Summary
Här presenterar vi ett protokoll för live-imaging såret reparation och den associera inflammatoriska reaktionen på plats och tid högupplösta i vivo. Denna metod använder Drosophila Pupp utvecklingsstadiet att möjliggöra långsiktiga imaging och spårning av viss cellpopulationer över tid och är kompatibel med effektiv RNAi-medierad genen inaktivering.
Abstract
Under den snabba inflammatoriska reaktionen till vävnadsskada rekryteras snabbt celler av det medfödda immunsystemet att skadan webbplats. En gång på såret, innate immuna celler utför ett antal viktiga funktioner, som bekämpar infektion, clearing nekrotisk skräp och stimulera matrix nedfall. För att fullständigt förstå de olika signalering händelser som reglerar detta immunsvar, är det viktigt att iaktta de komplexa beteenden av (och samspel som sker mellan) flera cell härstamningar in vivo och i realtid, med höga plats och tid-temporal upplösning. Den optiska translucens och den genetiska tractability Drosophila embryon har etablerat Drosophila som en ovärderlig modell till live-bild och dissekera grundläggande aspekter av inflammatoriska celler beteende, inklusive mekanismer för utvecklingsmässiga spridning, clearance av apoptotiska kroppar eller mikrobiella patogener och rekrytering till sår. Senaste arbete har dock nu visat att anställa mycket senare i Drosophila livscykel – Drosophila puppa – erbjuder ett antal distinkta fördelar, inklusive förbättrad RNAi effektivitet, längre imaging perioder, och betydligt större immunceller nummer. Här beskriver vi ett protokoll för imaging såret reparation och den associera inflammatoriska reaktionen på det plats och tid högupplöst i levande Drosophila puppor. För att följa dynamiken i både återepitelisation och inflammation, använder vi ett antal specifika i vivo fluorescerande markörer för både epitel och innate immuna celler. Vi har även demonstrera effektiviteten av foto-Cabriolet fluorophores, såsom Kaede, för följande specifika immunceller delmängder, för att spåra deras beteende när de migrerar till, och lösa från, skadan webbplats.
Introduction
En ändamålsenlig och effektiv inflammatorisk reaktion är avgörande för en organism att bekämpa infektioner, rensa skräp och dirigera reparation av skadade vävnader1. Även om detta svar är ett oundvikligt resultat av de flesta vävnadsskada, kräver inflammation strikt reglering eftersom en olämplig inflammatorisk reaktion har kopplats till en mängd olika mänskliga sjukdomar (inklusive kronisk icke-läkande sår, Överdriven ärrbildning och anlag för cancer)1,2,3. Tanke på detta kliniska relevans är det avgörande för att få en mer detaljerad förståelse av de molekylära och cellulära mekanismer som driver den inflammatoriska responsen för att utveckla nya prognostiska indikatorer och strategier för att behandla en rad kroniska inflammatoriska förhållanden, som skulle skydda reparera vävnader från långvarig och onödig inflammation.
Under de senaste åren har Drosophila blivit väletablerade och värdefulla modellsystem att dissekera de grundläggande funktionerna i den inflammatoriska reaktionen bevarad från insekter till mänskliga4,5. För närvarande erbjuder Drosophila långt större genetiska tractability än för närvarande är möjliga i andra experimentella modeller (t.ex. möss eller Sebrafisken) tillåter exakt plats och tid genmanipulation i vivo (att inaktivera eller över uttrycka någon gen av intresse inom specifika celltyper vid en definierad utvecklande tid-punkt) och användarvänlighet genome-wide skärmar6,7. Traditionellt har har de flesta live-imaging studier av läkning av sår och inflammation i Drosophila utförts på embryonala stadier, som embryon är orörliga (till skillnad från Drosophila larver eller vuxna) och optiskt genomskinlig vilket gör att oöverträffad hög upplösning i vivo imaging8. Detta har gjort det möjligt för forskare att visualisera snabb och robust rekrytering av Drosophila innate immuna celler (hemocytes) till sårområdet svar till den mekaniska eller laser-inducerad skadan till embryonala epitel9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. genom att kombinera dessa live-imaging studier med genmanipulation, studier i Drosophila embryon har upptäckt många viktiga immunceller proteiner som styr inflammatoriska celler beteende i vivo. Till exempel den CED-1 homolog Draper (en ITAM domän-innehållande protein) har identifierats som en viktig 'skada receptor' som medierar rekrytering Drosophila immuncellerna i en H2O2-koncentrationsberoende sätt till platser i skada15. Draper nivåer inom immunceller regleras i sin tur av kalcium-inducerad JNK signalering och förhöjda nedströms apoptotiska liket upptag12. Hemocyte motilitet ytterligare kräver komplexa cytoskeletal förändringar att samordna riktad migration mot såret och detta är beroende av aktiviteten hos cytoskeletal tillsynsmyndigheter såsom den aktin-bunta protein staden16 och familjen Rho små GTPases Rac och Rho9.
Drosophila är en holometabola insekter som går genom ytterligare larver och Pupp stadier efter embryogenes, innan att nå vuxen ålder17. Drosophila puppa har utvecklats som en ytterligare modell för icke-invasiv live-avbildning av en mängd olika dynamiska cellulära händelser, inklusive developmental cell migration18, celldelning19, cell tillväxt20och muskel kontraktion21. Mer nyligen, det har etablerat sig som en ny modell att studera dynamiken i såret reparation och inflammation i vivo22,23.
Precis som i embryonala stadier är Drosophila puppor orörlig och optiskt genomskinligt, efter noggrann dissektion från deras ogenomskinlig Pupp fall18. Genom att utnyttja detta optisk transparens, kan man följa beteendet i vivo med innate immuna celler (hemocytes) som svar på vävnadsskadan inom Drosophila Pupp vävnader, såsom Pupp wing22. Pupp vingen finns som en enkel dubbel struktur, som består av två stora platt epitelial ark som är anslutna runt flygeln periferin; extracellulära mellan dessa två epitelial skikt är fylld med hemolymph (insekt blod) och ett stort antal rörliga hemocytes24. Precis som embryon utlöser mekanisk eller laser-inducerad skada wing epitelet en snabb rekrytering av hemocytes till skada plats23. Nuläget Pupp erbjuder dock vissa distinkta fördelar för avbildning över tidigare embryonala stadier. Skadade puppor kan avbildas under mycket längre tidsperioder (för minst 5 h), mer vävnad området är tillgängligt för den experimentella störning (till exempel generationen av flera sår) och det finns betydligt större antal hemocytes närvarande vid detta skede ( att ge mer cell banor från längre avstånd för förbättrade statistiska styrkan under den matematiska analysen). Dessutom är RNAi-medierad genen inaktivering effektivitet avsevärt förbättras Pupp stegvis, så att många gener att vara 'bankat-ned' i en vävnad eller det tid-specifika sätt jämfört med den mer traditionella hela mutant metoden av embryon.
För att följa dynamiken i såret återepitelisation och den medföljande inflammatoriska svaren inom denna nya Pupp modell, två olika cellpopulationer måste märkas: Pupp epitelet och medfödda immuncellerna (Drosophila hemocytes). Det finns ett antal olika markörer (Tabell för material) att märka dessa två olika cellpopulationer - valet av markör beror på en given process studeras. För att markera den Pupp epitel, Drosophila rader som innehåller antingen utnyttjas en ubiquitously uttryckt GFP-märkta E-cadherin (som etiketter adherens föreningspunkter) rutinmässigt för att indikera ståndpunkter cellmarginalerna eller alternativt en GFP-märkta Aktin-bindande domänen för Moesin (som etiketter aktin cytoskelettet) att visualisera såret-kant kontraktila aktin ring och ledande utskjutande delar. Att märka de Drosophila hemocytes, en hemocyte-specifika srp-Gal425 till drive uttryck av nukleära RFP (för nukleära tracking), cytoplasmiska GFP eller GFP-märkta Moesin (för att märka cytoplasman eller aktin cytoskelettet, respektive) eller en photoconvertible fluorophore (såsom Kaede) används. I själva verket är det ofta fördelaktigt att använda flera immunceller markörer i kombination, för att aktivera samtidig analys av den kärntekniska rörelsen och cellmorfologi (se representativa resultat). Men eftersom detta protokoll innebär användning av Drosophila puppor, bara kombinationer av genetiska markörer som är livskraftig tills mitten av-Pupp stadier kan utnyttjas. Embryonala dödliga bestånd blir också inte lämplig. Detta är osannolikt att vara ett problem när imaging kontroll (eller vildtyp) puppor men är viktigt att beakta när gener rivas eller i ökad utsträckning, för att bedöma deras effekt på sårslutning eller inflammation. När det gäller tidig dödlighet orsakad av genen knockdown (eller överuttryck), en Gal80ts konstruktion kan användas för att framkalla de Gal4-driven knockdown senare i utvecklingen (se diskussion).
I vår nyligen genomförda studier, har flyttar till Pupp scenen möjliggjort att vi samla tillräckliga immunceller bana data för att analysera inflammatoriska beteende med hjälp av sofistikerad matematisk modellering, vilket i sin tur har gjort det möjligt för oss att härleda nya detaljer av såret inflammatoriska lockmedel signaler23. Till exempel visade denna metod att de sår korrektiv sprider sig långsamt genom den inflammera vävnaden på 200 μm2/min, en takt som är betydligt långsammare än tidigare föreslagit små kandidat molekyler såsom ATP eller H2O2 rapporteras till diffus26,27,28,29; dessa små ”skada” molekyler riskerar istället att fungera som tillåtande signaler. Dessutom genom att följa den långsiktiga beteenden av innate immuna celler som de lösa från ett inledande sår och utsätts för en sekund (gjorda vid olika tidpunkter efter först), har vi funnit en tillfällig 'desensibilisering' period under vilken immunceller är blinda för efterföljande skador23. Genom att utnyttja den långsiktiga imaging potentialen i Pupp-modellen, tillsammans med Drosophilas genetiska tractability, kan man följa beteendet hos vissa immunceller populationer (t.ex. endast de immuna celler rekryteras till sårområdet) i svar till efterföljande förolämpningar, använder de photoconvertible fluorophore30 som kan uttryckas enbart inom de immunceller härstamning23.
Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera dynamiken i såret reparation och den associera inflammatoriska reaktionen på plats och tid högupplösta använder levande Drosophila puppor. Vi tillhandahåller en detaljerad metod för att täcka de steg som krävs för inledande puppor beredning (dissektion och montering) och den efterföljande laser-medierad såra och time-lapse bildtagning. Vi beskriver också användning av foto-Cabriolet fluorophores att tillåta märkning av specifika immunceller delmängder i vivo. På lång sikt föreställer vi att denna nya Drosophila Pupp modell öppnar spännande möjligheter för dissekera komplexa signalering dynamiken bakom den inflammatoriska responsen till vävnadsskada. Genom att tillämpa mer sofistikerade statistiska analyser kan man avslöja funktioner svaret som annars skulle förbli experimentellt oåtkomliga, medan förbättrad RNAi effektiviteten kunde lämpar sig för tillämpningen av genome-wide screening inom immunceller i vivo att identifiera nya spelare reglera immunceller beteende.
Protocol
Detta protokoll består av fyra sekventiella steg: (1) förberedelse av Drosophila bestånd och iscensättning av Drosophila puppor, (2) Pupp dissektion och montering, (3) Pupp såra, (4) i vivo time-lapse confocal bildtagning.
1. beredning av Drosophila bestånd och iscensättning av puppor
- Skaffa lämpliga Drosophila bestånd (se inledning och Tabell för material).
- Samla unga friska vuxna flugor av lämpliga genotyp.
- Välj vuxen flyger genom att använda koldioxid gas pads att kort söva flugor och en fin pensel att överföra flyger av lämpliga genotyp eller kön till en samling injektionsflaska.
- Lägga till 20 och 20 jungfruliga hondjur i varje injektionsflaska innehållande standard flyga mat media (en majsmjöl-melass-agar blandning, se Tabell för material) kompletteras med jäst.
- För optimal Pupp generation, spets vuxna flugor varje dag på nya livsmedel i färska flaskor, att hålla alla flaskor vid 25 ° C.
Obs: Om den Gal4-UAS system31 används att köra härstamning-specifika genuttryck, alla åtgärder ska utföras vid 25 ° C eller högre, eftersom systemets Gal4-UAS är temperaturkänsliga. - 18 h innan den schemalagda bildsession, välj minst 10 nybildade vit före puppor (figur 1A) från injektionsflaskorna (dvs. 0 h efter puparium bildandet, APF) med pincett eller en fin pensel rubba puppor från interiör injektionsflaska ytan och överför puppor försiktigt vid sidan av en ren tom plast injektionsflaska.
Obs: Vandrande 3rd instar larver krypa uppåt ur mat mediet att genomgå förpuppningen; nybildade vit prepupae identifieras enkelt eftersom de besitter vrängs främre trakeer och stationära (till skillnad från 3rd instar larver). Nagelbanden förvandlas till den 'puparium' (Pupp fallet) som är från början mjuk och vit17. Vara måste försiktig att inte skada puppor, eftersom detta kan leda inte bara till en oönskad nervskade-inducerad inflammatorisk reaktion, utan också till en betydande försening. - Ålder de valda puppor till lämpliga utvecklingsstadiet (18 h APF ger optimala resultat) i injektionsflaskan vid 25 ° C.
Obs: När puppor utvecklas, blir Pupp fallet gradvis mörkare och mer sprött. - Förbereda andra reagenser för nästa steg före tid. För att göra den heptan limma, kombinera en 20 cm längd av upprullade dubbelhäftande tejp med 20 mL heptan i ett 50 mL centrifugrör, försegla med paraffin filmen och rock på rumstemperaturen över natten på bänken.
2. upprättande och dissektion av Drosophila puppor
- Överföra de iscensatta Drosophila puppor till en bit dubbelhäftande tejp på en glasskiva. Placera puppor så att den ventral sidan sitter ordentligt fast på band och ryggsidan är vänd uppåt (figur 1B).
Obs: Den främre av puppan blir identifierbar från de två trakeer som sticker ut från den främre änden av Pupp fallet. - Ta försiktigt bort puppor från deras skyddande puparium höljet i brightfield dissektion Mikroskop med pincett och mikro-sax (figur 1B-D).
- Inledningsvis gör ett snitt i regionen främre-mest i den puparium använder tången (figur 1B). Säkerställa att Pupp fallet i detta område är ihåliga och saknar Pupp vävnad eftersom puppor kommer har krympt i fallet under tidig Pupp utveckling.
- Efter detta inledande snitt, noggrant Riva eller klippa Pupp fallet öppen i en främre till bakre riktning med hjälp av pincett eller microscissors (figur 1 c) tills puppan är helt fria från brun ogenomskinlig sprött höljet (figur 1 d).
Obs: Puppor i detta skede är mycket bräcklig och försiktighet måste iakttas för att undvika punktering Pupp ytan; Det är uppenbart att punktera som hemolymph snabbt läcker ut från injektionsstället. Puppor med punkteringar, men små, ska kasseras.
- Montera puppor i en glasbotten maträtt med heptan lim.
- Använda en 20 mL pipettspetsen för att placera en 10 mL droppe färdiga heptan lim (se avsnitt 1.6 ovan) i en rad på glasbotten skålen.
- Låt limmet torka i 5 s innan du överför de dissekerade puppor försiktigt upp på heptan limmet med pincett (figur 1E).
- För att underlätta såra och imaging, radas puppor upp i rad; ca 5 puppor föreslås men mer blir hanterbara med erfarenhet.
Obs: Användning av heptan lim rekommenderas när du använder upprätt bildsystem men är inte nödvändigt när du använder en inverterad system. Om limmet skapar optiska avvikelser under imaging, puppor kan placeras direkt på täckglas istället – naturliga vidhäftningen mellan Pupp vävnad och glas blir tillräcklig i de flesta fall för stabil imaging, så länge man är försiktig när du flyttar imaging maträtt mellan Mikroskop.
- För bästa resultat, montera puppor så att vingen är platt på täckglas med majoriteten av wing ytan i direkt kontakt med täckglas (figur 1F). Rulla de puppor med pincett för att ändra sin position för att säkerställa att vingen är monterad korrekt.
- För att förhindra prov uttorkning under perioden imaging, Lägg en bit av absorberande filter papper indränkt i destillerat vatten vid sidan av glasbotten skålen i slutet av montering, vara noga med att inte störa puppor (figur 1E). Täck skålen med lock.
Obs: Puppor är nu redo för såra och imaging.
3. laser-inducerad såra Drosophila Pupp vingar
- Överföra glasbotten skålen som innehåller de monterade puppor till wide-fält Mikroskop utrustat med ett avstämbara lasersystem för ablation.
- Använd en pulsad-UV luftkylda kväve-pumpade ablation laser trimmad till 435 nm – se Tabell av material för detaljer11; exakta våglängden av det ljus som används för belysning väljs av användaren via ett lämpligt färgämne cell.
- Använda brightfield optik, justera kontrollerna Mikroskop scenen att lokalisera Pupp vingen av första puppan vara skadade (figur 1F).
- För optimalt resultat, Använd en olja nedsänkning 40 X eller 63 X objektiv för båda bildtagning och laser ablation; säkerställa att nedsänkning vätskan används (olja eller glycerol) är konsekvent mellan ablation och bildsystem. Justera mikroskopet att fokusera på planet av Pupp wing epitel närmaste täckglas (dvs fokus på regionen av epitel att vara sårad) med ratten på fina fokus.
- Använda Mikroskop scenen justeringarna, placera Pupp vingen så att området att vara sårad direkt i linje med kända målområdet av laser ablation.
- Använda en energitäthet dämparen bild monterad på mikroskopet för att manuellt justera effektnivån ljusets ablation.
Obs: Skjutreglaget dämparen har klicka stannar och domar att identifiera den relativa nivån av dämpning och tillåta användning av reproducerbara inställningar. - Använda en extern manuell avtryckare kontroll, aktivera ablation lasern med ett enda kort klick på avtryckaren för att göra ett sår. Kontrollera utseendet på övergående luftbubblan på webbplatsen ablation sedan såra kommer normalt åtföljas det. Kontrollera om den laserinducerad såra har varit framgångsrik med lämpliga fluorescerande filter för att visualisera Pupp epitel.
Obs: var noga med för att undvika oavsiktlig exponering för laserstrålar som beam reflektioner kan orsaka svår öga eller hudskador. - Om sårande misslyckas varierar fokalplanet (flytta Mikroskop fokus något ovanför eller nedanför den aktuella fokala nivån) och upprepa det enda klicket ablation avtryckaren. Alternativt kan du gradvis öka laser strömmen med dämparen bilden tills önskad såret storleken uppnås.
- Om du vill variera den ablation laser pulsen upprepning, Använd Repetition rate ratten på bakre Kontrollpanelen (som ändrar från mindre än 1 puls/s upp till 60 Hz). För optimal sårbildning, ange upprepning pulsen till 40 Hz.
- För att generera olika stora sår, Använd energitäthet dämparen bilden manuellt justera effektnivån ljusets ablation.
- Avstå från att såra alla de monterade puppor och använda dessa icke-uppföljningsstudien puppor som oskadad kontroller.
- För konsekvent resultat, regelbundet justera systemets ablation (med relevanta bruksanvisningen). Dessutom rengör och refill dye resonator cellen som styr laser output våglängden.
4. in Vivo Time-lapse Confocal Imaging
- Snabbt överföra glasbotten skålen till ett lämpligt Mikroskop för time-lapse avbildning.
Obs: För optimalt resultat, Använd en hög specifikation confocal eller snurrande skiva Mikroskop utrustat med känsliga detektorer som kan upptäcka både god Jordbrukarsed och mCherry fluorophores. - För att bild hela Pupp vingen, Använd en låg förstoring (t.ex. 20 X) objektiv (figur 2A). Bild sår reparation och den medföljande inflammatorisk reaktionen med hög rumslig upplösning, använda avsnittet Oljeimmer 40 X (NA 1.3) eller 63 X (NA 1,4) objektiv (se representativa bilder i figur 2B-D).
- Öppna den lämplig bild ta till fånga mjukvaran är associerad med mikroskopet.
- Använda programvaran image capture, slå på den lämpliga lasrar e.g. 488 nm och 561 nm lasrar att visualisera GFP och mCherry fluorophores, respektive (genom att klicka i de relevanta rutorna) och justera laser makt och vinning/offset inställningar att ge tillräcklig fluorescerande signal samtidigt undvika pixel mättnad; Använd den lägsta möjliga lasereffekten (i området 5-20%) att minimera fotoblekning och fototoxicitet.
- Att fånga båda reparation epitel och inflammatoriska celler rekryteras, Ställ mikroskopet att spela in en z-stack med fina fokus justeringsreglagen på Kontrollpanelen. för optimalt resultat, ställa in program (med manuell knapp-klick) att spela in z-skivor genom Pupp vingen (minst varje 3 mm), från toppen av sårade epitelet genom att extracellulära under (innehållande migrerar hemocytes) för att uppnå en stor z-stack (i intervallet 50-100 mm).
- För time-lapse imaging, spela in z-stackar vid regelbundna tidsintervall (minsta varje 30 s) för minst 1 h efter såra.
Notera: Den exakta tidsintervallen mellan z-stackar valt representerar en avvägning mellan att fånga den snabbt föränderliga cell dynamiken och undvika foto-blekning av proverna. - För att samtidigt bild flera puppor (inklusive icke-uppföljningsstudien oskadad kontroller), Använd en motoriserad scenen (bifogas mikroskopet) och funktionen multi-position förvärv inom avbildningsprogrammet. Manuellt ställa in positionen för varje enskild pupa inom programvaran med de scenen position rattarna och sedan manuellt ange lämpliga z-stack begränsningar (topp och botten) för varje enskild puppa.
- Visualisera time-lapse bilderna under Bildinsamling eller senare med specialist bild analys programvara (såsom ImageJ32) med z-stack projektioner eller 3D-rendering. Till exempel för att följa enskilda hemocytes rörelser (som i figur 2 c' och D'), spår hemocyte kärnor med hjälp av öppna ImageJ plug-ins ”TrackMate” eller ”Manuell spårning” (metoder som publiceras i 33, ( 34).
- Använd photoconvertible sonder (såsom Kaede30) till selektivt photoconvert och etikett en delmängd av epitelial eller immuna celler under imaging.
- Öppna lämpliga moduler inom avbildningsprogrammet att utföra photoconversion (såsom FRAP, fluorescens återhämtning efter foto-blekning modul) och aktivera 405nm laser (genom att klicka i rutan relevant programvara)35.
- Markera celler vara photoconverted inom FRAP programvaran med fyrkantig, Rund eller freehand markeringsverktyget. Inom programvaran FRAP, ange tid-kursen för photoconversion (blekning) till en enda iteration/ram och ange 405 nm laser vid 20% lasereffekt. Manuellt klicka Starta experimentet för att utföra photoconversion.
- Avsluta modulen FRAP (klicka på Stäng) och återgå till den ursprungliga imaging skärmen inom programvaran; användning av 488 nm och 561 nm lasrar till bild beteendet hos photoconverted och icke-photoconverted celler genom att inrätta en z-stack och time-lapse recording som ovan.
Obs: Photoconverted sonder förblir stabila i många timmar efter den initiala photoconversion, möjliggör uppförandet av photoconverted cellerna att följas över tiden (för minst 5 h). Exempelvis inflammatoriska celler i såret kan vara selektivt photoconverted (figur 2F) och deras beteende följde som de lösa från skadan webbplats (figur 2 g och H).
Representative Results
Det här protokollet beskriver utarbetandet av Drosophila puppor för levande time-lapse avbildning av såret reparation och inflammation i vivo. Med den här metoden bör det vara möjligt att generera flera högupplösta filmer Pupp sårslutning och inflammatoriska celler rekryteras med lätthet och bild de puppor för långa tidsperioder (minst 5 h) efter såra utan betydande fotoblekning.
Ett allmänt system för Drosophila pupa förberedelse
Figur 1 illustrerar den optimala metoden för att förbereda Drosophila puppor i vivo imaging. Drosophila vita 'prepupae' samlas på '0 h' efter puparium bildandet (APF), som krypa larverna upphöra motilitet och anta den stereotypa Pupp formen med vrängs andning bihang (externa) synliga deras främre-mest slutet ( Figur 1A). Den vita 0 h APF prepupae tillåts att utveckla för 18 h vid 25 ° C, då puparium har blivit brun (figur 1B) och är sedan dissekerade använder fin pincett eller microscissors (figur 1 c, ta bort det skyddande Pupp fallet) att avslöja den optiskt genomskinlig puppa inom (figur 1 d). Efter dissektion syns Pupp vingarna på laterala sidorna av Pupp bröstkorgen (markerad i blått, figur 1 c-D). I detta skede är andra Pupp kroppsdelar också lätt urskiljbara, inklusive ögon, ben och mage (märkt i figur 1 d). Benen är också lämpliga för såret inflammation studier och kan vara sårad med samma laser metod beskrivs ovan. Flera 18 h APF puppor kan monteras samtidigt inom imaging skålen (figur 1E, med heptan lim och en vatten-indränkt filterpapper för att minimera uttorkning) med planaste delen av vingen (konturerad blå) i kontakt med täckglaset ( Figur 1F); Detta är särskilt fördelaktiga om mikroskopet imaging är utrustad med en motoriserad steg att tillåta flera puppor registreras under en enda tänkbar period. Alla puppor som har blivit skadade under montering eller dissektion kasseras (t.ex. puppan ligger tredje i sekvensen, pilen i figur 1E). Andra delar av kroppen (t.ex. ögon och ben, konturerade rosa) kan också kontakta täckglaset och är tillgängliga för sårande och efterföljande imaging (figur 1F). För experiment studera enstaka sår, är laserinducerad skador generellt bäst tillfogade centralt i flygeln (asterisk, figur 1F), även andra platser kan användas om flera sår ska studeras.
Sterila såra aktiverar en robust inflammatorisk reaktion i Drosophila Pupp flygeln
För att följa såret reparation och den medföljande inflammatoriskt svar in vivo 18 h APF Drosophila puppor sårade vingar var avbildade med time-lapse konfokalmikroskopi (figur 2A-H). I nuläget Pupp är de wing epitel enkel platt ark av celler (märkt här med GFP-märkta E-cadherin för att markera enskilda cellgränserna, wing marginal beskrivs i figur 2A). Även i oskadad vingar (låg förstoring, siffror 2A och 2A'), stort antal flyttande innate immuna celler (hemocytes, märkt med srp-Gal4 driven cytoplasmiska GFP, gröna, och kärn RFP, magenta) finns inom den hemolymph ( insekt blod) upptar den mellanliggande extracellulära (figur 2A och 2A'). Laser-inducerad skada Pupp wing epitel (såret marginal beskrivs i vitt, figur 2B-D) stimulerar en snabb migrering av hemocytes till sårområdet (figur 2B-D och immun cellkärnor i figur 2B '-D'). Märkning av hemocytes med både en nukleär markör (t.ex. den nukleära RFP 'red-stinger') i kombination med en cytoplasmiska eller cytoskeletal markör (e.g. cytoplasmiska GFP eller GFP-märkta Moesin) är särskilt fördelaktig eftersom det tillåter den samtidiga spårning av hemocyte kärnor (för automatiserad analys av hemocyte beteende t.ex. migration hastighet och riktningen) och visualisering av hemocyte morfologi. Det sistnämnda är viktigt eftersom det tillåter oss att avgöra om hemocytes phagocytosing nekrotisk skräp (figur 2 c, infälld) på såret kanten (eller mikrober när det gäller infektion)12,23 och också låter oss följa deras protrusive beteende som de sträcker sig fina filopodia eller lamellipodia i sin framkant när de vandrar mot eller bort från såret.
Enkel uppföljning av hemocyte nukleära banor med hjälp av lämpliga bildanalys programvara32 (Tabell för material) visar komplexa plats och tid dynamiken i den inflammatoriska reaktionen, liknande den som tidigare rapporterats för sårade embryon9,36 (flerfärgad spår, figur 2 c' och D'). Inom bara 30 min av såra, börja hemocytes ligger närmast skadan webbplats riktad migration mot såret (figur 2 c'). Dock med ökande tid efter skada, hemocytes ligger successivt ytterligare från skadan webbplats börjar också riktad migration mot såret (figur 2D'). På detta sätt observeras en 'våg' av immunceller lyhördhet som sprider sig utåt från såret kant, som vi ser framför oss för att reflektera diffusionen av den såret korrektiv från skadan webbplats. Plats och tid immunceller dynamiken som tillhandahålls en användbar utgångspunkt för vår senaste studie som anställd sofistikerad matematisk modellering ('Bayesiansk inferens') analys att härleda nya egenskaper i såret lockmedel signal (detaljerade metoder (Publicerad i23). Genom att kalibrera våra beräkningsmodeller (som länkade såret lockmedel övertoningen till hemocyte bias) för att passa de observerade i vivo immun banor, kunde en extraktet detaljerade egenskaper hos det såret lockmedel från vår hemocyte bana data (till exempel andelen signal diffusion, källan och varaktigheten av signal produktion)23.
Dessutom av körning uttrycket av photoconvertible fluorophore Kaede av immunceller härstamning med srp-Gal4 (grön, figur 2E) vi har också kunnat selektivt etikett en subpopulation av dessa flyttande wing hemocytes (som t.ex. de rekryteras till sårområdet; E, innan UV-inducerad photoconversion och F, post-photoconversion). Vi kan sedan följa beteendet hos dessa hemocytes över tid (magenta, figur 2 g-H) som de lösa från sårområdet (pilar, figur 2 g och H) och jämföra hur deras beteende skiljer sig från de icke-photoconverted celler som inte når skadan webbplats. Vi har använt detta i vivo märkning teknik Visa att hemocytes rekryteras till en initial såret tillfälligt är fuktade en andra såret genereras 90 minuter senare23, även om denna differential märkning teknik kunde också har många andra insiktsfulla program i framtiden (se diskussion).
Med denna metod kan vi också samtidigt följa plats och tid dynamiken i såret reparation eller är-epitelialisering ' (figur 2B-D). Här ubiquitously uttryckt GFP-märkta E-cadherin etiketter de cellulära adherens föreningspunkterna i hela wing epitelet och tillåter formerna av enskilda epitelceller följas över tid. Såret kanten är lätt identifieras som korsningen mellan intakt GFP-märkta epitelceller och omärkt skräp (vit streckad linje, figur 2B-D). För majoriteten av sår börjar såret åter epitelialisera inom 1 h av skador och sår kanten förskott inåt (figur 2D); sår av denna storlek läker normalt inom 2-3 h skada23. Sårslutning både embryon och puppor drivs av en actomyosin kontraktila kabel tillsammans med ledande aktin-rika filopodia23,37. dessa cytoskeletal dynamics kan visualiseras direkt under såret reparera med hjälp av lämpliga i vivo reportrar, såsom GFP-märkta Spaghetti squash (Myosin reglerande ljusslinga) eller GFP-märkta aktin-bindande Moesin23. För vissa särskilt stora sår, men den actomyosin kabel och framkant filopodia kvarstår inte - dessa sår blivit 'kronisk' och aldrig helt åter epitelialisera23 även efter mycket längre tidsperioder (över 24 h) i vivo Imaging. Intressant, skiljer den inflammatoriska reaktionen som är associerad med dessa icke-läkande sår sig markant från den associerade med normal akut sår23 tyder på att onormala immunceller beteende kan vara en användbar prognostisk markör i kliniken . I framtiden kan ytterligare i vivo analys av kroniska sår med hjälp av långsiktiga imaging (över 24 tim) i Pupp-modellen tillhandahålla viktig mekanistisk insikt i detta försvagande tillstånd.
Figur 1: Drosophila pupa förberedelse för såra och live-imaging. (A) Drosophila vita prepupae som samlats vid 0 h APF, med framändan indikeras av vrängs andas bihang (externa). (B) efter att höja vit 0 h APF prepupae för 18 h vid 25 ° C, puparium visas brun. Dissektion av Pupp fallet ska börja på främre-mest regionen (pil), som anges av de everted trakeer som puppa korrekt är frånvarande från denna region, och fin pincett och/eller microscissors används för att avlägsna den Pupp skyddsfodral (C). Pupp vingar kommer att synas på de laterala sidorna på Pupp bröstkorgen (blå konturer). (D) Pupp fall bort helt från 18 h APF pupa, här puppa har rullat 90 ° för att Visa laterala sida, med vingen till avbildas i blått. (E-F) Fem 18h APF puppor monterad på täckglas inom imaging maträtt med heptan lim, med vatten-indränkt filterpapper att minimera uttorkning (E). Puppan ligger tredje i sekvensen (pil) ska kasseras som skadan inträffade under beredning. Puppor är monterade med den planaste delen av vingen (konturerad blå) i kontakt med täckglaset (F) och laserinducerad sår genereras centralt i flygeln (asterisk, F), även om andra platser får användas om flera sår är att studeras. Bilden i (D) anpassad med tillstånd från Weavers et al., 201623. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Dynamisk i vivo analys av inflammatoriska svar till vävnadsskada. Puppor dissekeras från Pupp skyddsfodral och monterad på täckglas (A) såras och därefter avbildas med time-lapse konfokalmikroskopi (B-H). Låg förstoring utsikt över oskadad Pupp vingen (A, wing marginal beskrivs i vitt) som innehåller stora mängder flyttfåglar hemocytes (A'). Laser-inducerad skada Pupp wing epitel (B-D, cellgränserna märkt med GFP-märkta Drosophila E-cadherin; sår marginal beskrivs i vitt) aktiverar en snabb inflammatorisk reaktion med migration av flera hemocytes ( SRP-Gal4 driven uttryck för nukleära RFP, magenta och cytoplasmiska GFP, grön) mot sårområdet (B-D; representanten bildrutor från en time-lapse film där varje bildruta är en projektion av 25 skivor 3 μm varje). Manuell spårning av hemocyte banor (flerfärgad spår, C' och D') ange komplexa plats och tid dynamiken i den inflammatoriska reaktionen, liknar som rapporterats för sårade embryon. Hemocytes också phagocytose nekrotisk cellulära skräp på sårområdet (pilspets, C och också infälld). Uttryck för photoconvertible fluorophore Kaede i immunceller härstamning (grön, E, använder srp-Gal4) gör att såret-rekryterade hemocytes (pil, E) differentially märkt (magenta, F) och följt med tiden som de lösa från skadan webbplats (pilar, G och H). De följande Pupp genotyperna utnyttjades: (A-D) w1118; ubi-DE-cad-GFP, srp-Gal4 > UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) och (E-H), w1118; srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III). Bilder anpassad med tillstånd från Weavers et al., 201623. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den akuta inflammatoriska reaktionen till vävnadsskada är en komplex och mycket dynamisk process som är nödvändig för att dirigera reparation av skadade vävnader, inklusive clearance av nekrotisk skräp och kampen mot infektion. För att fullt ut förstå och riva upp grundläggande aspekter av detta svar, är det viktigt att studier är utförda i vivo på 3-dimensionella levande prover för den exakta beteenden och samspelet mellan de olika cell härstamningar inblandade att följas exakt över tid. Realtidsanalys av dessa cell dynamics tillåter en mer detaljerad karakterisering av muterade fenotyper än statisk enda tidpunkter från fasta prover med klassiska immunohistokemi tekniker. Traditionellt har har de flesta live-imaging studier med hjälp av genetiskt eftertraktansvärda Drosophila -modellen använt det embryonala utvecklingsstadiet fruitfly tack vare dess optiska translucens och orörlighet jämfört med senare utvecklingsstadier4 , 5. mer nyligen vår grupp och andra har emellertid utvecklat Drosophila puppa som romanen modell att utföra hög upplösning och långsiktiga imaging av såret reparation och inflammation samtidigt in vivo8,22 ,23. Denna nya strategi erbjuder en spännande långsiktig potential för reda ut grundläggande aspekter av inflammatoriska celler beteendet och kan anpassas ytterligare för att undersöka andra cell-linjer (såsom Drosophila adipocyter dynamiska beteende 38) efter vävnadsskada.
Det finns ett antal kritiska faktorer under förberedelse och avbildning av sårade Drosophila puppor som avgör kvaliteten på de imaging resultaten som beskrivs ovan. Förmodligen är det svåraste steget av protokollet beskrivs den noggrann dissektion och exakt positionering av the puppor före såra och imaging. Puppor på denna utvecklingsfas är ytterst sårbara och även mindre oavsiktliga skador på puppor under beredning faser kommer avsevärt försämra experimentet; alla puppor som kan ha en oavsiktlig skada måste kasseras från experiment eftersom denna skada kunde aktivera sin egen inflammatorisk reaktion, vilket kan leda till mer utbredd (eller ens systemisk) effekter på inflammatoriska celler beteende någon annanstans i puppa. På grund av den pågående utvecklingen av de puppor som utnyttjas i dessa experiment (som genomgår betydande vävnad omflyttningar för att förbereda vävnader för vuxenlivet), ibland puppor kommer att flytta under imaging. Pupp rullande är, emellertid, mer sannolikt att uppstå om puppor inte har monterats korrekt med plattaste ytan av vingen (eller annan vävnad att avbildas) i direkt kontakt med täckglas; användning av heptan lim för att stabilisera puppor på täckglaset bör minimera denna oönskade rörelse. Därför måste också vara mycket försiktig att undvika lossnar puppor från sina noggrant justerad positioner när du flyttar proverna mellan Mikroskop; idealiskt, skadade lasern kopplas till samma mikroskopet ska användas för efterföljande time-lapse bildbehandling och foto-konvertering.
Förutom kunnande av Pupp dissektion och montering steg, kommer att exakta genotypen av the Drosophila puppor används ha en betydande inverkan på kvaliteten på de imaging data som genereras. Till exempel avgör antal kopior av Gal4 förare och UAS konstruktioner (t.ex. UAS-GFP eller UAS-Kaede) inom en enskild Pupp genotyp signal-brus-förhållandet under efterföljande imaging. Som en allmän regel konstruera fler kopior av en Gal4 eller UAS närvarande, desto större den totala nivån av fluorescerande protein (t.ex. god Jordbrukarsed eller Kaede) i vävnaden. Den optimala nivån av fluorescerande protein kommer dock en noggrann avvägning mellan upplyftande vävnad fluorescens tillräckligt för att tillåta hög kvalitet imaging (möjliggör användning av lägre laser befogenheter, minskning av fotoblekning och imaging över längre tid perioder) men utan att orsaka fluorophore-inducerad cellulär toxicitet. det optimala antalet Gal4 och UAS konstruktioner i varje experiment kommer att variera beroende på särskilda drivrutiner och fluorophores som används. Försiktighet bör iakttas att höja puppor vid 25 ° C (eller ovan, upp till 29 ° C) eftersom Gal4-UAS är temperaturkänsliga och kommer att vara ineffektiva på lägre temperaturer31. För att uppnå ytterligare nivåer av kontroll över vävnaden eller tid-specificitet Gal4 -driven uttryck, kan den Gal4-UAS system repressor Gal80 också omfattas av den Pupp genotyp39. Gal80 kan antingen användas för att förtrycka Gal4 aktivitet inom en viss vävnad (med en vävnadsspecifika Gal80) eller vid en viss tidpunkt (med en temperatur känslig Gal80). Gal4-UAS systemet kan ytterligare kombineras med andra oberoende binära system (såsom LexA -lexAop och QF -QUAS system) för att generera Drosophila som har flera konstruktioner (t.ex. fluorophores, RNAi linjer eller andra genetiska konstruktioner) uttryckte samtidigt i en rad olika vävnader39.
Användningen av denna nya Drosophila Pupp modell erbjuder ett antal fördelar jämfört med den mer traditionella embryo-metoden. Jämfört med den kortsiktiga imaging (upp till 3 h) tillgängliga i etapp 15 embryon (scenen på som mest embryonala såra studier utförs), puppor kan avbildas under betydligt längre tid (i princip förrän i vuxen ålder efter 96 Tim Pupp utveckling ). Dessutom mycket större antalet hemocytes (Drosophila innate immuna celler) är närvarande inom Pupp vävnader (och tillgänglig för imaging) jämfört med det mer begränsade antalet närvarande inom embryot och detta har gjort det möjligt för oss att samla in betydligt mer Imaging data på hemocyte beteende med samma totala antal exemplar. Avgörande, gjort detta, i sin tur det möjligt att applicera mer sofistikerad matematisk modellering för att analysera hemocytes beteende och extrahera roman funktionerna i såret tilldragande och inflammatorisk reaktion som annars skulle förblivit experimentellt otillgängliga23. En annan fördel med Pupp modellen är att RNAi-medierad gen knockdown är betydligt effektivare än i tidigare embryonala stadier, möjliggör förbättrad analys av vävnad eller tid-specifika genen inaktivering med binära system såsom Gal4-UAS system 39. effektiviteten av RNAi i detta skede öppnas således potential att utföra storskaliga (eller ens opartisk genome-wide) RNAi-skärmar för att söka efter nya spelare involverade i antingen såret reparation eller inflammatoriska celler beteende.
Men Drosophila puppor klart inte kan användas att studera de fenotyper som följd av genetiska mutationer som är embryonala dödliga; funktionella och live-imaging studier av gener som är viktiga för embryonal utveckling måste därför fortfarande utföras i embryon, om inte RNAi-medierad gen knockdown i en tid eller vävnadsspecifika sätt tillåter utveckling att ske genom att Pupp stadier. Embryot är också modellen av val att studera och leva-bild vissa funktioner av immunceller beteende, inklusive utvecklingsmässiga utspridningen av immunceller från deras ursprung, kontakt-hämning av förflyttning och fagocytos av apoptotiska lik genereras under utvecklande vävnad skulptera5,8 , som ännu inte har iakttagits i Pupp-modeller. Även om studier i Drosophila larver och vuxna har lämnat en viktig inblick i mekanismerna bakom såret reparation och inflammation40,41,42,43, 44 live-imaging studier i dessa skeden har visat sig svårt på grund av proverna inneboende mobila. Medan larver kan vara sövda för att korta perioder av live-imaging, på grund av den tillfälliga karaktären hos anestesi, endast korta ögonblicksbilder av levande såret reparera eller inflammatoriska reaktionen kan vara visualiserade45. En färsk studie har nu utvecklat ett förbättrat protokoll som tillåter långsiktiga avbildning av larval sårläkning46, även förberedelse och imaging fortfarande är betydligt mer utmanande än i embryon eller puppor. På lång sikt föreställer vi att genom att utnyttja den lämpligaste utvecklingsstadier för att hantera varje specifik fråga, studier i alla fyra av dessa olika Drosophila stadier - från embryon genom larver och Pupp perioder till vuxen ålder (var och en med sina egna unika fördelar och begränsningar) - kommer att ge kompletterande insikter i den molekylära och cellulära mekanism körning såret reparation och inflammation.
I framtiden, detta protokoll för såra och långsiktiga avbildning av Drosophila puppor lätt kan anpassas att studera en rad inflammation-relaterade fenomen och har långtgående potential för avslöjande roman funktioner av inflammatoriska sår svar. Kombinationen av långsiktiga imaging, tillsammans med tillämpningen av photoconvertible fluorophores (till exempel Kaede), är av stort värde för att förstå dynamiken i medfödda immunceller beteende och särskilt långt mindre förstås resolution fas av den inflammatoriska reaktionen i såret. Av specifikt märkning antingen individuell eller subpopulationer av immunceller (t ex rekryterade till ett sår) kommer det vara möjligt att analysera hur exponering för en miljömässig cue (t.ex. en liket eller skada) påverkar cellens immun efterföljande svar till en senare Cue. Drosophila hemocytes provocerande beteende kan ändras genom tidigare erfarenheter - till exempel de är trimmade för att bemöta vävnadsskada av tidigare fagocytos av apoptotiska lik under utveckling12 men det återstår att se huruvida andra miljömässiga cues framkalla liknande priming händelser. Även om studier av Pupp sår hittills har fokuserat på de medfödda inflammatoriskt svaren, Pupp wing modellen också ger ett utmärkt tillfälle att både live-bild och dissekera mekanismerna bakom epitelial sår reparation. Dessutom kan denna Pupp bildgivande metod också anpassas för att undersöka andra cell härstamningar svar på vävnad skador38, antingen i Pupp vingen själv eller andra lättillgängliga Pupp vävnader (t.ex. ögonen, ben eller bröstkorg) dynamiska beteende. Slutligen, genom att kombinera den genetiska tractability av Drosophila tillsammans med användarvänlighet långsiktiga Pupp imaging, romanen epitelial reparation eller inflammatoriska tillsynsmyndigheter kunde bli upptäckt genom tillämpning av opartisk genome-wide knock-down tillvägagångssätt.
Disclosures
Författarna förklarar de har inga konkurrerande intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi skulle vilja tacka ledamöterna av Martin, Nobes, Richardson och trä labs för bra diskussion. Vi tackar också Wolfson Bioimaging anläggningen (universitetet i Bristol, UK), Bloomington lager centrum (Indiana University, USA) och Vienna Drosophila Resource Centre (för Drosophila bestånd) och Flybase (för aktuell Drosophila gen annotation). Detta arbete stöds av en MRC projektbidrag till P.M. och WW (herr/J002577/1), en Wellcome Trust Senior Fellowship till WW och en Wellcome Trust Investigator Award till P.M..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila stocks | |||
| ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII) |
Kyoto Stock Center, DGRC | #109007 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
| ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III) |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #58742 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
| ubiquitous GFP-tagged Moesin P{sGMCA}3.1 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #59023 | The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T. |
| hemocyte specific serpent-Gal4 driver ;srp-Gal4; |
Generated by Katja Bruckner | Generated by Katja Bruckner | Expression of Scer\GAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004). |
| UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #8545 or #8547 | UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal |
| UAS-cytoplasmicGFP ;;P{UAS-GFP.S65T} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | Multiple stocks available (e.g. #1522) | Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness. |
| UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #26161 | Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV. |
| GFP-tagged spaghetti squash w1118;;P{sqh-GFP.RLC} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #57145 | The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:Avic\GFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ingredients for fly food media | Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.) | ||
| maize | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| soya flour | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| malt extract | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| molasses | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| Difco agar | BD Biosciences, Fisher Scientific | DF0142-15-2 | For preparation of fly food |
| Propionic acid | Sigma | 402907 | For preparation of fly food |
| Nipagen | Sigma | 79721 | For preparation of fly food |
| Dried baker's yeast | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | For preparation of fly food |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample preparation and mounting | |||
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | For preparation of heptane glue |
| Fine sable paintbrush | Daler-Rowney (or equivalent) | #0 or 1 | |
| Forceps | Fisher Scientific (or Fine Science Tools) | NC9404145 | Dumont #5 |
| Glass bottomed dishes for imaging | MatTek | P35G-0-10-C | We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment. |
| Heptane | Sigma | 51730-5ML | For preparation of heptane glue |
| Double sided sticky tape (e.g. Scotch) | Agar Scientific | AGG263 | For preparation of heptane glue |
| 50ml tube (for heptane glue) | Falcon tubes from Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparation of heptane glue |
| Glass microscope slides | Agar Scientific | AGL4244 | For dissection of Drosophila pupae |
| Dissecting stereo microscope with brightfield | Leica (or equivalent) | M50 | For dissection of Drosophila pupae |
| Microscissors | John Weiss International | 103123 | Miniature Research Scissors (straight) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser ablation and imaging | |||
| Nitogen ablation laser | Spectra-Physics (or Andor equivalent) | Model VSL-337ND-S | For wounding, this should be attached to a widefield imaging system |
| Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) | Leica (or equivalent) | TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) | Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal) |
| Environmental chamber | Life Imaging Services (or equivalent) | "Microscope Temperature Control System" | Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image Analysis Software | |||
| FRAP software module | Leica (or equivalent) | CLSM FRAP software module | For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede |
| ImageJ (image analysis software) | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012. |
| ImageJ plugin "Manual Tracking" | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.net/Manual_Tracking | |
| ImageJ plugin "TrackMate" | ImageJ, NIH | https://imagej.net/TrackMate | Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081 |
| Volocity (high performance 3D imaging software) | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | For image analysis |
| IMARIS (image analysis software) | Bitplane | IMARIS for Cell Biologists | For image analysis |
References
- Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration. Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Martin, P., Nunan, R. Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing. British Journal of Dermatology. 173 (2), 370-378 (2015).
- Razzell, W., Wood, W., Martin, P. Swatting flies: modelling wound healing and inflammation in Drosophila. Disease Model and Mechanism. 4 (5), 569-574 (2011).
- Wood, W., Martin, P. Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly. Development Cell. 40 (3), 221-233 (2017).
- Mohr, S. E., Smith, J. A., Shamu, C. E., Neumüller, R. A., Perrimon, N. RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 591-600 (2014).
- Muñoz-Soriano, V., López-Domenech, S., Paricio, N. Why mammalian wound-healing researchers may wish to turn to Drosophila as a model. Experimental Dermatology. 23 (8), 538-542 (2014).
- Weavers, H., Wood, W. Creating a Buzz about Macrophages: The Fly as an In Vivo Model for Studying Immune Cell Behavior. Developmental Cell. 38 (2), 129-132 (2016).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. Journal of Cell Biology. 168 (4), 567-573 (2005).
- Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biolog. 173 (3), 405-416 (2006).
- Razzell, W., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Calcium flashes orchestrate the wound inflammatory response through DUOX activation and hydrogen peroxide release. Current Biology. 23 (5), 424-429 (2013).
- Weavers, H., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Corpse Engulfment Generates a Molecular Memory that Primes the Macrophage Inflammatory Response. Cell. , (2016).
- Stramer, B., Winfield, M., Shaw, T., Millard, T. H., Woolner, S., Martin, P. Gene induction following wounding of wild-type versus macrophage-deficient Drosophila embryos. EMBO Reports. 9 (5), 465-471 (2008).
- Matsubayashi, Y., Coulson-Gilmer, C., Millard, T. H. Endocytosis-dependent coordination of multiple actin regulators is required for wound healing. Journal of Cell Bioliogy. 210 (3), 419-433 (2015).
- Evans, I. R., Rodrigues, F. S. L. M., Armitage, E. L., Wood, W. Draper/CED-1 Mediates an Ancient Damage Response to Control Inflammatory Blood Cell Migration In Vivo. Current Biology. 25 (12), 1606-1612 (2015).
- Zanet, J., Stramer, B., Millard, T., Martin, P., Payre, F., Plaza, S. Fascin is required for blood cell migration during Drosophila embryogenesis. Development. 136 (15), 2557-2565 (2009).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Ninov, N., Martín-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nature Protocols. 2 (12), 3074-3080 (2007).
- Gho, M., Bellaïche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126 (16), 3573-3584 (1999).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Berh, D., Scherzinger, A., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C., Risse, B. Automatic non-invasive heartbeat quantification of Drosophila pupae. Computers in Biology and Medicine. 93, 189-199 (2018).
- Sander, M., Squarr, A. J., Risse, B., Jiang, X., Bogdan, S. Drosophila pupal macrophages--a versatile tool for combined ex vivo and in vivo imaging of actin dynamics at high resolution. European Journal of Cell Biology. 92 (10-11), 349-354 (2013).
- Weavers, H., Liepe, J., Sim, A., Wood, W., Martin, P., Stumpf, M. P. H. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26 (15), 1975-1989 (2016).
- Fristrom, D., Wilcox, M., Fristrom, J. The distribution of PS integrins, laminin A and F-actin during key stages in Drosophila wing development. Development. 117 (2), (1993).
- Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Development Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
- Berg, H. Random Walks in Biology. , Princeton University Press. Available from: http://press.princeton.edu/titles/112.html (1993).
- Diehl, H., Ihlefield, H., Schwegler, H. Physik fur Biologen. , Springer-Verlag. (1991).
- Stewart, P. S., McFeters, G. A., Huang, C. T. Biofilm control by antimicrobial agents. Biofilms II Process Analysis and Application. , 373-405 (2000).
- Milo, R., Phillips, R. Cell Biology by the Numbers. , Garland Science. Available from: https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1 (2015).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceeding of National Academy of Science U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Cordelières, F. Manual tracking. National Institutes of Health. , Available from: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2015).
- Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Grueber, W., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biology. 173 (3), 405-416 (2006).
- Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
- Franz, A., Wood, W., Martin, P. Fat Body Cells Are Motile and Actively Migrate to Wounds to Drive Repair and Prevent Infection. Developmetal Cell. 44 (4), 460-470 (2018).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2012).
- Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and Cell Fusion Contribute to Wound Healing in the Adult Drosophila Epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science U S A. 105 (29), 10017-10022 (2008).
- Galko, M. J., et al. Cellular and Genetic Analysis of Wound Healing in Drosophila Larvae. PLoS Biology. 2 (8), e239 (2004).
- Brock, A. R., et al. Transcriptional regulation of Profilin during wound closure in Drosophila larvae. Journal of Cell Science. 125 (23), (2013).
- Wu, Y., Brock, A. R., Wang, Y., Fujitani, K., Ueda, R., Galko, M. J. A blood-borne PDGF/VEGF-like ligand initiates wound-induced epidermal cell migration in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (17), 1473-1477 (2009).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila Larvae to Study Epidermal Wound Closure and Inflammation. Methods in Molecular Biology. 1037, 449-461 (2013).
- Kakanj, P., et al. Insulin and TOR signal in parallel through FOXO and S6K to promote epithelial wound healing. Nature Communications. 7, 12972 (2016).
