Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Enkelt Sensillum innspillinger for Locust Palp Sensilla Basiconica

Published: June 23, 2018 doi: 10.3791/57863
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, China Agricultural University, 2Bio-tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences

Summary

Dette dokumentet beskriver en detaljert og effektiv protokoll for enkelt sensillum opptak fra sensilla basiconica på palps av insekt munndeler.

Abstract

Palps av locust munndeler anses å være konvensjonelle gustatory organer som spiller en viktig rolle i en locust utvalg spesielt for påvisning av permanente kjemiske signaler gjennom sensilla chaetica (tidligere kalt terminal sensilla eller crested sensilla). Det er nå økende bevis for at disse palps også har en olfactory funksjon. En odorant reseptor (LmigOR2) og en odorant-binding protein (LmigOBP1) er lokalisert i nerveceller og tilbehøret celler, henholdsvis i sensilla basiconica av palps. Enkelt sensillum opptak (SSR) brukes for opptak svarene på odorant reseptor neurons, som er en effektiv metode for screening aktive ligander på bestemte odorant reseptorer. SSR brukes i funksjonelle studier av odorant reseptorer i palp sensilla. Strukturen i sensilla basiconica ligger på kuppelen av palps avviker noe fra strukturen av på antenner. Derfor, når du utfører en SSR brakt frem av odorants, noen spesifikke råd kan være nyttig for å oppnå optimale resultater. I dette papiret introdusert en detaljert og effektiv protokoll for en SSR fra insekt palp sensilla basiconica.

Introduction

Dyr har utviklet en rekke chemosensory organer som forstand eksogene kjemiske signaler. I insekter er de viktigste chemosensory organene antennene og palps. På disse organene, er flere typer chemosensory hår, kalt chemosensory sensilla, innerveres av chemosensory neurons (CSNs) i hårene. CSNs i chemosensory sensilla gjenkjenner bestemte kjemiske signaler gjennom signaltransduksjon fra kjemiske stimuli til elektriske potensial som deretter overføres til sentralnervesystemet systemer1,2,3 .

CSNs express ulike chemosensory reseptorer [f.eksodorant reseptorer (ORs)], ionotropic reseptorer (IRs) og gustatory reseptorer (GRs) på deres membraner, som kodes eksogene kjemiske signaler forbundet med ulike typer chemosensation 4,5,6. Karakterisering av CSNs er nøkkelen til utviklingen av mobilnettet og molekylære mekanismer av insekt chemoreception. Nå enkelt sensillum opptak (SSR) er en mye brukt teknikk for karakterisering av insekt CSNs i de antennal sensilla av mange insekter, inkludert flyr7, biller møll8,9, bladlus10, gresshopper11, og maur12. Imidlertid få studier har brukt en SSR insekt palps13,14,15,16,17, fordi bestemt strukturer av deres sensilla gjøre en elektrofysiologiske opptak vanskelig18.

Svermer av gresshopper (Orthoptera) føre ofte til alvorlige beskjære skade og økonomisk tap19. Palps antas å spille en viktig rolle i mat valg av gresshopper,20,,21,,22,,23,,24. To typer chemosensory sensilla er undersøkt av en scanning elektron mikroskop (SEM). 350 sensilla chaetica og 7-8 sensilla basiconica er vanligvis observert på hver kuppel av locust palps18. Sensilla chaetica er gustatory sensilla som forstand permanent kjemiske signaler, mens sensilla basiconica har en olfactory funksjon, sensing flyktige kjemiske signaler.

Locust palps, diameter av de håret av sensilla basiconica (ca. 12 µm), er mye større enn sensilla chaetica (ca. 8 µm)18,25. Cuticular veggen av sensilla basiconica på palps er mye tykkere enn antennal sensilla18. I tillegg har kuppelen på palp væske innholdet i en svært fleksibel cuticle. Disse egenskapene bety at en penetrasjon med en microelectrode og en anskaffelse av god elektrofysiologiske signaler er vanskeligere enn for antennal sensilla. I denne utredningen er en detaljert og effektiv SSR protokoll for locust palp sensilla basiconica presentert med en video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av instrumenter og insekter

