Summary
Detta dokument beskriver en detaljerad och mycket effektiv protokoll för enstaka sensillum inspelningar från den sensilla basiconica på palps av insekt mouthparts.
Abstract
Palps av locust mouthparts anses vara konventionella luktintrycket organ som spelar en viktig roll i en locust mat val, särskilt för detektion av icke-flyktiga kemiska signaler genom sensilla chaetica (tidigare kallat terminal sensilla (eller crested sensilla). Det finns ökande bevis för att dessa palps också har en lukt funktion. En luktreceptor (LmigOR2) och en luktämnet-bindande protein (LmigOBP1) har lokaliserats i nervceller och tillbehör celler, respektive, i den sensilla basiconica av palps. Enda sensillum inspelning (SSR) används för att registrera Svaren av luktämnet receptor nervceller, som är en effektiv metod för screening aktiva ligander på specifika luktämnet receptorer. SSR används i funktionella studier av luktämnet receptorer i palp sensilla. Strukturera av den sensilla basiconica ligger på kupolen på palps skiljer sig något från strukturera av de på antenner. Därför, när du utför en SSR som framkallas av doftämnen, några specifika råd kan vara till hjälp för att få optimala resultat. I detta papper införs en detaljerad och mycket effektiv protokoll för en SSR från insekt palp sensilla basiconica.
Introduction
Djur har utvecklats en rad chemosensory organ känsla av exogena kemiska signaler. Hos insekter är de viktigaste chemosensory organ antenner och palps. På dessa organ, är flera typer av chemosensory hårstrån, kallas chemosensory sensilla, innerveras av chemosensory nervceller (CSNs) inom håren. CSNs i chemosensory sensilla erkänna särskilda kemiska signaler genom Signaltransduktion från kemiska stimuli till elektrisk potential som överförs därefter upp till det centrala nervsystem1,2,3 .
CSNs express olika chemosensory receptorer [e.g., luktämnen receptorer (ORs)], jonotropa receptorer (IRs) och luktintrycket receptorer (GRs) på membranen, som koda exogena kemiska signaler som är associerad med olika typer av chemosensation 4,5,6. Karakterisering av CSNs är nyckeln till förtydligandet av cellulära och molekylära mekanismer av insekten chemoreception. Nu enda sensillum inspelning (SSR) är en allmänt använd teknik för karakterisering av insekt CSNs i de antennal sensilla av många insekter, däribland flyger7, nattfjärilar8, skalbaggar9, bladlöss10, gräshoppor11, och myror12. Dock få studier har tillämpat en SSR-insekt palps13,14,15,16,17, eftersom deras sensilla särskilda strukturer gör en elektrofysiologiska inspelning svårt18.
Svärmar av gräshoppor (Orthoptera) orsakar ofta allvarlig Beskär skador och ekonomiska förluster19. På palps tros spela en viktig roll i mat val av gräshoppor20,21,22,23,24. Två typer av chemosensory sensilla utreds av ett svepelektronmikroskop (SEM). Vanligtvis, observeras 350 sensilla chaetica och 7-8 sensilla basiconica på varje kupol av locust palps18. Sensilla chaetica är luktintrycket sensilla känsla av icke-flyktiga kemiska ledtrådar, medan sensilla basiconica har en lukt funktion, avkänning flyktiga kemiska signaler.
På locust palps, diametrarna av hår uttagen av den sensilla basiconica (ca. 12 µm), är mycket större än de av sensilla chaetica (ca. 8 µm)18,25. Cuticular väggen i den sensilla basiconica på palps är mycket tjockare än antennal sensilla18. Kupolen på palp har dessutom flytande innehållet inom en mycket flexibel nagelband. Dessa egenskaper betyder att en penetration med en mikroelektrod och ett förvärv av bra elektrofysiologiska signaler är svårare än för antennal sensilla. I detta papper presenteras en utförlig och mycket effektiv SSR protokoll för locust palp sensilla basiconica med en video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av instrument och insekt
-
Förbereda volfram elektroder och stimuli lösningar
- Fixa en ny volframtråd (diameter på 0,125 mm, längd 75 mm) in i en micromanipulator och vässa det i en 10% (w/v) natrium nitrit (NaNO2) lösning i en spruta på 10 V som tillhandahålls av ett nätaggregat i ca 1 min under ett stereomikroskop (40 X förstoring).
- Doppa de vässade volframtråd upprepade gånger i 10% NaNO2 lösning, ca 4 mm vid 5 V i < 1 min (figur 1A).
- Undersöka diametern av vässade volfram spetsen ofta under stereomikroskopet tills det är fin nog att penetrera nagelbanden av en locust palp lukt sensillum (figur 1B).
- Förbereda lösningarna som stimulans. Späd varje ämnets kemiska stimulans i mineralolja. Späd 1-nonanol och nonanoic syra på 10% utspädningar. Späd E-2-hexenal och hexanal på 10-2, 10-3, 10-4och 10-5.
- Förbereda Pasteur rören som transporterar stimuli: Infoga filter pappersremsor (längd 2 cm, bredd 0,5 cm) in i Pasteur rören, lägga utspädda stimulans lösningar (varje 10 µl) till filterpapper remsorna och Anslut sedan Pasteur rören med pipettspetsar (1 ml).
-
Förbereda insekten
- Bakre gräshoppor (Locusta migratoria) med färska vete plantor under trånga förhållanden vid en relativ luftfuktighet på 60%, en temperatur på 28-30 ° C och en fotoperiod 18:6 h (ljus: mörk). Välj 1 - 3 dag-gamla 5th instar locust nymfer och ta bort antenner med fina saxarmarna för att undvika eventuella störningar vid inspelning.
-
Förbereda locust maxillary palp innehavaren
- Använda en glasskiva (25 x 75 mm) som basen av maxillary palp innehavaren (MPH). Bifoga en plast bit (1 mm i höjd, 10 mm i bredd, längd 35 mm) till ett hörn av glasskiva med dubbelhäftande tejp och äntligen fixa ett lock glas (18 x 18 mm) ovanpå plastbitarna med dubbelhäftande tejp. Placera en liten bit röd gummi tejp på täckglaset som ett icke-slip lager. Plastbitarna och skyddsglaset utgör plattformen för den locust palp. Höjden av plattformen är cirka 1,5 mm.
- Installera en volframtråd (diameter på 0,125 mm, längd 36 mm) på ett avstånd av 1,5 mm parallell till insidan av arbetskorgens kant. Fixa de två ändarna av kabeln på plattformen med dubbelhäftande tejp.
2. beredning av Locust Maxillary Palps
- Skär ett centrifugrör (1,5 ml) vertikalt i halvor och skär av botten. Placera gräshoppor i beredda röret. Lämna den ventrala regionen och chefen för den gräshoppor som exponeras. Fixa församlingen till glas bild med dubbelhäftande tejp (figur 2A).
- Dra den rätt maxillary palp på plattformen.
- Sätta volframtråd det fjärde segmentet av palp. Placera självhäftande spackel på varje sida av volframtråd, ca 2 mm från den maxillary palp (figur 2A och 2B).
3. inre Sensillum Recordings
- Placera locust maxillary palp preparatet under ett Mikroskop vid låg förstoring (100 X). Justera positionen för förberedelserna tills palp är vinkelrät mot inspelning elektroden (figur 3A).
- Referenselektroden (volframelektrod) för in locust ögat med hjälp av en micromanipulator. Flytta inspelning elektroden (volframelektrod) nära den maxillary palp med micromanipulator (figur 3B och 3 C).
- Justera enhetens lukt leverans till ca 1 cm från den maxillary palp (figur 3B).
- Öppna inspelningsprogrammet Auto Spike 32. Ange parametrarna inspelning enligt följande: inspelning skalan på 500 µV; hög cutoff av filtret på 300 Hz, låg cutoff på 200 Hz; och pretrigger på 10 s.
- Anslut inspelning elektroden till en 10 x universal AC/DC förstärkare.
- Växla mikroskopet till en hög förstoring (500 X). Infoga inspelning elektroden i basen av en basiconic sensillum på den maxillary palp och fint justera inspelning elektroden för att få bra spontana spikar (figur 3D).
- Öppna stimulans handkontrollen för att leverera en kontinuerlig luftström på 20 ml/s. Ange stimulering tiden till 1 s. posten signaler för 10 s, start 10 s före uppkomsten av stimulans pulsen.
- Använd en 10 x universal AC/DC förstärkare för att förstärka signalerna. Underlag IDAC 4 signaler. Analysera signalerna med programmet Auto Spike 32. AC-signaler är band-passera filtrerade mellan 200 till 300 Hz. Använd Auto Spike 32 för att skilja topp-till-botten amplituder från ljud. Beräkna svaren från nervcellerna som ökar i aktionspotential frekvenser (spikar per sekund) över spontana frekvenserna. Utföra en statistisk analys som använder GraphPad Prism 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Två sensilla subtyper (pb1 och pb2) på den locust maxillary palp identifieras utifrån olika svar dynamics och kemiska doftämnen (10% 1-nonanol och 10% nonanoic syra). Nervceller i pb1 producerar betydligt mer spikes att 1-nonanol än nonanoic syra medan nervceller i pb2 är betydligt mindre aktiveras av 1-nonanol jämfört med nonanoic syra (figur 4). Hexanal och E-2-Hexenal kan framkalla en locust palp öppna svar (POR)26. Hexanal är en riklig host växters gröna blad flyktiga som kan bidra till en ytterligare bekräftelse till den mat källa26. De spikar som framkallas i pb1 nervceller senast längre än på pb2 när de stimuleras av E-2-hexenal (figur 4). Nervceller i pb1 och pb2 uppvisar liknande robust Svaren till hexanal (figur 4). Jämförelse mellan de genomsnittliga förändringarna av alla spikar mellan perioderna 5 s före och 5 s efter stimulering indikerar att svaret på 1-nonanol är betydligt högre än till nonanoic syra i pb1, men motsatts i pb2 (figur 5). Nervceller i dessa två undertyper av sensilla bemöta dosberoende ligandinducerad E-2-hexenal och hexanal, och deras svar mönster till dessa två aldehyder skiljer (figur 6A och 6B).
Figur 1. Elektroden förberedelse. (A) denna panel visar en allmän bild av elektroden skärpning apparaten. Sprutan som innehåller 10% NaNO2 (vänster) används för att slipa elektroden (höger). (B) denna panel visar en nära bild av elektroden spetsen (a: lämplig; b: olämpliga). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Locust maxillary palp innehavaren (MPH). (A) The MPH och en locust monteras i glas bilden innan du placerar den under mikroskopet. (B) i denna panel visas en närbild av den locust maxillary palp, fastställs av volframtråd på plattformen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Enstaka sensillum inspelningar. (A) denna panel visar en vy av elektrofysiologi installationen. (B) denna panel visar en nära bild av locust preparatet monterad på mikroskopet. (C), denna bild visar den locust maxillary palp på 100 X förstoring. (D), denna bild visar palp vid 500 gångers förstoring. Pilen anger en basiconic sensillum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Svar spår av enstaka sensillum inspelningar av den locust maxillary palp. I denna panel står pb1 för subtyp 1 av den palp sensilla basiconica; PB2 står för undertyp 2 av de palp sensilla basiconica. Staplarna ovan spår visar stimulans varaktighet (1 s). För dessa inspelningar används alla lukter på 10% spädningar utom E-2-hexenal och hexanal, som är utspätt till 1%. Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 26. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5. Jämförelse av medelvärde antal spikar i nervceller i pb1 och pb2 stimuleras av nonanoic syra och 1-nonanol. Det genomsnittliga antalet spikar beräknas i perioder 5 s före och efter stimulering. I pb1, öka det genomsnittliga antalet spikar i nervceller svara på 1-nonanol betydligt högre än de av spikar i nervceller svara nonanoic syra (n = 11 palps; ANOVA med post hoc t-tester; p < 0,0001), i motsats till pb2 (n = 10 palps; ANOVA med post hoc t-tester; p = 0.0110). Felstapel representerar SEM. Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 26. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6. Mönster av nervceller i pb1 och pb2 besvara dosberoende ligandinducerad E-2-hexenal och hexanal. (A) denna panel visar mönster av nervceller i pb1 (± SEM; n = 12 palps). (B) denna panel visar mönster av nervceller i pb2 (± SEM; n = 10 palps). Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 26. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insekter är beroende av palps att upptäcka mat lukt, och deras palps tros spela en viktig roll i artbildning13,27. Palps är enkel olfactory organ och får allt större uppmärksamhet som en attraktiv modell för utforskning av neuromolecular nätverk underliggande chemosensation28.
Insekt labellar och palp SSRs har framgångsrikt utförts på Drosophila melanogaster, Anopheles gambiaeoch Culex quinquefasciatus13,14,15,16 , 17 men sällan har rapporterats i form av en videopresentation16,29. Däremot finns videodata på antennal SSRs för Drosophila, naveln länkar mal (Amyeloistransitella), Schistocerca Americanaoch vägglus (Cimex lectularius)16, 30 , 31 , 32 , 33.
Locust palp sensilla basiconica har en viss struktur som skiljer sig från locust antennal sensilla och många andra insekt sensilla. Med metoden som beskrivs här, handlingspänningar genereras av locust palp sensilla basiconica subtyper pb1 och pb2 kunde registreras och diskriminerade (figur 4 och figur 5).
Det kritiska steget är genomträngningen av inspelning elektroden. Inspelning elektroden bör infogas i basen av sensillum och avancerade tills bra signaler förvärvas. Dessutom är det viktigt att förhindra kupolen på palp från att kollapsa när inspelning elektroden är isatt i basen av sensillum. För att uppnå detta, vi inrätta en plattform inklusive en särskild locust maxillary palp hållare (MPH) och använde en volframtråd för att komprimera det fjärde segmentet av palp. Många upprepningar av denna procedur visar att detta är effektivt. Baserat på de svar mönster av nervceller i sensilla till flera odoranter, har vi, för första gången identifierat två undertyper av sensilla basiconica på den locust maxillary palp, nämligen pb1 och pb2.
Begränsning av den teknik som beskrivs i denna publikation är att det kunde användas för att registrera stora insekter (t.ex., fjärilar, skalbaggar och gräshoppor) tag inte att spela in små insekter (t.ex., flugor och myggor), som har sina egna plattformar och tekniker13,14,15,16,17. Denna teknik är ett komplement till befintliga metoder.
Sammanfattningsvis beskrivs ett mycket effektivt protokoll en SSR från insekt palp sensilla basiconica i detalj. Detta protokoll kan ge forskare med en användbar teknik i studier av molekylära och cellulära mekanismer av insekt luktsinnets funktion på mouthpart. Denna metod kopplat med gaskromatografi kunde användas för att identifiera naturliga elektrofysiologiskt-aktiva ligander i extrakt av gynnsamma föda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett stipendium från National Natural Science Foundation i Kina (No.31472037). Omnämnande av varunamn eller kommersiella produkter i den här artikeln är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte en rekommendation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | ADVENT | W559504 | Used for making the electrode and fixing the palp |
| NaNO2 | Sigma-aldrich | 563218-25G | Used for sharpening the tungsten wire |
| AC Power Supply | Syntech | A2-70 | Providing the voltage in sharpening the tungsten wire |
| Stereoscope | Motic | SMZ-163 | Used for observing the sharpening of tungsten wire |
| Microscope | Olympus | W-51 | Used for observing the sensilla on locust maxillary palp |
| Intelligent Data Acquisition Controller | Syntech | IDAC-4 | Real-time on screen display of all signals before and during recording |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 | Used for controlling the stimulus application |
| Electronic micromanipulator | C.M.D.T | CFT-8301D | Used for minor movement of the recording electrode |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Used for minor movement of the reference electrode |
| Speaker | EDIFIER | R101T06 | Connected with IDAC-4 and providing sound for the signal |
| Magnetic base | PDOK | PD-101 | Used to hold the electrode, and stimulus delivery tube |
| Vibration Isolation Table | TianHe | HAP-100-1208 | Used for isolating the vibration from the equipment |
| Glass slide | CITOGLAS | ZBP-407 | Used for making the base for the MPH |
| Blu-tack | Bostik | Blu-tack-45g | Fixing the tungsten wire |
| Pasteur tube | YARE | WITEG | Placing the filter paper containing stimuli stimulus solutions |
References
- Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 12987-12995 (2011).
- Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annual Review of Entomology. 58, 373-391 (2013).
- Zhang, J., Walker, W. B., Wang, G. Pheromone reception in moths: from molecules to behaviors. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 130, 109-128 (2015).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136 (1), 149-162 (2009).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30, 537-552 (2001).
- Roelofs, W., et al. Sex pheromone production and perception in European corn borer moths is determined by both autosomal and sex-linked genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7585-7589 (1987).
- Larsson, M. C., Leal, W. S., Hansson, B. S. Olfactory receptor neurons detecting plant odours and male volatiles in Anomala cuprea beetles (Coleoptera: Scarabaeidae). Journal of Insect Physiology. 47 (9), 1065-1076 (2001).
- Zhang, R., et al. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids. Current Biology. 27 (1), 55-61 (2017).
- Cui, X., Wu, C., Zhang, L. Electrophysiological response patterns of 16 olfactory neurons from the trichoid sensilla to odorant from fecal volatiles in the locust, Locusta migratoria manilensis. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 77 (2), 45-57 (2011).
- Sharma, K. R., et al. Cuticular hydrocarbon pheromones for social behavior and their coding in the ant antenna. Cell Reports. 12 (8), 1261-1271 (2015).
- de Bruyne, M., Clyne, P. J., Carlson, J. R. Odor coding in a model olfactory organ: the Drosophila maxillary palp. Journal of Neuroscience. 19 (11), 4520-4532 (1999).
- Syed, Z., Leal, W. S. Maxillary palps are broad spectrum odorant detectors in Culex quinquefasciatus. Chemical Senses. 32 (8), 727-738 (2007).
- Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36, e1725 (2010).
- Grant, A. J., Wigton, B. E., Aghajanian, J. G., O'Connell, R. J. Electrophysiological responses of receptor neurons in mosquito maxillary palp sensilla to carbon dioxide. Journal of Comparative Physiology A. 177 (4), 389-396 (1995).
- Blaney, W. The ultrastructure of an olfactory sensillum on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.). Cell and Tissue Research. 184 (3), 397-409 (1977).
- Hassanali, A., Njagi, P. G. N., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annual Review of Entomology. 50, 223-245 (2005).
- Chapman, R. F. Contact chemoreception in feeding by phytophagous insects. Annual Review of Entomology. 48, 455-484 (2003).
- Chapman, R. F., Sword, G. The importance of palpation in food selection by a polyphagous grasshopper (Orthoptera: Acrididae). Journal of Insect Behavior. 6, 79-91 (1993).
- Winstanley, C., Blaney, W. Chemosensory mechanisms of locusts in relation to feeding. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 750-758 (1978).
- Blaney, W., Duckett, A. The significance of palpation by the maxillary palps of Locusta migratoria (L.): an electrophysiological and behavioural study. Journal of Experimental Biology. 63, 701-712 (1975).
- Blaney, W. Electrophysiological responses of the terminal sensilla on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.) to some electrolytes and non-electrolytes. Journal of Experimental Biology. 60, 275-293 (1974).
- Jin, X., Zhang, S., Zhang, L. Expression of odorant-binding and chemosensory proteins and spatial map of chemosensilla on labial palps of Locusta migratoria (Orthoptera: Acrididae). Anthropod Structure & Development. 35 (1), 47-56 (2006).
- Zhang, L., Li, H., Zhang, L. Two olfactory pathways to detect aldehydes on locust mouthpart. International Journal of Biological Sciences. 13 (6), 759-771 (2017).
- Dweck, H. K. M., et al. Olfactory channels associated with the Drosophila maxillary palp mediate short- and long-range attraction. eLife. 5, e14925 (2016).
- Bohbot, J. D., Sparks, J. T., Dickens, J. C. The maxillary palp of Aedes aegypti, a model of multisensory Integration. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 48, 29-39 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. Journal of Visualized Experiments. 84, e51355 (2014).
- Ng, R., Lin, H. H., Wang, J. W., Su, C. Y. Electrophysiological recording from Drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility. Journal of Visualized Experiments. 125, e56147 (2017).
- Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. Journal of Visualized Experiments. 49, e2489 (2011).
- Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (Schistocerca Americana) olfactory circuits. Journal of Visualized Experiments. 71, e50139 (2013).
- Liu, F., Liu, N. Using single sensillum recording to detect olfactory neuron responses of bed bugs to semiochemicals. Journal of Visualized Experiments. 107, e53337 (2016).
