Summary
Questo articolo descrive un protocollo dettagliato ed altamente efficace per le registrazioni di single sensillum dalla basiconica di sensilli sul palpi dell'apparato boccale degli insetti.
Abstract
I palpi dell'apparato boccale locusta sono considerati organi gustativi convenzionali che svolgono un ruolo importante nella selezione di cibo di una locusta, soprattutto per il rilevamento dei segnali chimici non volatile attraverso sensilli chaetica (precedentemente denominato terminal sensilli o crestati sensilli). C'è ora aumentando la prova che questi palpi hanno anche una funzione olfattiva. Un recettore odorizzante (LmigOR2) e un odorant-binding protein (LmigOBP1) sono state localizzate nei neuroni e nelle cellule accessorio, rispettivamente, la basiconica di sensilli dei palpi. Single sensillum (SSR) di registrazione utilizzato per registrare le risposte dei neuroni odorant, che è un metodo efficace per lo screening di ligandi attivi sui recettori specifici odoranti. SSR è utilizzata negli studi funzionali dei recettori odorant in sensilli palpo. La struttura del basiconica di sensilli situato sulla cupola dei palpi differisce da piuttosto dalla struttura di quelli sulla antenne. Di conseguenza, quando si esegue un SSR suscitato da odoranti, qualche consiglio specifico può essere utile per ottenere risultati ottimali. In questa carta, è stato introdotto un protocollo dettagliato e altamente efficace per un relè SSR da insetto palpo sensilli basiconica.
Introduction
Gli animali si sono evoluti una gamma di chemosensory organi che percepiscono segnali chimici esogeni. In insetti, organi chemosensory più importanti sono le antenne e i palpi. Su questi organi, diversi tipi di peli chemosensory, chiamati sensilli chemosensory, sono innervati dai neuroni chemosensory (CSNs) entro i peli. CSNs in sensilli chemosensory riconoscere specifici segnali chimici attraverso la trasduzione del segnale da stimoli chimici a potenziali elettrici che vengono successivamente trasferiti fino al sistema nervoso centrale1,2,3 .
CSNs esprimere vari ricevitori chemosensory [ad es., odorant recettori (ORs)], recettori ionotropici recettori (IRs) e recettori gustativi (GRs) sulle loro membrane, che codificano spunti chimici esogeni associati alle varie forme di chemosensation 4,5,6. La caratterizzazione di CSNs è la chiave per la delucidazione dei meccanismi cellulari e molecolari dell'insetto chemorecezione. Ora sensillum singola registrazione (SSR) è una tecnica ampiamente utilizzata per la caratterizzazione di insetto CSNs in sensilli antennali di molti insetti, tra cui mosche7, falene8, coleotteri9, afidi10, locuste11, e le formiche12. Tuttavia, pochi studi hanno applicato un SSR a insetto palpi13,14,15,16,17, perché le particolari strutture di loro sensilli fanno un registrazione elettrofisiologica difficile18.
Sciami di locuste (Orthoptera) è spesso causano di danni alle colture gravi e perdita economica19. I palpi sono creduti per svolgere un ruolo importante nella selezione cibo delle locuste20,21,22,23,24. Due tipi di sensilli chemosensory sono studiati da un microscopio elettronico a scansione (SEM). Di solito, 350 sensilli chaetica e 7-8 sensilli basiconica sono osservati su ogni cupola della locusta palpi18. Chaetica di sensilli sono sensilli gustativi che percepiscono segnali chimici non volatile, mentre sensilli basiconica avere una funzione olfattiva, rilevamento segnali chimici volatili.
Il palpi locusta, i diametri dei socket capelli i sensilli basiconica (ca. 12 µm), sono molto maggiori di quelli di sensilli chaetica (ca. 8 µm)18,25. La parete cuticolare del basiconica di sensilli sui palpi è molto più spessa di quella di sensilli antennali18. Inoltre, la cupola del palpo ha contenuto fluido all'interno di una cuticola altamente flessibile. Queste caratteristiche fanno sì che una penetrazione con un microelettrodo e un'acquisizione di segnali elettrofisiologici buoni è più difficile per sensilli antennali. In questa carta, un protocollo SSR dettagliato ed altamente efficace per locusta palpo sensilli basiconica è presentato con un video.
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Protocol
1. preparazione degli strumenti e dell'insetto
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Preparazione delle soluzioni di elettrodi e stimoli tungsteno
- Difficoltà un nuovo filo di tungsteno (diametro di 0,125 mm, lunghezza 75 mm) in un micromanipolatore e affilarlo in una soluzione di nitrito (NaNO2) di sodio 10% (p/v) in una siringa a 10 V fornita da un alimentatore per circa 1 min sotto uno stereomicroscopio (ingrandimento 40x).
- Immergere il filo di tungsteno affilata ripetutamente nel NaNO2 soluzione al 10%, circa 4 mm a 5 V in < 1 min (Figura 1A).
- Esaminare il diametro della punta affilata tungsteno frequentemente sotto lo stereomicroscopio fino a quando è bene abbastanza penetrare la cuticola di un sensillum olfattivo del palpo locusta (Figura 1B).
- Preparare le soluzioni di stimolo. Diluire ciascuna della sostanza stimolo chimico in olio minerale. Diluire 1 isoottanolo e acido nonanoico alle diluizioni di 10%. Diluire E-2-esenale ed esanale alle 10-2, 10-3, 10-4e 10-5.
- Preparare Pasteur tubi che trasportano gli stimoli: strisce di carta da filtro (lunghezza di 2 cm, larghezza di 0,5 cm) inserire i tubi di Pasteur, aggiungere le soluzioni di stimolo diluito (ogni 10 µ l) per le strisce di carta da filtro e quindi collegare i tubi di Pasteur con puntali per pipette (1 ml).
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Preparare l'insetto
- Posteriore cavallette (Locusta migratoria) con piantine di grano fresco sotto condizioni di sovraffollamento presso un fotoperiodo di 18:6 h (luce: scuro), una temperatura di 28-30 ° C e un'umidità relativa del 60%. Scegli 1 di 3-giorno-vecchio 5th instar ninfe Locusta e rimuovere le antenne con forbice per evitare interferenze durante la registrazione.
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Preparando il titolare palpo mascellare locusta
- Utilizzare una lastra di vetro (25 x 75 mm) come la base di fissaggio del palpo mascellare (MPH). Attaccare un pezzo di plastica (1 mm di altezza, 10 mm di larghezza, 35 mm di lunghezza) in un angolo del vetrino con nastro bi adesivo e infine fissare un vetro di copertura (18 x 18 mm) sopra il pezzo di plastica con nastro bi adesivo. Posto un piccolo pezzo di nastro di gomma rossa sul vetro di copertura come strato antiscivolo. Il pezzo di plastica e il vetro di copertura costituiscono la piattaforma per il palpo locusta. L'altezza della piattaforma è di circa 1,5 mm.
- Installare un filo di tungsteno (diametro di 0,125 mm, lunghezza di 36 mm) ad una distanza di 1,5 mm parallelo all'interno bordo della piattaforma. Fissare le due estremità del filo sulla piattaforma con nastro bi adesivo.
2. preparazione dei palpi mascellari Locust
- Tagliare una provetta da centrifuga (1,5 ml) verticalmente a metà e tagliare il fondo. Inserire la locusta nella provetta di preparati. Lasciare la regione ventrale e la testa della locusta esposta. Difficoltà l'Assemblea sul vetrino con nastro adesivo biadesivo (Figura 2A).
- Tirare il palpo mascellare sulla piattaforma.
- Mettere il filo di tungsteno al quarto segmento il palpo. Mettere massa adesiva su ciascun lato del filo di tungsteno, a circa 2 mm dal palpo mascellare (Figura 2A e 2B).
3. single Sensillum registrazioni
- Luogo la preparazione di palpo mascellare locusta sotto un microscopio a basso ingrandimento (100x). Regolare la posizione della preparazione fino a quando il palpo è perpendicolare all'elettrodo di registrazione (Figura 3A).
- Inserire l'elettrodo di riferimento (elettrodo di tungsteno) nell'occhiello locusta utilizzando un micromanipolatore. Spostare l'elettrodo di registrazione (elettrodo di tungsteno) vicino il palpo mascellare con il micromanipolatore (Figura 3B e 3C).
- Regolare il dispositivo di rilascio di odore a circa 1 cm dal palpo mascellare (Figura 3B).
- Aprire il software di registrazione Auto Spike 32. Impostare i parametri di registrazione come segue: la scala di registrazione su 500 µV; l'alto cutoff del filtro su 300 Hz, la frequenza di taglio basso su 200 Hz; e il pretrigger su 10 s.
- Collegare l'elettrodo di registrazione per un 10 x universale AC/DC amplificatore.
- Passare il microscopio ad un ingrandimento elevato (500 X). Inserire l'elettrodo di registrazione nella base di un sensillum basiconic sul palpo mascellare e regolare delicatamente l'elettrodo di registrazione per ottenere buone spontanee picchi (Figura 3D).
- Aprire il controller di stimolo per fornire un flusso continuo di aria a 20 ml/s. impostare il tempo di stimolazione di 1 s. segnali di Record per 10 s, a partire di 10 s prima dell'inizio dell'impulso dello stimolo.
- Utilizzare un amplificatore di AC/DC universale di 10x per amplificare i segnali. Portare i segnali nei 4 IDAC. Analizzare i segnali con il software Auto Spike 32. Segnali AC sono filtrati passa-banda tra 200 a 300 Hz. uso Auto Spike 32 per distinguere le ampiezze picco-valle dai rumori. Calcolare le risposte dei neuroni come l'aumento della frequenza di potenziale di azione (punte al secondo) sopra le frequenze spontanee. Eseguire un'analisi statistica usando GraphPad Prism 7.
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Representative Results
Due sottotipi di sensilli (pb1 e pb2) sul palpo mascellare locuste vengono identificati in base a dinamiche di risposta diversa per chimica odoranti (isoottanolo 1 10% e 10% acido nonanoico). I neuroni in pb1 producono picchi significativamente più di 1-isoottanolo rispetto ad acido nonanoico mentre i neuroni in pb2 sono significativamente che meno attivata da 1 isoottanolo rispetto ad acido nonanoico (Figura 4). Esanale ed E-2-esenale può evocare un palpo locusta apertura risposta (POR)26. Esanale è una foglia di pianta verde abbondante host volatile che può contribuire ad un'ulteriore conferma per la fonte di cibo26. Le punte hanno suscitate nei neuroni pb1 Ultima più lunghi di quelli di pb2 quando essi sono stimolati da E-2-esenale (Figura 4). I neuroni in pb1 e pb2 esibiscono similmente robuste risposte a esanale (Figura 4). Confrontando le variazioni medie di tutti i picchi tra la s di periodi 5 prima e 5 s dopo la stimolazione indica che la risposta a 1 isoottanolo è significativamente superiore all'acido nonanoico in pb1, ma contrariamente a pb2 (Figura 5). I neuroni in questi due sottotipi di sensilli rispondono dose-dipendente E-2-esenale ed esanale e loro modelli di risposta a queste due aldeidi differiscono (Figura 6A e 6B).
Figura 1. Preparazione dell'elettrodo. Spettacoli (A), questo pannello mostra un generale dell'apparato d'affilamento di elettrodo. La siringa contenente 10% NaNO2 (a sinistra) viene utilizzata per affinare l'elettrodo (a destra). (B), questo pannello mostra una visuale ravvicinata della punta dell'elettrodo (r: adatto; b: inadatto). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Titolare di locusta palpo mascellare (MPH). (A) The MPH e una locusta sono montati su vetrino prima di posizionarla sotto il microscopio. (B) questo pannello mostra un primo piano del palpo mascellare di locusta, riparata dal legare di tungsteno sulla piattaforma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Singole registrazioni sensillum. (A), questo pannello mostra una vista l'installazione di elettrofisiologia. (B) questo pannello mostra una vista ravvicinata della preparazione locusta montata sul microscopio. (C) questa immagine mostra il palpo mascellare locusta a 100 ingrandimenti. (D) questa immagine mostra il palpo a 500 ingrandimenti. La freccia indica un sensillum basiconic. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Tracce di risposta delle registrazioni di single sensillum del palpo mascellare locusta. In questo pannello, pb1 acronimo di sottotipo 1 del basiconica di sensilli palpo; PB2 acronimo di sottotipo 2 del basiconica di sensilli palpo. Le barre sopra le tracce indicano la durata dello stimolo (1 s). Per queste registrazioni, tutti gli odori sono usati a diluizioni di 10% ad eccezione di E-2-esenale ed esanale, che sono diluiti all'1%. Questa figura è stata modificata da Zhang et al. 26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Confronto di numeri medi di picchi in neuroni in pb1 e pb2 stimolati da acido nonanoico e isoottanolo 1. I numeri medi delle punte vengono calcolati in periodi 5 s prima e dopo stimolazione. In pb1, i numeri medi delle punte nei neuroni rispondendo a 1 isoottanolo aumentano significativamente superiori a quelli delle punte in neuroni rispondendo a acido nonanoico (n = 11 palpi; ANOVA con post hoc, t-test; p < 0.0001), in contrasto con pb2 (n = 10 palpi; ANOVA con post hoc, t-test; p = 0.0110). La barra di errore rappresenta SEM Questa figura è stata modificata da Zhang et al. 26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 6. I modelli di neuroni in pb1 e pb2 rispondere dose-dipendente per E-2-esenale ed esanale. (A), questo pannello mostra i modelli dei neuroni in pb1 (± SEM; n = 12 palpi). (B), questo pannello mostra i modelli dei neuroni in pb2 (± SEM; n = 10 palpi). Questa figura è stata modificata da Zhang et al. 26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli insetti si basano su palpi per rilevare gli odori degli alimenti, e loro palpi sono creduti per svolgere un ruolo importante nella speciazione13,27. I palpi sono semplici organi olfattivi e stanno ricevendo crescente attenzione come un modello interessante per l'esplorazione della neuromolecular reti sottostanti chemosensation28.
Insetto labellar e palpo SSRs sono stati effettuati con successo su Drosophila melanogaster, Anopheles gambiaee Culex quinquefasciatus13,14,15,16 , 17 ma sono stati segnalati raramente sotto forma di un video di presentazione16,29. Al contrario, i dati video su SSRs antennali sono disponibili per Drosophila, l'ombelico orangeworm moth (Amyeloistransitella), Schistocerca Americanae le cimici dei letti (Cimex lectularius)16, 30 , 31 , 32 , 33.
Locusta palpo sensilli basiconica hanno una struttura particolare che differisce da quella dei sensilli antennali locusta e molti altri insetti sensilli. Utilizzando il metodo descritto qui, potenziali d'azione generati da locusta palpo sensilli basiconica sottotipi pb1 e pb2 potrebbe essere registrata e discriminati (Figura 4 e Figura 5).
Il passaggio fondamentale è la penetrazione dell'elettrodo di registrazione. L'elettrodo di registrazione dovrebbe essere inserito alla base del sensillum e avanzata fino a buoni segnali sono acquisiti. Inoltre, è importante evitare la cupola del palpo collasso quando l'elettrodo di registrazione è inserito alla base del sensillum. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo istituito una piattaforma tra cui un titolare di palpo mascellare speciale locusta (MPH) e utilizzato un filo di tungsteno per comprimere il quarto segmento del palpo. Molte ripetizioni di questa procedura dimostrano che questo è efficace. In base ai modelli di risposta dei neuroni in sensilli a parecchi odoranti, abbiamo, per la prima volta, identificato due sottotipi di sensilli basiconica il palpo mascellare la locusta, vale a dire pb1 e pb2.
La limitazione della tecnica descritta nella presente pubblicazione è che potrebbe essere utilizzato per registrare grossi insetti (ad es., falene, coleotteri e cavallette) po ' non registrare piccoli insetti (ad es., mosche e zanzare), che hanno le proprie piattaforme e tecniche13,14,15,16,17. Questa tecnica è complementare ai metodi esistenti.
In conclusione, un protocollo altamente efficace di un relè SSR da insetto palpo sensilli basiconica è descritto in dettaglio. Questo protocollo potrebbe fornire ai ricercatori con una tecnica utile nello studio dei meccanismi molecolari e cellulari dell'olfatto degli insetti sulla parte della bocca. Questo metodo collegato con gascromatografia possa essere utilizzato per identificare ligandi naturali electrophysiologically-attivo in estratti delle risorse alimentari favorevoli.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto da una sovvenzione dalla Fondazione Nazionale Scienze naturali della Cina (No.31472037). Qualsiasi menzione di marchi o prodotti commerciali in questo articolo è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica una raccomandazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | ADVENT | W559504 | Used for making the electrode and fixing the palp |
| NaNO2 | Sigma-aldrich | 563218-25G | Used for sharpening the tungsten wire |
| AC Power Supply | Syntech | A2-70 | Providing the voltage in sharpening the tungsten wire |
| Stereoscope | Motic | SMZ-163 | Used for observing the sharpening of tungsten wire |
| Microscope | Olympus | W-51 | Used for observing the sensilla on locust maxillary palp |
| Intelligent Data Acquisition Controller | Syntech | IDAC-4 | Real-time on screen display of all signals before and during recording |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 | Used for controlling the stimulus application |
| Electronic micromanipulator | C.M.D.T | CFT-8301D | Used for minor movement of the recording electrode |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Used for minor movement of the reference electrode |
| Speaker | EDIFIER | R101T06 | Connected with IDAC-4 and providing sound for the signal |
| Magnetic base | PDOK | PD-101 | Used to hold the electrode, and stimulus delivery tube |
| Vibration Isolation Table | TianHe | HAP-100-1208 | Used for isolating the vibration from the equipment |
| Glass slide | CITOGLAS | ZBP-407 | Used for making the base for the MPH |
| Blu-tack | Bostik | Blu-tack-45g | Fixing the tungsten wire |
| Pasteur tube | YARE | WITEG | Placing the filter paper containing stimuli stimulus solutions |
References
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