  1. Forbereder tungsten elektroder og stimuli
    1. Fikse en ny tungsten wire (på 0.125 mm, lengden på 75 mm) inn i en micromanipulator og skjerpe den i en 10% (w/v) natrium nitritt (NaNO2) løsning i en sprøyte på 10 V levert av en strømforsyning for ca 1 min under en stereomicroscope (40 X forstørrelse).
    2. Dypp skjerpet tungsten wire gjentatte ganger i 10% NaNO2 løsningen, rundt 4 mm på 5 V i < 1 min (figur 1A).
    3. Undersøke diameteren på skjerpet tungsten spissen ofte under stereomicroscope før det er fint nok å trenge styrke en locust palp olfactory sensillum (figur 1B).
    4. Klargjør følgende stimulus. Fortynn hver av kjemiske stimulans stoffet i mineralolje. Fortynne 1-nonanol og nonanoic syre på 10% fortynninger. Fortynne E-2-hexenal og hexanal på 10-2, 10-3, 10-4og 10-5.
    5. Forberede Pasteur rør bærer stimuli: sette inn filter papir strimler (lengden på 2 cm, bredde på 0,5 cm) i Pasteur rør, legge utvannet stimulans løsninger (hver 10 µl) til filter papir strimler, og koble deretter Pasteur rør med pipette-spisser (1 ml).
  2. Forberede insekt
    1. Bakre gresshopper (Locusta migratoria) av fersk hvete under overfylt forhold ved relativ luftfuktighet på 60%, en temperatur på 28-30 ° C og en fotoperiode av 18:6 h (lys: dark). Velg 1 - 3 dag-gamle 5th skikkelsen locust nymfer og fjerne antenner med fine saks å unngå forstyrrelser når innspillingen.
  3. Forbereder locust maxillary palp abonnenten
    1. Bruk et glass lysbilde (25 mm x 75 mm) som base for maxillary palp abonnenten (MPH). Knytt en plastdelen (1 mm i høyden, 10 mm bredde, 35 mm i lengde) til et hjørne av objektglass med dobbeltsidig teip, og til slutt fastsette et cover glass (18 x 18 mm) på plastdelen med dobbeltsidig teip. Sett en liten bit av rød gummi bånd på dekket glasset som sklisikre lag. Plastdelen og dekke glass utgjør plattformen for locust palp. Høyden på plattformen er ca 1,5 mm.
    2. Installere en tungsten wire (på 0.125 mm, lengden på 36 mm) i en avstand på 1,5 mm parallelt innsiden kanten av plattformen. Fikse de to endene av kabelen på plattformen med dobbeltsidig teip.

2. utarbeidelse av Locust Maxillary Palps

  1. Halvert en sentrifuge tube (1,5 ml) vertikalt og kutte av bunnen. Plass locust i forberedt røret. La ventrale regionen og leder av locust utsatt. Fastsette at samlingen av objektglass med dobbeltsidig teip (figur 2A).
  2. Trekk den rett maxillary palp på plattformen.
  3. Sette tungsten ledningen i den fjerde delen av palp. Plasser selvklebende kitte på hver side av tungsten ledningen, ca 2 mm fra den maxillary palp (figur 2A og 2B).

3. én Sensillum opptak

  1. Plass locust maxillary palp utarbeidelse under et mikroskop på en lav forstørrelse (100 X). Juster plasseringen av forberedelsene til palp er vinkelrett opptak elektroden (figur 3A).
  2. Sett inn referanse elektroden (wolfram elektrode) i locust øyet ved hjelp av en micromanipulator. Flytte opptak elektroden (wolfram elektrode) nær maxillary palp med micromanipulator (figur 3B og 3 C).
  3. Justere lukt levering enheten ca 1 cm fra den maxillary palp (figur 3B).
  4. Åpne brenningsprogramvaren Auto Spike 32. Angi opptaket parametrene som følger: opptak skalaen på 500 µV; høy cut-off filter på 300 Hz, lav cut-off på 200 Hz; og pretrigger på 10 s.
  5. Koble opptak elektroden til en 10 x universell AC/DC forsterker.
  6. Bytte mikroskopet til en høy forstørrelse (500 X). Sett inn opptak elektroden inn et basiconic sensillum på maxillary palp og delikat justere opptak elektroden for å få god spontan toppene (figur 3D).
  7. Åpne stimulans kontrolleren for å levere en kontinuerlig luftstrøm på 20 ml/s. stilles stimulering til 1 s. post signaler for 10 s, starter 10 før utbruddet av stimulans pulsen.
  8. Bruk en 10 x universell AC/DC forsterker for å forsterke signaler. Mate signalene inn IDAC 4. Analysere signaler med Auto Spike 32-programvaren. AC-signaler er båndpass filtrert mellom 200 til 300 Hz. Bruk Auto Spike 32 for å skille peak til trau amplituder fra lyder. Beregne svarene på neurons som øker i handlingen potensial frekvenser (pigger per sekund) spontan frekvenser. Utføre en statistisk analyse bruker GraphPad prisme 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To sensilla deltyper (pb1 og pb2) på locust maxillary palp identifiseres basert på forskjellige svar dynamics til kjemiske odorants (10% 1-nonanol og 10% nonanoic acid). Neurons i pb1 produsere betydelig mer toppene til 1-nonanol enn å nonanoic syre mens neurons i pb2 er betydelig mindre aktivert av 1-nonanol sammenlignet med nonanoic syre (Figur 4). Hexanal og E-2-Hexenal kan vekke en locust palp åpne svar (POR)26. Hexanal er en rikelig verten anlegget grønne blad flyktige som kan bidra til en ytterligere bekreftelse til mat kilde26. Toppene vakte i pb1 nervecellene sist lenger enn pb2 når de er stimulert av E-2-hexenal (Figur 4). Neurons i pb1 og pb2 utstilling tilsvarende robust Svar å hexanal (Figur 4). Sammenligne de mener endringene av alle toppene mellom perioder 5 s før og 5 s etter stimulering angir at responsen på 1-nonanol er betydelig høyere enn å nonanoic syre i pb1, men overføringsordreantallene i pb2 (figur 5). Neurons i disse to undergrupper av sensilla svare dose-dependently E-2-hexenal og hexanal, og deres reaksjonsmønster til disse to aldehyder forskjellig (figur 6A og 6B).

Figure 1
Figur 1. Elektroden forberedelse. (A) denne siden viser en generell oversikt over elektroden oppskarping apparatet. Sprøyten som inneholder 10% NaNO2 (venstre) brukes til å skjerpe elektroden (høyre). (B) dette panelet viser et nært visning av elektroden spissen (a: egnet, b: uegnet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Locust maxillary palp holderen (MPH). (A) The MPH og en locust er montert på av objektglass før du plasserer den under mikroskopet. (B) dette panelet viser et nærbilde av locust maxillary palp, fast ved tungsten wire på plattformen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Enkelt sensillum innspillinger. (A) dette panelet viser en visning av elektrofysiologi. (B) dette panelet viser et nært visning av locust utarbeidelse montert på mikroskopet. (C) dette bildet viser locust maxillary palp på 100 X forstørrelse. (D) dette bildet viser palp på 500 X forstørrelse. Pilen viser en basiconic sensillum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Svar spor av enkelt sensillum opptak av locust maxillary palp. I dette panelet står pb1 for undertype 1 av palp sensilla basiconica; pb2 står for undertype 2 av palp sensilla basiconica. Stolper over spor angir stimulans varigheten (1 s). Disse innspillingene brukes alle lukt på 10% fortynninger bortsett fra E-2-hexenal og hexanal, som er utvannet til 1%. Dette tallet har blitt endret fra Zhang et al. 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Sammenligning av gjennomsnittlig antall toppene i nerveceller i pb1 og pb2 stimulert av nonanoic syre og 1-nonanol. Gjennomsnittlig antall toppene beregnes i perioder 5 s før og etter stimulering. I pb1, gjennomsnittlig antall toppene i nervecellene svarer på 1-nonanol øker betydelig høyere enn toppene i neurons å nonanoic acid (n = 11 palps; VARIANSANALYSE med post hoc t-tester; p < 0,0001), i motsetning til pb2 (n = 10 palps; VARIANSANALYSE med post hoc t-tester; p = 0.0110). Feilen baren representerer SEM. Dette tallet har blitt endret fra Zhang et al. 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Mønstre av nerveceller i pb1 og pb2 svarer dose-dependently E-2-hexenal og hexanal. (A) dette panelet viser mønstre av neurons i pb1 (± SEM; n = 12 palps). (B) dette panelet viser mønstre av neurons i pb2 (± SEM; n = 10 palps). Dette tallet har blitt endret fra Zhang et al. 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Insekter er avhengige av palps å oppdage mat lukt, og deres palps antas å spille en viktig rolle i artsdannelse13,27. Palps er enkel olfactory organer og får stadig oppmerksomhet som en attraktiv modell for utforskning av neuromolecular nettverk underliggende chemosensation28.

Insekt labellar og palp SSRs har blitt utført på Drosophila melanogaster, Anopheles gambiaeog Culex quinquefasciatus13,14,15,16 , 17 men sjelden er rapportert i form av en videopresentasjon16,29. Derimot er video data på antennal SSRs tilgjengelige for Drosophila, navle orangeworm møll (Amyeloistransitella), Schistocerca Americanaog bed bug (Cimex lectularius)16, 30 , 31 , 32 , 33.

Locust palp sensilla basiconica har en bestemt struktur som er forskjellig fra locust antennal sensilla og mange andre insekt sensilla. Med metoden beskrevet her handling potensialer generert av locust palp sensilla basiconica subtyper pb1 og pb2 kan registreres og diskriminert (Figur 4 og figur 5).

Det kritiske trinnet er utbredelsen av opptak elektroden. Innspillingen elektroden skal settes inn i bunnen av sensillum og avanserte til gode signalene er ervervet. I tillegg er det viktig å unngå kuppelen på palp sammen når innspillingen elektroden settes inn i sensillum. For å oppnå dette, vi satt opp en plattform inkludert en spesiell locust maxillary palp holder (MPH) og brukt en tungsten wire for å komprimere den fjerde delen av palp. Mange repetisjoner av denne prosedyren viser at dette er effektive. Basert på responsen mønstre av nerveceller i sensilla til flere odorants, har vi, for første gang, identifisert to undergrupper av sensilla basiconica på locust maxillary palp, nemlig pb1 og pb2.

Begrensning av teknikken beskrevet i denne publikasjonen er at det kan brukes til å registrere store insekter (f.eks, møll, biller og gresshopper) stund innspilles små insekter (f.eks, fluer og mygg), som har sin egen plattformer og teknikker13,14,15,16,17. Denne teknikken er utfyllende til eksisterende metoder.

