Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vivo में Drosophila प्यूपा के भीतर भड़काऊ कोशिका गतिशीलता की ट्रैकिंग लंबी अवधि

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,4
1School of Biochemistry, Biomedical Sciences, University of Bristol, 2School of Cellular and Molecular Medicine, Biomedical Sciences, University of Bristol, 3MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh, Queens Medical Research Institute, 4School of Physiology, Pharmacology, and Neuroscience, Biomedical Sciences, University of Bristol

Summary

यहाँ हम लाइव इमेजिंग घाव मरम्मत और vivo मेंउच्च spatio-लौकिक समाधान पर जुड़े भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि Drosophila विकास के pupal चरण का उपयोग करने के लिए दीर्घकालिक इमेजिंग सक्षम और समय के साथ विशिष्ट कोशिका आबादी की ट्रैकिंग और कुशल RNAi-मध्यस्थता जीन निष्क्रियता के साथ संगत है ।

Abstract

ऊतक क्षति के लिए तेजी से भड़काऊ प्रतिक्रिया के दौरान, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं को जल्दी चोट साइट के लिए भर्ती कर रहे हैं । घाव पर एक बार, जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं ऐसे संक्रमण से लड़ने के रूप में आवश्यक कार्यों, की एक संख्या प्रदर्शन, गल मलबे समाशोधन, और मैट्रिक्स जमाव उत्तेजक । आदेश में पूरी तरह से विविध संकेतन घटनाओं है कि इस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित समझने के लिए, यह (और बातचीत है कि के बीच होने के जटिल व्यवहार का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है) vivo में एकाधिक सेल वंश, और वास्तविक समय में, उच्च के साथ spatio-लौकिक संकल्प । ऑप्टिकल translucency और Drosophila भ्रूण की आनुवंशिक पथ की एक अमूल्य मॉडल के रूप में Drosophila की स्थापना की है जीने की छवि और काटना के तंत्र सहित भड़काऊ कोशिका व्यवहार के बुनियादी पहलुओं, विकासात्मक फैलाव, अपोप्तोटिक लाशों और/या माइक्रोबियल रोगजनकों की मंजूरी, और घावों को भर्ती । हालांकि, अधिक हाल के काम अब दिखा दिया है कि Drosophila जीवन चक्र में एक बहुत बाद में मंच को रोजगार- Drosophila pupa-बेहतर RNAi दक्षता, अब इमेजिंग अवधि सहित अलग लाभ, की एक संख्या प्रदान करता है, और काफी अधिक प्रतिरक्षा सेल संख्या । यहाँ हम इमेजिंग घाव की मरम्मत और लाइव Drosophila प्यूपा में उच्च spatio-लौकिक संकल्प पर जुड़े भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. दोनों पुनः epithelialization और सूजन की गतिशीलता का पालन करने के लिए, हम दोनों उपकला और जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए vivo फ्लोरोसेंट मार्करों में विशिष्ट की एक संख्या का उपयोग करें । हम भी विशिष्ट प्रतिरक्षा कक्ष सबसेट का पालन करने के लिए, उनके व्यवहार को ट्रैक करने के लिए, और से हल करने के लिए, चोट साइट, जैसे Kaede के रूप में फोटो-परिवर्तनीय fluorophores की प्रभावशीलता का प्रदर्शन ।

Introduction

एक कुशल और प्रभावी भड़काऊ प्रतिक्रिया किसी भी जीव को संक्रमण, स्पष्ट मलबे से लड़ने के लिए निर्णायक है, और घायल ऊतकों की मरंमत का उद्घोष1। हालांकि इस प्रतिक्रिया सबसे ऊतक नुकसान का एक अपरिहार्य परिणाम है, सूजन सख्त विनियमन की आवश्यकता है क्योंकि एक अनुपयुक्त भड़काऊ प्रतिक्रिया विभिन्न मानव रोगों की एक किस्म से जोड़ा गया है (जीर्ण गैर चिकित्सा घावों सहित, अत्यधिक scarring, और कैंसर के लिए गड़बड़ी)1,2,3। इस नैदानिक प्रासंगिकता को देखते हुए, यह आणविक और सेलुलर तंत्र की एक और अधिक विस्तृत समझ प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है भड़काऊ प्रतिक्रिया ड्राइविंग क्रम में नए शकुन संकेतकों और रणनीति विकसित करने के लिए पुरानी भड़काऊ की एक सीमा का इलाज शर्तों, जो लंबे समय तक और अनावश्यक सूजन से ऊतकों की मरंमत की रक्षा कर सकते हैं ।

हाल के वर्षों में, Drosophila एक अच्छी तरह से स्थापित और मूल्यवान मॉडल प्रणाली भड़काऊ प्रतिक्रिया की बुनियादी सुविधाओं काटना मानव4,5के लिए कीड़ों से संरक्षित हो गया है । वर्तमान में, Drosophila (जैसे चूहों या zebrafish के रूप में) अन्य प्रयोगात्मक मॉडल में वर्तमान में संभव है की तुलना में अभी तक अधिक से अधिक आनुवंशिक पथ प्रदान करता है, vivo में सटीक spatio-लौकिक आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति (निष्क्रिय करने के लिए या पर एक परिभाषित विकासात्मक समय बिंदु पर विशिष्ट कोशिका प्रकार के भीतर ब्याज की किसी भी जीन एक्सप्रेस) और जीनोम चौड़ा स्क्रीन6,7में आसानी । परंपरागत रूप से, Drosophila में घाव भरने और सूजन के सबसे रहते इमेजिंग अध्ययन भ्रूण चरणों में प्रदर्शन किया गया है, के रूप में ( Drosophila लार्वा या वयस्कों के विपरीत) और ऑप्टिकली पारदर्शी जो सक्षम बनाता है vivo इमेजिंग8 में अद्वितीय उच्च रिज़ॉल्यूशन । यह शोधकर्ताओं ने Drosophila जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तेजी से और मजबूत भर्ती की कल्पना करने की अनुमति दी है (hemocytes) घाव साइट करने के लिए यांत्रिक या लेजर प्रेरित चोट के जवाब में भ्रूण उपकला9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. इन जीने-आनुवंशिक हेरफेर के साथ इमेजिंग अध्ययन के संयोजन से, Drosophila भ्रूण में अध्ययन कई महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा कोशिका प्रोटीन है कि vivo मेंभड़काऊ सेल व्यवहार नियंत्रण खुला है । उदाहरण के लिए, सीईडी-1 homolog ड्रेपर (एक आईटम डोमेन प्रोटीन युक्त) एक महत्वपूर्ण ' क्षति रिसेप्टर ' है कि एक एच2ओ2में प्रतिरक्षा कोशिकाओं Drosophila भर्ती मध्यस्थता के रूप में पहचान की गई है-निर्भर तरीके की साइटों के लिए नुकसान१५. प्रतिरक्षा कोशिकाओं के भीतर ड्रेपर स्तर कैल्शियम प्रेरित JNK संकेतन और अपोप्तोटिक लाश के नीचे की और ऊपर ऊंचा12द्वारा विनियमित बारी में हैं । Hemocyte गतिशीलता आगे के लिए घाव की दिशा में समंवय के लिए जटिल cytoskeletal परिवर्तन की आवश्यकता है और यह इस तरह के actin bundling प्रोटीन Fascin16 और Rho परिवार के रूप में cytoskeletal नियामकों की गतिविधि पर निर्भर है छोटे GTPases आरएसी और Rho9.

Drosophila एक holometabolous कीट है कि अतिरिक्त लार्वा और pupal embryogenesis के बाद चरणों के माध्यम से चला जाता है, वयस्कता17तक पहुंचने से पहले है । Drosophila pupa गैर इनवेसिव लाइव के लिए एक अतिरिक्त मॉडल के रूप में विकसित किया गया है गतिशील सेलुलर घटनाओं की एक किस्म की इमेजिंग, विकासात्मक सेल प्रवास सहित18, सेल डिवीजन19, सेल विकास20, और मांसपेशी संकुचन21. हाल ही में, यह एक उपंयास मॉडल है जिसमें घाव की मरंमत और vivo मेंसूजन की गतिशीलता22,23का अध्ययन करने के लिए के रूप में स्थापित किया गया है ।

बस भ्रूण चरणों में के रूप में, Drosophila प्यूपा अपने अपारदर्शी pupal मामलों18से सावधान विच्छेदन के बाद, मोबाइल और ऑप्टिकली पारदर्शी हैं । इस ऑप्टिकल पारदर्शिता का दोहन करके, एक सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के में vivo व्यवहार का पालन कर सकते हैं (hemocytes) Drosophila pupal ऊतकों के भीतर ऊतक क्षति के जवाब में, इस तरह के pupal विंग22के रूप में. विंग परिधि के आसपास जुड़े हुए हैं कि दो बड़े फ्लैट उपकला चादरें से मिलकर, pupal विंग एक सरल bilayered संरचना के रूप में मौजूद है; इन दो उपकला परतों के बीच extracellular अंतरिक्ष hemolymph (कीट रक्त) और बड़ी संख्या में gram hemocytes24से भर जाता है. बस के रूप में भ्रूण, यांत्रिक या लेजर पंख उपकला को प्रेरित चोट चोट साइट23के लिए hemocytes की एक तेजी से भर्ती से चलाता है । हालांकि, इस pupal चरण पहले भ्रूण चरणों पर इमेजिंग के लिए कुछ अलग लाभ प्रदान करता है । घायल प्यूपा अब तक समय अवधियों पर imaged किया जा सकता है (कम से 5 ज के लिए), अधिक ऊतक क्षेत्र प्रयोगात्मक गड़बड़ी के लिए उपलब्ध है (जैसे कई घावों की पीढ़ी के रूप में) और इस स्तर पर मौजूद hemocytes के काफी अधिक संख्या में हैं ( गणितीय विश्लेषण के दौरान बेहतर सांख्यिकीय शक्ति के लिए आगे की दूरी से अधिक सेल पथ प्रदान करना). इसके अलावा, RNAi की दक्षता-मध्यस्थता जीन निष्क्रियता काफी pupal चरणों में सुधार हुआ है, की अनुमति कई जीन ' हो खटखटाया-नीचे ' एक ऊतक या समय विशेष तरीके से अधिक परंपरागत भ्रूण के पूरे उत्परिवर्ती दृष्टिकोण की तुलना में ।

आदेश में घाव फिर से epithelialization और इस नए pupal मॉडल के भीतर भड़काऊ प्रतिक्रिया के साथ की गतिशीलता का पालन करने के लिए, दो अलग सेल आबादी लेबल किया जाना चाहिए: pupal उपकला और सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं (Drosophila hemocytes) । विभिंन मार्करों के एक नंबर (सामग्री की मेज) के लिए इन दो अलग सेल आबादी लेबल उपलब्ध हैं-मार्कर का चुनाव विशेष प्रक्रिया पर निर्भर करता है का अध्ययन किया जाएगा । pupal उपकला को चिह्नित करने के लिए, Drosophila लाइनों या तो एक बैरे व्यक्त GFP-टैग ई-cadherin (कि लेबल adherens जंक्शनों) नियमित रूप से सेल मार्जिन की स्थिति, या वैकल्पिक रूप से इंगित करने के लिए उपयोग किया जाता है, एक GFP-टैग Actin-Moesin के बंधन डोमेन (है कि Actin cytoskeleton लेबल) के लिए घाव धार सिकुड़ा Actin अंगूठी और प्रमुख बढ़त की दखलंदाजी कल्पना । के लिए Drosophila hemocytes, एक hemocyte-विशिष्ट एसआरपी Gal425 परमाणु आरएफपी की अभिव्यक्ति ड्राइव (परमाणु ट्रैकिंग के लिए), cytoplasmic GFP या GFP-टैग Moesin लेबल (कोशिका द्रव्य या actin cytoskeleton, क्रमशः लेबल के लिए) या एक photoconvertible fluorophore (जैसे Kaede) का उपयोग किया जाता है । वास्तव में, यह अक्सर संयोजन में एकाधिक प्रतिरक्षा सेल मार्कर का उपयोग करने के लिए लाभप्रद है, परमाणु आंदोलन और सेल आकृति विज्ञान के एक साथ विश्लेषण सक्षम करने के लिए (प्रतिनिधि परिणाम देखें) । हालांकि, के बाद से इस प्रोटोकॉल Drosophila प्यूपा का उपयोग शामिल है, आनुवंशिक मार्करों के केवल संयोजन है कि जब तक व्यवहार्य है मध्य pupal चरणों का उपयोग किया जा सकता है । इसके अलावा, भ्रूण घातक शेयरों उपयुक्त नहीं होगा । यह एक समस्या होने की संभावना नहीं है जब इमेजिंग नियंत्रण (या जंगली प्रकार) प्यूपा पर विचार करना महत्वपूर्ण है जब जीन के लिए नीचे खटखटाया जा रहा है या व्यक्त, घाव बंद करने या सूजन पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए । जल्दी जीन पछाड़ना (या एक्सप्रेस) की वजह से घातकता के मामले में, एक Gal80टीएस निर्माण के लिए Gal4 प्रेरित पछाड़ना बाद में विकास में प्रेरित किया जा सकता है (चर्चा देखें) ।

हमारे हाल के अध्ययनों में, pupal चरण में चल रहा है हमें पर्याप्त प्रतिरक्षा कोशिका पथ डेटा इकट्ठा करने के लिए परिष्कृत गणितीय मॉडलिंग, जो बारी में हमें घाव के उपंयास विवरण deduce करने की अनुमति दी है का उपयोग भड़काऊ व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए सक्षम है भड़काऊ आकर्षित23संकेत । उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण से पता चला कि घाव chemoattractant धीरे सूजन ऊतक के माध्यम से फैलता है २०० माइक्रोन2लैंडलाइंस, एक दर तक धीमी से पहले सुझाव दिया छोटे उम्मीदवार अणुओं जैसे एटीपी या एच2ओ2 के रूप में करने के लिए सूचित कर रहे हैं 26,27,28,29फैलाना; इन छोटे "नुकसान" अणुओं के बजाय स्वतंत्र संकेतों के रूप में कार्य करने की संभावना है । इसके अलावा, जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के दीर्घकालिक व्यवहार का पालन के रूप में वे एक प्रारंभिक घाव से दूर समाधान और एक दूसरे को उजागर कर रहे है (पहले के बाद विभिंन timepoints पर बना), हम एक ' अस्थाई ' ' संवेदनशील अवधि के दौरान खुला है जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं बाद की चोटों के लिए अंधे हैं23. pupal मॉडल की दीर्घकालिक इमेजिंग क्षमता का दोहन करके, एक साथ है Drosophila आनुवंशिक पथ के साथ, एक विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के व्यवहार का पालन कर सकते है (जैसे ही उन प्रतिरक्षा कोशिकाओं को घाव साइट पर भर्ती के रूप में) बाद अपमान के लिए उत्तर, photoconvertible fluorophore30 जो विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिका23वंश के भीतर व्यक्त किया जा सकता का उपयोग कर ।

यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए घाव की मरंमत की गतिशीलता कल्पना और उच्च spatio-लौकिक Drosophila प्यूपा का उपयोग कर संकल्प पर जुड़े भड़काऊ प्रतिक्रिया । हम प्रारंभिक प्यूपा तैयारी के लिए आवश्यक चरणों को कवर करने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान (विच्छेदन और बढ़ते) और बाद में लेजर मध्यस्थता घायल और समय-चूक इमेजिंग. हम भी vivo मेंविशिष्ट प्रतिरक्षा सेल सबसेट के लेबलिंग की अनुमति के लिए फोटो-परिवर्तनीय fluorophores के उपयोग का वर्णन । लंबी अवधि में, हम कल्पना है कि इस नए Drosophila pupal मॉडल जटिल संकेतन गतिशीलता ऊतक क्षति के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया अंतर्निहित विच्छेदन के लिए रोमांचक संभावनाएं खुल जाएगा । और अधिक परिष्कृत सांख्यिकीय विश्लेषण एक प्रतिक्रिया है कि अंयथा प्रयोग दुर्गम, whilst सुधार RNAi क्षमता के भीतर जीनोम चौड़ा स्क्रीनिंग के आवेदन को उधार दे सकता है की सुविधाओं को उजागर कर सकता है लागू करने से vivo में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को प्रतिरक्षा सेल व्यवहार को विनियमित उपंयास खिलाड़ियों की पहचान ।

Protocol

इस प्रोटोकॉल चार मुख्य अनुक्रमिक चरणों के होते हैं: (1) Drosophila स्टॉक्स और Drosophila प्यूपा के मचान की तैयारी, (2) Pupal विच्छेदन और बढ़ते, (3) घायल Pupal, (4) vivo समय-चूक फोकल इमेजिंग में ।

1. Drosophila स्टॉक्स और प्यूपा के मचान की तैयारी

  1. उपयुक्त Drosophila स्टॉक्स प्राप्त करें (परिचय और सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. उपयुक्त जीनोटाइप के युवा स्वस्थ वयस्क मक्खियों लीजिए ।
    1. एक संग्रह की शीशी के लिए उपयुक्त जीनोटाइप या लिंग के मक्खियों को स्थानांतरित करने के लिए मक्खियों और एक ठीक तूलिका को संक्षेप में anesthetize करने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड गैस पैड का उपयोग करके वयस्क मक्खियों का चयन करें ।
    2. 20 कुंवारी महिलाओं और प्रत्येक मानक मक्खी खाद्य मीडिया युक्त शीशी (एक cornmeal-गुड़-आगर मिश्रण, सामग्री की तालिकादेखें) खमीर के साथ पूरक के लिए 20 पुरुषों जोड़ें ।
  3. इष्टतम pupal पीढ़ी के लिए, टिप वयस्क ताजा शीशियों में नए भोजन पर प्रत्येक दिन मक्खियों, 25 डिग्री सेल्सियस पर सभी शीशियों रखने.
    नोट: यदि Gal4-यूएएस प्रणाली31 वंश-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, सभी कदम 25 डिग्री सेल्सियस या ऊपर, पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए के रूप में Gal4-यूएएस प्रणाली के तापमान संवेदनशील है ।
  4. 18 ज अनुसूचित इमेजिंग सत्र से पहले, कम से चयन 10 नव गठित सफेद पूर्व प्यूपा (चित्रा 1a) शीशियों से (यानी puparium गठन के बाद 0 एच, APF) संदंश या एक ठीक तूलिका का उपयोग करने के लिए आंतरिक शीशी सतह से प्यूपा को उखाड़ फेंकना और एक साफ खाली प्लास्टिक की शीशी की ओर करने के लिए सावधानी प्यूपा स्थानांतरण ।
    नोट: 3rd instar लार्वा घूमते हुए pupation से गुजरने के लिए भोजन के माध्यम से ऊपर की ओर क्रॉल करते हैं; नवगठित सफेद prepupae आसानी से पहचाने जाते हैं क्योंकि वे everted पूर्वकाल spiracles के अधिकारी हैं और (3rd instar लार्वा के विपरीत) स्थिर हैं । छल्ली ' puparium ' (pupal मामले) जो शुरू में नरम और सफेद17है में बदल जाता है । देखभाल प्यूपा हानिकारक से बचने के लिए लिया जाना चाहिए, क्योंकि यह न केवल एक अवांछित चोट प्रेरित भड़काऊ प्रतिक्रिया करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, लेकिन यह भी एक महत्वपूर्ण विकासात्मक देरी करने के लिए.
  5. उपयुक्त विकास चरण के लिए चयनित प्यूपा आयु (18 एच APF इष्टतम परिणाम देंगे) 25 डिग्री सेल्सियस पर शीशी में ।
    नोट: के रूप में प्यूपा विकसित, pupal मामले उत्तरोत्तर गहरा और अधिक भंगुर हो जाएगा ।
  6. अगले कदम के लिए समय से आगे के लिए अन्य रिएजेंट तैयार करते हैं । हेप् गोंद बनाने के लिए, एक ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में 20 मिलीलीटर हेप् के साथ डबल पक्षीय टेप लुढ़का के एक 20 सेमी लंबाई गठबंधन, आयल फिल्म और बेंच पर रातोंरात कमरे के तापमान पर चट्टान के साथ सील ।

2. Drosophila प्यूपा की तैयारी और विच्छेदन

  1. एक गिलास स्लाइड पर घुड़सवार डबल पक्षीय चिपचिपा टेप का एक टुकड़ा करने के लिए स्टेज्ड Drosophila प्यूपा स्थानांतरण । प्यूपा की स्थिति इतनी है कि ventral पक्ष दृढ़ता से टेप करने के लिए अटक गया है और पृष्ठीय पक्ष ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है (आंकड़ा 1b).
    नोट: pupa के पूर्वकाल pupal मामले के पूर्वकाल अंत से फैलाया दो spiracles से पहचाने जाने योग्य हो जाएगा ।
  2. सावधानीपूर्वक संदंश और माइक्रो-कैंची (आंकड़ा 1b-D) का उपयोग करके एक brightfield विच्छेदन माइक्रोस्कोप के अंतर्गत अपने सुरक्षात्मक puparium आवरण से प्यूपा निकालें ।
    1. शुरू में, पूर्वकाल में एक चीरा बनाने-संदंश (आंकड़ा 1b) का उपयोग कर puparium के अधिकांश क्षेत्र । सुनिश्चित करें कि इस क्षेत्र में pupal मामला खोखला और pupal ऊतक से रहित है क्योंकि प्यूपा जल्दी pupal विकास के दौरान मामले के भीतर सिकुड़ जाएगा ।
    2. इस प्रारंभिक चीरा के बाद, ध्यान से आंसू या pupal संदंश या microscissors (चित्रा 1C) का उपयोग कर दिशा के लिए एक पूर्वकाल में खुला मामला काट जब तक pupa ब्राउन अपारदर्शी भंगुर आवरण से पूरी तरह मुक्त है (1 डी आंकड़ा) ।
      नोट: इस स्तर पर प्यूपा बहुत नाजुक है और देखभाल के लिए pupal सतह puncturing से बचने के लिए लिया जाना चाहिए; puncturing स्पष्ट है के रूप में hemolymph जल्दी से पंचर साइट से बाहर लीक । हालांकि छोटे, पंचर के साथ प्यूपा छोड़ दिया जाना चाहिए ।
  3. एक गिलास तली हुई डिश में प्यूपा माउंट हेप् गोंद का उपयोग कर ।
    1. एक 20 मिलीलीटर पिपेट टिप का प्रयोग करें पूर्व की एक 10 मिलीलीटर बूंद-हेप् गोंद (ऊपर धारा १.६ देखें) कांच के नीचे पकवान पर एक पंक्ति में जगह है ।
    2. गोंद की अनुमति दें 5 एस के लिए सूखी संदंश (चित्रा 1E) का उपयोग हेप् गोंद पर ध्यान से विच्छेदित प्यूपा स्थानांतरित करने से पहले ।
    3. घायल और इमेजिंग की आसानी के लिए, एक पंक्ति में प्यूपा लाइन; लगभग 5 प्यूपा का सुझाव दिया है लेकिन अधिक अनुभव के साथ प्रबंध किया जाएगा ।
      नोट: हेप् गोंद के उपयोग की सिफारिश की है जब ईमानदार इमेजिंग प्रणालियों का उपयोग कर रहा है लेकिन आवश्यक नहीं है जब एक औंधा प्रणाली का उपयोग कर । यदि गोंद इमेजिंग के दौरान ऑप्टिकल विचलन बनाता है, प्यूपा बजाय coverglass पर सीधे रखा जा सकता है-pupal ऊतक और कांच के बीच प्राकृतिक आसंजन स्थिर इमेजिंग के लिए ज्यादातर मामलों में पर्याप्त हो जाएगा, जब तक देखभाल लिया जाता है जब इमेजिंग चलती सूक्ष्मदर्शी के बीच पकवान ।
  4. सबसे अच्छा परिणाम के लिए, प्यूपा माउंट इतना है कि पंख coverglass (चित्रा 1F) के साथ सीधे संपर्क में पंख की सतह के बहुमत के साथ coverglass पर फ्लैट है । प्यूपा संदंश का उपयोग कर अपनी स्थिति को बदलने के लिए विंग सुनिश्चित करने के लिए रोल सही ढंग से घुड़सवार है ।
  5. इमेजिंग अवधि के दौरान नमूना निर्जलीकरण को रोकने के लिए, बढ़ते के अंत में कांच तली हुई पकवान के पक्ष में शोषक फिल्टर आसुत पानी में लथपथ कागज का एक टुकड़ा जोड़ने के लिए, प्यूपा (चित्रा 1E) परेशान नहीं किया जा रहा सावधान । एक ढक्कन के साथ पकवान कवर ।
    नोट: प्यूपा अब घाव और इमेजिंग के लिए तैयार हैं ।

3. लेजर प्रेरित Drosophila Pupal पंख के घायल

  1. स्वरित्र लेजर पृथक प्रणाली से सुसज्जित एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के लिए घुड़सवार प्यूपा युक्त ग्लास तली हुई डिश हस्तांतरण ।
    1. का प्रयोग करें एक स्पंदित-यूवी एयर कूल्ड नाइट्रोजन-पंप पृथक लेजर ४३५ एनएम के लिए देखते-11विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें; रोशनी के लिए इस्तेमाल किया प्रकाश की सटीक तरंग दैर्ध्य एक उपयुक्त डाई सेल के माध्यम से उपयोगकर्ता द्वारा चुना जाता है ।
  2. brightfield प्रकाशिकी का उपयोग करना, माइक्रोस्कोप स्टेज नियंत्रण समायोजित करने के लिए पहले pupa के pupal विंग का पता लगाने के लिए घायल हो (चित्रा 1F).
  3. इष्टतम परिणामों के लिए, एक तेल विसर्जन 40X या दोनों इमेजिंग और लेजर पृथक के लिए 63X उद्देश्य लेंस का उपयोग करें; सुनिश्चित करें कि विसर्जन तरल इस्तेमाल किया (तेल या ग्लिसरॉल) पृथक और इमेजिंग प्रणालियों के बीच संगत है । pupal पंख उपकला के निकटतम कांच coverslip के विमान पर ध्यान केंद्रित करने के लिए माइक्रोस्कोप को समायोजित करें (अर्थात , घाव होने के लिए उपकला के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित) ठीक फोकस नियंत्रण घुंडी का उपयोग कर.
  4. माइक्रोस्कोप चरण समायोजन का उपयोग करना, pupal विंग की स्थिति ताकि क्षेत्र को घायल किया जा करने के लिए सीधे पृथक लेजर के ज्ञात लक्ष्य क्षेत्र के साथ संरेखित है.
  5. पृथक प्रकाश की शक्ति के स्तर को मैन्युअल रूप से समायोजित करने के लिए माइक्रोस्कोप करने के लिए सज्जित एक ऊर्जा घनत्व क्षीणन स्लाइड का प्रयोग करें ।
    नोट: क्षीणन स्लाइडर क्लिक बंद हो जाता है और क्षीणन के सापेक्ष स्तर की पहचान और reproducible सेटिंग्स के उपयोग की अनुमति के लिए फैसलों है.
  6. एक बाहरी मैनुअल ट्रिगर नियंत्रण का उपयोग करना, एक घाव बनाने के लिए ट्रिगर के एक संक्षिप्त क्लिक का उपयोग कर पृथक लेजर सक्रिय करें । पृथक साइट पर क्षणिक हवा बुलबुला की उपस्थिति के लिए जांच के बाद से घायल आम तौर पर यह साथ होगा । लेजर प्रेरित घायल pupal उपकला कल्पना करने के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट फिल्टर का उपयोग सफल रहा है, तो जाँच करें.
    नोट: ध्यान रखना लेजर बीम के लिए आकस्मिक जोखिम से बचने के रूप में बीम प्रतिबिंब गंभीर आंख या त्वचा क्षति पैदा कर सकता है ।
  7. अगर घायल असफल है, फोकल विमान बदलती है (माइक्रोस्कोप के ऊपर या वर्तमान फोकल स्तर से नीचे थोड़ा ध्यान केंद्रित चलती) और पृथक ट्रिगर के एक क्लिक दोहराएं । वैकल्पिक रूप से, जब तक वांछित घाव का आकार प्राप्त हो जाता है धीरे से लेजर शक्ति क्षीणन स्लाइड का उपयोग बढ़ा ।
  8. पृथक लेजर पल्स पुनरावृत्ति दर बदलती है, रियर नियंत्रण कक्ष पर दोहराव दर घुंडी का उपयोग करें (जो कम से 1 पल्स/एस अप करने के लिए ६० हर्ट्ज से दर परिवर्तन). इष्टतम घाव भरने के लिए, पल्स पुनरावृत्ति दर सेट करने के लिए ४० हर्ट्ज.
  9. अलग आकार घाव उत्पन्न करने के लिए, पृथक प्रकाश की शक्ति के स्तर को मैन्युअल रूप से समायोजित करने के लिए ऊर्जा घनत्व क्षीणन स्लाइड का उपयोग करें ।
  10. घुड़सवार प्यूपा के सभी घाव से बचना और जख्मी नियंत्रण के रूप में इन गैर ablated प्यूपा का उपयोग करें ।
  11. सुसंगत परिणामों के लिए, नियमित रूप से पृथक प्रणाली (प्रासंगिक संचालन मैनुअल का उपयोग करके) फिर से संरेखित करें । इसके अलावा, स्वच्छ और डाई प्रतिध्वनित सेल कि लेजर उत्पादन तरंग दैर्ध्य को नियंत्रित करता है फिर से भरना ।

4. में Vivo समय चूक फोकल इमेजिंग

  1. जल्दी समय के लिए एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप के लिए ग्लास तली हुई डिश हस्तांतरण-चूक इमेजिंग ।
    नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, एक उच्च विनिर्देश फोकल या कताई डिस्क सूक्ष्मदर्शी संवेदनशील डिटेक्टरों कि दोनों GFP और mCherry fluorophores का पता लगा सकते है के साथ सुसज्जित का उपयोग करें ।
  2. पूरे pupal विंग की छवि के लिए, एक कम आवर्धन (जैसे 20X) उद्देश्य लेंस (चित्रा 2a) का उपयोग करें । छवि घाव की मरंमत और उच्च स्थानिक संकल्प के साथ भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए आदेश में, तेल विसर्जन 40X (na १.३) या 63X (na १.४) उद्देश्य लेंस का उपयोग करें (देखें प्रतिनिधि छवियों में चित्र b-D) ।
  3. उपयुक्त छवि पर कब्जा माइक्रोस्कोप के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर खोलें ।
  4. छवि कैप्चर सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, उपयुक्त पराबैंगनीकिरण पर बारी उदा ४८८ एनएम और ५६१ एनएम पराबैंगनीकिरण GFP और mCherry fluorophores कल्पना करने के लिए, क्रमशः (प्रासंगिक बक्से में क्लिक करके) और लेजर शक्ति और लाभ समायोजित/ पर्याप्त फ्लोरोसेंट संकेत whilst पिक्सेल संतृप्ति से परहेज; सबसे कम संभव लेजर शक्ति का प्रयोग करें (रेंज में 5-20%) photobleaching और phototoxicity को कम करने के लिए ।
  5. दोनों की मरंमत उपकला और भड़काऊ सेल भर्ती पर कब्जा करने के लिए, नियंत्रण कक्ष पर ठीक फोकस समायोजन knobs का उपयोग कर एक जेड-स्टैक रिकॉर्ड करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट; इष्टतम परिणामों के लिए, सॉफ्टवेयर सेट (मैनुअल बटन क्लिकों का उपयोग कर) pupal विंग के माध्यम से z-स्लाइस रिकॉर्ड करने के लिए (न्यूनतम हर 3 मिमी), नीचे extracellular अंतरिक्ष के माध्यम से घायल उपकला के ऊपर से (युक्त hemocytes) को प्राप्त करने के लिए एक बड़ी z-स्टैक (५०-१०० मिमी की श्रेणी में) ।
  6. समय-चूक इमेजिंग के लिए, नियमित समय अंतरालों पर रिकॉर्ड z-स्टैक्स (न्यूनतम हर 30 s) कम से 1 h के बाद जख्मी ।
    नोट: चुने गए z-स्टैक्स के बीच सटीक समय अंतराल तेजी से बदलती हुई कक्ष गतिशीलता पर कब्जा करने और नमूनों के फोटो-ब्लीचिंग से बचने के बीच एक व्यापार-बंद का प्रतिनिधित्व करता है ।
  7. एक साथ छवि एकाधिक प्यूपा के लिए (गैर ablated घाव नियंत्रण सहित), एक मोटर चालित चरण का उपयोग करें (माइक्रोस्कोप के साथ संलग्न) और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के भीतर उपलब्ध बहु-स्थिति अधिग्रहण सुविधा. मैन्युअल स्तर स्थिति नियंत्रण knobs का उपयोग कर सॉफ्टवेयर के भीतर प्रत्येक व्यक्ति pupa की स्थिति सेट और फिर मैन्युअल प्रत्येक व्यक्ति pupa के लिए उचित z-स्टैक सीमा (ऊपर और नीचे) सेट.
  8. छवि कैप्चर के दौरान या बाद में विशेषज्ञ छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (जैसे ImageJ३२) के साथ z-स्टैक अनुमानों या 3-डी रेंडरिंग का उपयोग करके समय-व्यतीत छवियों को विज़ुअलाइज़ करना. उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत hemocytes के आंदोलनों का अनुसरण करने के लिए ( चित्र 2c' और डी 'के रूप में), ओपन एक्सेस ImageJ प्लग इन "TrackMate" या "मैनुअल ट्रैकिंग" ( ३३में प्रकाशित तरीकों का उपयोग करके hemocyte नाभिक ट्रैक करें, ३४) ।
  9. चुनिंदा photoconvert और इमेजिंग के दौरान उपकला या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के एक सबसेट लेबल करने के लिए (जैसे Kaede30) photoconvertible जांच का उपयोग करें ।
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के भीतर उपयुक्त मॉड्यूल खोलने के लिए photoconversion प्रदर्शन (जैसे frap है, फोटो ब्लीचिंग मॉड्यूल के बाद प्रतिदीप्ति वसूली) और 405nm लेजर सक्रिय (प्रासंगिक सॉफ्टवेयर बॉक्स में क्लिक करके)३५।
    2. वर्गाकार, वृत्ताकार या मुक्तहस्त चयन टूल का उपयोग करके frap है सॉफ़्टवेयर के भीतर photoconverted जाने के लिए कक्षों का चयन करें. frap है सॉफ्टवेयर के भीतर, photoconversion (ब्लीचिंग) के लिए एकएकल पुनरावृत्ति/फ्रेम और 20% लेजर शक्ति पर ४०५ एनएम लेजर सेट के लिए समय पाठ्यक्रम निर्धारित किया है । मैंयुअल रूप से क्लिक photoconversion करने के लिए प्रयोग प्रारंभ करें ।
    3. बाहर निकलें frap है मॉड्यूल (क्लिक करें बंद) और सॉफ्टवेयर के भीतर मूल इमेजिंग स्क्रीन पर लौटने; ऊपर के रूप में एक जेड-ढेर और समय चूक रिकॉर्डिंग की स्थापना करके photoconverted और गैर photoconverted कोशिकाओं के व्यवहार को छवि के लिए ४८८ एनएम और ५६१ एनएम पराबैंगनीकिरण का प्रयोग करें ।
      नोट: Photoconverted जांच प्रारंभिक photoconversion के बाद कई घंटे के लिए स्थिर रहते हैं, Photoconverted कोशिकाओं के व्यवहार को सक्षम करने के लिए समय पर पीछा किया (कम से 5 ज के लिए) । उदाहरण के लिए, घाव में सूजन कोशिकाओं को चुनिंदा photoconverted (चित्रा 2F) और उनके व्यवहार के रूप में वे चोट साइट से हल कर सकते है (चित्रा 2 जी और एच) ।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का वर्णन है Drosophila प्यूपा की तैयारी के लिए लाइव समय चूक इमेजिंग के घाव की मरंमत और vivo मेंसूजन । इस विधि का उपयोग करना, यह pupal घाव बंद करने और आसानी से भड़काऊ सेल भर्ती के कई उच्च संकल्प फिल्में उत्पन्न करने के लिए संभव होना चाहिए और लंबे समय अवधि के लिए प्यूपा छवि के लिए और महत्वपूर्ण photobleaching के बिना पोस्ट-जख्मी.

Drosophila pupa तैयारी हेतु एक सामान्य योजना

चित्र 1 Drosophila प्यूपा के लिए vivo इमेजिंग में तैयार करने के लिए इष्टतम विधि दिखाता है । Drosophila सफेद ' prepupae ' puparium गठन (APF) के बाद ' 0 एच ' पर एकत्र होते हैं, क्योंकि रेंगने वाले लार्वा गतिशीलता के साथ संघर्ष करते हैं और pupal श्वास everted (उपांग) के साथ बाहुबली spiracles आकार को अपना पूर्वकाल-सबसे अंत में दिखाई देते हैं ( चित्र 1a) । सफेद 0 एच APF prepupae 25 डिग्री सेल्सियस पर 18 ज के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है, जिसके द्वारा समय puparium भूरा हो गया है (आंकड़ा 1b) और फिर ठीक संदंश और/या microscissors का उपयोग कर विच्छेदित कर रहे हैं (चित्रा 1C, सुरक्षात्मक pupal मामले को दूर करने के लिए) प्रकट करने के लिए (चित्रा 1 डी) के भीतर ऑप्टिकली पारदर्शी pupa । विच्छेदन के बाद, pupal पंख pupal छाती के पार्श्व पक्षों पर दिखाई देंगे (नीले, चित्र 1C-डीमें उल्लिखित) । इस स्तर पर, अंय pupal शरीर के अंगों को भी आसानी से आंखें, पैर, और पेट सहित समझदार हैं, ( 1 डी चित्रामें लेबल) । पैर भी घाव सूजन अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं और ऊपर वर्णित एक ही लेजर विधि का उपयोग कर जख्मी किया जा सकता है । एकाधिक 18 एच APF प्यूपा इमेजिंग डिश के भीतर एक साथ रखा जा सकता है (चित्रा 1E, हेप् गोंद का उपयोग कर और एक पानी से लथपथ फिल्टर कागज निर्जलीकरण को कम करने के लिए) विंग के flattest भाग के साथ (नीले रंग) के साथ संपर्क में coverslip ( चित्रा 1F); यह विशेष रूप से लाभप्रद है अगर इमेजिंग माइक्रोस्कोप एक मोटर की अवस्था के साथ सुसज्जित करने के लिए कई प्यूपा एक एकल इमेजिंग अवधि के दौरान दर्ज की अनुमति है । किसी भी प्यूपा है कि विच्छेदन या बढ़ते के दौरान क्षतिग्रस्त हो गया है छोड़ दिया जाना चाहिए (उदाहरण के क्रम में तीसरे स्थित pupa, चित्रा 1Eमें तीर) । अंय शरीर के अंगों (जैसे आंखें और पैर, उल्लिखित गुलाबी) भी coverslip संपर्क कर सकते है और घाव और बाद इमेजिंग (चित्रा 1एफ) के लिए उपलब्ध हैं । एक घाव का अध्ययन प्रयोगों के लिए, लेजर प्रेरित नुकसान आम तौर पर सबसे अच्छा विंग (तारांकन चिह्न, चित्रा 1F) में केंद्रीय रूप से दण्डित कर रहे हैं, हालांकि अन्य स्थानों का उपयोग किया जा सकता है अगर कई घावों का अध्ययन किया जा करने के लिए कर रहे हैं.

बाँझ घाव Drosophila pupal विंग में एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया सक्रिय करता है

आदेश में घाव की मरंमत और vivo में भड़काऊ प्रतिक्रिया के साथ पालन करने के लिए, 18h APF Drosophila प्यूपा के घायल पंख फोकल समय चूक माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2a-एच) का उपयोग कर imaged थे । इस pupal चरण में, विंग epithelia कोशिकाओं के सरल फ्लैट चादरें (GFP का उपयोग कर लेबल-टैग ई-cadherin व्यक्तिगत कोशिका सीमाओं को चिह्नित करने के लिए, विंग मार्जिन चित्रा 2aमें उल्लिखित) । यहां तक कि घायल पंखों में (कम आवर्धन, आंकड़े 2a और 2a '), प्रवासी जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बड़ी संख्या (hemocytes, एसआरपी का उपयोग कर लेबल -Gal4 चालित cytoplasmic GFP, हरा, और परमाणु आरएफपी, रानी) hemolymph के भीतर पाए जाते है ( कीट रक्त) के हस्तक्षेप extracellular अंतरिक्ष (चित्रा 2a और 2a) पर कब्जा । लेजर प्रेरित चोट pupal विंग उपकला (घाव सफेद में उल्लिखित मार्जिन, चित्रा बी-डी) घाव साइट के लिए hemocytes के तेजी से प्रवास को उत्तेजित करता है (चित्रा बी-डी और चित्रा बी में प्रतिरक्षा कोशिका नाभिक '-डी ') । एक cytoplasmic या cytoskeletal मार्कर (जैसे cytoplasmic GFP या GFP टैग Moesin) के साथ संयोजन में दोनों एक परमाणु मार्कर (जैसे परमाणु आरएफपी ' लाल-दंश ') के साथ hemocytes लेबलिंग विशेष रूप से लाभप्रद है के रूप में यह अनुमति देता है hemocyte नाभिक के एक साथ ट्रैकिंग (hemocyte व्यवहार के स्वचालित विश्लेषण के लिए जैसे माइग्रेशन गति और दिशात्मकता) और hemocyte आकृति विज्ञान के दृश्य । बाद महत्वपूर्ण है क्योंकि यह हमें यह निर्धारित करने की अनुमति देता है कि क्या hemocytes phagocytosing का मलबा (चित्रा 2c, इनसेट) घाव के किनारे पर (या रोगाणु संक्रमण के मामले में)12,23 और भी हमें का पालन करने की अनुमति देता है उनके दखल व्यवहार के रूप में वे अपनी अग्रणी धार में ठीक filopodia या lamellipodia का विस्तार के रूप में वे की ओर पलायन से या दूर जा रहा है ।

उचित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर३२ (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर hemocyte परमाणु पथ की सरल ट्रैकिंग जटिल spatio-भड़काऊ प्रतिक्रिया के लौकिक गतिशीलता को दर्शाता है, कि पहले के लिए रिपोर्ट के समान घायल भ्रूण9,३६ (बहु रंग की पटरियों, चित्रा 2c' और डी ') । घायल के सिर्फ 30 मिनट के भीतर, hemocytes चोट साइट के निकटतम स्थित घाव (चित्रा 2c) की ओर निर्देशित माइग्रेशन शुरू करते हैं । हालांकि, समय के बाद बढ़ती चोट के साथ, hemocytes स्थित उत्तरोत्तर और चोट साइट से दूर भी घाव (चित्रा 2d') की दिशा में माइग्रेशन निर्देशित शुरू करते हैं । इस तरह, प्रतिरक्षा कोशिका जवाबदेही है कि घाव किनारे से बाहर फैल जाता है की एक ' लहर ' मनाया जाता है, जो हम चोट साइट से दूर घाव chemoattractant के प्रसार को प्रतिबिंबित करने के लिए कल्पना । इन spatio-लौकिक प्रतिरक्षा कोशिका गतिशीलता हमारे हाल के अध्ययन के लिए एक उपयोगी प्रारंभिक बिंदु प्रदान की है कि नियोजित परिष्कृत गणितीय मॉडलिंग (' Bayesian अनुमान ') विश्लेषण के लिए घाव आकर्षित संकेत के उपंयास गुणों का अनुमान (विस्तृत तरीकों 23में प्रकाशित) । हमारे गणनात्मक मॉडल (जो घाव को आकर्षित करने के लिए hemocyte पूर्वाग्रह से जुड़ा हुआ) vivo प्रतिरक्षा पथ में मनाया फिट करने के लिए, एक हमारे hemocyte पथ से आकर्षित घाव की विस्तृत विशेषताओं को निकालने सकता है डेटा (जैसे संकेत प्रसार दर, स्रोत, और संकेत उत्पादन की अवधि)23.

इसके अलावा, प्रतिरक्षा कोशिका के भीतर photoconvertible fluorophore Kaede की अभिव्यक्ति ड्राइविंग द्वारा एसआरपी का उपयोग वंश -Gal4 (ग्रीन, चित्रा 2E) हम भी चुनिंदा इन प्रवासी विंग hemocytes के एक उपजनसंख्या लेबल करने में सक्षम है (जैसे उन घाव साइट पर भर्ती; ई, से पहले यूवी प्रेरित photoconversion और एफ, पोस्ट-photoconversion) । हम तो समय के साथ इन hemocytes के व्यवहार का पालन कर सकते है (रानी, चित्रा 2g-h) के रूप में वे घाव स्थल से दूर समाधान (तीर, चित्रा 2 जी और एच) और तुलना कैसे उनके व्यवहार उन गैर photoconverted से अलग है वे कक्ष जो चोट स्थल तक नहीं पहुंचते । हम vivo लेबलिंग तकनीक में यह प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया है कि hemocytes एक प्रारंभिक घाव के लिए भर्ती अस्थायी रूप से एक दूसरे घाव उत्पन्न करने के लिए संवेदनशील हैं ९० मिनट बाद में23, हालांकि इस अंतर लेबलिंग तकनीक भी भविष्य में कई अंय व्यावहारिक अनुप्रयोगों है (चर्चा देखें) ।

इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम भी एक साथ घाव की मरंमत के spatio-लौकिक गतिशीलता का पालन कर सकते है या कर रहे है-epithelialisation ' (चित्रा बी-डी) । यहां बैरे व्यक्त GFP-टैग की गईं ई-cadherin विंग उपकला भर में सेलुलर adherens जंक्शनों लेबल और व्यक्तिगत उपकला कोशिकाओं के आकार समय पर पीछा किया जा करने के लिए अनुमति देता है. घाव एज आसानी से बरकरार GFP-लेबल उपकला कोशिकाओं और unलेबल्ड मलबे (सफेद डैश्ड रेखा, चित्रा बी-डी) के बीच जंक्शन के रूप में पहचाना जाता है । घावों के बहुमत के लिए, घाव की चोट के 1 ज के भीतर फिर से epithelialize शुरू होता है और घाव एज अग्रिम (चित्रा 2d); इस आकार के घावों आम तौर पर23चोट के 2-3 ज के भीतर चंगा होगा । दोनों भ्रूण और प्यूपा में घाव बंद एक actomyosin सिकुड़ा केबल अग्रणी बढ़त actin-अमीर filopodia23,३७के साथ एक साथ संचालित है; इन cytoskeletal गतिशीलता सीधे घाव की मरंमत में उपयुक्त का उपयोग कर के दौरान visualized किया जा सकता है जैसे GFP-टैग स्पेगेटी स्क्वैश (मायोसिन विनियामक प्रकाश श्रृंखला) या GFP-टैग actin-बाध्यकारी Moesin23। कुछ विशेष रूप से बड़े घावों के लिए, तथापि, actomyosin केबल और अग्रणी एज filopodia नहीं बनी रहती है-इन घावों बन ' क्रोनिक ' और कभी नहीं पूरी तरह से पुन:23 epithelialize के बाद भी बहुत लंबी अवधि (पर 24 ज) vivo में इमेजिंग. दिलचस्प है, भड़काऊ प्रतिक्रिया इन गैर चिकित्सा घावों के साथ जुड़े स्पष्ट रूप से अलग है कि सामान्य तीव्र घावों के साथ जुड़े23 सुझाव है कि असामान्य प्रतिरक्षा सेल व्यवहार क्लिनिक में एक उपयोगी शकुन मार्कर हो सकता है . भविष्य में, आगे vivo पुराने घावों के विश्लेषण में लंबी अवधि के इमेजिंग का उपयोग कर (पर 24 ज) pupal मॉडल में इस दुर्बल हालत में महत्वपूर्ण यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान हो सकता है ।

Figure 1
चित्र 1: Drosophila pupa और सजीव-इमेजिंग के लिए तैयार है । (क) Drosophila सफेद prepupae 0 एच APF में एकत्र, पूर्वकाल अंत के साथ everted श्वास उपांग (spiracles) द्वारा संकेत दिया । (ख) 25 डिग्री सेल्सियस पर 18 ज के लिए सफेद 0h APF prepupae स्थापना के बाद, puparium भूरे रंग दिखाई देता है । pupal मामले के विच्छेदन पूर्वकाल में शुरू करना चाहिए अधिकांश क्षेत्र (तीर), everted spiracles द्वारा संकेत के रूप में pupa उचित इस क्षेत्र से अनुपस्थित है, और ठीक संदंश और/या microscissors सुरक्षात्मक pupal मामले को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया (सी) । pupal पंख pupal छाती (नीली रूपरेखा) के पार्श्व पक्षों पर दिखाई देगा । (घ) Pupal मामले पूरी तरह से 18h APF pupa से हटा दिया, यहां pupa को पार्श्व पक्ष दिखाने के लिए ९० ° लुढ़का दिया गया है, पंख के साथ नीले रंग में उल्लिखित imaged हो । (E-F) पांच 18h APF प्यूपा इमेजिंग डिश के भीतर ग्लास coverslip पर घुड़सवार हेप् गोंद का उपयोग कर, पानी से लथपथ फिल्टर कागज के साथ निर्जलीकरण को कम करने के लिए (ई) । Pupa में स्थित तीसरे क्रम (तीर) को छोड़ दिया जाना चाहिए के रूप में नुकसान की तैयारी के दौरान हुई । प्यूपा विंग के flattest भाग के साथ बढ़ रहे हैं (नीले रेखांकित) coverslip के साथ संपर्क में (च) और लेजर प्रेरित घावों केंद्रीय विंग में उत्पन्न कर रहे हैं (तारक, एफ), हालांकि अन्य स्थानों का उपयोग किया जा सकता है अगर कई घाव कर रहे हैं का अध्ययन किया जाए । (घ) में छवि बुनकरों एट अल., २०१६23से अनुमति के साथ अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: vivo ऊतक क्षति के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया के विश्लेषण में गतिशील । प्यूपा सुरक्षात्मक pupal मामलों से विच्छेदित और ग्लास coverslip पर घुड़सवार (एक) जख्मी कर रहे है और बाद में फोकल समय चूक माइक्रोस्कोपी (बी एच) का उपयोग कर छवि । जख्मी pupal विंग (एक, सफेद में उल्लिखित विंग मार्जिन) जिसमें प्रवासी hemocytes (ए') की बड़ी संख्या शामिल हैं, के कम आवर्धन दृश्य । pupal विंग उपकला के लिए लेजर प्रेरित चोट (बी डी, सेल GFP-टैग Drosophila ई-cadherin का उपयोग लेबल की सीमाओं; सफेद में उल्लिखित घाव मार्जिन) एकाधिक hemocytes के प्रवास के साथ एक तेजी से भड़काऊ प्रतिक्रिया को सक्रिय करता है ( एसआरपी-Gal4 के परमाणु आरएफपी, रानी और cytoplasmic GFP, हरे रंग की अभिव्यक्ति प्रेरित) घाव साइट की ओर (B-D; एक समय-चूक फिल्म है जिसमें प्रत्येक फ्रेम 25 स्लाइस 3 माइक्रोन प्रत्येक के एक प्रक्षेपण से प्रतिनिधि फ्रेम) । hemocyte पथ के मैनुअल ट्रैकिंग (बहु रंग पटरियों, सी ' और डी ') भड़काऊ प्रतिक्रिया के जटिल spatio-लौकिक गतिशीलता, कि घायल भ्रूण के लिए रिपोर्ट के समान संकेत मिलता है । Hemocytes भी घाव स्थल (arrowhead, सी और भी इनसेट) में phagocytoseी सेलुलर मलबे । प्रतिरक्षा कोशिका वंश में photoconvertible fluorophore Kaede की अभिव्यक्ति (ग्रीन, ई, एसआरपी Gal4का उपयोग) सक्षम बनाता है घाव-भर्ती hemocytes (तीर, ई) को अंतर से लेबल (रानी, एफ) और उसके बाद समय के साथ के रूप में वे चोट साइट से हल (तीर, जी और एच) । निम्नलिखित pupal पादी का उपयोग किया गया: (A-D) w१११८; यूबीआई-डी-सीएडी-GFP, एसआरपी-Gal4 > यूएएस-GFP (II); यूएएस-nRFP (III) और (E-H) w१११८; एसआरपी-Gal4 (II); यूएएस-Kaede (III). छवियों बुनकरों एट अल., २०१६23से अनुमति के साथ अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

ऊतक क्षति के लिए तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया एक जटिल और अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है कि घायल ऊतकों की मरंमत का उद्घोष करने के लिए आवश्यक है, जिसमें गल चुके मलबे की निकासी और संक्रमण के खिलाफ लड़ाई शामिल है । को पूरी तरह से समझते है और इस प्रतिक्रिया के बुनियादी पहलुओं को जानने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि अध्ययन 3 पर vivo में प्रदर्शन कर रहे है आयामी रहने के नमूने के लिए सटीक व्यवहार और विभिंन सेल वंशावली शामिल की बातचीत के लिए पीछा किया जा सही समय के साथ । इन सेल गतिशीलता के वास्तविक समय विश्लेषण की अनुमति देता है एक अधिक विस्तृत लक्षण उत्परिवर्ती phenotypes की तुलना में स्थिर एकल समय-अंक से क्लासिक immunohistochemistry तकनीकों का उपयोग कर निर्धारित नमूनों । परंपरागत रूप से, सबसे अधिक रहते इमेजिंग आनुवंशिक रूप से परितंत्रीय Drosophila मॉडल का उपयोग कर अध्ययन अपने ऑप्टिकल translucency और बाद में विकास के चरणों की तुलना में गतिहीनता के कारण fruitfly विकास के भ्रूण चरण का इस्तेमाल किया है4 , 5. हालांकि, अधिक हाल ही में हमारे समूह और दूसरों को एक उपंयास मॉडल के रूप में Drosophila pupa विकसित किया है उच्च संकल्प और घाव की मरंमत और सूजन के दीर्घकालिक इमेजिंग प्रदर्शन के साथ ही vivo में8,22 ,23. इस उभरते दृष्टिकोण भड़काऊ कोशिका व्यवहार के बुनियादी पहलुओं को जानने के लिए एक रोमांचक दीर्घकालिक क्षमता प्रदान करता है और आगे अंय कोशिका वंश के गतिशील व्यवहार की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (जैसे Drosophila adipocytes ३८) के बाद ऊतक चोट ।

वहां तैयारी और घायल Drosophila प्यूपा कि इमेजिंग परिणामों की गुणवत्ता का निर्धारण करेगा ऊपर वर्णित इमेजिंग के दौरान महत्वपूर्ण कारकों में से एक नंबर रहे हैं । यकीनन वर्णित प्रोटोकॉल के सबसे कठिन कदम सावधान विच्छेदन और प्यूपा की सटीक स्थिति से पहले घायल और इमेजिंग है । इस विकास के चरण में प्यूपा अत्यंत नाजुक है और भी तैयारी चरणों के दौरान प्यूपा को मामूली आकस्मिक क्षति काफी प्रयोग ख़राब होगा; किसी भी प्यूपा है कि लगातार अनैच्छिक नुकसान हो सकता है प्रयोग से खारिज किया जाना चाहिए के बाद से इस नुकसान अपनी भड़काऊ प्रतिक्रिया है, जो और अधिक व्यापक प्रसार करने के लिए नेतृत्व हो सकता है (या यहां तक कि प्रणालीगत) में कहीं भी भड़काऊ सेल व्यवहार पर प्रभाव pupa । इन प्रयोगों में उपयोग प्यूपा के चल रहे विकास के कारण (जो वयस्कता के लिए ऊतकों को तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण ऊतक पुनर्व्यवस्थाओं के दौर से गुजर रहे हैं), कभी-कभार प्यूपा इमेजिंग के दौरान कदम होगा । Pupal रोलिंग है, तथापि, और अधिक होने की संभावना है अगर प्यूपा सही ढंग से flattest की सतह के साथ माउंट नहीं किया गया है विंग (या अन्य ऊतक imaged किया जा करने के लिए) coverglass के साथ सीधे संपर्क में; आवरण कांच पर प्यूपा को स्थिर करने के लिए हेप् गोंद का प्रयोग इस अवांछनीय आंदोलन को कम करना चाहिए । इस कारण से, महान देखभाल भी उनके ध्यान से संरेखित पदों से प्यूपा जब सूक्ष्मदर्शी के बीच नमूने ले जाने से बचने के लिए लिया जाना चाहिए; आदर्श रूप में, घाव लेजर एक ही माइक्रोस्कोप करने के लिए संलग्न किया जाएगा बाद में समय चूक इमेजिंग और फोटो रूपांतरण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।

pupal विच्छेदन और बढ़ते कदम की प्रवीणता के अलावा, Drosophila प्यूपा का सटीक जीनोटाइप इस्तेमाल किया इमेजिंग डेटा की गुणवत्ता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव होगा उत्पंन । उदाहरण के लिए, एक व्यक्ति यूएएस Kaede के भीतर Gal4 ड्राइवर और यूएएस constructs (उदा. यूएएस-GFP या pupal-जीनोटाइप) की प्रतियां की संख्या अनुवर्ती इमेजिंग के दौरान सिग्नल-टू-शोर अनुपात निर्धारित करेगी । एक सामांय नियम के रूप में, एक Gal4 या यूएएस के अधिक प्रतियां मौजूद निर्माण, अधिक से अधिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन का कुल स्तर (जैसे GFP या Kaede) ऊतक के भीतर । फ्लोरोसेंट प्रोटीन का इष्टतम स्तर होगा, तथापि, उंनयन ऊतक प्रतिदीप्ति पर्याप्त उच्च गुणवत्ता इमेजिंग की अनुमति के बीच एक सावधान संतुलन (कम लेजर शक्तियों के उपयोग को सक्षम करने, विस्तारित समय में photobleaching और इमेजिंग में कमी पीरियड्स) लेकिन fluorophore प्रेरित सेलुलर विषाक्तता के कारण के बिना; प्रत्येक प्रयोग में Gal4 और यूएएस का इष्टतम संख्या विशेष ड्राइवरों और fluorophores इस्तेमाल किया जा रहा के अनुसार भिन्न हो जाएगा । देखभाल के लिए 25 डिग्री सेल्सियस (या ऊपर, 29 डिग्री सेल्सियस) पर प्यूपा बढ़ाने के लिए लिया जाना चाहिए क्योंकि Gal4-यूएएस प्रणाली तापमान संवेदनशील है और कम तापमान31पर अप्रभावी हो जाएगा । Gal4संचालित अभिव्यक्ति की ऊतक या समय-विशिष्टता पर नियंत्रण के अतिरिक्त स्तर को प्राप्त करने के लिए, Gal4-यूएएस प्रणाली दमन Gal80 भी pupal जीनोटाइप३९के भीतर शामिल किया जा सकता है । Gal80 या तो एक विशेष ऊतक के भीतर Gal4 गतिविधि दमन (एक ऊतक-विशिष्ट Gal80 का उपयोग कर) या एक विशेष समय (एक तापमान संवेदनशील Gal80 का उपयोग कर) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Gal4-यूएएस प्रणाली को और अन्य स्वतंत्र बाइनरी प्रणालियों के साथ संयुक्त किया जा सकता है (जैसे कि LexA-lexAop और QF-QUAS सिस्टम्स) उत्पन्न करने के लिए Drosophila जो अनेक construction (उदा. fluorophores, RNAi लाइंस या अन्य आनुवंशिक निर्माण)३९विभिन्न ऊतकों की एक सीमा में एक साथ व्यक्त किया.

इस नए Drosophila pupal मॉडल का उपयोग अधिक पारंपरिक भ्रूण दृष्टिकोण पर लाभ के एक नंबर प्रदान करता है । अल्पकालिक इमेजिंग की तुलना में (3 ज तक) चरण में उपलब्ध 15 भ्रूण (मंच है जिस पर सबसे अधिक भ्रूण घायल अध्ययन प्रदर्शन कर रहे हैं), प्यूपा समय की काफी लंबी अवधि में imaged किया जा सकता है (pupal विकास के ९६ एच के बाद वयस्कता तक प्रिंसिपल में ). इसके अलावा, hemocytes की अभी तक अधिक से अधिक संख्या (Drosophila जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं) pupal ऊतकों के भीतर मौजूद है (और इमेजिंग के लिए उपलब्ध है) भ्रूण के भीतर मौजूद अधिक सीमित संख्या की तुलना में और यह हमें काफी अधिक इकट्ठा करने की अनुमति दी है hemocyte व्यवहार पर इमेजिंग डेटा नमूनों की एक ही कुल संख्या का उपयोग कर । महत्वपूर्ण, यह, बारी में, हमें सक्षम किया गया है और अधिक परिष्कृत गणितीय मॉडलिंग hemocytes व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए और घाव attractants और भड़काऊ प्रतिक्रिया है कि अंयथा बना रहे है प्रयोग के उपंयास सुविधाओं को निकालने के लिए दुर्गम२३. pupal मॉडल का एक अंय लाभ यह है कि RNAi-मध्यस्थता जीन पछाड़ना काफी पहले भ्रूण चरणों की तुलना में अधिक कुशल है, की अनुमति ऊतक या समय की बेहतर विश्लेषण-विशिष्ट जीन इस तरह के Gal4-यूएएस प्रणाली के रूप में बाइनरी सिस्टम का उपयोग कर निष्क्रियता ३९. इस स्तर पर RNAi की दक्षता इस प्रकार है कि या तो घाव की मरंमत या भड़काऊ कोशिका व्यवहार में शामिल उपंयास खिलाड़ियों के लिए खोज करने के लिए बड़े पैमाने पर (या भी निष्पक्ष जीनोम चौड़ा) RNAi स्क्रीन प्रदर्शन करने की क्षमता को खोलता है ।

तथापि, Drosophila प्यूपा स्पष्ट रूप से phenotypes आनुवंशिक उत्परिवर्तनों जो भ्रूण घातक होते है जिसके परिणामस्वरूप का अध्ययन नहीं किया जा सकता; कार्यात्मक और जीने-जीन है कि भ्रूण के विकास के लिए आवश्यक है की इमेजिंग अध्ययन इसलिए अभी भी भ्रूण में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, जब तक RNAi-मध्यस्थता जीन पछाड़ना एक समय या ऊतक विशिष्ट तरीके से विकास परमिट के माध्यम से pupal चरणों के लिए होते हैं । भ्रूण भी अपने मूल, संपर्क-गतिवान और अपोप्तोटिक लाशों के phagocytosis के निषेध से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विकासात्मक फैलाव सहित प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार की कुछ सुविधाओं का अध्ययन और जीने के लिए पसंद का मॉडल रहता है विकासात्मक ऊतक5,8 जो अभी तक pupal मॉडल में नहीं देखा गया है मूर्ति के दौरान उत्पंन । हालांकि Drosophila लार्वा और वयस्कों में अध्ययन अंतर्निहित घाव की मरंमत और सूजन४०,४१,४२,४३तंत्र में एक महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है, ४४ लाइव-इमेजिंग अध्ययन इन चरणों में नमूनों की अंतर्निहित मोबाइल प्रकृति के कारण मुश्किल साबित कर दिया है । Whilst लार्वा लाइव-इमेजिंग की संक्षिप्त अवधि की अनुमति देने के लिए anesthetized जा सकता है, संज्ञाहरण के अस्थायी प्रकृति के कारण, लाइव घाव की मरम्मत या भड़काऊ प्रतिक्रिया के केवल छोटे स्नैपशॉट४५visualized किया जा सकता है । एक ताजा अध्ययन अब एक सुधार प्रोटोकॉल है कि परमिट अब लार्वा घाव भरने४६की अवधि इमेजिंग, हालांकि तैयारी और इमेजिंग अभी भी काफी अधिक भ्रूण या प्यूपा की तुलना में चुनौतीपूर्ण रहने का विकास किया है । लंबी अवधि में, हम कल्पना है कि सबसे उपयुक्त विकास के चरण का उपयोग करके प्रत्येक विशिष्ट प्रश्न का पता, इन विभिंन Drosophila चरणों के सभी चार में अध्ययन-लार्वा और pupal अवधि के माध्यम से वयस्कता के लिए भ्रूण से (प्रत्येक के साथ अपने स्वयं के अनूठे फायदे और सीमाएं)-आणविक और सेलुलर तंत्र ड्राइविंग घाव की मरंमत और सूजन में पूरक अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा ।

भविष्य में, Drosophila प्यूपा के घायल और दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए इस प्रोटोकॉल को आसानी से सूजन से संबंधित घटना की एक सीमा का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और भड़काऊ घाव प्रतिक्रिया के उपंयास सुविधाओं को उजागर करने के लिए दूरगामी क्षमता है । दीर्घकालिक इमेजिंग के संयोजन, एक साथ photoconvertible fluorophores के आवेदन के साथ (जैसे Kaede के रूप में), सहज प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार की गतिशीलता को समझने के लिए महान मूल्य के हैं और विशेष रूप से, अभी तक कम समझ के संकल्प चरण घाव भड़काऊ प्रतिक्रिया । विशेष रूप से या तो व्यक्तिगत या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के उपजनसंख्या लेबल द्वारा (जैसे एक घाव में भर्ती लोगों के रूप में) यह कैसे एक पर्यावरण क्यू के लिए जोखिम का विश्लेषण संभव हो जाएगा (जैसे एक लाश या चोट के रूप में) प्रतिरक्षा है सेल बाद में प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है एक बाद क्यू. Drosophila hemocytes के भड़काऊ व्यवहार पिछले अनुभवों से बदला जा सकता है-उदाहरण के लिए, वे12 विकास के दौरान अपोप्तोटिक लाशों के पूर्व phagocytosis द्वारा ऊतक चोट का जवाब करने के लिए प्रधानमंत्री हैं, लेकिन यह देखा जा करने के लिए रहता है क्या अंय पर्यावरणीय cues समान भड़काने की घटनाओं को प्रेरित करते हैं । हालांकि pupal घावों के अध्ययन अब तक सहज भड़काऊ प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित किया है, pupal विंग मॉडल भी दोनों रहते छवि और काटना उपकला घाव की मरंमत अंतर्निहित तंत्र के लिए एक आदर्श अवसर प्रदान करता है । इसके अलावा, इस pupal इमेजिंग विधि भी ऊतक नुकसान३८के जवाब में अंय कोशिका वंश के गतिशील व्यवहार की जांच अनुकूलित किया जा सकता है, या तो pupal विंग में ही या अंय आसानी से सुलभ pupal ऊतकों (जैसे आंखें, पैर या छाती के रूप में) । अंत में, दीर्घकालिक pupal इमेजिंग, उपंयास उपकला मरंमत या भड़काऊ नियामकों की आसानी के साथ एक साथ Drosophila की आनुवंशिक पथ के संयोजन के द्वारा निष्पक्ष जीनोम के आवेदन के माध्यम से खुला हो सकता है चौड़ा दस्तक नीचे दृष्टिकोण.

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि वे हितों का कोई प्रतिस्पर्धी संघर्ष नहीं है.

Acknowledgments

हम उपयोगी चर्चा के लिए मार्टिन, Nobes, रिचर्डसन और लकड़ी प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा । हम भी Wolfson (ब्रिस्टल, ब्रिटेन के विश्वविद्यालय), ब्लूमिंगटन स्टॉक सेंटर (इंडियाना विश्वविद्यालय, यूएसए) और वियना Drosophila संसाधन केंद्र ( Drosophila स्टॉक्स के लिए) और Flybase (अप करने के लिए तारीख के लिए Drosophila धंयवाद जीन एनोटेशन) । इस काम के लिए एक MRC परियोजना अनुदान द्वारा p.m. और W.W. (MR/J002577/1), W.W. के लिए एक वेलकम ट्रस्ट वरिष्ठ फैलोशिप और एक वेलकम ट्रस्ट अन्वेषक पुरस्कार द्वारा समर्थन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila stocks
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin
;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)		 Kyoto Stock Center, DGRC #109007 Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin
;;Ubi-p63E-shg.GFP (III)		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #58742 Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged Moesin
P{sGMCA}3.1		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #59023 The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T.
hemocyte specific serpent-Gal4 driver
;srp-Gal4;		 Generated by Katja Bruckner Generated by Katja Bruckner Expression of Scer\GAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP
w1118;;P{UAS-RedStinger}6		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #8545 or #8547 UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal
UAS-cytoplasmicGFP
;;P{UAS-GFP.S65T}		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) Multiple stocks available (e.g. #1522) Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness.
UAS-photoconvertibleKaede
w1118;; P{UAS-Kaede.A}3		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #26161 Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV.
GFP-tagged spaghetti squash
w1118;;P{sqh-GFP.RLC}		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #57145 The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:Avic\GFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter.
Name Company Catalog Number Comments
Ingredients for fly food media Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.)
maize Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
soya flour Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
malt extract Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
molasses Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
Difco agar BD Biosciences, Fisher Scientific DF0142-15-2 For preparation of fly food
Propionic acid Sigma 402907 For preparation of fly food
Nipagen Sigma 79721 For preparation of fly food
Dried baker's yeast Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD For preparation of fly food
Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation and mounting
Parafilm Sigma P7793-1EA For preparation of heptane glue
Fine sable paintbrush Daler-Rowney (or equivalent) #0 or 1
Forceps Fisher Scientific (or Fine Science Tools) NC9404145 Dumont #5
Glass bottomed dishes for imaging MatTek P35G-0-10-C We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment.
Heptane Sigma 51730-5ML For preparation of heptane glue
Double sided sticky tape (e.g. Scotch) Agar Scientific AGG263 For preparation of heptane glue
50ml tube (for heptane glue) Falcon tubes from Fisher Scientific 14-432-22 For preparation of heptane glue
Glass microscope slides Agar Scientific AGL4244 For dissection of Drosophila pupae
Dissecting stereo microscope with brightfield Leica (or equivalent) M50 For dissection of Drosophila pupae
Microscissors John Weiss International 103123 Miniature Research Scissors (straight)
Name Company Catalog Number Comments
Laser ablation and imaging
Nitogen ablation laser Spectra-Physics (or Andor equivalent) Model VSL-337ND-S For wounding, this should be attached to a widefield imaging system
Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) Leica (or equivalent) TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal)
Environmental chamber Life Imaging Services (or equivalent) "Microscope Temperature Control System" Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging
Name Company Catalog Number Comments
Image Analysis Software
FRAP software module Leica (or equivalent) CLSM FRAP software module For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede
ImageJ (image analysis software) National Institutes of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/ Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012.
ImageJ plugin "Manual Tracking" National Institutes of Health (NIH) https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJ plugin "TrackMate" ImageJ, NIH https://imagej.net/TrackMate Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (high performance 3D imaging software) Perkin Elmer Volocity 6.3 For image analysis
IMARIS (image analysis software) Bitplane IMARIS for Cell Biologists For image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration. Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).
  2. Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
  3. Martin, P., Nunan, R. Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing. British Journal of Dermatology. 173 (2), 370-378 (2015).
  4. Razzell, W., Wood, W., Martin, P. Swatting flies: modelling wound healing and inflammation in Drosophila. Disease Model and Mechanism. 4 (5), 569-574 (2011).
  5. Wood, W., Martin, P. Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly. Development Cell. 40 (3), 221-233 (2017).
  6. Mohr, S. E., Smith, J. A., Shamu, C. E., Neumüller, R. A., Perrimon, N. RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 591-600 (2014).
  7. Muñoz-Soriano, V., López-Domenech, S., Paricio, N. Why mammalian wound-healing researchers may wish to turn to Drosophila as a model. Experimental Dermatology. 23 (8), 538-542 (2014).
  8. Weavers, H., Wood, W. Creating a Buzz about Macrophages: The Fly as an In Vivo Model for Studying Immune Cell Behavior. Developmental Cell. 38 (2), 129-132 (2016).
  9. Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. Journal of Cell Biology. 168 (4), 567-573 (2005).
  10. Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biolog. 173 (3), 405-416 (2006).
  11. Razzell, W., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Calcium flashes orchestrate the wound inflammatory response through DUOX activation and hydrogen peroxide release. Current Biology. 23 (5), 424-429 (2013).
  12. Weavers, H., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Corpse Engulfment Generates a Molecular Memory that Primes the Macrophage Inflammatory Response. Cell. , (2016).
  13. Stramer, B., Winfield, M., Shaw, T., Millard, T. H., Woolner, S., Martin, P. Gene induction following wounding of wild-type versus macrophage-deficient Drosophila embryos. EMBO Reports. 9 (5), 465-471 (2008).
  14. Matsubayashi, Y., Coulson-Gilmer, C., Millard, T. H. Endocytosis-dependent coordination of multiple actin regulators is required for wound healing. Journal of Cell Bioliogy. 210 (3), 419-433 (2015).
  15. Evans, I. R., Rodrigues, F. S. L. M., Armitage, E. L., Wood, W. Draper/CED-1 Mediates an Ancient Damage Response to Control Inflammatory Blood Cell Migration In Vivo. Current Biology. 25 (12), 1606-1612 (2015).
  16. Zanet, J., Stramer, B., Millard, T., Martin, P., Payre, F., Plaza, S. Fascin is required for blood cell migration during Drosophila embryogenesis. Development. 136 (15), 2557-2565 (2009).
  17. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  18. Ninov, N., Martín-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nature Protocols. 2 (12), 3074-3080 (2007).
  19. Gho, M., Bellaïche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126 (16), 3573-3584 (1999).
  20. Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
  21. Berh, D., Scherzinger, A., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C., Risse, B. Automatic non-invasive heartbeat quantification of Drosophila pupae. Computers in Biology and Medicine. 93, 189-199 (2018).
  22. Sander, M., Squarr, A. J., Risse, B., Jiang, X., Bogdan, S. Drosophila pupal macrophages--a versatile tool for combined ex vivo and in vivo imaging of actin dynamics at high resolution. European Journal of Cell Biology. 92 (10-11), 349-354 (2013).
  23. Weavers, H., Liepe, J., Sim, A., Wood, W., Martin, P., Stumpf, M. P. H. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26 (15), 1975-1989 (2016).
  24. Fristrom, D., Wilcox, M., Fristrom, J. The distribution of PS integrins, laminin A and F-actin during key stages in Drosophila wing development. Development. 117 (2), (1993).
  25. Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Development Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
  26. Berg, H. Random Walks in Biology. , Princeton University Press. Available from: http://press.princeton.edu/titles/112.html (1993).
  27. Diehl, H., Ihlefield, H., Schwegler, H. Physik fur Biologen. , Springer-Verlag. (1991).
  28. Stewart, P. S., McFeters, G. A., Huang, C. T. Biofilm control by antimicrobial agents. Biofilms II Process Analysis and Application. , 373-405 (2000).
  29. Milo, R., Phillips, R. Cell Biology by the Numbers. , Garland Science. Available from: https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1 (2015).
  30. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceeding of National Academy of Science U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  31. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Cordelières, F. Manual tracking. National Institutes of Health. , Available from: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2015).
  34. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  35. Grueber, W., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  36. Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biology. 173 (3), 405-416 (2006).
  37. Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
  38. Franz, A., Wood, W., Martin, P. Fat Body Cells Are Motile and Actively Migrate to Wounds to Drive Repair and Prevent Infection. Developmetal Cell. 44 (4), 460-470 (2018).
  39. del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2012).
  40. Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and Cell Fusion Contribute to Wound Healing in the Adult Drosophila Epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
  41. Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science U S A. 105 (29), 10017-10022 (2008).
  42. Galko, M. J., et al. Cellular and Genetic Analysis of Wound Healing in Drosophila Larvae. PLoS Biology. 2 (8), e239 (2004).
  43. Brock, A. R., et al. Transcriptional regulation of Profilin during wound closure in Drosophila larvae. Journal of Cell Science. 125 (23), (2013).
  44. Wu, Y., Brock, A. R., Wang, Y., Fujitani, K., Ueda, R., Galko, M. J. A blood-borne PDGF/VEGF-like ligand initiates wound-induced epidermal cell migration in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (17), 1473-1477 (2009).
  45. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila Larvae to Study Epidermal Wound Closure and Inflammation. Methods in Molecular Biology. 1037, 449-461 (2013).
  46. Kakanj, P., et al. Insulin and TOR signal in parallel through FOXO and S6K to promote epithelial wound healing. Nature Communications. 7, 12972 (2016).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३६ घाव भरने सूजन जन्मजात उन्मुक्ति Drosophila melanogaster Drosophila pupa hemocyte सेल माइग्रेशन लाइव-इमेजिंग लेजर पृथक फोकल माइक्रोस्कोपी photoconversion
<em>Vivo में</em> <em>Drosophila</em> प्यूपा के भीतर भड़काऊ कोशिका गतिशीलता की ट्रैकिंग लंबी अवधि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weavers, H., Franz, A., Wood, W.,… More

Weavers, H., Franz, A., Wood, W., Martin, P. Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae. J. Vis. Exp. (136), e57871, doi:10.3791/57871 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter