Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Langsiktig i Vivo sporing av inflammatoriske celle dynamikken i Drosophila Pupae

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,4
1School of Biochemistry, Biomedical Sciences, University of Bristol, 2School of Cellular and Molecular Medicine, Biomedical Sciences, University of Bristol, 3MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh, Queens Medical Research Institute, 4School of Physiology, Pharmacology, and Neuroscience, Biomedical Sciences, University of Bristol

Summary

Her presenterer vi en protokoll for live-imaging såret reparasjon og tilknyttede inflammatorisk respons på spatio-temporale høyoppløselig i vivo. Denne metoden bruker pupal utviklingstrinn Drosophila aktivere langsiktige imaging og sporing av bestemt celle populasjoner over tid og er kompatibel med effektiv RNAi-mediert genet inaktivering.

Abstract

Under rask inflammatorisk respons til å ødelegge vev rekrutteres raskt cellene av medfødte immunforsvaret til skade området. Når på såret, medfødte immunceller utfører en rekke viktige funksjoner, for eksempel kampene infeksjon, fjerne nekrotisk rusk og stimulere matrix deponering. For å forstå ulike signalnettverk hendelsene som regulerer denne immunrespons, er det avgjørende å observere kompleks oppførsel av (og samhandlinger som oppstår mellom) flere celle linjene i vivo, og i sanntid, med høy spatio-temporale oppløsning. Den optiske gjennomskinnelighet og den genetiske tractability av Drosophila embryo har etablert Drosophila som en uvurderlig modell til live-image og dissekere grunnleggende aspekter av inflammatoriske celle opptreden, inkluderer mekanismer utviklingsmessige spredning, rydding av apoptotisk lik og/eller mikrobiell patogener og rekruttering til sår. Men flere nyere arbeider har nå vist at ansette et mye senere tidspunkt i Drosophila livssyklus- Drosophila puppe-tilbyr en rekke forskjellige fordeler, inkludert forbedret RNAi effektivitet, lengre imaging perioder, og betydelig større immun cellen tallene. Her beskriver vi en protokoll for bildebehandling såret reparasjon og tilknyttede inflammatorisk respons på høy spatio-temporale oppløsningen i live Drosophila pupae. For å følge dynamikken i både re epithelialization og betennelse, bruker vi en rekke spesifikke i vivo fluorescerende markører for både epitel og medfødte immunceller. Vi også demonstrere effektiviteten av foto-cabriolet fluorophores, for eksempel Kaede, for å følge bestemte immun celle undergrupper, for å spore deres atferd som de migrerer til og løse fra skade området.

Introduction

En effektiv inflammatorisk respons er viktig for noen organismer å bekjempe infeksjoner, fjerne rusk og organisere reparasjon av skadet vev1. Selv om dette svaret er en uunngåelig resultat av de fleste vevsskade, krever betennelse strenge reguleringer fordi en upassende betennelsesreaksjon har vært knyttet til en rekke ulike menneskelige sykdommer (inkludert kronisk ikke-healing sår, overdreven scarring og predisposition til kreft)1,2,3. Gitt denne kliniske relevans, er det avgjørende å få en mer detaljert forståelse av mobilnettet og molekylære mekanismer kjøring inflammatorisk respons for å utvikle nye prognostiske indicators og strategier for å behandle en rekke kronisk inflammatorisk forhold som kan beskytte reparasjon vev fra lengre og unødvendig betennelse.

De siste årene blitt Drosophila en godt etablert og verdifulle modellsystem å dissekere grunnleggende funksjonene til betennelsesreaksjon bevart fra insekter til menneskelig4,5. I dag tilbyr Drosophila langt større genetisk tractability enn det som er mulig i andre eksperimentelle modeller (som mus eller sebrafisk), tillater presis spatio-temporale genetisk manipulasjon i vivo (å deaktivere eller over express noen genet av interesse i spesifikke celletyper på en definert utviklingsmessige tidspunkt) og brukervennlighet genomet hele skjermer6,7. Tradisjonelt er de fleste live-imaging studier av sårheling og betennelser i Drosophila utført på embryonale stadier, embryoer er immobile (i motsetning til Drosophila larver eller voksne) og optisk gjennomsiktig som gjør at enestående høy oppløsning i vivo imaging8. Dette har tillatt forskere å visualisere raske og robuste rekruttering av Drosophila medfødte immunceller (hemocytes) til såret området i respons til mekanisk eller laser-indusert skade embryonale epitel9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. ved å kombinere disse live-imaging studier med genetisk manipulering, studier i Drosophila embryoer har avdekket mange viktige immun celle proteiner som styrer inflammatorisk celle atferd i vivo. For eksempel CED-1 homolog Draper (en ITAM domenet inneholder protein) har blitt identifisert som en viktig "skade reseptor" som formidler rekruttering Drosophila immunceller i en H2O2-avhengige måte til områder av skade15. Draper nivåer i immunceller reguleres igjen av kalsium-indusert JNK signalering og opphøyet nedstrøms apoptotisk lik opptak12. Hemocyte motilitet videre krever kompleks cellen cytoskjelett endringer å koordinere regisserte migrering mot såret og dette er avhengig av aktiviteten av cellen cytoskjelett regulatorer som utgangen-bunting protein Fascin16 og Rho familien liten GTPases Rac og Rho9.

Drosophila er en holometabolous insekt som går gjennom flere larver og pupal stadier følgende embryogenesis, før nå voksen alder17. Drosophila puppen er utviklet som en ekstra modell for ikke-invasiv live-imaging av en rekke dynamisk mobilnettet begivenheter, inkludert utviklingsmessige celle migrasjon18, celledeling19, celle vekst20og muskel sammentrekning21. Nylig har det blitt etablert som en ny modell i å studere dynamikken i såret reparasjon og betennelse i vivo22,23.

Akkurat som embryonale stadier er Drosophila pupae immobile og optisk gjennomskinnelig, etter forsiktig disseksjon deres ugjennomsiktig pupal tilfeller18. Ved å utnytte denne optiske gjennomsiktighet, kan man følge virkemåte i vivo medfødte immunceller (hemocytes) svar vevsskade i Drosophila pupal vev, som pupal fløyen22. Den pupal vingen eksisterer som en enkel bilayered struktur og består av to store flate epithelial ark er tilkoblet rundt fløyen periferien; den ekstracellulære plassen mellom disse to epiteliale lag er fylt med hemolymph (insekt blod) og stort antall motile hemocytes24. Akkurat som i embryo utløser mekanisk eller laser-indusert skade fløyen epitel en raske rekrutteringen av hemocytes til skade området23. Men tilbyr denne pupal scenen noen klare fordeler for bildebehandling over tidligere embryonale stadier. Skadet pupae kan avbildes over langt lengre tidsrom (for minst 5 h), flere vev er tilgjengelig for eksperimentell forstyrrelsene (for eksempel generering av flere sår) og det er betydelig større antall hemocytes tilstede ved dette stadiet ( gi mer celle baner fra lengre avstander for forbedret statistisk styrke under matematiske analysen). Videre forbedret effektiviteten i RNAi-mediert genet inaktivering betydelig pupal etapper, slik at mange gener å være 'banket-ned' i en vev eller tid-spesifikk måte sammenlignet med de mer tradisjonelle hele mutant tilnærmingen av embryo.

For å kunne følge dynamikken i såret re epithelialization og tilhørende inflammatorisk respons innen denne pupal modellen, to ulike celle populasjoner må merkes: pupal epitel og cellene av medfødte immunforsvaret (Drosophila hemocytes). En rekke forskjellige indikatorer (Tabell for materiale) er tilgjengelig til å merke disse to ulike celle populasjoner - valg av markøren, avhenger av det detalj forarbeide å bli undersøkt. For å markere pupal epitel, Drosophila linjer som inneholder enten benyttes en overalt uttrykt GFP-merket E-cadherin (som merker adherens veikryss) rutinemessig for å angi plasseringen av cellemargene, eller eventuelt en GFP-merket Utgangen-bindende domenet til Moesin (som merker begrepsordbok cytoskeleton) å visualisere de sår-edge kontraktile utgangen ring og ledende utstikkende deler. Merke Drosophila hemocytes, en hemocyte-spesifikke srp-Gal425 til stasjonen uttrykk for kjernefysisk RFP (for kjernefysisk sporing), cytoplasmatiske GFP eller GFP-merket Moesin (etikett cytoplasma eller utgangen cytoskjelett, henholdsvis) eller en photoconvertible fluorophore (for eksempel Kaede) brukes. Faktisk er det ofte en fordel å bruke flere immun celle markører i kombinasjon, aktivere samtidig analyse av kjernefysiske bevegelsen og celle morfologi (se representant resultater). Men siden denne protokollen innebærer bruk av Drosophila pupae, bare kombinasjoner av genetiske markører som er levedyktig til midt-pupal stadier kan benyttes. Også kan embryonale dødelige aksjer ikke egnet. Dette er usannsynlig å være et problem når imaging kontroll (eller vill-type) pupae men er viktig å vurdere når gener er å bli slått ned eller overexpressed, for å vurdere deres effekt på såret nedleggelse eller betennelse. Ved tidlig dødelighet forårsaket av genet knockdown (eller overuttrykte), en Gal80ts konstruere kan brukes å indusere Gal4-drevet knockdown senere i utvikling (se diskusjon).

I våre studier, har flytte til pupal scenen hjulpet oss å samle tilstrekkelig immun cellen bane data å analysere inflammatorisk atferd med avansert matematisk modellering, som i sin tur har tillatt oss å utlede romanen detaljer av såret inflammatorisk attractant signaler23. For eksempel viste denne tilnærmingen at såret chemoattractant sprer seg langsomt gjennom betent vev på 200 μm2/minutt en pris langt tregere enn tidligere foreslått liten kandidat molekyler som ATP eller H2O2 rapporteres til Diffus26,27,28,29; disse små "skade" molekylene er i stedet vil fungere som ettergivende signaler. Videre ved å følge langsiktige virkemåten for medfødte immunceller som de løse fra et innledende sår og er utsatt for et sekund (laget i forskjellige timepoints etter først), har vi avdekket en midlertidig 'desensitization"perioden som immunceller er blind påfølgende skader23. Ved å utnytte langsiktige tenkelig potensialet av pupal modellen, sammen med Drosophilas genetisk tractability, kan man følge virkemåten til bestemte immun celle populasjoner (for eksempel bare de immunceller rekruttert til såret området) i svar på etterfølgende fornærmelser, bruker photoconvertible fluorophore30 som kan uttrykkes utelukkende innenfor immun celle avstamning23.

Her beskriver vi en protokoll for å visualisere dynamikken i såret reparasjon og tilknyttede inflammatorisk respons på høy spatio-temporale oppløsning med levende Drosophila pupae. Vi gir en detaljert metodikk for å dekke trinnene som kreves for første pupae utarbeidelse (disseksjon og montering) og påfølgende laser-mediert såret og tidsinnstilt bildebehandling. Vi beskriver også bruk av foto-cabriolet fluorophores å tillate merkingen av bestemt immun celle delsett i vivo. På lang sikt ser vi at denne Drosophila pupal modellen åpner spennende muligheter for dissekere komplekse signalnettverk dynamikken underliggende betennelsesreaksjon til å ødelegge vev. Ved å bruke mer avanserte statistiske analyser kan en avdekke funksjoner i svaret som ellers ville være eksperimentelt utilgjengelige, mens forbedret RNAi effektiviteten kunne låne seg anvendelsen av genomet hele screening i immunceller i vivo identifisere romanen spillere regulere immunsystemet celle atferd.

Protocol

Denne protokollen består av fire viktigste sekvensielle trinn: (1) utarbeidelse av Drosophila aksjer og iscenesettelse av Drosophila pupae, (2) Pupal disseksjon og montering, (3) Pupal såret, (4) i vivo tidsinnstilt AC confocal bildebehandling.

1. forberedelse av Drosophila aksjer og iscenesettelse av Pupae

  1. Få riktige Drosophila aksjer (se introduksjon og Tabell for materiale).
  2. Samle unge friske voksne flyr av aktuelle genotype.
    1. Velg voksen flyr med karbondioksid gass pads for å bedøve kort fluene og en fin pensel overføre flyr av aktuelle genotype eller kjønn til samling ampuller.
    2. Legge til 20 jomfru kvinner og 20 menn hvert hetteglass med standard fly mat media (en cornmeal-melasse-agar blanding, se Tabellen for materiale) med gjær.
  3. For optimal pupal generasjon, tips voksne fluene hver dag på ny mat i frisk ampuller, holde alle ampuller på 25 ° C.
    Merk: Hvis Gal4-UAS systemet31 brukes til å kjøre slektslinje kundespesifikk genuttrykk, alle trinnene bør utføres ved 25 ° C eller over, som Gal4-UAS systemet er ømfintlig.
  4. 18 h før planlagt bildebehandling økten, Velg minst 10 nyopprettede hvit pre pupae (figur 1A) fra hetteglass (dvs. 0 h etter blodsugende formasjon, APF) ved hjelp av Tang eller en fin pensel for å dislodge pupae fra interiør medisinglass overflaten og overføre pupae nøye ved siden av en feilfri tom emballasje plast flaske.
    Merk: Vandrende 3rd skikkelsen Larvene gjennomgå oppover utenfor mat medium å gjennomgå pupation; nyopprettede hvit prepupae er lett identifiseres som de har everted fremre voksne og er stasjonære (i motsetning til 3rd skikkelsen Larvene). Cuticle forvandles den 'blodsugende' (pupal tilfelle) som er utgangspunktet myk og hvite17. Være må forsiktig å unngå å skade pupae, da dette kan føre ikke bare til en uønsket skade-indusert inflammatorisk respons, men også til betydelig utviklingsmessige forsinkelser.
  5. Alder de valgte pupae til det riktige utviklingen scenen (18 h APF gir optimale resultater) i ampullen på 25 ° C.
    Merk: Når pupae utvikler, pupal tilfelle blir gradvis mørkere og mer skjør.
  6. Forberede andre neste steg foran tid. For å gjøre heptane lim, kombinerer en 20 cm lengde på fremhevet dobbeltsidig tape med 20 mL heptane i et 50 mL sentrifuge rør, tetning med parafin filmen og rock i romtemperatur over natten på benken.

2. forberedelse og Disseksjon av Drosophila Pupae

  1. Overføre de iscenesatte Drosophila pupae til et stykke tosidige selvklebende tape montert på et glass lysbilde. Plasser pupae slik at siden ventrale er godt fast på båndet og dorsal side er vendt oppover (figur 1B).
    Merk: Det fremre av puppen kan identifiseres av to voksne stikker fra den fremre delen av pupal saken.
  2. Fjern forsiktig pupae fra deres beskyttende blodsugende casing under brightfield disseksjon mikroskop med tang og mikro-saks (figur 1B-D).
    1. I utgangspunktet gjør et snitt i fremre mest regionen blodsugende ved hjelp av pinsett (figur 1B). Kontroller at pupal saken i dette området er hul og blottet for pupal vev fordi pupae vil har krympet i tilfelle under pupal utviklingen.
    2. Etter denne første snitt, nøye rive eller klippes pupal saken i en fremre bakre retning bruke tang eller microscissors (figur 1 c) til puppe er helt fri fra brun ugjennomsiktig sprø casing (figur 1 d).
      Merk: Pupae på dette stadiet er veldig skjør og må være forsiktig å unngå punktering pupal overflaten; punktering er åpenbart som hemolymph raskt lekker ut fra webområdet punktering. Pupae med punkteringer, men små, bør forkastes.
  3. Monter pupae i et glass bunn rett ved hjelp av heptane lim.
    1. Bruk en 20 mL pipette tips for å plassere en 10 mL slippe pre-forberedt heptane lim (se avsnitt 1.6 ovenfor) i en linje på glassbunn parabolen.
    2. Tillate limet tørke 5 s før du overfører de dissekert pupae nøye på heptane lim ved hjelp av pinsett (figur 1E).
    3. For enkel såret og bildebehandling, justere pupae After Another; ca 5 pupae er foreslått, men mer vil være håndterbart erfaring.
      Merk: Bruk heptane lim anbefales når du bruker oppreist imaging-systemer, men er ikke nødvendig når du bruker en invertert system. Hvis limet oppretter optisk avvik under bildebehandling, pupae kan plasseres direkte på coverglass stedet-naturlig vedheft mellom pupal vev og glass vil være tilstrekkelig i de fleste tilfeller for stabil bildebehandling, som er forsiktig når du flytter avbilding Dish mellom mikroskop.
  4. For best resultat, Monter pupae slik at vingen er flat på coverglass med fleste av vingeflaten i direkte kontakt med coverglass (figur 1F). Roll pupae bruke tang til å endre sin posisjon for å sikre vingen er montert riktig.
  5. For å unngå eksempel dehydrering i tenkelig perioden, Legg absorberende filter papir dynket i destillert vann ved siden av glassbunn rett på slutten av montering, pass på ikke å forstyrre pupae (figur 1E). Dekk parabolen med lokk.
    Merk: Pupae er nå klar for såret og bildebehandling.

3. laser-indusert såret Drosophila Pupal vinger

  1. Overføre glassbunn parabolen som inneholder de monterte pupae til wide-field mikroskop utstyrt med en tunable laser ablasjon system.
    1. Bruk en pulserende-UV luftkjølt nitrogen-pumpet ablasjon laser innstilt til 435 nm-se Tabellen for materiale for detaljer11; presis bølgelengden til lyset brukes til belysning er valgt av brukeren via en passende fargestoff celle.
  2. Bruke brightfield optikk, justere mikroskop scenen å finne pupal vingen av første puppe skal såret (figur 1F).
  3. For optimale resultater, bruke en olje nedsenking 40 X eller 63 X linsen for begge avbilding og laser ablasjon; Kontroller at nedsenking væsken brukes (olje eller glyserol) er konsekvent mellom ablasjon og imaging systems. Justere mikroskop for å fokusere på flyet pupal fløyen epitel nærmeste glass dekkglassvæske (dvs. fokus på regionen epitel å bli såret) ved hjelp av finskruen kontrollknappen.
  4. Med mikroskopet scenen justeringene, plassere pupal vingen slik at området for å være såret er direkte på linje med kjente målområdet av ablasjon laser.
  5. Bruk et energi tetthet demperen lysbilde montert på mikroskopet manuelt justere strømnivået for ablasjon lyset.
    Merk: Attenuator glidebryteren har Klikk Stopp og avgjørelser å identifisere det relative nivået av demping og tillater reproduserbar innstillinger.
  6. Bruker en ekstern manuelt utløse kontroll, aktivere ablasjon laser bruke ett kort Klikk utløseren for å lage et sår. Sjekk for utseendet av forbigående luftboble på webområdet ablasjon siden såret vil normalt bli fulgt den. Sjekk Hvis laser-indusert såret har vært vellykket bruke riktige fluorescerende filtre for å visualisere pupal epitel.
    Merk: Pass på å unngå utilsiktet eksponering for laserstråler strålen refleksjoner kan forårsake alvorlige øye eller skader huden.
  7. Hvis såret er vellykket, varierer fokalplanet (flytte mikroskop fokus over eller under gjeldende fokal nivå) og gjenta museklikk ablasjon utløseren. Alternativt gradvis øke laser makt bruker demperen lysbildet til ønsket såret størrelsen er oppnådd.
  8. For å variere ablasjon laser puls-repetisjon, bruke gjentakelseshastigheten knotten på bakre kontrollpanelet (som endrer fra mindre enn 1 puls/s opp til 60 Hz). For optimal såret, angi repetisjon puls til 40 Hz.
  9. Vil generere ulike størrelse sår, bruke energi tetthet demperen lysbildet å manuelt innstille styrkenivå ablasjon lyset.
  10. Avstå fra såret alle de monterte pupae og bruke disse ikke-ablated pupae som unwounded kontroller.
  11. Konsekvente resultater ved regelmessig justere ablasjon systemet (med relevante bruksanvisningen). Også rengjøre og fylle farge resonator cellen som styrer laser utskrift bølgelengden.

4. i Vivo Time-lapse AC Confocal Imaging

  1. Raskt overføre glassbunn retten til en passende mikroskop for tidsinnstilt bildebehandling.
    Merk: For optimale resultater, bruk en høy spesifikasjon AC confocal eller roterende plate mikroskop utstyrt med følsom detektorer som kan oppdage både GFP og mCherry fluorophores.
  2. For å bilde hele pupal vingen, bruk en lav forstørrelse (f.eks 20 X) linsen (figur 2A). For image sår reparasjon og tilhørende inflammatorisk respons med høy romlig oppløsning, bruke oljeneddyp 40 X (NA 1.3) eller 63 X (NA 1.4) mål linser (se representant bilder i finne 2B-D).
  3. Åpne den aktuelle bildet fange programvaren knyttet til mikroskopet.
  4. Ved hjelp av image fange programvare, slå på aktuelle lasere f.eks 488 nm og 561 nm lasere å visualisere GFP og mCherry fluorophores, henholdsvis (ved å klikke i de aktuelle boksene) og justere laser makt og vinning/forskyvning for å gi tilstrekkelig fluorescerende signalet mens unngå pixel metning; bruke lavest mulig kraften (i området 5-20%) å minimere photobleaching og Phototoksisitet.
  5. Å fange både reparere epitel og provoserende cellen rekruttering, satt mikroskop for å registrere en z-stabel ved hjelp av finskruen justering knotter på kontrollpanelet; for optimale resultater, sette programvare (med manuell knappeklikk) til posten z-skiver gjennom pupal vingen (minimum hver 3 mm), fra toppen av sårede epitel gjennom til den ekstracellulære plassen under (inneholder overfører hemocytes) for å oppnå en stor z-stack (i størrelsesorden 50-100 mm).
  6. Registrere z-stabler for tidsinnstilt bildebehandling, ved jevnlige intervaller (minimum hver 30 s) for minst 1 h etter såret.
    Merk: Nøyaktig tidsintervallet mellom z-stabler valgt representerer en avveining mellom fange raskt skiftende celle dynamikken og unngå Foto-bleking av prøvene.
  7. Å samtidig bilde flere pupae (inkludert ikke-ablated unwounded kontroller), bruke et motorisert Stadium (festet til mikroskopet) og multi-posisjon oppkjøpet funksjonen tilgjengelig i tenkelig programvare. Manuelt angi plasseringen til hvert individuelle puppe i programvaren bruker scenen posisjon kontroll knotter og deretter manuelt angi aktuelle z-stack grensene (topp og bunn) for hver individuelle puppe.
  8. Visualisere time-lapse bildene under image fange eller senere med spesialist analyseprogramvare (for eksempel ImageJ32) bruker z-stack anslag eller 3D-gjengivelse. For eksempel, å følge bevegelsene til individuelle hemocytes (som i figur 2C' og D'), spor hemocyte kjerner ved hjelp av åpen tilgang ImageJ pluginmoduler "TrackMate" eller "Manuell sporing" (metoder publisert i 33, 34).
  9. Bruk photoconvertible sonder (som Kaede30) for å velge photoconvert og merke et delsett av epitelial eller immun celler under bildebehandling.
    1. Åpne passende moduler i tenkelig programvare å utføre photoconversion (for eksempel FRAP, fluorescens utvinning etter Foto-bleking modul) og aktivere 405nm laser (ved å klikke i boksen relevant programvare)35.
    2. Merk cellene skal photoconverted i FRAP programvaren med firkantede, runde eller Frihånd markeringsverktøyet. FRAP programvaren, settes i gang-løpet for photoconversion (bleking) til ett enkelt iterasjon/bilde og angi 405 nm laser på 20% laser makt. Manuelt klikke Start eksperimentet for å utføre photoconversion.
    3. Avslutte modulen FRAP (Klikk Lukk) og gå tilbake til den opprinnelige tenkelig skjermen i programvaren; Bruk 488 nm og 561 nm lasere å image virkemåten for photoconverted og ikke-photoconverted celler ved å sette opp en z-stack og tid-lapse innspillingen som ovenfor.
      Merk: Photoconverted sonder forbli stabil i mange timer etter den første photoconversion, aktivere virkemåten til photoconverted cellene skal følges over tid (for minst 5 h). For eksempel inflammatoriske celler i såret kan selektivt photoconverted (figur 2F) og deres atferd fulgte de løse skaden området (figur 2 g og H).

Representative Results

Denne protokollen beskriver utarbeidelse av Drosophila pupae for live tidsinnstilt bildebehandling av såret reparasjon og betennelse i vivo. Bruker denne metoden, bør det være mulig å generere flere høyoppløselige filmer pupal såret nedleggelse og provoserende celle rekruttering med letthet og bilde pupae for lange perioder (minst 5 h) etter såret uten betydelige photobleaching.

En generell ordning for Drosophila puppe forberedelse

Figur 1 illustrerer den optimale metoden for forbereder Drosophila pupae i vivo bildebehandling. Drosophila hvit "prepupae" er samlet på '0 h' etter blodsugende dannelse (APF), som gjennomgå Larvene opphøre motilitet og vedta stereotype pupal figuren med everted pust vedheng (voksne) synlig ved utgangen deres fremre mest ( Figur 1A). Den hvite 0t APF prepupae tillates å utvikle for 18 h ved 25 ° C, da blodsugende blitt brown (figur 1B) og er deretter dissekert bruke fine tang og/eller microscissors (figur 1 c, fjerne beskyttende pupal saken) å avsløre den optisk gjennomskinnelig puppe innen (figur 1 d). Etter disseksjon vises pupal vingene på lateral sidene av pupal thorax (uthevet i blått, figur 1 cD). På dette stadiet er andre pupal kroppsdeler også lett synlig, inkludert øyne, ben og magen (merket i figur 1 d). Beina er også egnet for såret betennelse studier og kan bli såret med samme laser beskrevet ovenfor. Flere 18t APF pupae kan monteres samtidig i tenkelig parabolen (figur 1E, bruker heptane lim og en vann-gjennomvåt filter papir for å minimere dehydrering) med flateste porsjon wing (disponerte blå) i kontakt med dekkglassvæske ( Finne 1F); Dette er særlig fordelaktig hvis tenkelig mikroskopet er utstyrt med en motorisert scene å tillate flere pupae innspilling én enkelt tenkelig periode. Noen pupae som har blitt skadet under disseksjon eller montering bør forkastes (f.eks puppe plassert tredje i rekken pilen i finne 1E). Andre deler av kroppen (f.eks øyne og ben, skissert rosa) kan også kontakte dekkglassvæske og er tilgjengelig for såret og påfølgende imaging (figur 1F). For eksperimenter studere enkelt sår, er laser-indusert skader generelt best påført sentralt i fløyen (stjerne, figur 1F), selv om andre steder kan brukes hvis flere sår studeres.

Sterilt såret aktiverer en robust betennelsesreaksjon i Drosophila pupal fløyen

For å kunne følge såret reparasjon og den tilhørende betennelsesreaksjon- i vivo, sårede vingene til 18t APF Drosophila pupae ble fotografert med time-lapse AC confocal mikroskopi (figur 2A-H). På dette pupal stadiet er wing epithelia enkel flat ark av celler (merket her bruker GFP-merket E-cadherin merke enkelte cellekantlinjene, fløyen margin skissert i figur 2A). Selv i unwounded vinger (lav forstørrelse tallene 2A og 2A'), store mengder trekkfugler medfødte immunceller (hemocytes, merket med srp-Gal4 drevet cytoplasmatiske GFP, grønn, og kjernefysiske RFP, magenta) er funnet i hemolymph ( insekt blod) opptar mellomliggende ekstracellulære plassen (figur 2A og 2A'). Laser-indusert skade pupal fløyen epitel (såret margin i hvitt, figur 2B-D) stimulerer en rask overføring av hemocytes til såret området (figur 2B-D og immun celle kjerner i figur 2B '-D'). Merking hemocytes med både en kjernefysisk markør (f.eks kjernefysiske RFP "rød-stinger") i kombinasjon med en cytoplasmatiske eller cellen cytoskjelett markør (f.eks cytoplasmatiske GFP eller GFP-merket Moesin) er spesielt fordelaktig fordi det gir den samtidige sporing av hemocyte kjerner (for automatisk analyse av hemocyte atferd f.eks overføringshastighet og retningen) og visualisering av hemocyte morfologi. Sistnevnte er viktig fordi det tillater oss å bestemme om hemocytes er phagocytosing nekrose rusk (figur 2C, innfelt) på såret kanten (eller mikrober ved infeksjon)12,23 og tillater oss også å følge protrusive atferd som de utvider fine filopodia eller lamellipodia på sine ledende som de migrerer mot eller bort fra såret.

Enkel sporing av hemocyte kjernefysiske baner med riktig Image Analysis programvare32 (Tabell for materiale) viser komplekse spatio-temporale dynamikken i inflammatorisk respons, lik som rapportert tidligere såret embryo9,36 (flerfargede spor, figur 2C' og D'). Innen bare 30 min av såret, hemocytes ligger nærmest til skade området begynne regisserte migrering mot såret (figur 2C'). Men med økende tid etter skade, hemocytes ligger gradvis videre fra skade området også begynne regisserte migrering mot såret (figur 2D'). På denne måten er en "bølge" av immun celle respons som sprer seg utover fra såret kanten observert, som vi ser for å gjenspeile spredningen av sår chemoattractant fra skade området. Disse spatio-temporale immun celle dynamics ga nyttig utgangspunkt for vår siste undersøkelse som ansatt avansert matematisk modellering (Bayesisk slutning) analyse å antyde romanen egenskaper av såret attractant (detaljert metoder Publisert i23). Ved kalibrering våre datamodeller (som linket såret attractant graderingen hemocyte bias) tilpasses observert i vivo immun baner, kan en ekstra detaljert kjennetegner såret attractant fra våre hemocyte bane (for eksempel signal diffusjon hastigheten, kilden og varigheten av signal produksjon)23.

Videre ved å kjøre uttrykk for photoconvertible fluorophore Kaede innen immun celle avstamning bruker srp-Gal4 (grønn, figur 2E) vi har også vært i stand til å selektivt merke en subpopulasjon av disse vandrende wing hemocytes (som de rekruttert til såret området. E, før UV-indusert photoconversion og F, post-photoconversion). Vi kan du følge virkemåten til disse hemocytes over tid (magenta, figur 2 g-H) som de løse fra såret området (piler, figur 2 g og H) og sammenligne hvordan deres atferd er forskjellig fra de ikke-photoconverted celler som ikke nå skade området. Vi har brukt dette i vivo merking teknikk for å demonstrere at hemocytes rekruttert til en innledende såret midlertidig er ufølsomme til et andre sår generert 90 minutter senere23, selv om denne differensial merking teknikken kan også har mange andre innsiktsfull programmer i fremtiden (se diskusjon).

Bruker denne tilnærmingen, kan vi også samtidig følge spatio-temporale dynamikken i såret reparasjon eller er epithelialisation' (figur 2B-D). Her overalt uttrykt GFP-merket E-cadherin etiketter mobilnettet adherens veikryss i hele fløyen epitel og lar former av personlige epitelceller følges over tid. Såret kanten er lett identifiseres som krysset mellom intakt GFP-merket epitelceller og umerkede rusk (hvit stiplet linje, figur 2B-D). For fleste av sår begynner såret å re epithelialize innen 1t skade og såret kanten fremskritt innover (figur 2D); sår på denne størrelsen vil vanligvis leges innen 2-3 h skade23. Såret nedleggelse i både embryoer og pupae er drevet av en actomyosin kontraktile videokabel sammen med ledende utgangen-rike filopodia23,37; Denne cellen cytoskjelett dynamikken kan visualiseres direkte under såret reparasjon ved hjelp av riktig i vivo journalister, som GFP-merket Spaghetti squash (Myosin forskrifter lys kjeden) eller GFP-merket utgangen-bindende Moesin23. Noen spesielt store sår, men actomyosin kabelen og ledende filopodia værende ikke - disse sårene blir "kronisk" og aldri helt nytt epithelialize23 selv etter mye lengre perioder (over 24 h) av in vivo bildebehandling. Interessant, er inflammatorisk respons forbundet med disse ikke-healing sår markert forskjellig fra forbundet med vanlig akutt sår23 antyder at unormal immun celle atferd kan være en nyttig prognostiske markør i klinikken . I fremtiden, kan videre i vivo analyse av kroniske sår med langsiktige imaging (over 24 h) i pupal modellen gi viktig mekanistisk innsikt i denne ødeleggende tilstand.