Avslutningsvis er en SSR fra insekt palp sensilla basiconica svært effektive protokollen beskrevet i detalj. Denne protokollen kan gi forskere med en nyttig teknikk i studiet av molekylære og cellulære mekanismer av insekt luktesans på mouthpart. Denne metoden knyttet gass kromatografi kan brukes til å identifisere naturlig electrophysiologically-aktiv ligander i ekstrakter av gunstige matressurser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er støttet av et stipend fra National Natural Science Foundation av Kina (No.31472037). Nevne varenavn eller kommersielle produkter i denne artikkelen er utelukkende å gi informasjon, og innebærer ikke en anbefaling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tungsten wire ADVENT W559504 Used for making the electrode and fixing the palp
NaNO2 Sigma-aldrich 563218-25G Used for sharpening the tungsten wire
AC Power Supply Syntech A2-70 Providing the voltage in sharpening the tungsten wire
Stereoscope Motic SMZ-163 Used for observing the sharpening of tungsten wire
Microscope Olympus W-51 Used for observing the sensilla on locust maxillary palp
Intelligent Data Acquisition Controller Syntech IDAC-4 Real-time on screen display of all signals before and during recording
Stimulus controller Syntech CS-55 Used for controlling the stimulus application
Electronic micromanipulator C.M.D.T CFT-8301D Used for minor movement of the recording electrode
Micromanipulator Narishige MN-151 Used for minor movement of the reference electrode
Speaker EDIFIER R101T06 Connected with IDAC-4 and providing sound for the signal
Magnetic base PDOK PD-101 Used to hold the electrode, and stimulus delivery tube
Vibration Isolation Table TianHe HAP-100-1208 Used for isolating the vibration from the equipment
Glass slide CITOGLAS ZBP-407 Used for making the base for the MPH
Blu-tack Bostik Blu-tack-45g Fixing the tungsten wire
Pasteur tube YARE WITEG Placing the filter paper containing stimuli stimulus solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 12987-12995 (2011).
  2. Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annual Review of Entomology. 58, 373-391 (2013).
  3. Zhang, J., Walker, W. B., Wang, G. Pheromone reception in moths: from molecules to behaviors. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 130, 109-128 (2015).
  4. Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
  5. Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136 (1), 149-162 (2009).
  6. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
  7. de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30, 537-552 (2001).
  8. Roelofs, W., et al. Sex pheromone production and perception in European corn borer moths is determined by both autosomal and sex-linked genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7585-7589 (1987).
  9. Larsson, M. C., Leal, W. S., Hansson, B. S. Olfactory receptor neurons detecting plant odours and male volatiles in Anomala cuprea beetles (Coleoptera: Scarabaeidae). Journal of Insect Physiology. 47 (9), 1065-1076 (2001).
  10. Zhang, R., et al. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids. Current Biology. 27 (1), 55-61 (2017).
  11. Cui, X., Wu, C., Zhang, L. Electrophysiological response patterns of 16 olfactory neurons from the trichoid sensilla to odorant from fecal volatiles in the locust, Locusta migratoria manilensis. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 77 (2), 45-57 (2011).
  12. Sharma, K. R., et al. Cuticular hydrocarbon pheromones for social behavior and their coding in the ant antenna. Cell Reports. 12 (8), 1261-1271 (2015).
  13. de Bruyne, M., Clyne, P. J., Carlson, J. R. Odor coding in a model olfactory organ: the Drosophila maxillary palp. Journal of Neuroscience. 19 (11), 4520-4532 (1999).
  14. Syed, Z., Leal, W. S. Maxillary palps are broad spectrum odorant detectors in Culex quinquefasciatus. Chemical Senses. 32 (8), 727-738 (2007).
  15. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
  16. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36, e1725 (2010).
  17. Grant, A. J., Wigton, B. E., Aghajanian, J. G., O'Connell, R. J. Electrophysiological responses of receptor neurons in mosquito maxillary palp sensilla to carbon dioxide. Journal of Comparative Physiology A. 177 (4), 389-396 (1995).
  18. Blaney, W. The ultrastructure of an olfactory sensillum on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.). Cell and Tissue Research. 184 (3), 397-409 (1977).
  19. Hassanali, A., Njagi, P. G. N., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annual Review of Entomology. 50, 223-245 (2005).
  20. Chapman, R. F. Contact chemoreception in feeding by phytophagous insects. Annual Review of Entomology. 48, 455-484 (2003).
  21. Chapman, R. F., Sword, G. The importance of palpation in food selection by a polyphagous grasshopper (Orthoptera: Acrididae). Journal of Insect Behavior. 6, 79-91 (1993).
  22. Winstanley, C., Blaney, W. Chemosensory mechanisms of locusts in relation to feeding. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 750-758 (1978).
  23. Blaney, W., Duckett, A. The significance of palpation by the maxillary palps of Locusta migratoria (L.): an electrophysiological and behavioural study. Journal of Experimental Biology. 63, 701-712 (1975).
  24. Blaney, W. Electrophysiological responses of the terminal sensilla on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.) to some electrolytes and non-electrolytes. Journal of Experimental Biology. 60, 275-293 (1974).
  25. Jin, X., Zhang, S., Zhang, L. Expression of odorant-binding and chemosensory proteins and spatial map of chemosensilla on labial palps of Locusta migratoria (Orthoptera: Acrididae). Anthropod Structure & Development. 35 (1), 47-56 (2006).
  26. Zhang, L., Li, H., Zhang, L. Two olfactory pathways to detect aldehydes on locust mouthpart. International Journal of Biological Sciences. 13 (6), 759-771 (2017).
  27. Dweck, H. K. M., et al. Olfactory channels associated with the Drosophila maxillary palp mediate short- and long-range attraction. eLife. 5, e14925 (2016).
  28. Bohbot, J. D., Sparks, J. T., Dickens, J. C. The maxillary palp of Aedes aegypti, a model of multisensory Integration. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 48, 29-39 (2014).
  29. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. Journal of Visualized Experiments. 84, e51355 (2014).
  30. Ng, R., Lin, H. H., Wang, J. W., Su, C. Y. Electrophysiological recording from Drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility. Journal of Visualized Experiments. 125, e56147 (2017).
  31. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. Journal of Visualized Experiments. 49, e2489 (2011).
  32. Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (Schistocerca Americana) olfactory circuits. Journal of Visualized Experiments. 71, e50139 (2013).
  33. Liu, F., Liu, N. Using single sensillum recording to detect olfactory neuron responses of bed bugs to semiochemicals. Journal of Visualized Experiments. 107, e53337 (2016).

Tags

Nevrovitenskap problemet 136 enkelt sensillum opptak palp luktesans sensilla basiconica chemosensory neuron locust
Enkelt Sensillum innspillinger for Locust Palp Sensilla Basiconica
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., You, Y., Zhang, L. Single… More

Li, H., You, Y., Zhang, L. Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica. J. Vis. Exp. (136), e57863, doi:10.3791/57863 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter