Summary
Мы представляем эффективной и простой в использовании протокола для подготовки начального клеточных культур данио рерио эмбрионов для transfection и живых клеток, а также протокол для подготовки первичной клетки мозга взрослых рыбок данио.
Abstract
Данио рерио эмбрионов являются прозрачными и быстро развиваются вне матери, что позволяет отлично в vivo визуализации динамических биологических процессов в нетронутыми и развивающихся позвоночных. Однако в целом монтирует ограничено подробных изображений морфологии клеток различных типов и внутриклеточных структур. Таким образом мы создали эффективный и простой в использовании протокола для живых клеток первичной культуре zebrafish эмбриона и взрослых ткани.
Короче говоря 2 dpf zebrafish эмбриона, dechorionated, deyolked, стерилизации и отделить в отдельные ячейки с коллагеназы. После шага фильтрации клетки первичной покрытием на стекла дно блюда и культивировали в течение нескольких дней. Свежих культурах, как долго термин differenciated, может использоваться для высокого разрешения конфокальный изображений исследования. Культура содержит различных типов клеток, с striated миоцитов и нейронов, видные на поли L-лизин покрытие. Чтобы специально внутриклеточных структур label флуоресцентных маркеров белков мы также создали электропорации протокол, который позволяет трансфекции плазмидной ДНК в различных типов клеток, включая нейронов. Таким образом в присутствии оператора определенные стимулы, поведение сложных клеток и внутриклеточных динамики первичных данио рерио клеток может оцениваться с высоким пространственным и временным разрешением. Кроме того с помощью головного мозга взрослых рыбок данио, мы демонстрируем, что описанные диссоциации технику, а также основных условий культивирования, также работать для взрослых рыбок данио ткани.
Introduction
Данио рерио (данио рерио, D. рерио) — популярная модель позвоночных для многочисленных областей фундаментальных и биомедицинских исследований1. Данио рерио эмбрионы быстро развиваться ex внутриутробно, прозрачным, и подходят под микроскопом, таким образом обеспечивая отличные предпосылки для изучения развития позвоночных в живом организме. Из-за генетических уступчивость данио рерио2были созданы многие стабильной репортер трансгенных линий с выражение определенного типа клеток различных флуоресцентных маркеров, что позволяет для наблюдения за конкретными клеточных популяций. Данио рерио сообщество предлагает целый ряд так называемых Gal4-водитель линий, которые несут трансген, выражая синтетических Kal4TA4 (или KalTA3-эквивалент GalFF) гена с доменом Gal4-ДНК связывающих дрожжей сливается с вирусной transcriptional активации домены под контролем усилители определенного типа клеток. Эти линии драйвер пересечены эффекторных линий, которые осуществляют трансгенов, состоящий из определенной последовательности вверх по течению активация (УАС) сливается с Репортер ген. Kal4TA4 протеин связывает к элементу UAS, тем самым активизируя ячейки типа селективный выражение Репортер ген3,4. Этот подход позволяет весьма разнообразных комбинаторной исследований почти всех доступных enhancer и репортер элементов в двойной трансгенных животных.
Однако углубленных живых изображений с упором на отдельные ячейки или их субцеллюлярные содержание ограничено в целом и постоянно меняющейся эмбриона. Для решения биологических вопросов конкретных клеток с высоким разрешением, часто предпочтительнее использование клеточных культур. Существуют некоторые клеточных линий данио рерио, но они считаются сильно выбранных5,6,7 и их распространения часто занимает много времени. Кроме того все доступные клеточных линий являются фибробластов производные, ограничивая эксперименты с использованием культуры клеток к одному типу клеток. Таким образом мы установили эффективный и простой в использовании протокола подготовить Главные ячейки непосредственно из zebrafish эмбриона и взрослых рыбок данио мозга, а также подходы для увеличения продолжительности жизни, культуры и расширения разнообразия культивируемых типы клеток. Кроме того мы представляем процедура transfect эмбриональных клеток первичной с конструкциями выражение для флуоресцентных органеллы маркеров. Таким образом клеточной морфологии и внутриклеточных структур могут быть проанализированы с высоким пространственным и временным разрешением в типах различных клеток, которые сохраняют свои основные характеристики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные описанные здесь ведется в соответствии с правовыми нормами (ЕС-Директива 2010/63). Обслуживание и обработка рыбы утвержден местными властями и животных представитель технический университет Брауншвейга и Нижней Саксонии государственного управления защиты прав потребителей и безопасности пищевых продуктов (LAVES, Ольденбург, Германия; BS (02.05) TU TSchB AZ. §4).
1. Подготовка первичной клеток эмбрионов у рыбок данио
- Подготовка 2 дня пост оплодотворение (dpf) zebrafish эмбриона
- День 1: Настройка нескольких переходах штамма данио рерио выбора и согласно спецификации вашего данио рерио фонда менеджер8.
- День 2: Mate рыбы и собирать яйца8 непосредственно после нереста в 10 см Петри (пластик). Удалите Мертвого или загрязненных яиц с пипетка Пастера (пластик). Мыть яйца 1 x с Danieau 30% (5,8 мм натрия хлорид, хлорид калия 0,07 мм, 0,04 мм магния сульфат, нитрат кальция 0,06 мм, 5 мм 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic кислоты, рН 7,2)8 с метиленовым синим 0,0001% (w/v). Обмен средне-Danieau 30% без Метиленовый синий, так как может вызвать аутофлюоресценция метиленовым синим и инкубировать яйца в ночь на 28 ° C.
Примечание: Начните с минимум 100 яиц на линии рыб для того чтобы получить достаточное количество клеток. Не вызывают более чем 150 эмбрионов в одной чашке Петри. - День 3: Удаление мертвых или загрязненных эмбрионов и обмена средне-Danieau 30%. Определите количество эмбрионов путем подсчета. Инкубировать эмбрионов в ночь на 28 ° C.
Примечание: При использовании трансгенные линии, выражая флуоресцентный репортер, скрининг на 1 dpf или 2 dpf может быть необходимым.
Примечание: Для большего количества эмбрионов, рекомендуется принять черно-белое изображение соответствующих Петри (рис. 1A) и подсчитать количество эмбрионов с изображений программное обеспечение. - День 4: Эмбрионов в настоящее время 2 dpf. Чтобы удалить chorions, добавить 1 мл Проназа при концентрации 1 мг/мл по 10 мл 30% Danieau8 и инкубировать эмбрионов в шейкере при комнатной температуре до тех пор, пока все chorions являются отдельные (20 – 40 минут в зависимости от температуры окружающей среды). Стирка с Danieau 30% для удаления Проназа и chorions и держать эмбрионов при комнатной температуре до дальнейшего использования.
- Приготовление блюд нижней многоразовые поли L-лизин стекла с покрытием
Примечание: Коммерчески доступных стекла дно блюда предназначены для одноразового использования только и дорогим. Следующая процедура описывает, как подготовить многоразовые самодельные стекла дно блюда из стандартных лабораторных материалов.- Просверлите отверстие диаметром 10 мм в нижней части стандартной ячейки культуры блюд (диаметр 6 см, пластик) (рис. 1B). Вымойте блюдо дно тщательно с водопроводной водой для удаления пыли бурения.
- Распространения Силиконовая смазка вокруг отверстия на нижней блюдо дно и прикрепить coverslip с помощью смазки как клей. Убедитесь, что жир тюленей разрыв между блюдо дно и coverslip.
Примечание: Убедитесь в том, что толщина используемых coverslips подходит для позднее визуализации приложений. - Мыть посуду самодельные стекла дно тщательно, но осторожно, холодной водопроводной водой и мылом. Промойте стекло дно блюда три раза с дейонизированной водой, чтобы удалить мыла. Воздушно-сухой блюдо крышки и блюдо дно и хранить их в коробке чистого до дальнейшего использования.
- В день подготовки культуры (день 4 см 1.1.4): Смочите оба внутри блюдо крышки и блюдо дно с 70% (v/v) этанола. Поместите блюдо крышки и блюдо дно вверх с внутренней стороны в стерильных верстак с ламинарным потоком и УФ-излучения. Просушите пока испарится этанола, а затем применять УФ света 20 мин. После этого лечения блюда собираются и рассматривать как стерильные.
- Для покрытия, Пипетка 200 мкл поли L-лизин (0,1 мг/мл) в середине каждое блюдо дно стекла и распространилась на coverslip жидкости, разбив поверхностное натяжение с кончиком пипетки. Пусть сухой для 60 мин, затем вымыть 1 x с стерильных 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Удалите жидкость. Держите блюда под скамейке до дальнейшего использования.
Примечание: Другие покрытия может испытываться в зависимости от цели эксперимента. Мы нашли поли L-лизин достаточно для поддержки роста нейронов, в то время как лечение пластика без каких-либо дополнительных покрытий, по-видимому, благоприятные для роста фибробластоподобных клеток (Рисунок 1E, F).
Примечание: Самодельные стекла дно блюда может использоваться много раз. Для обмена coverslip, вымыть теплой водопроводной водой, тщательно снимите coverslip и удалить оставшиеся смазка с 70% (v/v) этанола и мыло.
- Подготовка и покрытия начальных клеток
- В день подготовки культуры (день 4 см 1.1.4): переноса эмбрионов в стерильных клетки культуры блюдо (диаметр 6 см) с помощью свежих Пластиковые пипетки Пастера. Удалите жидкость скачкообразно, до тех пор, пока все эмбрионы собираются в большие капли с диаметром около 2 см или меньше.
- Блюдо с эмбрионов в стерильных верстак и добавить CO2-независимый средний (с 10% (v/v) отфильтровывать технического индикатора бычьим сывороточным, 1 x глютамина и 1,2% (v/v) 10 000 U пенициллин-стрептомицином; средний с все добавки находится в следующих называется «клетки культуры среднего») до тех пор, пока блюдо, наполовину заполненной.
Примечание: Альтернативы CO2-независимый средний может испытываться в зависимости от цели эксперимента, как например neurobasal средний, средний DMEM или Лейбовиц в L-15 среде. CO2-независимых среднего и среднего L-15 Лейбовиц имеют то преимущество, не требующих CO2 инкубатора. - Чтобы удалить желток, Пипетка эмбрионов вверх и вниз с помощью кончика 200 мкл пипетки. Успешное deyolking могут быть признаны помутнение среды.
- Заполните клетки культуры блюдо с 70% (v/v) этанола и другой клетки культуры блюдо со свежими клетки культуры среднего. Используйте кончик отсечения 1000 мкл дозатор для переноса эмбрионов в стерильных ячейки ситечко с ручкой (40 мкм; Рисунок 1 c). Возьмите фильтр за ручку и окунуть его в блюдо с этанолом, так что все эмбрионы погружения на 5 s. сразу же потом, опускайте ситечко с эмбрионами в блюдо с свежие клетки культуры среднего.
Примечание: Ячейки сита может быть повторно использован несколько раз. Протереть мягкой щеткой под струей водопроводной воды, хранить их в 70% этанола, а сухой и УФ лечить их под стерильную работу скамейке непосредственно перед использованием (см. также 1.2.4). - Перенос эмбрионов в стерильных 1,5 мл реакции трубы (примерно 100 эмбрионов в одной тубе). Добавьте коллагеназы (тип 2) разводят в среде культуры клеток до конечной концентрации 4 мг/мл в общем объеме 1 мл. Инкубируйте трубы с эмбрионов на вращателе вертикальные трубки с 30 оборотов в мин 45 мин при комнатной температуре.
- Отделить оставшиеся ячейки сгустки, дозирование смеси эмбриона коллагеназа вверх и вниз с наконечником 1000 мкл пипетки. Затем фильтр суспензию клеток через стрейнер стерильных ячейки с вентиляционной прорезью (40 мкм; Рисунок 1 d) в 50 мл Конические трубки. Промойте ситечко с приблизительно 10 мл свежего клеток питательной среды.
- Пелле клетки центрифугированием на 3 мин при 180 x g. Таблетки могут быть почти невидимым. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 200 мкл свежие клетки культуры среднего за 30 первоначально используются эмбрионы.
Примечание: Чтобы получить видимый Пелле, рекомендуется начать с как минимум 100 эмбрионов. - Пипетка 200 мкл суспензии клеток, полученных на шаге 1.3.7 непосредственно на стекло области блюдо дно самодельные поли L-лизин покрытием стекла (см. 1.2). Инкубируйте 60 мин при комнатной температуре под стерильную верстак. Добавить 6 мл свежего клеток питательной среды и инкубировать Главные ячейки на 28 ° C.
- Выполните нужную визуализации приложений, с помощью инвертированного микроскопа при 28 ° C. Обмен клетки культуры среднего ежедневно. Культур может использоваться для обработки изображений в течение нескольких дней после покрытия (ДАП).
Рисунок 1: культуры главной ячейки zebrafish эмбриона. (A) черно-белое изображение 1 ДАП эмбрионов, которые могут быть обработаны программное средство для анализа количество эмбрионов. (B) клетки культуры блюда (диаметр 6 см) с просверленное отверстие (диаметр 10 мм) используются для подготовки многоразовые самодельные стекла дно блюда. (C) ячейки сита (40 мкм) с простой ручкой используются как «Подсачеки» окунуться deyolked эмбрионов в этанол и быстро передать их свежие клетки питательной среды. (D) ячейки сита (40 мкм) с вентиляционными слоты используются для фильтрации клетки после коллагеназы опосредованной диссоциации. (E) после того, как 5 ДАП, Главные ячейки посеян на стекле, главным образом с поли L-лизин покрытием форме нейронов с выраженным расширений. Шкалы бар = 100 µm. (F) после того, как 5 удить рыбу на лечение пластика без покрытия, фибробластоподобных клеток зарастают культуры. Шкалы бар = 100 µm. (E) и (F) были приобретены в Микроскоп epifluorescent. (G) ДАП половым свете изображение первичных элементов, производных от дикого типа данио рерио на 1. Полосатая миоцитов и кластеры нейронов, расширяя тонкие процессы можно легко заметить. Шкалы бар = 50 µm. (H) культивируемых клеток трансгенные линии тг (ptf1a: eGFP) jh1, который выражает eGFP в нейрональных прародителями основном ГАМК нейронов в задний мозг и подмножество клеток сетчатки населения29, 30 , 31. Шкала бар = 50 µm. (G) и (H) были приобретены конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с использованием стекла дно блюда, приготовленные как показано на рисунке (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
2. transfection первичных клеток с плазмидной ДНК
- Ресуспензируйте отфильтровывать технического индикатора и гранулированных клеток, полученных в шаг 1.3.7 в ПБС вместо среднего культуры клеток. Пятно Алиготе суспензию клеток с Трипановый синий для определения количества клеток в Счетной камере9.
- Смешать с 10 мкг Ультрачистые плазмидной ДНК в пробке реакции 1,5 мл 0,5 миллиона клеток и отрегулировать общий объем до 100 мкл с ПБС.
Примечание: Для наших экспериментов, мы главным образом используется выражение конструкций на основе плазмида pCS2 +10. Выражение открытом чтения фреймов, клонированные в несколько клонирования сайт pCS2 + управляется вездесущие промоутер человека цитомегаловирусом (CMV промоутер). Другие выражения конструкции и промоутеров может испытываться (см. также представитель результаты и рис. 2 и рис. 3). - Передача клетки ДНК смесь сразу кювет электропорации (0,4 см), место кювета в электропорации устройства и electroporate со следующими параметрами: одноразовый импульс, экспоненциального распада, 280 V, 950 МКФ.
- Непосредственно после электропорация передачи клетки ДНК смесь в 1,5 мл трубку реакции с 300 мкл свежие клетки питательной среды.
- Плита 200 мкл суспензии клеток, как описано в 1.3.8 и действовать как описано в 1.3.9 в зависимости от конструкции используется выражение, выражение флуоресцентных белков может быть обнаруживаемыми, после нескольких часов или на следующий день.
3. Окрашивание фиксированной Главные ячейки
Примечание: Внутриклеточных структур также могут быть визуализированы на классический иммуноокрашивания вместо флуоресцентные синтеза белка журналистам. Данио рерио начальных ячеек мы используем следующие стандартный протокол образцового пятно ядро, F-актина и ацетилированный тубулин с флуоресцентных маркеров.
- Плита клетки на поли L-лизин покрытием крышки скользит помещены в блюдо блюдо или multiwell культуры клеток, как описано выше (см. 1.3.8).
- Для фиксации, удалить носитель и охватывают клетки с параформальдегида 4% в ПБС. Инкубируйте клетки для 10 мин при 4 ° C на шейкер. Вымыть клетки 3 x 5 мин с ПБС при комнатной температуре. Убедитесь, что ПБС охватывает клетки полностью и выполните стиральная в шейкере.
- Чтобы заблокировать и для разрушения фиксированные клетки, клетки накрыть ПБС, содержащих 5% обезжиренное молоко и 0,3% Тритон X-100. Место клетки для 10 мин при комнатной температуре на шейкер. Вымойте клетки, как описано в 3.2.
- Для обозначения ацетилированный тубулин, маркер для аксоны11, разбавляют основное антитело стоматологов в ПБС, содержащей 1% обезжиренное молоко. Обложка клетки с этим решением и инкубировать их за ночь при 4 ° C на шейкер. На следующий день Вымойте клетки, как описано в 3.2.
- Разбавить вторичное антитело проспряганное с зеленым fluorochrom флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) 1: 100 в однократном ПБС, содержащей 1% обезжиренное молоко и инкубировать клетки с это решение в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте (обложка блюдо например с коробкой или Алюминий фольга) в шейкере. Вымойте клетки, как описано в 3.2.
- Чтобы одновременно пятно Цитоскелет актина и ядер, Инкубируйте клетки в ПБС дополнена Фаллоидин12 конъюгированных с красным флюрохром (1:50) и 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)13 (100 нг/мл) для 10 минут в комнате Температура в темноте на шейкер. Вымойте клетки, как описано в 3.2.
- Для подготовки клетки для изображений, Наденьте чистую поверхность стекла объект перевозчика (микроскопа) и место на падение среднего монтажа на нем. Возьмите крышку выскальзования с фиксированной и окрашенных клеток из блюдо с помощью пинцета и поместите его на падение с клетками, стоящих перед перевозчиком объекта. Убедитесь, что установка среднего распространяется по всей площади крышки выскальзования. Пусть сухой в темноте.
- Магазин фиксированной и смонтированы клетки в темноте при температуре 4 ° C до тех пор, пока требуемое изображений приложение выполняется.
Рисунок 2: Transfection выражения создает путем электропорации. (A) распространение нейрон transfected с ПК eGFP 1 ДАП. (B) полосатая myocyte (2 dap), выражая эндоплазматического ретикулума целевых белков ss ЗП-KDEL. (C) два нейронов в кластере нейрональных transfected с ПК MitoTag-рекламы ЯФП 2 ДАП. (D) клетки (удить рыбу 2) тройной transfected с ПК-DCX-tdTomato, ПК MitoTag-рекламы ЯФП и ПК H2B-mseCFP. (E) pSK-UAS:mCherry electroporated в клетки первичной (1 dap) производные от двойной трансгенных эмбрионов, перевозящих трансгенов тг (atoh1a: Gal4TA4) hzm222 и тг (4xUAS:KGFPGI) hzm332 результате экспрессия гена GFP в нейрональных прародителями задний мозг. Масштаб баров = 10 мкм. (A-E) были приобретены Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия с использованием стекла дно блюда, как показано на рисунке 1B. (F) флуоресцентных пятнать фиксированной данио рерио первичной нейронов в 5 ДАП. Синий: DAPI (ядро); Красный: Фаллоидин (F-миозина); Зеленый: Ацетилированные тубулин (нейронов). Шкалы бар = 10 мкм. (G) нейроноподобных клеток transfected с ПК mClover. В отеле 2 ДАП, расширение не является видимым. В 5 удить рыбу, neurite как структура сформировалась. Шкалы бар = 25 µm. (H) нейрон же подготовки как в ячейку (F), окруженный фибробластов подобных клеток. Шкалы бар = 10 мкм. (я) нейрон производным от трансгенной эмбриона, перевозящих трансген тг (XITubb: DsRed) zf14828 transfected с ПК mClover. Между 12 и 15 ДАП, невритов проходят массовые дегенерации. Шкалы бар = 100 µm. клетки, показано в (F-я) были посеяны на стекло с покрытием поли L-лизин (F, H) или пластика (G, я), культивируемые в L-15 среде в присутствии 10% отфильтровывать технического индикатора бычьим сывороточным и нейрональных дополнение B-27 (разбавленных 1:50) и образы с помощью микроскопа epifluorescent. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
4. Подготовка первичных клеток от взрослого мозга данио рерио
-
Мозг добыча
- Выберите взрослых рыб по крайней мере 90 дней. Если требуется работать с типом конкретной ячейки, выберите трансгенные линии, в котором выражение клеток конкретных флуоресцентные репортер будет позволяют визуализировать нужные ячейки.
- Место рыбы в стакан, наполненный 200 мл анестетика Tricaine8 (0,2%) в Danieau 30%. Подождите, пока рыба перестает двигаться. Погружайте наркотизированных рыбы в стакан, наполненный 200 мл ледяной воды на 15 минут, чтобы усыпить его.
- Заполните чашку Петри (диаметр 6 см) с 70% (v/v) этанола. Удержать рыбу за хвост с парой пинцетом и окунуть ее в этанол. Обеспечения, рыба полностью погружен в этаноле для 5 s.
- Экстракт мозга согласно протоколу Гупта и Маллинс14 с следующие приспособления: использовать только инструменты, газобетона или стерильной упаковке и вскрыть голову в стерильных ПБС.
- Непосредственно после экстракции, место мозга в чашке Петри (диаметром 3 см) наполнены стерильный ПБС и переместить блюдо под стерильную верстак для клеточной культуры.
-
Мозг диссоциации и покрытия начальных клеток
- Место два комплекта стерильным пинцетом (газобетона), стерильные Петри (диаметр 6 см) заполнены с 70% (v/v) этанола, стерильные Петри (диаметр 10 см) заполнены с Лейбовиц в L-15 среде с 10% (v/v) отфильтровывать технического индикатора бычьим сывороточным, B-27 (1:50) и 1,2% (v / v) 10,000 U пенициллин-стрептомицином и один стерильные клеток сетчатый фильтр с ручкой (40 мкм; Рисунок 1 c) под чистой скамейке.
- Место клетки ситечко в чашке Петри заполнены с этанолом и убедитесь, что уровень жидкости по крайней мере 5 мм выше, чем в нижней части ситечко.
- Используя первый набор пинцетов, передача мозга в сетчатый фильтр, уже помещены в этаноле и убедитесь, что он полностью покрыта жидкости. После 1 s, передача ситечко с мозгом в Петри, содержащие Лейбовиц в L-15 среде с выше описанных добавки.
- Используя второй набор пинцетов, передачи, мозг в стерильных 1,5 мл реакции заполнены с 500 мкл Лейбовиц L-15 среде с выше описал добавки. Добавьте коллагеназы (тип 2) до конечной концентрации 4 мг/мл в общем объеме 1 мл.
- Инкубируйте трубку на вертикальные трубки ротатор с 30 оборотов в мин 35 мин при комнатной температуре. Механически отделить оставшиеся сгустки ткани, закупорить вверх и вниз с помощью кончика пипетки 1000 мкл для облегчения процесса диссоциации.
- Остановите диссоциации, когда нет видимых частиц остается в растворе. Фильтр суспензию клеток через стрейнер стерильных ячейки с вентиляционной прорезью (40 мкм; Рисунок 1 d) в 50 мл Конические трубки. Промойте ситечко с приблизительно 10 мл свежего клеток питательной среды.
Примечание: Когда достигается одноклеточного подвеска, фильтрации шаг необходим не так как в случае эмбрионы диссоциации. Мозг является мягких тканей и как таковое оно является более склонны быть однородно отделен в одну ячейку подвеска. - Пелле клетки центрифугированием на 5 мин при 180 x g и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл свежего Лейбовиц L-15 среды с выше описанных добавки.
- Пипетка 500 мкл суспензии клеток (50% полученных клеток) на одно блюдо дно самодельные поли L-лизин стекла с покрытием (см. 1.2) или в хорошо 24-ну плиты. Сворачивать в случае небольших поверхностей (т.е., 125 мкл раствора для колодца 96-луночных плиты). Инкубируйте 60 мин при комнатной температуре под стерильную верстак. Затем добавьте необходимый объем свежего среднего для заполнения определенного контейнера и инкубировать Главные ячейки на 28 ° C.
- Выполните нужную визуализации приложений, с помощью инвертированного микроскопа при 28 ° C. Культур может использоваться для обработки изображений в течение нескольких дней после покрытия. