incompatíveis; PR = produtos revisados; PE = cartilhas estendidas; D19 e d20 = subprodutos de excisão do excesso, os números representam o tamanho de nucleotídeos. (Esta figura é uma adaptação de Su et al . 25 com permissão.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 . Reparação de 3' penúltimo deoxyinosine lesões. Reparação ensaios foram realizados com 2 U Klenow polimerase e 50 pmol substratos em 37 ° C conforme descrito na etapa de protocolo 2.3. As reações foram extinguidas no indicado vezes. Estes painéis mostram reações com (A) T-eu substrato; (B), G-eu substrato; (C) A-eu substrato; e (D) C-eu substrato. RP = produtos de reparação; EP = produtos de excisão; PE = produtos de extensão da primeira demão, at+ = sódio íon adutos. (E), a correção de níveis para T-eu, G-eu e A-fosse a média de três determinações e as barras de erro representam 1 desvio-padrão. Os níveis de correção para C-fosse a média de duas determinações. (Esta figura é uma adaptação de Su et al . 25 com permissão.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Substratos | Sequências de | Eficiência de correção (pmol) | |
| P21/T32 | 3'-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 17,3 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 18,4 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28S4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 22.9 | |
| MM1 | 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | ||
| MM2 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 13.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA | |||
| MM3 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 16,9 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA | |||
| MM4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 15.1 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA | |||
| MM5 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 4.2 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA | |||
| MM6 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5* | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA | |||
| MM7 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA | |||
| MILÍMETRO8 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACATTGGGAA | |||
| MM9 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA | |||
| A-EU | 3'-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT | 8.2 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| C-EU | 3'-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT | 1.0 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| G-EU | 3'-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT | 15,4 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| T-EU | 3'-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT | 16.6 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
Tabela 1. Revisão de substratos e eficiência de correção por fragmento de Klenow. Esta tabela mostra os bold (realce) 4-nucleotídeos 3'-na extremidade do modelo contendo phosphorothioate modificações. Os pares de bases incompatíveis estão em negrito. Os correcção ensaios foram realizados com 2 U (8.6 pmol) Klenow polimerase, 50 pmol de substrato e 4 ddNTPs a 37 ° C durante 10 min. * esses valores são os limites mais baixos para o nível de revisão porque o ruído de fundo impede que estimativas precisas de < 1% do sinais de massa totais observados. (Esta figura é uma adaptação de Su et al . 25 com permissão.)
| BEM | TERMO | SNP_ID | 2º-PCRP | 1º-PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | TM | PcGC | PWARN | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_CALL | EXT1_MASS |
| W1 | iPLEX | T28 | AT | AT | AT | AT | AT | AT | AT | F | 8524.54 | ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | |||
| W1 | iPLEX | P21 | AT | AT | AT | AT | AT | AT | AT | F | 6495.24 | TACCAGTCAGGACGTTGGGAA | |||
Tabela 2. Arquivo T28_P21.xlsx. a configuração foi usada para Figura 3D, 3E, 4Ae 5A.
| 1201-1 |
| 1201-2 |
| 1201-3 |
| 1201-4 |
| 1201-5 |
| 1201-6 |
| 1201-7 |
Tabela 3. arquivo 1201.xlsx. a configuração foi usada para 7 reações na Figura 4A.
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Discussion
Este estudo descreveu um ensaio revisão passo a passo da atividade analisado pelo instrumento comercial escolhido (consulte a Tabela de materiais) usando MALDI-TOF MS. As principais vantagens incluem que o primer e o modelo são etiqueta grátis e fácil de executar, permitindo maior flexibilidade na criação de experiências. Uma fluxo-Cal completa de processamento de 30 testes de revisão levaria 4 h, incluindo 3 h para executar manualmente as correcção reações e sua limpeza, enquanto as análises MALDI-TOF MS usando o protocolo referido leva 1 h para completar. A principal desvantagem deste método é a quantidade de substrato necessário para o ensaio. Para obter resultados consistentes e sinais fortes, usamos 50 pmol de substrato de DNA em uma reação de 20 µ l; assim, a quantidade de DNA é muito maior do que com radiolabeled DNA experiências8,9,10. Reduzindo o volume e o tamanho da amostra e ajuste fino da operação de MS podem reduzir a quantidade de substrato necessário.
Oligonucleotídeos sintéticos obtidos de fontes comerciais podem ser usados para o estudo de revisão diretamente, sem qualquer outra purificação ou tratamento. No entanto, é aconselhável verificar a pureza e a qualidade do DNA por MALDI-TOF MS. Os laços phosphorothioate foram introduzidos para substituir o último 4 ligações fosfodiéster na extremidade 3' do modelo (tabela 1) para reduzir a degradação inespecífica da strand, modelo (Figura 3), embora a um custo mais elevado, por exemplo. Curiosamente, os sinais a partir do modelo e primer DNA podem ser bem separados por MS em virtude de suas diferenças de tamanho; assim, esta modificação phosphorothioate não é necessária. Na Figura 3E, por exemplo, todos os produtos possíveis da extensão da primeira demão P21 revisão excisão e ressíntese foram menos de 22 nt (m/z < 7.000), enquanto todos os fragmentos de degradação do modelo T28 foram maior que 24 nt (m/z > 7.000 ). Os resultados na Figura 4A vinham a mesma P21/T28 duplex definido como aqueles na Figura 3E. Uma janela alargada de m/z 6.000-7.000 mostra apenas os sinais do primer DNA sem quaisquer sinais de confundimento do modelo.
A estratégia de usar as primeiras demão com uma extensão de ddNMP provou para ser muito estável, e, assim, produtos contendo ddNMP são bons indicadores para o ensaio de revisão. A adição de ddNMP para produtos de excisão pode 'congelar' os produtos revisão no estado para análise imediatamente após excisão. Como alternativa, usando um único dNTP correto (Figura 5B) em vez de 4 ddNTPs para suprimir a atividade hidrolítica específico da correcção do exonuclease também é viável.
Parar as reações com um procedimento de extração padrão fenol/clorofórmio provou para ser o melhor meio para o término da reação, desde que, em uma única etapa, ele permite que as reações ser interrompido enquanto também retira qualquer interferência de proteína. Alternativamente, ácido têmpera, que é passível de automação, então neutralizado pela não-metal alcalino sem uma separação de fases, também demonstrou resultados fiáveis. Adutos de íon sódio (Na+ na Figura 4, 5e 7) são motivo de preocupação, uma vez que podem aumentar o fundo e complicar a discriminação de sinal. Um uso adequado da resina limpa pode reduzir tais interferências; Contudo, mesmo quando tal adutos estão presentes, eles normalmente têm picos muito menores em relação ao seu pai-sinal e esta propriedade pode ser usada para distinguir entre elas (Figura 4, 5e 7). Geralmente, a altura do pico de sódio adutos foi proporcional aos principais picos; a inclusão ou exclusão de sódio adutos no cálculo não afetou significativamente os resultados da quantificação. Portanto, para a quantificação, usamos a altura do pico principal somente para o cálculo.
Os experimentos de correcção descritos aqui se aproveitou de incompatibilidades internas para demonstrar a importância do do exonuclease partição de domínio o doseamento de KF26 e a DNA polimerase detalhada eu capacidade para corrigir eficientemente o descompasso em cima para 4 nt o montante da primeira demão 3'-extremidade (Figura 5, MM1 - 4) possivelmente devido à estabilidade de base-emparelhamento com a primeira demão-modelo entroncamentos27. Além disso, este estudo também costumava cartilhas contendo penúltima deoxyinosine lesões para estudar uma pol que reparar de endo reparação V-cortou intermediários. Os resultados mostraram que T-foi reparado mais eficientemente que A-I e G-eu; no entanto, C-era refratário para reparar o pol (tabela 1 e Figura 7). Estes resultados confirmam que uma análise de MALDI-TOF MS pode ser muito útil para revisão e vários curto-patch28 devido a sua alta resolução de ensaios de reparação do DNA.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a facilidade do núcleo integrado NCFPB genômica funcional (Taipei, Taiwan) e o laboratório de farmacogenômica NRPB (Taipei, Taiwan) pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação da Fundação de saúde de Taiwan (L-Il) e o Ministério da ciência e tecnologia, Taipei, Taiwan, ROC [mais 105-2320-B-002-047] para Hu Wei-Yao, [mais 105-2628-B-002-051-MY3] para Su Kang-Yi e [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] por Liang-na Lin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
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