Figure 1
Figur 1: Drosophila puppe forberedelse til såret og live bildebehandling. (A) Drosophila hvit prepupae samlet på 0t APF, med fremre enden dvs everted puste vedheng (voksne). (B) etter heve hvitt 0t APF prepupae 18 h ved 25 ° C, blodsugende vises brun. Disseksjon av pupal saken skal begynne på fremre mest regionen (pil), angitt av de everted voksne som puppe riktig er fraværende fra denne regionen, og fine tang og/eller microscissors å fjerne beskyttende pupal saken (C). Pupal vingene vises på lateral sidene av pupal thorax (blå disposisjoner). (D) Pupal tilfelle fjernet helt fra 18t APF puppe, her Puppen har blitt rullet 90 ° for å vise lateralt med vingen til å avbildes blått. (E-F) Fem 18t APF pupae montert på glass dekkglassvæske i imaging parabolen med heptane lim, med vann-gjennomvåt filter papir å minimere dehydrering (E). Puppe ligger tredje i rekken (pil) skal kastes som oppstått skade under forberedelse. Pupae er montert med flateste delen av vingen (disponerte blå) i kontakt med dekkglassvæske (F) og laser-indusert sår er generert sentralt i vingen (stjerne, F), selv om andre steder kan brukes hvis flere sår studier. Bildet i (D) tilpasset med tillatelse fra Weavers et al., 201623. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Dynamisk i vivo analyse av inflammatorisk reaksjon på vevsskade. Pupae dissekert fra beskyttende pupal tilfeller og montert på glass dekkglassvæske (A) er såret og deretter fotografert bruker time-lapse AC confocal mikroskopi (B-H). Lav forstørrelse visningen av unwounded pupal vingen (A, fløyen margin i hvitt) som inneholder store mengder trekkfugler hemocytes (A'). Laser-indusert skade pupal fløyen epitel (B-D, cellekantlinjene merket bruker GFP-merket Drosophila E-cadherin; sår margin i hvitt) aktiverer en rask betennelsesreaksjon med migrering av flere hemocytes ( SRP-Gal4 drevet uttrykk for kjernefysisk RFP, magenta og cytoplasmatiske GFP, grønn) mot såret området (B-D, representant rammer fra en time-lapse film der hvert bilde er en projeksjon av 25 skiver 3 μm hver). Manuell sporing av hemocyte baner (flerfargede spor, C' og D') Angi komplekse spatio-temporale dynamikken i inflammatorisk respons, lik som rapportert for sårede embryoer. Hemocytes også phagocytose nekrose mobilnettet rusk på såret området (arrowhead, C og også innfelt). Av photoconvertible fluorophore Kaede i immun celle avstamning (grønn, E, bruker srp-Gal4) kan sår-rekruttert hemocytes (pil, E) ulikt merket (magenta F) og fulgte over tid som de løse skaden området (piler, G og H). De følgende pupal genotyper ble benyttet: (A-D) w1118; ubi-DE-cad-GFP, srp-Gal4 > UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) og (Eh) w1118; srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III). Bilder tilpasset med tillatelse fra Weavers et al., 201623. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Akutt betennelsesreaksjon til å ødelegge vev er en kompleks og svært dynamisk prosess som er avgjørende for å organisere reparasjon av skadet vev, inkludert avstanden nekrose rusk og kampen mot infeksjon. Du forstår og avdekke grunnleggende aspekter av dette svaret, er det avgjørende at studier utført i vivo på 3-dimensjonale living prøver for at nøyaktige virkemåten og interaksjoner av de ulike celle overleveringslinjer involvert følges nøyaktig over tid. Analyse i sanntid av denne cellen dynamikken kan nærmere karakteristikk av mutant fenotyper enn statisk enkelt tidspunkt fra fast prøver med klassiske immunohistochemistry teknikker. Tradisjonelt har har de fleste live-imaging studier med genetisk medgjørlig Drosophila modellen brukt embryonale utviklingstrinn fruitfly pga optisk gjennomskinnelighet og ubevegelighet forhold til senere utviklingsstadier4 , 5. men nylig vår gruppe og andre har utviklet Drosophila puppe som roman modell å utføre høy oppløsning og langsiktig imaging såret reparasjon og betennelse samtidig i vivo8,22 ,23. Denne nye tilnærmingen tilbyr en spennende langsiktige potensialet for unraveling grunnleggende aspekter av inflammatoriske cellen og videre kan tilpasses for å undersøke den dynamiske oppførselen til andre cellen linjene (for eksempel Drosophila adipocytter 38) etter vev skade.

Det er flere viktige faktorer i forberedelse og avbilding av sårede Drosophila pupae som bestemmer kvaliteten på bildebehandling resultater beskrevet ovenfor. Uten tvil er det vanskeligste trinnet beskrevet protokollen forsiktig disseksjon og nøyaktig posisjonering av pupae før såret og bildebehandling. Pupae på denne utviklingen scene er ekstremt skjøre og selv mindre skader til pupae i forberedelser fasen vil betydelig svekke eksperimentet. noen pupae som kanskje har vedvarende utilsiktet skade må slettes fra eksperimentet siden skade kunne aktivere sin egen inflammatorisk respons, som kan føre til mer utbredt (eller selv systemisk) effekter på inflammatorisk celle oppførsel andre steder i puppen. Pågående utbygging av pupae benyttet i disse eksperimentene (som er under betydelig vev rearrangements for å forberede vev voksen), noen ganger pupae flyttes i løpet av tenkelig. Pupal ruller er, imidlertid, oppstår vanligvis hvis pupae ikke har blitt montert riktig med flateste overflaten av vingen (eller andre vev avbildes) i direkte kontakt med coverglass; Bruk av heptane lim å stabilisere pupae på dekket glasset skal minimere denne uønskede bevegelsen. Derfor må stor forsiktighet også tas dislodging pupae fra sine nøye justert posisjoner når du flytter prøvene mellom mikroskop; ideelt sett knyttet såret laser til samme mikroskopet påfølgende tidsinnstilt bildebehandling og foto-konvertering.

I tillegg kan ferdighet av pupal disseksjon og montering trinn, vil nøyaktig genotype av de Drosophila pupae brukes ha en betydelig effekt på kvaliteten på bildebehandling data generert. For eksempel avgjør hvor mange eksemplarer av Gal4 fører og UAS konstruksjoner (f.eks UAS-GFP eller UAS-Kaede) i en enkelt pupal genotype signal-til-støy-forhold under påfølgende bildebehandling. Som regel flere eksemplarer av et Gal4 eller UAS konstruere stede, jo større den totale mengden fluorescerende protein (f.eks GFP eller Kaede) i vevet. Det optimale nivået på fluorescerende protein vil imidlertid være en forsiktig balanse mellom heve vev fluorescens tilstrekkelig å tillate høykvalitets tenkelig (bruk av lavere laser krefter, reduksjon i photobleaching og imaging over lengre tid perioder) men uten å forårsake fluorophore-indusert mobilnettet toksisitet; det optimale antallet Gal4 og UAS konstruksjoner i hvert eksperiment vil variere i henhold til bestemte drivere og fluorophores brukes. Forsiktighet bør utvises å heve pupae ved 25 ° C (eller høyere, opptil 29 ° C) fordi Gal4-UAS systemet er ømfintlig og vil være ineffektiv ved lavere temperaturer31. For å oppnå flere nivåer av kontroll over vev eller tid-spesifisitet av Gal4 -drevet uttrykk, kan Gal4-UAS systemet repressor Gal80 også være inkludert i pupal genotype39. Gal80 kan enten brukes til å undertrykke Gal4 aktivitet innenfor et bestemt vev (med en vev-spesifikk Gal80) eller på et bestemt tidspunkt (med en temperatur sensitive Gal80). Gal4-UAS systemet kan videre kombinert med andre uavhengige binære systemer (som Meglos -lexAop og QF -QUAS -systemer) for å generere Drosophila som har flere konstruksjoner (f.eks fluorophores, RNAi linjer eller andre genetisk konstruksjoner) uttrykt samtidig i en rekke forskjellige vev39.

Bruk av denne nye Drosophila pupal modellen tilbyr en rekke fordeler fremfor den mer tradisjonelle tilnærmingen for fosteret. Sammenlignet med den kortsiktige imaging (opptil 3 h) tilgjengelig i SS15 embryoer (scenen som mest embryonale såret studier er utført), pupae kan avbildes over betydelig lengre perioder (i prinsippet til voksen etter 96 h pupal utvikling ). Videre langt større antall hemocytes (Drosophila medfødte immunceller) er tilstede i pupal vev (og tilgjengelig for imaging) sammenlignet med mer begrenset antall stede i fosteret og dette har tillatt oss å samle betydelig mer bildebehandling data på hemocyte atferd med samme antall eksemplarer. Avgjørende, har det, i sin tur gitt oss bruke mer avanserte matematisk modellering for å analysere hemocytes atferd og ekstra romanen funksjoner i såret Oktenol og betennelsesreaksjon som ville ellers ha forblitt eksperimentelt utilgjengelig23. En annen fordel av pupal modellen er at RNAi-mediert genet knockdown er betydelig mer effektiv enn på tidligere embryonale stadier, gir bedre analyse av vev eller tid-spesifikke genet inaktivering bruker binære systemer som Gal4-UAS systemet 39. effektiviteten av RNAi på dette stadiet dermed åpner muligheten å utføre storskala (eller selv upartiske genomet-bred) RNAi skjermer for å søke etter nye spillere involvert i såret reparasjon eller inflammatorisk celle atferd.

Imidlertid Drosophila pupae klart kan ikke brukes til å studere av fenotyper som følge av genetiske mutasjoner som embryonale dødelige; funksjonelle og live-imaging studier av gener som er avgjørende for embryonale utvikling må derfor fortsatt utføres i embryoer, med mindre RNAi-mediert genet knockdown en eller vev-spesifikk måte tillater utvikling skal skje gjennom til pupal stadier. Fosteret også fortsatt av valg å studere og live-image visse funksjoner i immun celle atferd, inkludert utviklingsmessige utbredelse av immunceller fra deres opprinnelse, kontakt-hemming av bevegelse og fagocytose av apoptotisk lik generert under utviklingsmessige vev sculpting5,8 som ennå ikke vært observert i pupal modeller. Selv om studier i Drosophila larver og voksne har gitt en viktig innsikt mekanismene bak såret reparasjon og betennelse40,41,42,43, 44 live-imaging studier på disse stadiene har vist vanskelig på grunn av den iboende mobil innholdet i prøvene. Mens Larvene kan være anesthetized for å tillate korte perioder av live bildebehandling, på grunn av midlertidige natur av bedøvelsen, bare kort øyeblikksbilder av live såret reparere eller betennelsesreaksjon kan bli visualisert45. En fersk studie har nå utviklet en forbedret protokoll som tillater langsiktige avbilding av larver sårheling46, selv om forberedelse og tenkelig fortsatt er betydelig mer utfordrende enn i embryo eller pupae. På lang sikt ser vi at ved å benytte den mest passende utviklingsstadiet for å løse hver spesifikke spørsmål, studier i alle fire av disse forskjellige Drosophila stadier - fra embryo gjennom larver og pupal perioder til voksen (hver med sine egne unike fordeler og begrensninger) - vil gi supplerende kunnskaper om molekylære og mobilnettet mekanismen såret reparasjon og betennelse.

I fremtiden denne protokollen for såret og langsiktig bildebehandling av Drosophila pupae lett kan tilpasses å studere en rekke betennelse-lignende fenomener og har omfattende muligheter for avdekke romanen funksjoner av inflammatoriske såret respons. Kombinasjonen av langsiktig bildebehandling, sammen med bruk av photoconvertible fluorophores (for eksempel Kaede), er av stor verdi for å forstå dynamikken i medfødte immunsystemet celle atferd og spesielt langt mindre forstått oppløsning fasen av såret betennelsesreaksjon. Ved spesielt merking individ eller subpopulasjoner av immunceller (som de rekruttert til et sår) vil det være mulig å analysere hvordan eksponering for en miljømessig stikkordet (for eksempel lik eller skade) påvirker immun cellens påfølgende svar senere signalet. Inflammatorisk virkemåten til Drosophila hemocytes kan endres ved tidligere erfaringer - for eksempel de er primet for å svare på vev skade av tidligere fagocytose av apoptotisk lik under utvikling12 men det gjenstår å se om andre miljømessige stikkordene indusere lignende grunning hendelser. Selv om studier av pupal sår hittil har fokusert på medfødte betennelsesreaksjon, den pupal vinge modellen også gir en ideell mulighet til både live-image og analysere mekanismene bak epithelial såret reparasjon. Dessuten, denne pupal bildebehandling metode kan også tilpasses for å undersøke den dynamiske oppførselen av andre cellen overleveringslinjer svar på vev skade38, enten i den pupal vingen selv eller andre lett tilgjengelig pupal vev (som øyne, ben eller syn). Til slutt, ved å kombinere den genetiske tractability av Drosophila med enkel langsiktige pupal imaging, romanen epithelial reparasjon eller inflammatorisk regulatorer kunne avdekket gjennom anvendelse av upartiske genomet hele sammenleggbare tilnærminger.

Disclosures

Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke medlemmer av Martin, Nobes, Richardson og tre laboratorier for nyttig diskusjon. Vi takker også Wolfson Bioimaging anlegget (University of Bristol, UK), Bloomington lager sentrum (Universitetet i Indiana, USA) og Vienna Drosophila Kompetansesenteret ( Drosophila aksjer) og Flybase (for oppdatert Drosophila gene merknader). Dette arbeidet ble støttet av MRC prosjekt stipend pm og ww (MR/J002577/1), en Wellcome Trust Senior fellesskap til ww og en Wellcome Trust etterforsker Award PM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila stocks
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin
;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)		 Kyoto Stock Center, DGRC #109007 Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin
;;Ubi-p63E-shg.GFP (III)		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #58742 Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged Moesin
P{sGMCA}3.1		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #59023 The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T.
hemocyte specific serpent-Gal4 driver
;srp-Gal4;		 Generated by Katja Bruckner Generated by Katja Bruckner Expression of Scer\GAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP
w1118;;P{UAS-RedStinger}6		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #8545 or #8547 UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal
UAS-cytoplasmicGFP
;;P{UAS-GFP.S65T}		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) Multiple stocks available (e.g. #1522) Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness.
UAS-photoconvertibleKaede
w1118;; P{UAS-Kaede.A}3		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #26161 Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV.
GFP-tagged spaghetti squash
w1118;;P{sqh-GFP.RLC}		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #57145 The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:Avic\GFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter.
Name Company Catalog Number Comments
Ingredients for fly food media Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.)
maize Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
soya flour Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
malt extract Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
molasses Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
Difco agar BD Biosciences, Fisher Scientific DF0142-15-2 For preparation of fly food
Propionic acid Sigma 402907 For preparation of fly food
Nipagen Sigma 79721 For preparation of fly food
Dried baker's yeast Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD For preparation of fly food
Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation and mounting
Parafilm Sigma P7793-1EA For preparation of heptane glue
Fine sable paintbrush Daler-Rowney (or equivalent) #0 or 1
Forceps Fisher Scientific (or Fine Science Tools) NC9404145 Dumont #5
Glass bottomed dishes for imaging MatTek P35G-0-10-C We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment.
Heptane Sigma 51730-5ML For preparation of heptane glue
Double sided sticky tape (e.g. Scotch) Agar Scientific AGG263 For preparation of heptane glue
50ml tube (for heptane glue) Falcon tubes from Fisher Scientific 14-432-22 For preparation of heptane glue
Glass microscope slides Agar Scientific AGL4244 For dissection of Drosophila pupae
Dissecting stereo microscope with brightfield Leica (or equivalent) M50 For dissection of Drosophila pupae
Microscissors John Weiss International 103123 Miniature Research Scissors (straight)
Name Company Catalog Number Comments
Laser ablation and imaging
Nitogen ablation laser Spectra-Physics (or Andor equivalent) Model VSL-337ND-S For wounding, this should be attached to a widefield imaging system
Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) Leica (or equivalent) TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal)
Environmental chamber Life Imaging Services (or equivalent) "Microscope Temperature Control System" Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging
Name Company Catalog Number Comments
Image Analysis Software
FRAP software module Leica (or equivalent) CLSM FRAP software module For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede
ImageJ (image analysis software) National Institutes of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/ Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012.
ImageJ plugin "Manual Tracking" National Institutes of Health (NIH) https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJ plugin "TrackMate" ImageJ, NIH https://imagej.net/TrackMate Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (high performance 3D imaging software) Perkin Elmer Volocity 6.3 For image analysis
IMARIS (image analysis software) Bitplane IMARIS for Cell Biologists For image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration. Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).
  2. Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
  3. Martin, P., Nunan, R. Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing. British Journal of Dermatology. 173 (2), 370-378 (2015).
  4. Razzell, W., Wood, W., Martin, P. Swatting flies: modelling wound healing and inflammation in Drosophila. Disease Model and Mechanism. 4 (5), 569-574 (2011).
  5. Wood, W., Martin, P. Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly. Development Cell. 40 (3), 221-233 (2017).
  6. Mohr, S. E., Smith, J. A., Shamu, C. E., Neumüller, R. A., Perrimon, N. RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 591-600 (2014).
  7. Muñoz-Soriano, V., López-Domenech, S., Paricio, N. Why mammalian wound-healing researchers may wish to turn to Drosophila as a model. Experimental Dermatology. 23 (8), 538-542 (2014).
  8. Weavers, H., Wood, W. Creating a Buzz about Macrophages: The Fly as an In Vivo Model for Studying Immune Cell Behavior. Developmental Cell. 38 (2), 129-132 (2016).
  9. Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. Journal of Cell Biology. 168 (4), 567-573 (2005).
  10. Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biolog. 173 (3), 405-416 (2006).
  11. Razzell, W., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Calcium flashes orchestrate the wound inflammatory response through DUOX activation and hydrogen peroxide release. Current Biology. 23 (5), 424-429 (2013).
  12. Weavers, H., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Corpse Engulfment Generates a Molecular Memory that Primes the Macrophage Inflammatory Response. Cell. , (2016).
  13. Stramer, B., Winfield, M., Shaw, T., Millard, T. H., Woolner, S., Martin, P. Gene induction following wounding of wild-type versus macrophage-deficient Drosophila embryos. EMBO Reports. 9 (5), 465-471 (2008).
  14. Matsubayashi, Y., Coulson-Gilmer, C., Millard, T. H. Endocytosis-dependent coordination of multiple actin regulators is required for wound healing. Journal of Cell Bioliogy. 210 (3), 419-433 (2015).
  15. Evans, I. R., Rodrigues, F. S. L. M., Armitage, E. L., Wood, W. Draper/CED-1 Mediates an Ancient Damage Response to Control Inflammatory Blood Cell Migration In Vivo. Current Biology. 25 (12), 1606-1612 (2015).
  16. Zanet, J., Stramer, B., Millard, T., Martin, P., Payre, F., Plaza, S. Fascin is required for blood cell migration during Drosophila embryogenesis. Development. 136 (15), 2557-2565 (2009).
  17. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  18. Ninov, N., Martín-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nature Protocols. 2 (12), 3074-3080 (2007).
  19. Gho, M., Bellaïche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126 (16), 3573-3584 (1999).
  20. Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
  21. Berh, D., Scherzinger, A., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C., Risse, B. Automatic non-invasive heartbeat quantification of Drosophila pupae. Computers in Biology and Medicine. 93, 189-199 (2018).
  22. Sander, M., Squarr, A. J., Risse, B., Jiang, X., Bogdan, S. Drosophila pupal macrophages--a versatile tool for combined ex vivo and in vivo imaging of actin dynamics at high resolution. European Journal of Cell Biology. 92 (10-11), 349-354 (2013).
  23. Weavers, H., Liepe, J., Sim, A., Wood, W., Martin, P., Stumpf, M. P. H. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26 (15), 1975-1989 (2016).
  24. Fristrom, D., Wilcox, M., Fristrom, J. The distribution of PS integrins, laminin A and F-actin during key stages in Drosophila wing development. Development. 117 (2), (1993).
  25. Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Development Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
  26. Berg, H. Random Walks in Biology. , Princeton University Press. Available from: http://press.princeton.edu/titles/112.html (1993).
  27. Diehl, H., Ihlefield, H., Schwegler, H. Physik fur Biologen. , Springer-Verlag. (1991).
  28. Stewart, P. S., McFeters, G. A., Huang, C. T. Biofilm control by antimicrobial agents. Biofilms II Process Analysis and Application. , 373-405 (2000).
  29. Milo, R., Phillips, R. Cell Biology by the Numbers. , Garland Science. Available from: https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1 (2015).
  30. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceeding of National Academy of Science U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  31. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Cordelières, F. Manual tracking. National Institutes of Health. , Available from: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2015).
  34. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  35. Grueber, W., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  36. Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biology. 173 (3), 405-416 (2006).
  37. Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
  38. Franz, A., Wood, W., Martin, P. Fat Body Cells Are Motile and Actively Migrate to Wounds to Drive Repair and Prevent Infection. Developmetal Cell. 44 (4), 460-470 (2018).
  39. del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2012).
  40. Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and Cell Fusion Contribute to Wound Healing in the Adult Drosophila Epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
  41. Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science U S A. 105 (29), 10017-10022 (2008).
  42. Galko, M. J., et al. Cellular and Genetic Analysis of Wound Healing in Drosophila Larvae. PLoS Biology. 2 (8), e239 (2004).
  43. Brock, A. R., et al. Transcriptional regulation of Profilin during wound closure in Drosophila larvae. Journal of Cell Science. 125 (23), (2013).
  44. Wu, Y., Brock, A. R., Wang, Y., Fujitani, K., Ueda, R., Galko, M. J. A blood-borne PDGF/VEGF-like ligand initiates wound-induced epidermal cell migration in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (17), 1473-1477 (2009).
  45. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila Larvae to Study Epidermal Wound Closure and Inflammation. Methods in Molecular Biology. 1037, 449-461 (2013).
  46. Kakanj, P., et al. Insulin and TOR signal in parallel through FOXO and S6K to promote epithelial wound healing. Nature Communications. 7, 12972 (2016).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 136 sår helbredelse betennelse medfødt immunitet Drosophila melanogaster Drosophila puppe hemocyte celle migrasjon live bildebehandling laser ablasjon AC confocal mikroskopi photoconversion
Langsiktig <em>i Vivo</em> sporing av inflammatoriske celle dynamikken i <em>Drosophila</em> Pupae
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weavers, H., Franz, A., Wood, W.,… More

Weavers, H., Franz, A., Wood, W., Martin, P. Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae. J. Vis. Exp. (136), e57871, doi:10.3791/57871 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter