Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Langsigtet In Vivo sporing af inflammatoriske celler dynamikken i Drosophila pupper

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,4
1School of Biochemistry, Biomedical Sciences, University of Bristol, 2School of Cellular and Molecular Medicine, Biomedical Sciences, University of Bristol, 3MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh, Queens Medical Research Institute, 4School of Physiology, Pharmacology, and Neuroscience, Biomedical Sciences, University of Bristol

Summary

Her præsenterer vi en protokol til live imaging sår reparation og det tilknyttede inflammatoriske respons på høj spatio-temporal opløsning i vivo. Denne metode udnytter Drosophila puppe udviklingstrin at muliggøre langsigtede imaging og sporing af specifikke cellepopulationer over tid og er kompatibel med effektiv RNAi-medieret genet inaktivering.

Abstract

Under den hurtige inflammatoriske respons på vævsskader, er cellerne i medfødte immun-systemet hurtigt rekrutteret til skaden site. Én gang på såret, medfødte immun celler udføre en række væsentlige funktioner, såsom bekæmpelse af infektion, clearing nekrotisk debris og stimulere matrix deposition. For fuldt ud at forstå de mangfoldige signalering begivenheder, der regulere denne immunrespons, det er afgørende at overholde den komplekse adfærd af (og samspil, der opstår mellem) flere celle lineages in vivo og i realtid, med høje spatio-temporal opløsning. Den optiske gennemskinnelighed og den genetiske sporbarhed af Drosophila embryoner har etableret Drosophila som en uvurderlig model til live-billede og dissekere grundlæggende aspekter af inflammatoriske celler adfærd, herunder mekanismer af udviklingsmæssige spredning, clearance af apoptotiske lig og/eller mikrobielle patogener og rekruttering til sår. Nyere arbejde har imidlertid nu vist, at ansætte et langt senere tidspunkt i Drosophila livscyklus – Drosophila puppe-tilbyder en række forskellige fordele, herunder forbedret RNAi effektivitet, længere imaging perioder, og betydeligt større immun celle numre. Her beskriver vi en protokol for billedbehandling sår reparation og det tilknyttede inflammatoriske respons på den høje spatio-temporal opløsning i live Drosophila pupper. For at følge dynamikken i både re epithelialization og inflammation, bruger vi en række specifikke i vivo fluorescerende markører for både epitel og medfødte immun celler. Vi har også demonstrere effektiviteten af foto-konvertible fluorophores, såsom Kaede, for efter bestemt immun celle subsets, for at spore deres adfærd, da de vandrer til, og beslutsomhed fra skaden site.

Introduction

En effektiv inflammatorisk reaktion er afgørende for enhver organisme at bekæmpe infektion, rydde murbrokker og orkestrere reparation af tilskadekomne væv1. Selv om dette svar er en uundgåelig resultat af de fleste vævsskader, kræver betændelse streng regulering, fordi en uhensigtsmæssig inflammatorisk reaktion har været forbundet med en lang række forskellige menneskelige sygdomme (herunder kroniske ikke-healing sår, overdreven ardannelse og disposition til kræft)1,2,3. Denne kliniske relevans er det afgørende at opnå en mere detaljeret forståelse af de molekylære og cellulære mekanismer kørsel det inflammatoriske respons for at udvikle nye prognostiske indikatorer og strategier til at behandle en række kroniske inflammatoriske betingelser, som kan beskytte reparation væv fra langvarig og unødvendige betændelse.

I de seneste år, er Drosophila blevet en veletableret og værdifulde modelsystem til at dissekere grundlæggende funktioner i det inflammatoriske respons bevaret fra insekter til menneskelige4,5. På nuværende tidspunkt Drosophila tilbyder langt større genetisk sporbarhed end det er i øjeblikket muligt i andre eksperimentelle modeller (såsom mus eller zebrafisk), muliggør præcis spatio-temporale genmanipulation i vivo (til at inaktivere eller over udtrykke nogen gen af interesse inden for specifikke celletyper for en defineret udviklingsmæssige tidspunkt) og brugervenlighed genome-wide skærme,6,7. Traditionelt, er de fleste live imaging studier af sårheling og betændelse i Drosophila blevet udført på vorden, som embryoner er immobile (i modsætning til Drosophila larver eller voksne) og optisk gennemskinnelige som muliggør enestående høj opløsning i vivo billeddannelse8. Dette har givet forskere til at visualisere den hurtige og robust rekruttering af Drosophila medfødte immun celler (hemocytes) til webstedet sår som reaktion på den mekaniske eller laser-induceret skade til embryonale epitel9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. ved at kombinere disse live-imaging studier med genmanipulation, studier i Drosophila embryoner har afdækket mange vigtige immun celle proteiner, der styrer inflammatoriske celle behavior in vivo. For eksempel, CED-1 homolog Draper (en ITAM domæne indeholdende protein) er blevet identificeret som et vigtigt» skade receptor» der medierer rekruttering Drosophila immun celler i en H2O2-afhængige måde til steder i beskadige15. Draper niveauer inden for immunceller er igen reguleret af calcium-induceret JNK signalering og forhøjede nedstrøms apoptotiske liget optagelse12. Hemocyte motilitet yderligere kræver komplekse cytoskeletal ændringer at koordinere styret migration mod såret og dette er afhængig af aktiviteten af cytoskeletal lovgivere såsom actin-bundling protein Fascin16 og familien Rho små GTPases Rac og Rho-9.

Drosophila er en holometabolous insekt, der går gennem de ekstra larve og puppe faser efter embryogenese, før nåede voksenalderen17. Drosophila puppe er blevet udviklet som en supplerende model for non-invasiv live-imaging af en række dynamiske cellulære begivenheder, herunder udviklingsmæssige celle migration18, celledeling19, celle vækst20og muskel sammentrækning21. Mere nylig, det blev fastslået som en ny model til at studere dynamikken i såret reparation og betændelse i vivo22,23.

Ligesom i vorden er Drosophila pupper immobile og optisk gennemskinnelig, efter omhyggelig dissektion fra deres uigennemsigtig puppe tilfælde18. Ved at udnytte denne optiske gennemsigtighed, kan man følge i vivo -opførsel af medfødte immun celler (hemocytes) som reaktion på vævsskade i Drosophila puppe væv, såsom puppe fløj22. Den puppe fløj eksisterer som en simpel bilayered struktur, bestående af to store flade epitelial plader, der er tilsluttet omkring wing periferien; det ekstracellulære rum mellem disse to epitel lag er fyldt med hemolymph (insekt blod) og det store antal motile hemocytes24. Ligesom i embryoner udløser mekaniske eller laser-induceret skade wing epitel en hurtig ansættelse af hemocytes til skade site23. Men denne puppe stadie tilbyder nogle forskellige fordele for billeddannelse over tidligere vorden. Tilskadekomne pupper kan være afbildet over langt længere perioder (for mindst 5 h), mere væv område er tilgængelig for den eksperimentelle undertrykkelse af netbårne (f.eks. generation af flere sår) og der er et betydeligt større antal hemocytes til stede på dette tidspunkt ( giver mere celle baner fra længere afstande til forbedrede statistiske effekt under den matematiske analyse). Desuden, forbedret effektiviteten af RNAi-medieret genet inaktivering betydeligt i puppe stadier, tillade mange gener at være 'slået ned' i et væv eller time-specifik måde i forhold til de mere traditionelle hele mutant tilgang af embryoner.

For at følge dynamikken i såret re epithelialization og den ledsagende inflammatorisk respons inden for denne nye puppe model, to forskellige cellepopulationer skal mærkes: puppe epitel og de medfødte immun celler (Drosophila hemocytes). En række forskellige markører (Tabel af materialer) er tilgængelige til at mærke disse to forskellige cellepopulationer - valg af markør afhænger af de særlige proces skal undersøges. For at markere den puppe epitel, Drosophila linjer, der indeholder enten udnyttes en allestedsnærværende udtrykt normal god landbrugspraksis-tagged E-cadherin (der etiketter adherens vejkryds) rutinemæssigt for at angive positioner af cellemargener, eller alternativt en normal god landbrugspraksis-mærket Aktin-bindende domæne af Moesin (der etiketter actin cytoskeleton) til at visualisere sår-kant kontraktile actin ring og førende fremspring. At mærke Drosophila hemocytes, en hemocyte-specifikke srp-Gal425 -drev udtryk for nukleare RFP (for nukleart sporingen), cytoplasmatisk normal god landbrugspraksis eller normal god landbrugspraksis-markeret Moesin (at mærke cytoplasma eller actin cytoskeleton, henholdsvis) eller en photoconvertible fluorophore (såsom Kaede) anvendes. Faktisk er det ofte fordelagtigt at bruge flere immun celle markører i kombination, aktivere simultan analyse af den nukleare bevægelse og celle morfologi (Se repræsentative resultater). Men da denne protokol indebærer anvendelse af Drosophila pupper, kun kombinationer af genetiske markører som er levedygtige indtil midten af puppe faser kan udnyttes. Også, embryonale dødbringende bestande vil ikke være egnet. Det er usandsynligt, at være et problem, når imaging kontrol (eller wild-type) pupper men er vigtigt at overveje, når gener er at blive slået eller overexpressed, for at vurdere deres effekt på såret lukning eller betændelse. I tilfælde af tidlig dødelighed forårsaget af genet knockdown (eller overekspression), en Gal80ts konstruktion kan bruges til at fremkalde den Gal4-drevet knockdown senere i udvikling (Se diskussion).

I vores nyere undersøgelser, er flytter ind i den puppe stadie lykkedes os at samle tilstrækkelige immun celle bane data til at analysere inflammatoriske adfærd ved hjælp af avanceret matematisk modellering, som igen har tilladt os at udlede roman detaljer af sår inflammatorisk attractant signaler23. For eksempel viste denne tilgang at såret chemoattractant breder sig langsomt gennem det betændte væv på 200 μm2/min, et langt langsommere end tidligere foreslået lille kandidat molekyler såsom ATP sats eller H2O2 indberettes til diffuse26,27,28,29; disse små "skader" molekyler forventes i stedet at fungere som eftergivende signaler. Derudover ved at følge de langsigtede adfærd i medfødte immun celler, som de løse fra et indledende sår og udsættes for en anden (lavet på forskellige timepoints efter først), har vi afdækket en midlertidig 'desensibilisering' periode, hvilke immunceller er blinde for efterfølgende skader23. Ved at udnytte den puppe model, sammen med Drosophilas genetiske sporbarhed langsigtede imaging potentiale, kan man følge funktionsmåden for bestemt immun cellepopulationer (f.eks. kun de immunceller rekrutteret til webstedet sår) i svar til efterfølgende fornærmelser, ved hjælp af photoconvertible fluorophore30 som kan udtrykkes udelukkende inden for immun celle lineage23.

Her beskriver vi en protokol for at visualisere dynamikken i såret reparation og det tilknyttede inflammatoriske respons på høj spatio-temporal opløsning ved hjælp af levende Drosophila pupper. Vi giver en detaljeret metode til at dække de trin, der kræves til den indledende pupper forberedelse (dissektion og montering) og den efterfølgende laser-medieret kvæstelse og time-lapse imaging. Vi beskriver også brug af foto-cabriolet fluorophores at tillade mærkning af bestemt immun celle subsets i vivo. I den langsigtede forestiller vi at denne nye Drosophila puppe model åbner spændende muligheder for dissekere komplekse signaling dynamikken bag den inflammatoriske reaktion på vævsskade. Ved at anvende mere avancerede statistiske analyser kan man afdække funktioner af de svar, der ellers ville forblive eksperimentelt utilgængelige, mens RNAi effektivisering kunne egner sig til anvendelsen af genome-wide screening inden for immunceller i vivo til at identificere nye spillere regulering immun celle adfærd.

Protocol

Denne protokol består af fire vigtigste sekventielle trin: (1) udarbejdelse af Drosophila bestande og iscenesættelse af Drosophila pupper, (2) puppe dissektion og montering, (3) puppe sårede, (4) i vivo time-lapse Konfokal billeddannelse.

1. forberedelse af Drosophila bestande og iscenesættelse af pupper

  1. Få relevante Drosophila bestande (Se introduktion og Tabel af materialer).
  2. Indsamle unge raske voksne fluer af passende genotype.
    1. Vælg voksne fluer ved hjælp af kuldioxid gas puder til kortvarigt bedøver fluer og en fin pensel til at overføre flyver af passende genotype eller køn til en samling hætteglas.
    2. Tilføj 20 jomfruelige hunner og 20 hanner til hvert hætteglas indeholdende standard flyve mad medier (en cornmeal-melasse-agar blanding, se Tabel af materialer) suppleret med gær.
  3. For den optimale puppe generation, tip de voksne fluer hver dag på ny mad i frisk hætteglas, holde alle hætteglas ved 25 ° C.
    Bemærk: Hvis Gal4-UAS system31 bruges til at drive afstamning-specifikke genekspression, alle trin skal udføres ved 25 ° C eller derover, som Gal4-UAS systemet temperatur følsom.
  4. 18 h før den planlagte imaging session, skal du vælge mindst 10 nydannede hvid før pupper (figur 1A) fra hætteglas (dvs 0 h efter puparium dannelse, APF) med pincet eller en fin pensel til at løsne pupper fra den indvendige hætteglas overflade og overføre pupper omhyggeligt til siden af en ren tomme plastik hætteglas.
    Bemærk: Vandrer 3rd instar larver kravle opad ud af mad medium til at gennemgå pupation; nydannede hvide prepupae let kan identificeres som de besidder everteret forreste Spirakler og er stationær (i modsætning til 3rd instar larver). Hårstrået omdannes til den 'puparium' (den puppe sag), som er i første omgang bløde og hvide17. Pleje skal tages til at undgå at beskadige pupper, da dette kan medføre en uønsket skade-induceret inflammatorisk reaktion, men også en betydelig forsinket.
  5. Alder de udvalgte pupper til den passende udviklingsstadiet (18 h giver optimale resultater, APF) i hætteglas ved 25 ° C.
    Bemærk: Som pupper udvikle, puppe sagen vil blive gradvist mørkere og mere skørt.
  6. Forberede andre reagenser til de næste trin før tid. For at gøre heptan lim, kombinere en 20 cm længde af opløftede dobbeltklæbende tape med 20 mL heptan i et 50 mL centrifugeglas, forsegle med paraffin film og rock ved rumtemperatur natten over på bænken.

2. forberedelse og dissektion af Drosophila pupper

  1. Overføre de iscenesatte Drosophila pupper til et stykke dobbeltsidet klistret tape monteret på et glas dias. Placer pupper, så den ventrale side sidder solidt fast på båndet og den dorsale side vender opad (figur 1B).
    Bemærk: Den forreste af puppe bliver identificerbare fra de to Spirakler fremspringende fra den forreste ende af den puppe sag.
  2. Fjern forsigtigt pupper fra deres beskyttende puparium beklædning under en brightfield dissektion mikroskop ved hjælp af mikro-saks (figur 1B-D) og pincet.
    1. I første omgang gøre et snit i regionen anterior-mest i puparium ved hjælp af pincet (figur 1B). Sikre at den puppe sag på dette område er hule og blottet for puppe væv, fordi pupper vil have skrumpet ind i sagen i den tidlige puppe udvikling.
    2. Efter denne indledende indsnit, forsigtigt rive eller skære sagen puppe åbne i en forreste til bageste retning med pincet eller microscissors (figur 1 c), indtil puppe er helt fri for den brune uigennemsigtige sprødt casing (fig. 1 d).
      Bemærk: Pupper på nuværende tidspunkt er meget skrøbelige og skal sørges for at undgå punktering puppe overfladen; punktering er indlysende, som hemolymph hurtigt siver ud fra webstedet punktering. Pupper med punkteringer, uanset hvor lille, skal kasseres.
  3. Montere pupper i en glas-bund fad ved hjælp af heptan lim..
    1. Bruge en 20 mL pipette tip til at placere en 10 mL dråbe forberedte heptan lim. (Se afsnit 1.6 ovenfor) i en linje på den glas-bund fad.
    2. Tillad limen tørre i 5 s før du overfører de dissekeret pupper omhyggeligt på heptan lim. ved hjælp af pincet (figur 1E).
    3. For at lette sårede og billeddannelse, line pupper op i en række; cirka 5 pupper er foreslået, men mere vil være håndterbar med erfaring.
      Bemærk: Brug af heptan lim. anbefales, når du bruger oprejst Billeddannende systemer men er ikke nødvendigt, når du bruger en omvendt system. Hvis limen skaber optiske aberrationer under imaging, pupper kan placeres direkte på daekglas i stedet – naturlige vedhæftning mellem puppe væv og glas vil være tilstrækkeligt i de fleste tilfælde til stabil imaging, så længe omhu, når du flytter imaging Dish mellem mikroskoper.
  4. For de bedste resultater, montere pupper så at vingen er fladt på daekglas med størstedelen af wing overflade i direkte kontakt med daekglas (figur 1F). Roll pupper bruge pincet til at ændre deres holdning for at sikre, at vingen er monteret korrekt.
  5. For at undgå prøve dehydrering billedbehandling i perioden, skal du tilføje et stykke absorberende filter papir dyppet i destilleret vand ved siden af den glas-bund fad i slutningen af montering, være omhyggelig med ikke at forstyrre pupper (figur 1E). Dæk fadet med et låg.
    Bemærk: Pupper er nu klar til sårede og billedbehandling.

3. laser-induceret såret af Drosophila puppe vinger

  1. Overføre den glas-bund fad indeholdende de monterede pupper til wide-felt mikroskop udstyret med en afstemmelige laser ablation system.
    1. Brug en pulserende UV luftkølede kvælstof-pumpet ablation laser tunet til 435 nm – Se Tabel af materialer for detaljer11; den præcise bølgelængde lys anvendes til belysning er valgt af brugeren via en passende farvestoffet celle.
  2. Hjælp brightfield optik, justere mikroskop fase kontrol hen til lokalisere den puppe fløj af den første puppe at være såret (figur 1F).
  3. For optimale resultater, bruge en olie fordybelse 40 X eller 63 X mål linse til begge imaging og laser ablation; sikre, at den fordybelse væske bruges (olie eller glycerol) overensstemmelse mellem ablation og imaging systems. Justere mikroskop til at fokusere på flyet af puppe wing epitel nærmeste glas coverslip (dvs. fokus på regionen af epitel at være såret) ved hjælp af fine fokus kontrolknappen.
  4. Ved hjælp af mikroskop fase justeringer, Placer den puppe fløj, så området at være såret direkte på linje med det kendte målområdet af ablation laser.
  5. Bruge en energi tæthed lyddæmper dias monteret på mikroskopet at manuelt justere effektniveau lysets ablation.
    Bemærk: Skyderen lyddæmper har klik stop og domme til at identificere den relative niveau af dæmpning og tillade anvendelse af reproducerbare indstillinger.
  6. Ved hjælp af en ekstern manuel udløser kontrol, aktivere ablation laser ved hjælp af et enkelt kort Klik på triggeren for at et sår. Tjek for udseendet af den forbigående luftboble på webstedet ablation da såret vil normalt ledsages det. Kontrollere hvis laser-induceret såret har været succesfulde ved hjælp af passende fluorescerende filtre til at visualisere den puppe epitel.
    Bemærk: sørge for at undgå utilsigtet eksponering for laserstråler som beam refleksioner kan forårsage alvorlige øjne eller hud skader.
  7. Hvis såret er mislykket, variere brændplanet (flytte mikroskop fokus lidt over eller under det aktuelle niveau, fokale) og Gentag et enkelt klik på udløseren ablation. Alternativt, gradvist øge laser power ved hjælp af diasset lyddæmper, indtil den ønskede sår størrelse er opnået.
  8. For at variere ablation laser gentagelse puls, bruge gentagelseshyppighed knop på den bageste Kontrolpanel (hvilket ændrer satsen fra mindre end 1 puls/s op til 60 Hz). For optimal såret, skal du angive gentagelse puls til 40 Hz.
  9. For at generere forskellige størrelse sår, skal du bruge energitæthed lyddæmper dias manuelt justere effektniveau lysets ablation.
  10. Afstå fra sårede alle de tilsluttede pupper og bruge disse ikke-ablated pupper som unwounded kontrol.
  11. For ensartede resultater, jævnligt justere ablation systemet (ved hjælp af den relevante betjeningsvejledning). Også, rense og genopfylde cellen farvestof resonator, der styrer laser output bølgelængde.

4. in Vivo Time-lapse Konfokal Imaging

  1. Hurtigt overføre den glas-bund fad til en passende mikroskop for time-lapse billeddannelse.
    Bemærk: Optimale resultater, bruge en høj specifikation Konfokal eller spinning disc mikroskop udstyret med følsomme detektorer, der kan afsløre både normal god landbrugspraksis og mCherry fluorophores.
  2. For at billede af hele puppe wing, bruge en lav forstørrelse (f.eks. 20 X) mål linse (figur 2A). For at billedet sår reparation og den ledsagende inflammatorisk respons med stor rumlig opløsning, bruge oliebestan 40 X (NA 1.3) eller 63 X (NA 1.4) Målet linser (Se repræsentative billeder i figur 2B-D).
  3. Åbn passende image capture software forbundet med mikroskop.
  4. Brug image capture software, tænde passende lasere fx 488 nm og 561 nm lasere til at visualisere normal god landbrugspraksis og mCherry fluorophores, henholdsvis (ved at klikke i de relevante bokse) og justere laser power og gevinst/offset indstillingerne til at give tilstrækkelig fluorescerende signal samtidig undgå pixel mætning; Brug den laveste mulige laser power (i området 5-20%) til at minimere photobleaching og fototoksicitet.
  5. At fange begge reparation epitel og inflammatoriske celle rekruttering, sæt mikroskop til at optage en z-stak ved hjælp af justeringsknapperne fine fokus på Kontrolpanel; for optimale resultater, indstille software (ved hjælp af manuel knap-klik) til at registrere z-skiver gennem den puppe fløj (minimum hver 3 mm), fra toppen af den sårede epitel igennem til det ekstracellulære rum under (indeholdende overflytter hemocytes) for at opnå en stor z-stak (i intervallet 50-100 mm).
  6. For time-lapse imaging, registrere z-stakke tidsintervaller (minimum hver 30 s) for mindst 1 h post såret.
    Bemærk: Den nøjagtige tidsintervallet mellem z-stakke valgt repræsenterer en trade-off mellem fanger hurtigt skiftende celle dynamics og undgå foto-blegning af prøverne.
  7. Du kan samtidigt billede flere pupper (herunder ikke-ablated unwounded kontrol), brug en motoriseret fase (knyttet til mikroskop) og funktionen multi-position erhvervelse tilgængelige inden for den billedbehandlingsprogrammer. Manuelt angive en placering for hver enkelte puppe i softwaren ved hjælp af scenen position kontrol drejeknapper og derefter manuelt indstille passende z-stakken grænser (top og bund) for hver enkelte puppe.
  8. Visualisere time-lapse billeder, enten under billedoptagelse eller senere med specialist billede analyse software (såsom ImageJ32) ved hjælp af z-stakken fremskrivninger eller 3D-rendering. For eksempel, at følge bevægelser af individuelle hemocytes (som i figur 2 c' og D'), track hemocyte kerner ved hjælp af open-access ImageJ plug-ins "TrackMate" eller "Manual sporingsmetoder" (offentliggjort i 33, 34).
  9. Bruge photoconvertible sonder (såsom Kaede30) til selektivt photoconvert og mærke et undersæt af epitel eller immun celler under imaging.
    1. Åbn relevante moduler inden for billedbehandling software til at udføre photoconversion (såsom FRAP, fluorescens opsving efter foto-blegning modul) og aktivere 405nm laser (ved at klikke i boksen relevant software)35.
    2. Vælg cellerne til at blive photoconverted inden for de FRAP software ved hjælp af firkantede, runde eller frihånd markeringsværktøjet. FRAP-softwaren, skal tid-kursus for photoconversion (blegning) til en enkelt iteration/ramme og angive 405 nm laser på 20% laser power. Klik manuelt starte forsøget for at udføre photoconversion.
    3. Afslutte FRAP modul (Klik på Luk) og vende tilbage til den oprindelige imaging skærm i softwaren; Brug 488 nm og 561 nm lasere til billede funktionsmåden for photoconverted og ikke-photoconverted celler ved at oprette en z-stakken og time-lapse optagelse som ovenfor.
      Bemærk: Photoconverted sonder forbliver stabilt i mange timer efter den første photoconversion, aktivering af funktionen af photoconverted cellerne skal følges over tid (for mindst 5 h). For eksempel, inflammatoriske celler i såret kan være selektivt photoconverted (figur 2F) og deres adfærd efterfulgt som de løse fra skaden site (figur 2 g og H).

Representative Results

Denne protokol beskriver forberedelse af Drosophila pupper til live time-lapse billeddannelse af sår reparation og betændelse i vivo. Ved hjælp af denne metode, bør det være muligt at generere flere med høj opløsning film puppe sår lukning og inflammatoriske celle rekruttering med lethed og image pupper i lang tidsperioder (mindst 5 h) post såret uden betydelige photobleaching.

En generel ordning for Drosophila puppe forberedelse

Figur 1 illustrerer den optimale metode for at forberede i vivo billeddannelse Drosophila pupper. Drosophila hvid 'prepupae' er indsamlet på '0 h' efter puparium dannelse (APF), som de kravlende larver ophøre motilitet og vedtage den stereotype puppe form med everteret vejrtrækning vedhæng (Spirakler) synlig på deres forreste yderste ende ( Figur 1A). Den hvide 0 h APF prepupae får lov til at udvikle til 18 h ved 25 ° C, på hvilket tidspunkt puparium er blevet brun (figur 1B) og er derefter dissekeret ved hjælp af fine pincet og/eller microscissors (figur 1 c, til at fjerne den puppe etui) til at afsløre den optisk gennemskinnelige puppe inden for (fig. 1 d). Efter dissektion bliver puppe vingerne synlige på de laterale sider af puppe brystkassen (vises med blåt, figur 1 c-D). På dette stadium er andre puppe kropsdele også nemt mærkbar, herunder øjne, ben og mave (mærket i figur 1 d). Benene er også velegnet til sår betændelse undersøgelser og kan blive såret med den samme laser metode beskrevet ovenfor. Flere 18 h APF pupper kan være monteret samtidigt inden for billedbehandling skålen (figur 1E, ved hjælp af heptan lim. og en vand-gennemblødt filtrerpapir for at minimere dehydrering) med fladeste del af wing (skitserede blå) i kontakt med coverslip ( Figur 1F); Dette er særligt fordelagtigt, hvis imaging mikroskop er udstyret med en motoriseret fase at tillade flere pupper registreres i én enkelt imaging periode. Enhver pupper, der er blevet beskadiget under dissektion eller montering skal kasseres (f.eks. puppe placeret tredje i rækkefølgen, pil i figur 1E). Andre dele af kroppen (f.eks. øjne og ben, skitserede pink) kan også kontakte coverslip og er tilgængelige for at have såret og efterfølgende imaging (figur 1F). For eksperimenter studerer enkelt sår, er laser-induceret skader generelt bedst påførte centralt i wing (stjernen, figur 1F), selv om andre steder kan anvendes, hvis flere sår skal undersøges.

Sterile såret aktiveres en robust inflammatorisk respons i Drosophila puppe fløj

For at følge sår reparation og den ledsagende inflammatorisk respons in vivo sårede vingerne af 18 h APF Drosophila pupper blev afbildet bruge time-lapse konfokalmikroskopi (figur 2A-H). På denne puppe stadie er wing epitheler enkle flade plader af celler (mærket her ved hjælp af normal god landbrugspraksis-tagged E-cadherin til at markere enkelte cellegrænserne, fløj margen skitseret i figur 2A). Selv i unwounded vinger (lav forstørrelse, tal 2A og 2A'), stort antal migrerende medfødte immun celler (hemocytes, mærket ved hjælp af srp-Gal4 drevet cytoplasmatisk NGL, grøn, og nukleare RFP, magenta) er fundet inden for () hemolymph insekt blod) besætter det mellemliggende ekstracellulære rum (figur 2A og 2A'). Laser-induceret skade til puppe wing epitel (såret margen skitseret i hvid, figur 2B-D) stimulerer en hurtig overførsel af hemocytes til webstedet sår (figur 2B-D og immun cellekerner i figur 2B '-D'). Mærkning hemocytes med både en nuklear markør (f.eks. den nukleare RFP 'red-stinger') i kombination med et cytoplasmatisk eller cytoskeletal markør (fx cytoplasmatisk normal god landbrugspraksis eller normal god landbrugspraksis-mærket Moesin) er særlig fordelagtige da det giver mulighed for at samtidige inddeling af hemocyte kerner (for automatiseret analyse af hemocyte adfærd fx overførsel hastighed og retningsbestemt) og visualisering af hemocyte morfologi. Sidstnævnte er vigtig, da det tillader os at afgøre, om hemocytes phagocytosing nekrotisk vragrester (figur 2 c, inset) på såret kant (eller mikrober i tilfælde af infektion)12,23 og tillader os også at følge deres protrusive adfærd som de udvide fine filopodia eller lamellipodia på deres forkant, da de vandrer mod eller væk fra såret.

Simpel sporing af hemocyte nukleare baner ved hjælp af passende billedanalyse software32 (Table of Materials) viser den komplekse spatio-temporale dynamikken i det inflammatoriske respons, svarende til det rapporterede tidligere for såret embryoner9,36 (multi-farvede spor, figur 2 c' og D'). Inden for kun 30 min på såret, hemocytes placeret tættest til skaden site begynder styret migration mod såret (figur 2 c'). Men med stigende tid efter skade, hemocytes beliggende gradvis yderligere væk fra skaden site også begynde styret migration mod såret (figur 2D'). På denne måde er en "bølge" af immun celle lydhørhed, der spreder sig udad fra såret kant observeret, som vi forestiller os for at afspejle diffusion af såret chemoattractant væk fra skaden site. Disse spatio-temporale immun celle dynamics forudsat et nyttigt udgangspunkt for vores seneste undersøgelse, der ansat sofistikerede matematiske modellering ('Bayesiansk inferens») analyse til at udlede nye egenskaber såret attractant signal (detaljerede metoder udgivet i23). Ved at kalibrere vores beregningsmæssige modeller, (der kædet hemocyte bias sår attractant gradient) så den passer til de observerede i vivo immun baner, kunne en ekstrakt detaljerede egenskaber såret attractant fra vores hemocyte bane data (såsom signal diffusion sats, kilde og varigheden af signal produktion)23.

Derudover ved at køre udtryk for photoconvertible fluorophore Kaede inden for immun celle afstamning ved hjælp af srp-Gal4 (grøn, figur 2E) vi har også kunnet selektivt mærke en delpopulation af disse vandrende wing hemocytes (f.eks. dem rekrutteret til webstedet sår. E, før UV-induceret photoconversion og F, post-photoconversion). Vi kan derefter følge funktionen af disse hemocytes over tid (magenta, figur 2 g-H), som de løse fra webstedet sår (pile, figur 2 g og H) og sammenligne, hvordan deres opførsel er forskellig fra de ikke-photoconverted celler, der ikke når skaden site. Vi har brugt dette i vivo mærkning teknik til at demonstrere, at hemocytes ansat til en indledende sår midlertidigt er desensibiliserede til en anden såret genereret 90 minutter senere23, selv om denne differentierede mærkning teknik kunne også har mange andre indsigtsfulde applikationer i fremtiden (Se diskussion).

Brug denne fremgangsmåde, kan vi også samtidig følge spatio-temporale dynamikken i såret reparation eller er epithelialisation' (figur 2B-D). Her allestedsnærværende udtrykt normal god landbrugspraksis-tagged E-cadherin etiketter cellulære adherens vejkryds i hele wing epitel og tillader figurer af individuelle epitelceller følges over tid. Såret kant er let identificeres som krydset mellem intakt normal god landbrugspraksis-mærket epitelceller og umærkede vragrester (hvide stiplede linje, figur 2B-D). For fleste af sår begynder såret at re epithelialize i 1 h af kvæstelser og sår kant forskud indad (figur 2D); sår af denne størrelse vil typisk heler inden for 2-3 h skade23. Såret lukning i både embryoner og pupper er drevet af en actomyosin kontraktile kabel sammen med førende actin-rige filopodia23,37; disse cytoskeletal dynamics kan visualiseres direkte under sår reparation ved hjælp af passende i vivo journalister, som normal god landbrugspraksis-tagged Spaghetti squash (Myosin regulerende lys kæde) eller normal god landbrugspraksis-tagged actin-bindende Moesin23. For nogle særligt store sår, men det actomyosin kabel og forkant filopodia varer ved ikke - disse sår blive 'kroniske' og aldrig helt igen epithelialize23 selv efter længere perioder (over 24 timer) af in vivo Imaging. Interessant, er det inflammatoriske respons forbundet med disse ikke-healing sår markant forskellig fra forbundet med normale akutte sår23 , unormal immun celle adfærd kunne være en nyttig prognostiske markør i klinikken . Yderligere i fremtiden, måske i vivo analyse af kroniske sår ved hjælp af langsigtede imaging (over 24 h) i den puppe model giver vigtigt mekanistiske indblik i denne invaliderende tilstand.

Figure 1
Figur 1: Drosophila puppe forberedelse til sårede og live imaging. (A) Drosophila hvid prepupae indsamlet på 0 h APF, med forreste ende angivet af everteret vejrtrækning vedhæng (Spirakler). (B) efter at hæve hvid 0 h APF prepupae til 18 h ved 25 ° C, puparium vises brune. Dissektion af den puppe sag bør begynde på forreste-mest region (pil), anført af de everted Spirakler som puppe ordentlig er fraværende fra denne region, og fine pincet og/eller microscissors anvendes til at fjerne den puppe etui (C). De puppe vinger vil være synlige på de laterale sider af den puppe thorax (blå konturer). (D) puppe tilfældet fjernet fuldstændig fra 18 h APF puppe, her puppe har været rullet 90 ° for at vise laterale side, med fløjen til afbildning vises med blåt. (E-F) Fem 18h APF pupper monteret på glas coverslip i imaging parabol med heptan lim., med vand-gennemblødt filtrerpapir at minimere dehydrering (E). Puppe placeret tredje i rækkefølgen (pil) skal kasseres som skader opstået under forberedelse. Pupper er monteret med den fladeste del af wing (skitserede blå) i kontakt med coverslip (F) og laser-induceret sår er genereret centralt i wing (stjernen, F), selv om andre steder kan anvendes, hvis flere sår er skal undersøges. Billedet i (D) tilpasset med tilladelse fra vævere et al., 201623. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Dynamisk i vivo analyse af den inflammatoriske reaktion på vævsskade. Pupper dissekeret fra beskyttende puppe tilfælde og monteret på glas coverslip (A) er såret og efterfølgende afbildet bruge time-lapse konfokalmikroskopi (B-H). Lav forstørrelse visning af den unwounded puppe fløj (A, fløj margen skitseret i hvidt), der indeholder store mængder af vandrende hemocytes (A'). Laser-induceret skade til puppe wing epitel (B-D, cellegrænserne mærket ved hjælp af normal god landbrugspraksis-tagged Drosophila E-cadherin, såret margen skitseret i hvidt) aktiveres en hurtig inflammatorisk respons med flere hemocytes ( -overførsel SRP-Gal4 drevet udtryk for nukleare RFP, magenta og cytoplasmatisk normal god landbrugspraksis, grøn) mod webstedet sår (B-D, repræsentative rammer fra en time-lapse film, hvor hvert billede er en projektion af 25 skiver 3 μm). Manuel sporing af hemocyte baner (multi-farvede spor, C' og D') angive komplekse spatio-temporale dynamikken i det inflammatoriske respons, ligner, rapporteres for sårede embryoner. Hemocytes også phagocytosis nekrotisk celleaffald på webstedet sår (pilespids, C og også). Udtryk for photoconvertible fluorophore Kaede i immun celle lineage (grøn, E, ved hjælp af srp-Gal4) gør det muligt for sår-ansat hemocytes (pil, E) at være varierende mærket (magenta, F) og fulgt over tid som de løse fra skade site (pile, G og H). De følgende puppe genotyper blev udnyttet: (A-D) w1118; ubi-DE-cad-NGL, srp-Gal4 > UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) og (E-H) w1118; srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III). Billeder tilpasset med tilladelse fra vævere et al., 201623. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Akut inflammatorisk reaktion på vævsskade er en kompleks og yderst dynamisk proces, der er afgørende for at orkestrere reparation af tilskadekomne væv, herunder clearance af nekrotisk snavs og til at bekæmpe infektion. For fuldt ud at forstå og optrævle grundlæggende aspekter af dette svar, er det afgørende, at undersøgelser er udført i vivo på 3-dimensionelle levende prøver i orden nemlig den præcise opførsel og samspillet mellem de forskellige celle lineages involveret skal følges præcist over tid. Real-time analyse af disse celle dynamics giver mulighed for en mere detaljeret karakterisering af mutant fænotyper end statisk enkelt tid-point fra faste prøver ved hjælp af klassisk Immunhistokemi teknikker. Traditionelt har brugt de fleste live imaging undersøgelser ved hjælp af genetisk tractable Drosophila model fruitfly embryonale udviklingstrin på grund af sine optiske gennemskinnelighed og ubevægelighed i forhold til den senere udviklingsstadier4 , 5. men mere for nylig vores gruppe og andre har udviklet Drosophila puppe som en roman model til at udføre høj opløsning og langsigtede imaging sår og betændelse samtidigt i vivo8,22 ,23. Denne nye tilgang tilbyder en spændende langsigtede potentiale for unraveling grundlæggende aspekter af den inflammatoriske celle adfærd og kan tilpasses yderligere for at undersøge den dynamiske opførsel af andre celle lineages (såsom Drosophila adipocytter 38) efter vævsskade.

Der er en række kritiske faktorer under forberedelse og billeddannelse af sårede Drosophila pupper, der afgør kvaliteten af imaging resultaterne beskrevet ovenfor. Velsagtens er det mest vanskelige skridt af den beskrevne protokol omhyggelig dissektion og præcis positionering af pupper inden såret og billedbehandling. Pupper på denne udviklingsstadiet er ekstremt skrøbelige og selv mindre utilsigtet skade på pupper under forberedelse faser vil væsentligt forringer eksperimentet; enhver pupper, der kan have fået utilsigtede skader skal kasseres fra forsøget, da denne skade kunne aktivere sin egen inflammatorisk reaktion, som kunne føre til mere udbredt (eller endda systemisk) effekter på inflammatoriske celle opførsel andre steder i puppe. På grund af den igangværende udvikling af pupper udnyttes i disse eksperimenter (som undergår betydelige væv rearrangementer for at forberede voksenalderen væv), lejlighedsvis pupper vil flytte i løbet af billedbehandling. Puppe rullende er, dog, mere tilbøjelige til at opstå, hvis pupper ikke har været monteret korrekt med den fladeste overfladen af fløjen (eller andre væv til afbildning) i den direkte kontakt med daekglas; Brug af heptan lim. til at stabilisere pupper på dækslet glas bør minimere denne uønskede bevægelse. Af denne grund, skal stor omhu også taget at undgå løs pupper fra deres nøje justerede positioner, når du flytter prøverne mellem mikroskoper; ideelt, såret laser vil blive knyttet til den samme mikroskop bruges til efterfølgende time-lapse imaging og foto-konvertering.

Ud over præstationsprøvninger af puppe dissektion og montering trin, vil Drosophila pupper bruges præcise genotype har en betydelig indvirkning på kvaliteten af de billeddiagnostiske data genereret. For eksempel, afgør antallet af kopier af Gal4 driver og UAS konstruktioner (f.eks. UAS-normal god landbrugspraksis eller UAS-Kaede) inden for en individuel puppe genotype signal til støjforhold under efterfølgende billeddannelse. Som en generel regel, de flere kopier af et Gal4 eller UAS konstruere øjeblikket, jo større det samlede niveau af fluorescerende proteiner (f.eks. normal god landbrugspraksis eller Kaede) inden for væv. Det optimale niveau af fluorescerende proteiner bliver dog en omhyggelig balance mellem opløftende væv fluorescens tilstrækkeligt til at give høj kvalitet billeddannelse (brug af lavere laser beføjelser, reduktion af photobleaching aktiveres og imaging over længere tid perioder), men uden at forårsage fluorophore-induceret cellulære toksicitet; det optimale antal Gal4 og UAS konstruktioner i hvert forsøg vil variere alt efter de særlige drivere og fluorophores bliver brugt. Bør sikres at hæve pupper ved 25 ° C (eller over op til 29 ° C), fordi Gal4-UAS system er temperatur følsom og vil være ineffektivt på lavere temperaturer31. For at opnå yderligere niveauer af kontrol over væv eller tid-specificiteten af Gal4 -drevet udtryk, kan Gal4-UAS system repressor Gal80 også inkluderes i puppe genotype39. Gal80 kan enten bruges til at undertrykke Gal4 aktivitet inden for en bestemt væv (ved hjælp af en væv-specifik Gal80) eller på et bestemt tidspunkt (ved hjælp af en temperatur følsom Gal80). Gal4-UAS system kan yderligere kombineres med andre uafhængige binære systemer (såsom LexA -lexAop og QF -QUAS systemer) til at generere Drosophila som har flere konstruktioner (f.eks. fluorophores, RNAi linjer eller andre genetiske konstruktioner) samtidig til udtryk i en række forskellige væv39.

Brug af denne nye Drosophila puppe model tilbyder en række fordele i forhold til de mere traditionelle embryo tilgang. I forhold til de kortsigtede imaging (op til 3 h) tilgængelig i fase 15 embryoner (fase hvor mest embryonale såret undersøgelser udføres), pupper kan være afbildet over betydeligt længere perioder (i princippet indtil voksenalderen efter 96 timer puppe udvikling ). Desuden langt større antal hemocytes (Drosophila medfødte immun celler) er stede i puppe væv (og tilgængelige for imaging) sammenlignet med mere begrænset antallet stede i fosteret og dette har tilladt os at samle betydeligt mere billeddiagnostiske data på hemocyte adfærd ved hjælp af den samme samlede antal enheder. Afgørende, har dette, til gengæld aktiveret os til at anvende mere avancerede matematiske modellering for at analysere hemocytes adfærd og udtrække roman egenskaber såret attraktanter og inflammatoriske respons, der ellers ville forblevet eksperimentelt utilgængelige23. En anden fordel ved den puppe model er, at RNAi-medieret gen knockdown er betydeligt mere effektivt end på tidligere embryonale stadier, giver forbedret analyse af væv eller time-specifik genet inaktivering ved hjælp af binære systemer såsom Gal4-UAS system 39. effektiviteten af RNAi på nuværende tidspunkt således åbner mulighed for at udføre store skala (eller endda upartiske genome-wide) RNAi skærme for at søge efter nye aktører i enten sår reparation eller inflammatorisk celle adfærd.

Dog Drosophila pupper klart kan ikke bruges til at studere fænotyper som følge af genetiske mutationer, som er embryonale dødbringende; funktionel og live imaging studier af gener, der er afgørende for embryonale udvikling skal derfor stadig udføres i embryoner, medmindre RNAi-medieret gen knockdown i en tid eller væv-specifik måde tillader udvikling at opstå gennem puppe faser. Fosteret er også fortsat model valg at studere og live-billede visse funktioner af immun celle adfærd, herunder udviklingsmæssige spredningen af immunceller fra deres oprindelse, kontakt-inhibering af bevægelse og fagocytose af apoptotiske lig genereret under udviklingsmæssige væv sculpting5,8 , som endnu ikke er blevet overholdt i puppe modeller. Selv om undersøgelser i Drosophila larver og voksne har givet et vigtigt indblik i mekanismerne bag såret reparation og betændelse40,41,42,43, 44 live imaging undersøgelser på disse stadier har vist sig vanskeligt på grund af prøverne, der i sagens natur mobil karakter. Medens larverne kan være bedøvede tillade korte perioder af live-imaging, på grund af den midlertidige karakter af anæstesi, kun korte snapshots af levende såret reparere eller inflammatoriske respons kan være visualiseret45. En nylig undersøgelse har nu udviklet en forbedret protokol, der tillader mere langsigtede billeddannelse af larve sårheling46, selv udarbejdelse og imaging stadig forblive betydeligt mere udfordrende end i embryoner eller pupper. I den langsigtede forestiller vi at ved at udnytte den mest hensigtsmæssige udviklingsstadiet for at løse hver specifikke spørgsmål, undersøgelser i alle fire af disse forskellige Drosophila faser - fra embryoner gennem larve og puppe perioder til voksenalderen (hver med deres egen unikke fordele og begrænsninger) - vil give supplerende indsigt i de molekylære og cellulære mekanisme kørsel sår reparation og betændelse.

Fremover vil denne protokol for sårede og langsigtede billeddannelse af Drosophila pupper nemt kan tilpasses til at studere en række betændelse-relaterede fænomener og har vidtgående muligheder for at afdække nye funktioner af inflammatoriske sår svar. Kombinationen af langsigtede imaging, sammen med anvendelse af photoconvertible fluorophores (såsom Kaede), er af stor værdi for at forstå dynamikken i medfødte immun celle adfærd og navnlig den langt mindre forstået opløsning fase af såret inflammatorisk respons. Ved specielt mærkning enten individet eller delpopulationer af immunceller (f.eks. ansatte på et sår) vil det være muligt at analysere hvordan eksponering for en miljømæssig cue (f.eks. en liget eller skade) påvirker den immun celle efterfølgende svar på et senere cue. Drosophila hemocytes provokerende adfærd kan ændres af tidligere erfaringer - for eksempel, de er klar til at reagere på vævsskade af forudgående fagocytose af apoptotiske lig under udvikling12 men det er stadig uvist om andre miljømæssige stikord fremkalde lignende priming begivenheder. Selv om undersøgelser af puppe sår hidtil har fokuseret på de medfødte inflammatorisk respons, puppe wing model også giver en ideel mulighed for at både live-billede og dissekere de underliggende epitelial sår reparation mekanismer. Desuden kunne dette puppe billedmetoden også tilpasses for at undersøge den dynamiske opførsel af andre celle lineages i svar til væv skader38, enten i den puppe fløj, sig selv eller andre lettilgængelige puppe væv (såsom øjne, ben eller thorax). Endelig, ved at kombinere den genetiske sporbarhed af Drosophila sammen med lethed af langsigtede puppe imaging, Roman epitelial reparation eller inflammatorisk tilsynsmyndigheder kunne være afdækket gennem anvendelse af uvildige genome-wide knock-down tilgange.

Disclosures

Forfatterne erklærer, de har ingen konkurrerende interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke medlemmerne af Martin, Nobes, Richardson og træ labs for nyttig diskussion. Vi takker også Wolfson Bioimaging facilitet (University of Bristol, UK), Bloomington Stock centrum (Universitet i Indiana, USA) og Vienna Drosophila Resource Centre (for Drosophila bestande) og Flybase (for op til dato Drosophila gen annotation). Dette arbejde blev støttet af en MRC Project Grant til P.M. og WW (hr./J002577/1), en Wellcome Trust Senior stipendium til WW og en Wellcome Trust Investigator Award til kl.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila stocks
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin
;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)		 Kyoto Stock Center, DGRC #109007 Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin
;;Ubi-p63E-shg.GFP (III)		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #58742 Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged Moesin
P{sGMCA}3.1		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #59023 The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T.
hemocyte specific serpent-Gal4 driver
;srp-Gal4;		 Generated by Katja Bruckner Generated by Katja Bruckner Expression of Scer\GAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP
w1118;;P{UAS-RedStinger}6		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #8545 or #8547 UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal
UAS-cytoplasmicGFP
;;P{UAS-GFP.S65T}		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) Multiple stocks available (e.g. #1522) Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness.
UAS-photoconvertibleKaede
w1118;; P{UAS-Kaede.A}3		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #26161 Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV.
GFP-tagged spaghetti squash
w1118;;P{sqh-GFP.RLC}		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #57145 The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:Avic\GFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter.
Name Company Catalog Number Comments
Ingredients for fly food media Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.)
maize Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
soya flour Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
malt extract Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
molasses Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
Difco agar BD Biosciences, Fisher Scientific DF0142-15-2 For preparation of fly food
Propionic acid Sigma 402907 For preparation of fly food
Nipagen Sigma 79721 For preparation of fly food
Dried baker's yeast Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD For preparation of fly food
Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation and mounting
Parafilm Sigma P7793-1EA For preparation of heptane glue
Fine sable paintbrush Daler-Rowney (or equivalent) #0 or 1
Forceps Fisher Scientific (or Fine Science Tools) NC9404145 Dumont #5
Glass bottomed dishes for imaging MatTek P35G-0-10-C We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment.
Heptane Sigma 51730-5ML For preparation of heptane glue
Double sided sticky tape (e.g. Scotch) Agar Scientific AGG263 For preparation of heptane glue
50ml tube (for heptane glue) Falcon tubes from Fisher Scientific 14-432-22 For preparation of heptane glue
Glass microscope slides Agar Scientific AGL4244 For dissection of Drosophila pupae
Dissecting stereo microscope with brightfield Leica (or equivalent) M50 For dissection of Drosophila pupae
Microscissors John Weiss International 103123 Miniature Research Scissors (straight)
Name Company Catalog Number Comments
Laser ablation and imaging
Nitogen ablation laser Spectra-Physics (or Andor equivalent) Model VSL-337ND-S For wounding, this should be attached to a widefield imaging system
Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) Leica (or equivalent) TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal)
Environmental chamber Life Imaging Services (or equivalent) "Microscope Temperature Control System" Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging
Name Company Catalog Number Comments
Image Analysis Software
FRAP software module Leica (or equivalent) CLSM FRAP software module For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede
ImageJ (image analysis software) National Institutes of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/ Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012.
ImageJ plugin "Manual Tracking" National Institutes of Health (NIH) https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJ plugin "TrackMate" ImageJ, NIH https://imagej.net/TrackMate Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (high performance 3D imaging software) Perkin Elmer Volocity 6.3 For image analysis
IMARIS (image analysis software) Bitplane IMARIS for Cell Biologists For image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration. Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).
  2. Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
  3. Martin, P., Nunan, R. Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing. British Journal of Dermatology. 173 (2), 370-378 (2015).
  4. Razzell, W., Wood, W., Martin, P. Swatting flies: modelling wound healing and inflammation in Drosophila. Disease Model and Mechanism. 4 (5), 569-574 (2011).
  5. Wood, W., Martin, P. Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly. Development Cell. 40 (3), 221-233 (2017).
  6. Mohr, S. E., Smith, J. A., Shamu, C. E., Neumüller, R. A., Perrimon, N. RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 591-600 (2014).
  7. Muñoz-Soriano, V., López-Domenech, S., Paricio, N. Why mammalian wound-healing researchers may wish to turn to Drosophila as a model. Experimental Dermatology. 23 (8), 538-542 (2014).
  8. Weavers, H., Wood, W. Creating a Buzz about Macrophages: The Fly as an In Vivo Model for Studying Immune Cell Behavior. Developmental Cell. 38 (2), 129-132 (2016).
  9. Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. Journal of Cell Biology. 168 (4), 567-573 (2005).
  10. Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biolog. 173 (3), 405-416 (2006).
  11. Razzell, W., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Calcium flashes orchestrate the wound inflammatory response through DUOX activation and hydrogen peroxide release. Current Biology. 23 (5), 424-429 (2013).
  12. Weavers, H., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Corpse Engulfment Generates a Molecular Memory that Primes the Macrophage Inflammatory Response. Cell. , (2016).
  13. Stramer, B., Winfield, M., Shaw, T., Millard, T. H., Woolner, S., Martin, P. Gene induction following wounding of wild-type versus macrophage-deficient Drosophila embryos. EMBO Reports. 9 (5), 465-471 (2008).
  14. Matsubayashi, Y., Coulson-Gilmer, C., Millard, T. H. Endocytosis-dependent coordination of multiple actin regulators is required for wound healing. Journal of Cell Bioliogy. 210 (3), 419-433 (2015).
  15. Evans, I. R., Rodrigues, F. S. L. M., Armitage, E. L., Wood, W. Draper/CED-1 Mediates an Ancient Damage Response to Control Inflammatory Blood Cell Migration In Vivo. Current Biology. 25 (12), 1606-1612 (2015).
  16. Zanet, J., Stramer, B., Millard, T., Martin, P., Payre, F., Plaza, S. Fascin is required for blood cell migration during Drosophila embryogenesis. Development. 136 (15), 2557-2565 (2009).
  17. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  18. Ninov, N., Martín-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nature Protocols. 2 (12), 3074-3080 (2007).
  19. Gho, M., Bellaïche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126 (16), 3573-3584 (1999).
  20. Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
  21. Berh, D., Scherzinger, A., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C., Risse, B. Automatic non-invasive heartbeat quantification of Drosophila pupae. Computers in Biology and Medicine. 93, 189-199 (2018).
  22. Sander, M., Squarr, A. J., Risse, B., Jiang, X., Bogdan, S. Drosophila pupal macrophages--a versatile tool for combined ex vivo and in vivo imaging of actin dynamics at high resolution. European Journal of Cell Biology. 92 (10-11), 349-354 (2013).
  23. Weavers, H., Liepe, J., Sim, A., Wood, W., Martin, P., Stumpf, M. P. H. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26 (15), 1975-1989 (2016).
  24. Fristrom, D., Wilcox, M., Fristrom, J. The distribution of PS integrins, laminin A and F-actin during key stages in Drosophila wing development. Development. 117 (2), (1993).
  25. Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Development Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
  26. Berg, H. Random Walks in Biology. , Princeton University Press. Available from: http://press.princeton.edu/titles/112.html (1993).
  27. Diehl, H., Ihlefield, H., Schwegler, H. Physik fur Biologen. , Springer-Verlag. (1991).
  28. Stewart, P. S., McFeters, G. A., Huang, C. T. Biofilm control by antimicrobial agents. Biofilms II Process Analysis and Application. , 373-405 (2000).
  29. Milo, R., Phillips, R. Cell Biology by the Numbers. , Garland Science. Available from: https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1 (2015).
  30. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceeding of National Academy of Science U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  31. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Cordelières, F. Manual tracking. National Institutes of Health. , Available from: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2015).
  34. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  35. Grueber, W., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  36. Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biology. 173 (3), 405-416 (2006).
  37. Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
  38. Franz, A., Wood, W., Martin, P. Fat Body Cells Are Motile and Actively Migrate to Wounds to Drive Repair and Prevent Infection. Developmetal Cell. 44 (4), 460-470 (2018).
  39. del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2012).
  40. Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and Cell Fusion Contribute to Wound Healing in the Adult Drosophila Epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
  41. Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science U S A. 105 (29), 10017-10022 (2008).
  42. Galko, M. J., et al. Cellular and Genetic Analysis of Wound Healing in Drosophila Larvae. PLoS Biology. 2 (8), e239 (2004).
  43. Brock, A. R., et al. Transcriptional regulation of Profilin during wound closure in Drosophila larvae. Journal of Cell Science. 125 (23), (2013).
  44. Wu, Y., Brock, A. R., Wang, Y., Fujitani, K., Ueda, R., Galko, M. J. A blood-borne PDGF/VEGF-like ligand initiates wound-induced epidermal cell migration in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (17), 1473-1477 (2009).
  45. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila Larvae to Study Epidermal Wound Closure and Inflammation. Methods in Molecular Biology. 1037, 449-461 (2013).
  46. Kakanj, P., et al. Insulin and TOR signal in parallel through FOXO and S6K to promote epithelial wound healing. Nature Communications. 7, 12972 (2016).

Tags

Immunologi og infektion sag 136 sår healing betændelse medfødt immunitet Drosophila melanogaster Drosophila puppe hemocyte celle migration live imaging laser ablation Konfokal mikroskopi photoconversion
Langsigtet <em>In Vivo</em> sporing af inflammatoriske celler dynamikken i <em>Drosophila</em> pupper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weavers, H., Franz, A., Wood, W.,… More

Weavers, H., Franz, A., Wood, W., Martin, P. Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae. J. Vis. Exp. (136), e57871, doi:10.3791/57871 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter