Summary
Burada yüksek spatio-zamansal çözünürlük vivo içindecanlı görüntüleme yara onarım ve ilişkili inflamatuar yanıt için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem uzun vadeli görüntüleme ve belirli hücre popülasyonlarının zaman içinde izleme etkinleştirmek için Drosophila geliştirme pupa aşaması kullanır ve verimli RNAi aracılı gen inactivation ile uyumludur.
Abstract
Doku hasarı hızlı inflamatuar yanıt sırasında doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücrelerini hızlı bir şekilde yaralanma siteye işe. Bir defada yara, doğuştan gelen bağışıklık hücreleri enfeksiyon mücadele, nekrotik enkaz açıklıkta ve matris ifade uyarıcı gibi temel fonksiyonları bir dizi yapmak. Tam bu bağışıklık yanıtının düzenleyen farklı sinyal olayları anlamak için karmaşık davranışları (ve arasındaki etkileşimleri) gözlemlemek önemlidir birden çok hücre soy içinde vivo ve gerçek zamanlı, yüksek kendisinin zamansal çözünürlük. Optik kalınlığı ve Drosophila embriyolar genetik tractability Drosophila canlı görüntü için çok değerli bir model olarak kurduk ve inflamatuar hücre davranışı, mekanizmaları da dahil olmak üzere temel yönlerini incelemek gelişimsel dağılma, apoptotik cesetler ve/veya mikrobiyal patojenler ve işe alım yaralar için boşluk. Ancak, daha yeni iş şimdi bir daha sonraki aşamada Drosophila yaşam döngüsü- Drosophila pupa – içinde istihdam bir dizi gelişmiş RNAi verimlilik, süreleri, Imaging uzun dahil olmak üzere farklı avantajlar sunar göstermiştir ve önemli ölçüde daha fazla bağışıklık hücre sayıları. Burada görüntüleme yara onarım için bir iletişim kuralı ve ilişkili inflamatuar yanıt içinde canlı Drosophila pupa spatio-temporal yüksek çözünürlükte açıklanmaktadır. Yeniden epithelialization ve inflamasyon dinamikleri takip etmek için biz epitel ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri için bir dizi belirli vivo içinde floresan işaretleri kullanın. Ayrıca yaralanma sitesinden belirli bağışıklık hücre alt kümeleri için göç gibi davranışlarını izlemek için aşağıdaki fotoğraf-üstü açık fluorophores, Kaede gibi ve çözmek etkinliğini göstermektedir.
Introduction
Verimli ve etkili bir enflamatuar yanıt herhangi bir organizma enfeksiyon mücadele enkaz temizleyip yaralı doku1tamiri yönetmek çok önemli. Bu yanıtı çoğu doku hasarı kaçınılmaz bir sonucu olsa da, uygunsuz bir enflamatuar yanıt farklı insan hastalıkları (Kronik yaralar şifa dahil olmak üzere çeşitli için bağlı çünkü inflamasyon sıkı düzenleme gerektirir aşırı skarlasma ve kansere yatkınlık)1,2,3. Bu klinik önemi göz önüne alındığında, bu yeni prognostik göstergeler ve kronik inflamatuar çeşitli tedavi stratejileri geliştirmek için inflamatuar yanıt sürüş moleküler ve hücresel mekanizmaları daha ayrıntılı bir anlayış elde etmek çok önemlidir koşullar, tamir doku uzun ve gereksiz enflamasyon korumak olabilir.
Son yıllarda, Drosophila böcekler insan4,5' e korunmuş inflamatuar yanıt temel özelliklerini incelemek için bir iyi kurulmuş ve değerli modeli sistemi haline gelmiştir. Şu anda, Drosophila diğer modeller (örneğin, fare veya zebra balığı), şu anda mümkün olduğundan çok daha büyük genetik tractability sunar kesin spatio-temporal genetik manipülasyon vivo erişimine izin verme (devre dışı bırakabilirsiniz için veya herhangi bir gen ilgi belirli hücre tipleri içinde tanımlanmış bir gelişimsel zaman-nokta aşırı hızlı) ve rahatlık-in Genom geniş ekranlar6,7. Embriyo sağlayan hareketsiz (farklı olarak Drosophila larva veya yetişkin) ve Optik yarı saydam olarak geleneksel olarak, en canlı görüntüleme çalışmaları yara iyileşmesi ve iltihap Drosophila embriyonik aşamada gerçekleştirilen eşsiz yüksek çözünürlüklü vivo içinde 8görüntüleme. Bu yanıt olarak embriyonik epitel9, mekanik veya lazer kaynaklı yaralanma yara bölgesine Drosophila doğuştan gelen bağışıklık hücreleri (hemocytes) hızlı ve sağlam alımı görselleştirmek araştırmacılar sağladı 10 , 11 , 12 , 13 , 14. bu canlı görüntüleme çalışmalar genetik manipülasyon ile birleştirerek, çalışmalarda Drosophila embriyo inflamatuar hücre davranış içinde vivokontrol birçok önemli bağışıklık hücre proteinleri ortaya çıkardı. Örneğin, CED-1 homolog Draper (bir ITAM etki alanını içeren protein) tespit edilmiştir bir önemli 'zarar reseptör' Bu işe alım Drosophila bağışıklık hücreleri bir H2O2aracılık eder-bağımlı şekilde sitelerine 15zarar. Draper düzeyleri bağışıklık hücreleri içinde sırayla kalsiyum kaynaklı JNK sinyal ve yükseltilmiş aşağı apoptotik ceset alımını12tarafından düzenlenmektedir. Hemocyte motilite daha fazla yara doğru yönlendirilmiş geçiş koordine etmek için karmaşık hücre iskeleti değişiklikler gerektirir ve bu aktin donatılacak protein Fascin16 ve Rho aile küçük gibi hücre iskeleti düzenleyiciler aktivite bağlıdır GTPases Rac ve Rho9.
Drosophila embriyogenez yetişkinlik17ulaşmadan önce aşağıdaki ek larva ve pupa aşamaları geçer holometabolous bir böcek var. Drosophila pupa non-invaziv canlı görüntüleme dinamik hücresel olaylar, gelişimsel hücre göç18, hücre bölünmesi19, hücre büyüme20ve kas gibi çeşitli için ek bir model olarak geliştirilmiştir kasılma21. Daha yakın zamanlarda, hangi yara onarım ve inflamasyon vivo içinde22,23dinamiklerini incelemek yeni bir model olarak kurulmuştur.
Sadece embriyonik olduğu gibi Drosophila pupa dikkatli diseksiyon onların opak pupa durumlarda18den sonra hareketsiz ve Optik yarı saydam, aşamalıdır. Bu optik şeffaflık istismar tarafından bir yanıt olarak Drosophila pupa dokularda, pupa kanat22gibi doku hasarı doğuştan gelen bağışıklık hücreleri (hemocytes) vivo davranışını izleyebilirsiniz. Pupa kanat kanat çevre bağlı olan iki büyük yassı epitel yaprak oluşan basit bir bilayered yapısı olarak var olur; Bu iki epitel katmanlar arasında ekstrasellüler boşluk hemolymph (böcek kan) ve çok sayıda hareketli hemocytes24ile doldurulur. Embriyo olduğu gibi kanat epitel için mekanik veya lazer kaynaklı yaralanma yaralanma sitesi23hemocytes hızlı alımı tetikler. Ancak, pupa bu aşamada daha erken embriyonik aşamaları üzerinde görüntüleme için farklı bazı avantajlar sunar. Üzerinden çok uzun zaman süre (en az 5 h) yaralı pupa görüntüsü, daha fazla doku alan (örneğin, çok sayıda yarası oluşturma) deneysel pertürbasyon için kullanılabilir ve önemli ölçüde daha fazla sayıda hemocytes bu sahne () mevcut vardır daha fazla hücre yörüngeleri üzerinden daha fazla mesafeler için geliştirilmiş istatistiksel güç matematiksel analiz sırasında sağlayan). Ayrıca, RNAi aracılı gen inactivation verimliliğini önemli ölçüde 'çaldı bir doku veya embriyolar daha geleneksel bütün mutant yaklaşım karşılaştırıldığında zaman özgü şekilde aşağı ' birçok genler izin pupa aşamalarında artırıldı.
Yara yeniden epithelialization ve bu yeni pupa modeli içinde eşlik eden inflamatuar yanıt dinamikleri takip etmek için iki farklı hücre popülasyonlarının etiketlenmesi gerekir: pupa epitel ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri (Drosophila hemocytes). Bir dizi farklı işaretleri (Tablo reçetesi) bu iki farklı hücre popülasyonlarının etiketlemek kullanılabilir - marker seçim belirlenmesi için belirli göreve bağlıdır. Pupa epitel, ya içeren Drosophila satırların işaretlemek için bir ubiquitously ifade GFP öğesini E-(yani adherens kavşaklar etiketleri) cadherin rutin olarak kullanılan hücre kenar boşluklarını veya alternatif olarak, bir GFP olarak etiketlenmiş konumlarını belirtmek için Aktin-bağlayıcı etki (Bu aktin sitoiskeleti etiketleri) Moesin, yara-kenar contractile aktin halka ve öncü çıkıntılar görselleştirmek için. Drosophila hemocytes hemocyte özgü srp-Gal425 (için nükleer izleme) nükleer RFP, sitoplazmik GFP veya GFP öğesini Moesin (sırasıyla sitoplazma veya aktin sitoiskeleti etiketlemek için) sürücü ifade olarak etiketlemek için veya bir photoconvertible fluorophore (örneğin Kaede) kullanılır. Aslında, nükleer hareket ve hücre morfolojisi (bkz: temsilcisi sonuçları) eşzamanlı analizini etkinleştirmek için birlikte, birden çok bağışıklık hücre işaretleri kullanmak için genellikle avantajlıdır. Bu iletişim kuralı Drosophila pupa kullanımı gerektirdiğinden, orta-pupa aşamaları-ebilmek var olmak kullanmak kadar ancak, sadece genetik işaretler bu uygun oluşur. Ayrıca, embriyonik öldürücü stokları uygun olmayacaktır. Bu olası bir sorun denetim görüntüleme olmak (veya vahşi tipi) pupa ama genleri nakavt üzere olduğunuzda dikkate almak önemlidir veya yara kapatma veya iltihap üzerindeki etkileri değerlendirmek için overexpressed. Gen nakavt (veya overexpression), Gal80TH neden erken ölümcül olması durumunda yapı geliştirmede daha sonra Gal4 tahrik nakavt ikna etmek için kullanılabilir (konuya bakın).
Bizim son çalışmalarda, pupa sahne alanı inflamatuar davranışı kullanarak sırayla yara roman ayrıntılarını anlamak bize izin verdi karmaşık matematiksel modelleme, analiz için yeterli bağışıklık hücre yörünge veri toplamak bize sağladı inflamatuar cezbedici23sinyalleri. Örneğin, bu yaklaşım yara chemoattractant yavaş yavaş 200 μm kalınlığında2/min, daha önce önerilen küçük aday molekül ATP gibi daha çok daha yavaş bir oran, iltihaplı doku yoluyla yayılır veya H2O2 rapor ortaya 26,27,28,29diffüz; Bu küçük "hasar" moleküller yerine keyfi sinyaller olarak hareket muhtemeldir. Ayrıca, onlar uzak bir ilk yara gidermek ve biraz (çeşitli timepoints sonra ilk yapılan) maruz doğuştan gelen bağışıklık hücreleri uzun vadeli davranışını takip ederek, biz hangi bağışıklık hücreleri geçici 'duyarsızlaştırma' döneminde ortaya çıkardığı sonraki yaralanmaları23için kör vardır. Pupa modeli ile birlikte Drosophila'nın genetik tractability, uzun vadeli görüntüleme potansiyelini istismar tarafından bir belirli bağışıklık hücre popülasyonlarının (örneğin yalnızca işe yara siteye bağışıklık hücreleri) davranışını içinde takip edebilirsiniz sonraki hakaret, sadece bağışıklık hücre lineage23içinde ifade photoconvertible fluorophore30 kullanarak yanıt.
Burada tarif biz yara onarım ve yaşam kullanarak yüksek spatio-temporal çözünürlükte ilişkili inflamatuar yanıt dinamikleri görselleştirmek için bir protokol Drosophila pupa. Biz ilk pupa hazırlık (diseksiyon ve montaj) ve sonraki lazer-aracılı yaralama ve hızlandırılmış görüntüleme için gereken adımları kapsayacak ayrıntılı bir metodoloji sağlamak. Ayrıca fotoğraf-Cabrio fluorophores belirli bağışıklık hücre alt kümeleri içinde vivoetiketleme izin vermek için nasıl kullanılacağını açıklar. Vadede, biz bu yeni Drosophila pupa misal-ecek açık yukarıya doku hasarı için inflamatuar yanıt temel karmaşık sinyalleşme dynamics dissekan için heyecan verici olanaklar öngörülüyor. Daha karmaşık istatistiksel analizler uygulayarak bir geliştirilmiş RNAi verimliliği kendisi içinde Genom geniş tarama uygulamasına ödünç verebilir iken Aksi takdirde deneysel olarak erişilemeyen kalacaktı yanıtı özelliklerini ortaya çıkarmak bağışıklık hücreleri vivo içinde yeni oyuncular bağışıklık hücre davranış düzenleyen tanımlamak için.
Protocol
Bu iletişim kuralı dört ana sıralı adımlardan oluşur: (1) hazırlık Drosophila stokları ve Drosophila pupa evreleme, (2) pupa diseksiyon ve montaj, (3) pupa yaralama, (4) vivo hızlandırılmış confocal görüntüleme.
1. hazırlanması Drosophila stokları ve pupa evreleme
- (Bkz: giriş ve Malzemeler tablo) uygun Drosophila stokları edinin.
- Uygun genotip genç sağlıklı yetişkin uçar toplamak.
- Kısaca sinekler anestezi için karbon dioksit gazı pedleri kullanarak seçme yetişkin uçar ve aktarmak için iyi bir boya fırçası uygun genotip veya cinsiyet bir koleksiyon şişe için uçar.
- 20 bakire kadın ve 20 erkek standart sinek gıda medya içeren her şişe ekleyin (Mısır unu-pekmez-agar karışımı, Tablo malzemelerigörmek) Maya ile desteklenmiştir.
- En iyi pupa üretimi için yetişkin sinekler her gün taze ampul, yeni gıda tüm şişeleri 25 ° C'de tutmak üzerine ipucu.
Not: Gal4-UAS sistem31 lineage özel gen ekspresyonu sürmeyi kullanılıyorsa Gal4-UAS sistem sıcaklık duyarlı olduğu gibi tüm adımları 25 ° C veya üzerinde yapılmalıdır. - Zamanlanmış görüntüleme oturumu öncesinde 18 h şişeleri (yani puparium oluşumu, APF sonra 0 h) üzerinden en az 10 yeni kurulan beyaz ön Pupa (Şekil 1A) seçin pupa iç şişe yüzeyinden çıkarmak için forseps veya iyi bir fırça kullanarak ve Pupa dikkatle temiz boş bir plastik şişe tarafına aktarın.
Not: Gezgin 3rd INSTAR larva yukarı doğru pupation geçmesi gıda orta dışında tarama; Onlar diplidir ön vızıltısı sahip (3rd INSTAR larva) sabit olarak ve yeni kurulan beyaz prepupae kolayca tanımlanır. Manikür 'başlangıçta yumuşak ve beyaz17olan puparium ' (pupa harf) dönüştürür. Bu sadece istenmeyen bir yaralanma kaynaklı enflamatuar yanıt aynı zamanda önemli bir gelişimsel gecikme neden olabilir gibi pupa zarar görmesini önlemek için bakım alınması gerekir. - 25 ° C'de şişe içinde uygun gelişimsel aşamaya (18 h APF en iyi sonuçları verecektir) seçili pupa yaş
Not: pupa geliştirdikçe, pupa durum giderek daha koyu ve daha kırılgan olacak. - Diğer reaktifler vaktinden bir sonraki adım için hazır olun. Tutkal, 20 cm uzunluğunda toplanan çift taraflı bant ile 20 mL heptane 50 mL santrifüj tüpü içinde birleştirmek heptane yapmak, parafin film ve rock gecede bankta oda sıcaklığında kapatın.
2. hazırlık ve Drosophila pupa diseksiyon
- Aşamalı Drosophila pupa yapışkan bant çift taraflı bir cam slayt üzerinde monte edilmiş bir parçası aktarın. Pupa ventral tarafta sıkıca teybe sıkıştı ve dorsal tarafta (Şekil 1B) yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
Not: Pupa ön pupa kasanın ön taraftan çıkıntılı iki vızıltısı üzerinden tanımlanabilir olacaktır. - Dikkatle pupa forseps ve mikro-makas (Şekil 1B-D) kullanarak bir aydınlık alan diseksiyon mikroskop altında onların koruyucu puparium kasa kaldırın.
- Başlangıçta, bir kesi forseps (Şekil 1B) kullanarak puparium en ön bölgede olun. Pupa kasanın içinde erken pupa geliştirme sırasında shrunk çünkü bu alanda pupa durum içi boş ve pupa doku yoksun olduğundan emin olun.
- Bu ilk kesi sonra dikkatlice gözyaşı veya açık bir anterior posterior yönüne pupa kahverengi opak kırılgan kasa (Şekil 1 d) üzerinden tamamen boşalana kadar forseps veya microscissors (Şekil 1 c) kullanarak içinde kesme pupa durumunda.
Not: Bu aşamada pupa çok kırılgandır ve pupa yüzey delinme önlemek için bakım alınmalıdır; hemolymph hızlı bir şekilde delik sitesinden akması gibi delinme açıktır. Pupa delikler, ancak küçük ile atılmalıdır.
- Heptane tutkal kullanarak cam popolu bir tabak içinde pupa bağlayın.
- 20 mL pipet ucu bir çizgi üzerinde cam popolu çanak önceden hazırlanmış heptane tutkal (bakınız Bölüm 1,6 yukarıda) bir 10 mL damla eklemenizi sağlar.
- 5 için kuru tutkal izin disseke pupa dikkatle forseps (Şekil 1E) kullanarak heptane tutkal üzerine aktarmadan önce s.
- Yaralama ve görüntüleme kolaylaştırmak için pupa arkaya sıraya girin; yaklaşık 5 pupa önerdi ama daha fazla deneyim ile yönetilebilir olacaktır.
Not: Heptane yapıştırıcı kullanımı dik görüntüleme sistemleri kullanırken önerilir ancak ters bir sistem kullanırken gerekli değildir. Tutkal optik oluşturursa sapmalarını görüntüleme, pupa sırasında doğrudan coverglass yerine yerleştirilebilir-görüntüleme taşırken özen sürece pupa doku ve cam arasındaki doğal yapışma istikrarlı görüntüleme için çoğu durumda yeterli olacaktır Mikroskoplar arasında çanağı.
- En iyi sonuçlar için coverglass (Şekil 1F) ile doğrudan temas kanat kanat yüzeyi çoğunluğu ile coverglass üzerinde düz pupa bağlarsınız. Kanat doğru takılı emin olmak için konumlarını değiştirmek için forseps kullanarak pupa rulo.
- Örnek dehidratasyon görüntüleme süresi boyunca önlemek için bir emici filtre cam popolu çanak montaj (1E rakam) pupa bozmamaya dikkat edin, sonunda tarafına distile su batırılmış kağıt parçası ekleyin. Bir kapak ile çanak kapağı.
Not: Pupa yaralama ve görüntüleme için hazırsınız.
3. Lazer kaynaklı Drosophila pupa Wings yaralama
- Bir akort lazer ablasyon sistemiyle donatılmış geniş alanlı mikroskop için takılı pupa içeren cam popolu çanak aktarın.
- Geniş puls-UV hava soğutmalı ablasyon azot Pompalı Lazer ayarlı 435 için kullanım nm- Malzemeler tablo bkz. Ayrıntılar11için; ışığın aydınlatma için kullanılan kesin dalga boyu bir uygun boya hücre Kullanıcı tarafından seçilir.
- Aydınlık alan optik, kullanarak ayarlamak için ilk pupa pupa kanat bulmak için mikroskop sahne denetimleri (Şekil 1F) yaralandı.
- En iyi sonuçlar, her iki görüntüleme için bir petrol daldırma veya 40 X 63 X objektif lens kullanın ve lazer ablasyon; kullanılan daldırma sıvı (yağ veya gliserol) ablasyon ve görüntüleme sistemleri arasında tutarlı olduğundan emin olun. Pupa kanat epitel cam coverslip (yani odak epitel yaralı bölgenin yer) en yakın uçak odaklanmak için mikroskop ayarlamak iyi odak kontrol düğmesi kullanarak.
- Yaralı alan doğrudan ablasyon lazer bilinen hedef alanıyla hizalanacak biçimde mikroskop sahne ayarları kullanarak, pupa kanat getirin.
- Mikroskop için donatılmış bir enerji yoğunluğu zayıflatıcı slayt ablasyon ışık güç düzeyini el ile ayarlamak için kullanın.
Not: Zayıflatıcı kaydırıcıyı tıklayın durur ve Fıkıh zayıflama göreli düzeyini tanımlamak ve tekrarlanabilir ayarları kullanımına izin vermek için vardır. - Bir dış manüel tetik denetimi kullanarak, bir yara yapmak için tetikleyici tek bir kısa tıklama kullanarak ablasyon lazer etkinleştirin. Geçici hava kabarcığı ablasyon sitesindeki görünümünü için yaralama normalde eşlik edecek bu yana denetleyin. Lazer kaynaklı yaralama pupa epitel görselleştirmek için uygun floresan filtreleri kullanarak başarılı olmuştur eğer kontrol edin.
Not: ışın yansımaları veya ciddi göz neden olabilir deri hasar lazer ışınları kazayla maruz önlemek için dikkat ediniz. - Yaralama başarısız olursa, (geçerli odak düzeyi altında veya biraz üstünde mikroskop odağı taşıyarak) odak düzlemi değişir ve ablasyon tetikleyici tek tıklama tekrarlayın. Alternatif olarak, istenen yara boyutu elde edilir kadar zayıflatıcı slayt kullanarak lazer gücü yavaş yavaş artırın.
- Ablasyon lazer darbe tekrarlama oranı değişir için tekrarlama oranı knob arka Kontrol Paneli'nde kullanın (daha az--dan 1 darbe/s hızı değiştiği 60 Hz). En iyi yaralama için darbe tekrarlama oranı 40 Hz olarak ayarlayın.
- Farklı boyutlu yaralar oluşturmak için enerji yoğunluğu zayıflatıcı slayt ablasyon ışık güç düzeyini el ile ayarlamak için kullanın.
- Tüm takılı pupa yaralama kaçınmak ve bu sigara ablated pupa unwounded denetimleri kullanın.
- Tutarlı sonuçlar için düzenli olarak (ilgili işletim kılavuzu kullanarak) ablasyon sistem yeniden hizalayın. Ayrıca, temiz ve çıkış dalga boyunda denetler boya rezonatör hücre doldurma.
4. içinde Vivo hızlandırılmış Confocal görüntüleme
- Hızlı bir şekilde cam popolu çanak hızlandırılmış görüntüleme için uygun bir mikroskop aktarın.
Not: bir yüksek belirtimi confocal veya iplik disk mikroskop GFP ve mCherry fluorophores algılayabilir hassas yangın dedektörleri ile donatılmış en iyi sonucu elde etmek için kullanın. - Bütün pupa Kanada görüntü için bir düşük büyütme (Örneğin 20 X) objektif lens (Şekil 2A) kullanın. Yağı daldırma 40 X görüntü yara onarım ve beraberindeki inflamatuar yanıt yüksek uzaysal çözünürlük ile sırayla kullanın (NA 1.3) veya (NA 1.4) objektif lensler (bkz. Şekil 2B-Dtemsilcisi görüntüleri) X 63.
- Mikroskop ile ilişkili uygun görüntü yakalama yazılımı açın.
- Görüntü yakalama yazılımı kullanarak, uygun lazerler Örneğin 488 nm ve 561 nm lazerler GFP ve mCherry fluorophores, sırasıyla (ilgili kutulara tıklatarak) görselleştirmek ve lazer güç ayarlamak ve kazanç/ayarlarını vermek için mahsup hesabı açın piksel doygunluk kaçınmak iken yeterli floresan sinyal; En düşük olası lazer güç (aralığı 5-%20) photobleaching ve fototoksisite en aza indirmek için kullanın.
- Her iki tamir yakalamak için epitel ve inflamatuar hücre işe alım, Ayarla denetim masasında; iyi odak ayarlama düğmeleri kullanarak bir z-yığın kaydetmek için mikroskop en iyi sonuçlar için (el ile düğme tıkırtı kullanarak) yazılım kayıt z-dilimlere pupa kanat (her 3 mm en az) aracılığıyla (geçirme hemocytes içeren) altında ekstrasellüler alana epitel yaralı tepesinden büyük bir elde etmek için ayarla z-yığın (50-100 mm aralığında).
- Hızlandırılmış görüntüleme için z-yığınlar düzenli zaman aralıklarında kaydetmek (en az 30 s) en az 1 s sonrası yaralama için.
Not: Fotoğraf-beyazlatma örnekleri kaçınarak ve hızla değişen hücre dinamiği yakalayan arasında bir ticaret-off z-yığınlar seçilmiş tam olarak ne zaman aralığını temsil eder. - Aynı anda birden fazla Pupa (sigara ablated unwounded denetimleri de dahil olmak üzere) görüntü için bir motorlu sahne (mikroskop için ekli) ve düşsel bilgisayar yazılımı içinde bulunan çok pozisyon alma özelliğini kullanın. El ile tek tek her pupa aşaması pozisyon kontrol düğmeleri kullanarak yazılım içinde konumunu ayarlayabilirsiniz ve daha sonra el ile her bireysel pupa uygun z-yığın sınırlarını (üst ve alt).
- Hızlandırılmış görüntüleri görüntü yakalama sırasında veya daha sonra uzman görüntü analiz yazılımı (örneğin, ImageJ32) ile z-yığın tahminlerini veya 3 boyutlu kullanarak görselleştirmek. Örneğin, bireysel hemocytes hareketlerini izledi (olduğu gibi Şekil 2C' ve D'), parça hemocyte çekirdek açık erişim ImageJ tapa-ins "TrackMate" veya "Manuel izleme" ( 33, yayınlanan yöntemleri kullanılarak 34).
- Photoconvertible Probe prob (Kaede30gibi) seçmeli olarak photoconvert için kullanın ve epitelyal veya bağışıklık hücre alt grubunu görüntüleme sırasında etiket.
- Açmak photoconversion gerçekleştirmek için düşsel bilgisayar yazılımı içinde uygun modülleri (gibi sıkı bağlamak, floresans kurtarma fotoğraf ağartma sonra modül) ve 405nm (ilgili yazılım kutusunda tıklatarak) lazer35harekete geçirmek.
- Photoconverted kare, yuvarlak veya serbest seçim aracını kullanarak sıkı bağlamak yazılım içinde olmak için hücreleri seçin. Sıkı bağlamak yazılım içinde zaman-ders photoconversion (Bleaching) için tek bir yineleme/kare ayarlayabilirsiniz ve 405 nm lazer % 20 lazer güç. El ile photoconversion gerçekleştirmek için denemeyi Başlat ' ı tıklatın.
- Sıkı bağlamak modülü ( Closedüğmesini tıklayın) çıkmak ve yazılım içinde orijinal görüntü ekrana dönmek; Kullanım 488 nm ve bir z-yığın ve yukarıdaki gibi hızlandırılmış kayıt ayarlayarak photoconverted ve photoconverted olmayan hücreleri davranışını görüntüye 561 nm lazerler.
Not: Photoconverted sondalar birçok saat (için en az 5 h) zaman içinde takip edilecek photoconverted hücreleri davranışını etkinleştirme ilk photoconversion sonra kararlı kalır. Örneğin, yarada inflamatuar hücreler seçmeli olarak photoconverted (Şekil 2F) olabilir ve yaralanma sitesinden (Şekil 2 g ve H) çözümleyecekleri davranışlarını takip.
Representative Results
Bu iletişim kuralı Drosophila pupa hazırlık yara onarım ve iltihap vivo içindecanlı zaman hata görüntüleme için açıklar. Bu yöntemi kullanarak, birden çok yüksek çözünürlüklü filmler pupa yara kapatma ve inflamatuar hücre işe alım kolaylıkla oluşturmak ve sonrası önemli photobleaching yaralama pupa uzun (en az 5 h) dönemleri için görüntü mümkün olmalıdır.
Drosophila pupa hazırlık için genel bir şeması
Şekil 1 Drosophila pupa vivo içinde görüntüleme için hazırlanması için en uygun yöntemi göstermektedir. Gezinme larva hareketliliği ateşkes ve klişeleşmiş pupa şekliyle kabul beyaz 'prepupae' puparium oluşumu (APF), sonra '0 s' toplanan drosophila nefes ekleri (vızıltısı) onların ön en sonunda ( görünür diplidir Şekil 1A). Beyaz 0 h APF prepupae puparium haline gelmiştir hangi zaman brown (Şekil 1B) ve are o zaman disseke iyi forseps ve/veya microscissors (koruyucu pupa durumu kaldırmak içinŞekil 1 c,) kullanarak 25 ° C'de 18 h için geliştirmek için izin ortaya çıkarmak için Optik yarı saydam pupa (Şekil 1 d) içinde. Diseksiyon, pupa kanatları pupa toraks (mavi, Şekil 1 c-Dözetlenmiştir) ve yan tarafta görünür hale gelir. Bu aşamada, diğer pupa vücut parçaları da gözler, bacaklar ve karın ( Şekil 1 diçinde etiketli olan) da dahil olmak üzere kolayca discernable vardır. Bacakları da yara iltihap çalışmalar için uygundur ve yukarıda açıklanan aynı lazer yöntemiyle yaralı. Birden fazla 18 h APF pupa aynı anda görüntüleme çanak içinde (1E rakamkullanarak heptane tutkal ve su ıslanmış filtre kağıdı su kaybı en aza indirmek için,) kanat (Seviyelendirilmiş mavi) coverslip ( ile temas halinde düz bölümüyle monte edilebilir Rakam 1F); görüntüleme mikroskop tek tek görüntüleme döneminde kaydedilmek üzere birkaç pupa izin vermek için bir motorlu sahne ile donatılmışsa özellikle avantajlıdır. Diseksiyon veya montaj sırasında hasar görmüş herhangi bir pupa atılmalıdır (Örneğin pupa bulunan üçüncü sıra, 1E rakamoku). Diğer vücut parçaları (Örneğin gözleri ve bacaklar, Seviyelendirilmiş pembe) da coverslip iletişim kurabilir ve yaralama için kullanılabilir ve sonraki (Şekil 1F) görüntüleme. Her ne kadar çok sayıda yarası belirlenmesi için ise diğer konumlarda kullanılabilir tek yaralar eğitim deneyler için lazer kaynaklı zararlar genellikle en iyi merkezi olarak kanat (yıldız, Şekil 1F), verdirdi.
Steril yaralama Drosophila pupa kanadında sağlam bir enflamatuar yanıt etkinleştirir
Yara onarım ve beraberindeki inflamatuar yanıt içinde vivo, 18 h APF Drosophila pupa yaralı wings izleyebilmek için confocal hızlandırılmış mikroskobu (Şekil 2A-H) kullanarak görüntüsü. Pupa bu aşamada kanat epiteli basit düz yaprak hücreleri (buraya tek tek hücre sınırları, kanat kenar boşluğu Şekil 2Aözetlenen işaretlemek için GFP öğesini E-cadherin kullanarak etiketli) olan. Unwounded kanatları içinde bile (düşük büyütme, rakamlar 2A ve 2A'), çok sayıda göçmen doğuştan gelen bağışıklık hücreleri (hemocytes, sitoplazmik GFP, yeşil, tahrik srp-Gal4 kullanarak etiketli ve nükleer RFP, macenta) hemolymph () içinde bulundu böcek kan) aradan geçen ekstraselüler yer kaplayan (Şekil 2A ve 2A'). Lazer kaynaklı yaralanma pupa kanat epitel (beyaz, Şekil 2B-Dözetlenen yara kenar) hemocytes (Şekil 2B-D ve bağışıklık hücre çekirdeği Şekil 2B yara sitesine hızlı bir göç uyarır '-D'). O bırakmak gibi hemocytes her ikisi ile etiketleme bir nükleer işaretleyici (Örneğin nükleer RFP 'kırmızı-stinger') birlikte bir sitoplazmik veya hücre iskeleti marker (Örneğin sitoplazmik GFP veya GFP öğesini Moesin) ile özellikle avantajlıdır eş zamanlı izleme hemocyte çekirdeği (için hemocyte davranış Örneğin geçiş hız ve yön otomatik analizi) ve hemocyte morfoloji görselleştirme. İkinci önemli hemocytes nekrotik enkaz phagocytosing olup olmadığını belirlemek için bize izin verir (Şekil 2C, iç metin) yara kenar (veya mikropların enfeksiyon durumunda)12,23 ve ayrıca takip etmemizi sağlar protrusive davranışlarını yara uzak ya da doğru göç gibi onlar iyi filopodia ya da lamellipodia, onların öncü uzatmak gibi.
Basit hemocyte nükleer yörüngeler uygun görüntü analizi yazılım32 kullanarak izleme (Tablo reçetesi) inflamatuar yanıt için daha önce bildirilen benzer karmaşık spatio-zamansal dinamiği gösterir yaralı embriyo9,36 (çok renkli parça, Şekil 2C' ve D'). Yaralama sadece 30 dk içinde en yakın yaralanma siteye bulunan hemocytes yara doğru yönlendirilmiş geçiş başlar (Şekil 2C'). Ancak, giderek artan bir saat sonrası yaralanma, aşamalı olarak bulunan hemocytes daha da uzağa--dan yaralanma yer de yara doğru yönlendirilmiş geçiş başlar (Şekil 2B'). Bu şekilde, dışa doğru yayılır yara kenarından bağışıklık hücre yanıt bir 'dalga', hangi biz yara chemoattractant yaralanma sitesinden difüzyon yansıtacak şekilde öngörülüyor görülmektedir. Bu spatio-temporal bağışıklık hücre dinamikler roman yara cezbedici sinyal (detaylı yöntemleri özelliklerini anlaması için gelişmiş matematiksel modelleme ('Bayesian kesmesi') analiz istihdam bizim yeni çalışma için yararlı bir başlangıç noktası sağlanan 23' te) yayınlandı. (Yara cezbedici degrade hemocyte önyargı için bağlı) bizim Hesaplamalı modelleri gözlenen vivo içinde bağışıklık yörüngeleri sığacak şekilde ayarlama tarafından biri bizim hemocyte yörünge yara cezbedici detaylı özelliklerini ayıklayabilir veri (örneğin, sinyal difüzyon oranı, kaynak ve sinyal üretim süresi)23.
Ayrıca, biz de seçerek bu göçmen kanat hemocytes subpopulation (sözgelimi etiket geçirebildi srp-Gal4 (yeşil, Şekil 2E) kullanarak bağışıklık hücre silsilesi içinde photoconvertible fluorophore Kaede ifade sürüş tarafından Bu yara siteye işe; E, daha önce UV kaynaklı photoconversion ve F, post-photoconversion). Onlar yara sitesinden (oklar, Şekil 2 g ve H) gidermek ve davranışlarını o sigara-photoconverted farkı ne karşılaştırmak o zaman zaman içinde (Eflatun, Şekil 2 g-H) bu hemocytes davranışını takip edebileceğimiz yaralanma sitesine ulaşmak değil hücreler. Biz teknik etiketleme bu vivo içinde yara bir ilk işe hemocytes geçici olarak oluşturulan ikinci bir yara desensitized göstermek için kullanılan fark bu etiketleme tekniği de olabilir, ancak daha sonra23, 90 dakika birçok diğer anlayışlı uygulamanın gelecekte (konuya bakın) vardır.
Bu yaklaşımı kullanarak, biz de aynı anda yara onarım veya konum-epithelialisation spatio-zamansal dinamiği takip edebilirsiniz ' (Şekil 2B-D). Burada ubiquitously ifade GFP öğesini E-cadherin hücresel adherens kavşaklar kanat epitel boyunca etiketleri ve zaman içinde takip edilmesi gereken bireysel epitel hücrelerinin şekiller sağlar. Yara kenarına kolayca GFP etiketli sağlam epitel hücreleri ve etiketsiz enkaz (beyaz kesikli çizgi, Şekil 2B-D) arasında bağlantı olarak tanımlanır. Yaraların çoğunluğu için yaranın içinde 1 h yaralanma ve yara kenar gelişmeler içe doğru (Şekil 2B); yeniden epithelialize başlar Bu büyüklükte yaralar genellikle yaralanma232-3 saat içinde iyileşir. Yara kapatma embriyo ve pupa bir actomyosin contractile kablosu ile birlikte öncü aktin zengini filopodia23,37tarafından tahrik edilmektedir; hücre iskeleti bu dinamikler doğrudan uygun vivo gazetecilere, GFP öğesini spagetti squash (Myosin düzenleyici hafif zinciri) veya GFP öğesini aktin-bağlama Moesin23gibi kullanarak yara onarım sırasında görüntülenir. İçin özellikle büyük bazı yaralar, ancak actomyosin kablo ve öncü filopodia ısrar ediyorsunuz - bu yaralar 'kronik' olmak ve asla tam23 bile çok daha uzun süreler içinde vivo sonra (üzerinde 24 s) yeniden epithelialize görüntüleme. İlginçtir, bu sigara şifa yaralar ile ilişkili inflamatuar yanıt belirgin anormal bağışıklık hücre davranış yararlı bir prognostik marker klinikte olabileceğini düşündüren normal akut yaralar23 ile ilişkili farklıdır . Gelecekte, daha fazla kronik yaralar uzun vadeli görüntüleme (24 h üzerinden) pupa model kullanma içinde vivo Analizi önemli mekanik kavrama içine bu zayıflatıcı durum sağlayabilir.
Resim 1: Drosophila pupa hazırlık yaralama ve canlı görüntüleme. Beyaz prepupae toplanan 0 h APF, ön ucuna sahip(a) Drosophila belirttiği ekleri (vızıltısı) nefes diplidir. (B) beyaz 0 h APF prepupae 25 ° c 18 h için yükseltme sonra puparium kahverengi görünür. Diseksiyon pupa davanın doğru pupa yoktur olarak diplidir vızıltısı tarafından belirtilen en ön bölgesi (ok), başlamalıdır bu bölge ve iyi forseps ve/veya koruyucu pupa durumu (C) kaldırmak için kullanılan microscissors. Pupa kanatları toraks ve pupa (mavi anahatlarını) yan tarafta görünür. (D) pupa dava tamamen 18 h APF pupa kaldırıldı., burada pupa kanat yansıması ile yan yana göstermek için 90 ° mavi özetlenen alındı. (E-F) Beş 18h APF pupa çanak heptane tutkal, suya batırılmış filtre su kaybı (E) en aza indirmek için kağıt ile kullanarak Imaging içinde cam coverslip monte. Pupa (ok) sırada yer alan üçüncü hazırlık sırasında hasar oluştu olarak atılan. Pupa coverslip (F) ile temas kanat (Seviyelendirilmiş mavi) düz bölümüyle monte edilir ve her ne kadar çok sayıda yarası varsa diğer konumlarda kullanılabilir lazer kaynaklı yaralar kanat (yıldız, F), merkezi olarak oluşturulan incelenecektir için. Dokumacılar vd., 201623izniyle uyarlanmıştır (D) resimde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Dinamik vivo içinde analiz doku hasarı ile inflamatuar yanıtın. Koruyucu pupa durumlarda disseke ve cam coverslip(a)monte pupa yaralı ve daha sonra confocal hızlandırılmış mikroskobu (B-H) kullanarak yansıma. Düşük unwounded pupa kanat büyütme görünümünü (A, beyaz özetlenen kanat kenar boşluğu) içeren çok sayıda göçmen hemocytes (A'). Lazer kaynaklı yaralanma pupa kanat epitel ( Drosophila E-cadherin GFP öğesini kullanarak; yara beyaz özetlenen kenar boşluğu etiketliB-D, hücre sınırları) için birden çok hemocytes ( geçirilmesi ile hızlı bir enflamatuar yanıt etkinleştirir SRP-Gal4 ifade nükleer RFP, macenta ve sitoplazmik GFP, yeşil tahrik) yara site (B-D; 25 dilimler 3 mikron her bir projeksiyon olduğu her kare bir hızlandırılmış filmden temsilcisi kareler) doğru. Manuel hemocyte yörüngeleri izlenmesine (çok renkli parça, C' ve D') belirtmek için yaralı embriyo bildirilen inflamatuar yanıt, benzer karmaşık spatio-zamansal dinamiği. Hemocytes Ayrıca nekrotik hücresel enkaz yara yerinde phagocytose (ok ucu, C ve aynı zamanda iç metin). Bağışıklık hücre lineage (yeşil, E, srp-Gal4kullanarak) içinde photoconvertible fluorophore Kaede ifade edilecek differentially (Eflatun, F) etiketli ve takip yara işe hemocytes (ok, E) sağlar zaman içinde yaralanma sitesinden (oklar, G ve H) çözümleyecekleri gibi. Aşağıdaki pupa genotip kullanılmıştır: (A-D) w1118; ubi DE cad GFP srp-Gal4 > UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) ve (E-H) w1118; srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III). Görüntüleri dokumacılar vd., 201623izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Doku hasarı akut inflamatuvar yanıtı nekrotik artıkları ve enfeksiyon mücadele gümrükleme dahil yaralı dokuların onarımı yönetmek için gerekli olan karmaşık ve son derece dinamik bir süreçtir. Tam olarak anlamak ve bu yanıt temel yönlerini çözmek için bu hassas davranış için sırayla 3 boyutlu yaşam örnekleri üzerinde gerçekleştirilen in vivo çalışmalar vardır ve çeşitli etkileşimler soy takip edilecek dahil hücre çok önemlidir doğru bir şekilde zaman içinde. Bu hücre dinamiği gerçek zamanlı analiz daha detaylı karakterizasyonu mutant fenotipleri statik tek zaman noktalarından gelen klasik immünhistokimya teknikleri kullanarak sabit örnekleri sağlar. Geleneksel olarak, genetik olarak uysal Drosophila modelini kullanarak en canlı görüntüleme çalışmaları-si olmak kullanılmış fruitfly geliştirme optik kalınlığı ve daha sonraki gelişim aşamalarında4 ' e göre hareketsizlik nedeniyle embriyonik evre , 5. ancak, son zamanlarda bizim grup ve diğerleri Drosophila pupa yüksek çözünürlüklü ve uzun vadeli inflamasyon ve yara onarım aynı anda görüntüleme gerçekleştirmek için yeni bir model olarak geliştirdik vivo içinde8,22 ,23. Ortaya çıkan bu yaklaşım inflamatuar hücre davranışı çözülen temel yönlerini için heyecan verici bir uzun vadeli potansiyel sunar ve daha fazla (örneğin, Drosophila adiposit diğer hücre soy dinamik davranışı araştırmak için adapte edilebilir 38) doku hasarı takip.
Hazırlık ve yukarıda açıklanan görüntüleme sonuçları kalitesini belirleyecek yaralı Drosophila pupa görüntüleme sırasında bir dizi kritik faktörler vardır. Tartışmalı en zor açıklanan protokolünün dikkatli diseksiyon ve pupa yaralama ve görüntüleme önce hassas konumlandırma adımdır. Pupa gelişimsel bu aşamada son derece kırılgan ve pupa hazırlık aşamaları sırasında bile ufak kaza sonucu hasar önemli ölçüde deneme zarar; Bu hasar inflamatuar hücre davranış başka bir yerde daha fazla yaygın (veya hatta sistemik) etkisi neden olabilir kendi inflamatuar yanıt etkinleştirmek beri kasıtsız zarar sürekli var herhangi bir pupa deneyden atılmalıdır pupa. (Bu dokuların yetişkinlik için hazırlamak için önemli doku düzenlemeler geçiyor) bu deneylerde kullanılan pupa devam eden gelişimi nedeniyle zaman zaman pupa görüntüleme boyunca hareket eder. Pupa yuvarlanmak ancak, büyük olasılıkla pupa doğru kanat (veya yansıması için diğer doku) düz yüzeyle coverglass ile; doğrudan temas halinde monte değil oluşur Pupa kapak camına stabilize etmek heptane yapıştırıcı kullanımı istenmeyen bu hareketin en aza indirmek gerekir. Bu nedenle, büyük bir özenle da örnekleri mikroskoplar arasında taşırken dikkatli bir şekilde hizalanmış konumlarını üzerinden pupa kekii önlemek için alınmalıdır; ideal olarak, yaralama lazer sonraki zaman hata görüntüleme ve fotoğraf dönüştürme için kullanılmak üzere aynı mikroskop iliştirilecektir.
Pupa diseksiyon ve montaj adımları yeterlilik ek olarak kullanılan Drosophila pupa tam genotip oluşturulan görüntüleme veri kalitesi üzerinde önemli bir etkisi olacaktır. Örneğin, Gal4 sürücü ve bireysel bir pupa genotip içinde UAS yapıları (Örneğin UAS GFP veya UAS-Kaede) kopya sayısını izleyen görüntüleme sırasında sinyal-gürültü oranı belirler. Genel bir kural olarak, Gal4 veya UAS daha fazla kopyasını hediye, büyük doku floresan protein (Örneğin GFP veya Kaede) Toplam düzeyini oluşturmak. Floresan protein optimum düzeyde ancak, yeterince yüksek kaliteli görüntüleme (alt lazer gücü, photobleaching azalma kullanmanızı ve genişletilmiş zaman içinde görüntüleme izin vermek için yükseltme doku floresans arasında dikkatli bir denge olacak dönemleri) ama fluorophore indüklenen hücresel toksisite; neden olmadan Gal4 ve UAS yapıları her denemede en uygun sayısı belirli sürücüleri ve kullanılan fluorophores göre değişir. Gal4-UAS sistem sıcaklık duyarlı ve daha düşük sıcaklık31, etkisiz olacak çünkü 25 ° C (veya üzerinde 29 ° C'ye kadar) pupa yetiştirmeye özen gösterilmelidir. Doku üzerinde kontrol ek düzeyleri veya ifade tahrik Gal4 -zaman-özgüllük elde etmek için Gal4-UAS sistem önleyici Gal80 da içinde pupa genotip39dahil edilebilir. Gal80 Gal4 etkinliği (doku özel Gal80 kullanarak) belirli bir doku içinde veya belirli bir zamanda bastırmak için de kullanılabilir (bir sıcaklık kullanarak hassas Gal80). Gal4-UAS sistem daha fazla ile diğer bağımsız ikili sistemler (LexA -lexAop ve QF -QUAS sistemleri gibi) birden çok yapıları (Örneğin fluorophores, RNAi satırları olan Drosophila oluşturmak için kombine edilebilir veya diğer genetik yapıları) aynı anda bir dizi farklı dokuların39dile getirdi.
Bu yeni Drosophila pupa model kullanımı daha geleneksel embriyo yaklaşım avantajlar sunmaktadır. Kısa vadeli görüntüleme (en çok 3 saat) göre (hangi çalışmalar yaralama en embriyonik aşamada yapılmaktadır) sahne 15 embriyo mevcuttur Pupa (içinde asıl yetişkinlik sonra pupa gelişiminin 96 h kadar önemli ölçüde daha uzun süreler boyunca görüntüsü ). Ayrıca, hemocytes (Drosophila doğuştan gelen bağışıklık hücreleri) çok daha büyük sayıda bulunmaktadır daha sınırlı sayıda embriyo içinde mevcut pupa dokularda mevcut (ve görüntüleme için kullanılabilir) kıyasla ve bu bizi toplamaya izin verdi önemli ölçüde daha fazla hemocyte davranışı numuneler aynı toplam sayısını kullanarak verileri görüntüleme. En önemlisi, bu, buna karşılık, bize hemocytes davranışını analiz ve yara cezbedici ve aksi deneysel olarak kalırdı inflamatuar yanıt roman özellikleri ayıklamak için daha karmaşık matematiksel modelleme uygulamak için sağlamıştır ulaşılmaz23. Bu gen RNAi aracılı nakavt aşamalarında doku veya ikili sistem öyle aynı derecede Gal4-UAS sistemi kullanarak zaman özel gen inactivation gelişmiş analiz izin daha erken embriyonik, önemli ölçüde daha verimli pupa modelin başka bir yararı olduğunu 39. RNAi verimliliği bu aşamada, böylece büyük ölçüde (veya hatta tarafsız Genom-geniş) gerçekleştirmek potansiyeline açar RNAi ekranlarında yeni oyuncular yara onarım veya inflamatuar hücre davranışı yer aramak için.
Ancak, Drosophila pupa açıkça embriyonik genetik mutasyonlar sonucu fenotipleri çalışmaya kullanılamaz öldürücü; RNAi aracılı gen nakavt zaman veya doku özgü şekilde geliştirme yoluyla pupa aşamalara gerçekleşmesi için izin vermediği sürece fonksiyonel ve canlı görüntüleme çalışmaları embriyonik geliştirme için gerekli olan genlerin embriyo, bu nedenle hala yapılması gerekiyor. Embriyo de eğitim için seçim ve canlı görüntü modeli kalır bağışıklık hücre davranış, kökenlerine bağışıklık hücreleri gelişimsel dağılma, iletişim-hareket inhibisyonu ve fagositoz apoptotik ceset de dahil olmak üzere belirli özellikleri gelişimsel doku henüz pupa modellerinde gözlenen değil5,8 heykel sırasında oluşturulan. Drosophila larva ve yetişkin araştırmaları yara onarım ve inflamasyon40,41,42,43, altında yatan mekanizmaları içine önemli bir fikir vermiş olsa da Bu aşamalar 44 canlı görüntüleme çalışmaları örnekleri doğal olarak mobil yapısı nedeniyle zor kanıtlamıştır. Larva canlı görüntüleme kısa süreler izin vermek için anestezi iken, anestezi geçici doğası nedeniyle, sadece kısa anlık görüntülerini canlı yara onarım veya inflamatuar yanıt görüntülenmeyecektir45olabilir. Yeni yapılan bir çalışmada şimdi önemli ölçüde daha embriyo veya pupa zorlu hazırlık ve hala Imaging kalır, ancak uzun vadeli görüntüleme larva yara46, şifa veren bir geliştirilmiş iletişim kuralı geliştirmiştir. Vadede, biz bu belirli her soru, bu farklı Drosophila aşamalar - embriyo larva ve pupa dönemi yetişkinliğe (her biri aracılığıyla gelen dört çalışmalarda adresi için en uygun gelişim sahne kullanarak öngörülüyor kendi benzersiz avantajları ve sınırlamalar) - inflamasyon ve yara tamir sürüş moleküler ve hücresel mekanizma tamamlayıcı içgörüler sağlayacaktır.
Gelecekte, yaralama ve Drosophila pupa uzun vadeli görüntüleme için bu protokolü olayları inflamasyon-ilgili bir dizi çalışmaya kolayca adapte edilebilir ve iltihaplı yara yanıtının açığa çıkarmak yeni özellikler için geniş kapsamlı potansiyeline sahiptir. Photoconvertible fluorophores (örneğin, Kaede), uygulama ile birlikte uzun süreli görüntüleme bileşimidir doğuştan gelen bağışıklık hücre davranış dinamiklerini anlamak için çok değerli ve özellikle, çok daha az çözünürlük aşaması anladım yara inflamatuar yanıt. Özellikle bireysel ya da bağışıklık hücreleri (örneğin, bu işe bir yara için) altgrupları etiketleme tarafından nasıl etkiler (örneğin, bir ceset veya yaralanma) bir çevre işaret maruz bağışıklık hücre sonraki yanıt-e doğru bir daha sonra analiz etmek mümkün olacak işaret. Drosophila hemocytes inflamatuar davranışını önceki deneyimleri ile değiştirilebilir - Örneğin, onlar doku yaralanması için yanıt vermek için apoptotik cesetleri önceki fagositoz tarafından geliştirme12 sırasında astarlanmalıdır ama bunu göreceğiz ister çevre diğer yardımlar benzer astar olaylar neden. Çalışmalar, pupa yaralar doğuştan gelen inflamatuar yanıt üzerinde odaklanmıştır, pupa kanat modeli de her iki canlı görüntü için ideal bir fırsat sağlar ve epitel yara onarım altında yatan mekanizmaları incelemek. Ayrıca, bu pupa görüntüleme yöntemi aynı zamanda yanıt olarak doku hasarı38, pupa kanat veya diğer kolayca erişilebilir pupa doku (gözler, bacaklar veya toraks gibi) diğer hücre soy dinamik davranışı araştırmak için adapte. Son olarak, Drosophila genetik tractability uzun vadeli pupa görüntüleme kolaylığı ile birlikte birleştirerek, roman epitel onarım veya inflamatuar düzenleyiciler tarafsız genom çapında knock aşağı uygulanması yoluyla açığa olabilir yaklaşıyor.
Disclosures
Yazarlar onlar ilgi rakip çakışma var bildirin.
Acknowledgments
Martin, Nobes, Richardson ve ahşap labs yararlı tartışma için teşekkür etmek istiyorum. Wolfson Bioimaging tesis (University of Bristol, İngiltere), Bloomington stok merkezi (Indiana Üniversitesi, ABD) ve Viyana Drosophila Kaynak Merkezi ( Drosophila stokları) ve Flybase (için güncel Drosophila ayrıca teşekkür ediyoruz gen ek açıklama). Bu çalışma saatleri arasında MRC proje desteği tarafından desteklenen ve WW (Bay/J002577/1), bir hoş geldiniz güven kıdemli bursu için WW ve bir hoş geldiniz güven araştırmacı Ödülü saatleri arasında.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila stocks | |||
| ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII) |
Kyoto Stock Center, DGRC | #109007 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
| ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III) |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #58742 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
| ubiquitous GFP-tagged Moesin P{sGMCA}3.1 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #59023 | The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T. |
| hemocyte specific serpent-Gal4 driver ;srp-Gal4; |
Generated by Katja Bruckner | Generated by Katja Bruckner | Expression of Scer\GAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004). |
| UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #8545 or #8547 | UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal |
| UAS-cytoplasmicGFP ;;P{UAS-GFP.S65T} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | Multiple stocks available (e.g. #1522) | Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness. |
| UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #26161 | Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV. |
| GFP-tagged spaghetti squash w1118;;P{sqh-GFP.RLC} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #57145 | The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:Avic\GFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ingredients for fly food media | Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.) | ||
| maize | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| soya flour | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| malt extract | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| molasses | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| Difco agar | BD Biosciences, Fisher Scientific | DF0142-15-2 | For preparation of fly food |
| Propionic acid | Sigma | 402907 | For preparation of fly food |
| Nipagen | Sigma | 79721 | For preparation of fly food |
| Dried baker's yeast | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | For preparation of fly food |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample preparation and mounting | |||
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | For preparation of heptane glue |
| Fine sable paintbrush | Daler-Rowney (or equivalent) | #0 or 1 | |
| Forceps | Fisher Scientific (or Fine Science Tools) | NC9404145 | Dumont #5 |
| Glass bottomed dishes for imaging | MatTek | P35G-0-10-C | We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment. |
| Heptane | Sigma | 51730-5ML | For preparation of heptane glue |
| Double sided sticky tape (e.g. Scotch) | Agar Scientific | AGG263 | For preparation of heptane glue |
| 50ml tube (for heptane glue) | Falcon tubes from Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparation of heptane glue |
| Glass microscope slides | Agar Scientific | AGL4244 | For dissection of Drosophila pupae |
| Dissecting stereo microscope with brightfield | Leica (or equivalent) | M50 | For dissection of Drosophila pupae |
| Microscissors | John Weiss International | 103123 | Miniature Research Scissors (straight) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser ablation and imaging | |||
| Nitogen ablation laser | Spectra-Physics (or Andor equivalent) | Model VSL-337ND-S | For wounding, this should be attached to a widefield imaging system |
| Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) | Leica (or equivalent) | TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) | Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal) |
| Environmental chamber | Life Imaging Services (or equivalent) | "Microscope Temperature Control System" | Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image Analysis Software | |||
| FRAP software module | Leica (or equivalent) | CLSM FRAP software module | For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede |
| ImageJ (image analysis software) | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012. |
| ImageJ plugin "Manual Tracking" | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.net/Manual_Tracking | |
| ImageJ plugin "TrackMate" | ImageJ, NIH | https://imagej.net/TrackMate | Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081 |
| Volocity (high performance 3D imaging software) | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | For image analysis |
| IMARIS (image analysis software) | Bitplane | IMARIS for Cell Biologists | For image analysis |
References
- Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration. Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Martin, P., Nunan, R. Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing. British Journal of Dermatology. 173 (2), 370-378 (2015).
- Razzell, W., Wood, W., Martin, P. Swatting flies: modelling wound healing and inflammation in Drosophila. Disease Model and Mechanism. 4 (5), 569-574 (2011).
- Wood, W., Martin, P. Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly. Development Cell. 40 (3), 221-233 (2017).
- Mohr, S. E., Smith, J. A., Shamu, C. E., Neumüller, R. A., Perrimon, N. RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 591-600 (2014).
- Muñoz-Soriano, V., López-Domenech, S., Paricio, N. Why mammalian wound-healing researchers may wish to turn to Drosophila as a model. Experimental Dermatology. 23 (8), 538-542 (2014).
- Weavers, H., Wood, W. Creating a Buzz about Macrophages: The Fly as an In Vivo Model for Studying Immune Cell Behavior. Developmental Cell. 38 (2), 129-132 (2016).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. Journal of Cell Biology. 168 (4), 567-573 (2005).
- Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biolog. 173 (3), 405-416 (2006).
- Razzell, W., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Calcium flashes orchestrate the wound inflammatory response through DUOX activation and hydrogen peroxide release. Current Biology. 23 (5), 424-429 (2013).
- Weavers, H., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Corpse Engulfment Generates a Molecular Memory that Primes the Macrophage Inflammatory Response. Cell. , (2016).
- Stramer, B., Winfield, M., Shaw, T., Millard, T. H., Woolner, S., Martin, P. Gene induction following wounding of wild-type versus macrophage-deficient Drosophila embryos. EMBO Reports. 9 (5), 465-471 (2008).
- Matsubayashi, Y., Coulson-Gilmer, C., Millard, T. H. Endocytosis-dependent coordination of multiple actin regulators is required for wound healing. Journal of Cell Bioliogy. 210 (3), 419-433 (2015).
- Evans, I. R., Rodrigues, F. S. L. M., Armitage, E. L., Wood, W. Draper/CED-1 Mediates an Ancient Damage Response to Control Inflammatory Blood Cell Migration In Vivo. Current Biology. 25 (12), 1606-1612 (2015).
- Zanet, J., Stramer, B., Millard, T., Martin, P., Payre, F., Plaza, S. Fascin is required for blood cell migration during Drosophila embryogenesis. Development. 136 (15), 2557-2565 (2009).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Ninov, N., Martín-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nature Protocols. 2 (12), 3074-3080 (2007).
- Gho, M., Bellaïche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126 (16), 3573-3584 (1999).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Berh, D., Scherzinger, A., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C., Risse, B. Automatic non-invasive heartbeat quantification of Drosophila pupae. Computers in Biology and Medicine. 93, 189-199 (2018).
- Sander, M., Squarr, A. J., Risse, B., Jiang, X., Bogdan, S. Drosophila pupal macrophages--a versatile tool for combined ex vivo and in vivo imaging of actin dynamics at high resolution. European Journal of Cell Biology. 92 (10-11), 349-354 (2013).
- Weavers, H., Liepe, J., Sim, A., Wood, W., Martin, P., Stumpf, M. P. H. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26 (15), 1975-1989 (2016).
- Fristrom, D., Wilcox, M., Fristrom, J. The distribution of PS integrins, laminin A and F-actin during key stages in Drosophila wing development. Development. 117 (2), (1993).
- Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Development Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
- Berg, H. Random Walks in Biology. , Princeton University Press. Available from: http://press.princeton.edu/titles/112.html (1993).
- Diehl, H., Ihlefield, H., Schwegler, H. Physik fur Biologen. , Springer-Verlag. (1991).
- Stewart, P. S., McFeters, G. A., Huang, C. T. Biofilm control by antimicrobial agents. Biofilms II Process Analysis and Application. , 373-405 (2000).
- Milo, R., Phillips, R. Cell Biology by the Numbers. , Garland Science. Available from: https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1 (2015).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceeding of National Academy of Science U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Cordelières, F. Manual tracking. National Institutes of Health. , Available from: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2015).
- Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Grueber, W., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biology. 173 (3), 405-416 (2006).
- Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
- Franz, A., Wood, W., Martin, P. Fat Body Cells Are Motile and Actively Migrate to Wounds to Drive Repair and Prevent Infection. Developmetal Cell. 44 (4), 460-470 (2018).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2012).
- Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and Cell Fusion Contribute to Wound Healing in the Adult Drosophila Epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science U S A. 105 (29), 10017-10022 (2008).
- Galko, M. J., et al. Cellular and Genetic Analysis of Wound Healing in Drosophila Larvae. PLoS Biology. 2 (8), e239 (2004).
- Brock, A. R., et al. Transcriptional regulation of Profilin during wound closure in Drosophila larvae. Journal of Cell Science. 125 (23), (2013).
- Wu, Y., Brock, A. R., Wang, Y., Fujitani, K., Ueda, R., Galko, M. J. A blood-borne PDGF/VEGF-like ligand initiates wound-induced epidermal cell migration in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (17), 1473-1477 (2009).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila Larvae to Study Epidermal Wound Closure and Inflammation. Methods in Molecular Biology. 1037, 449-461 (2013).
- Kakanj, P., et al. Insulin and TOR signal in parallel through FOXO and S6K to promote epithelial wound healing. Nature Communications. 7, 12972 (2016).
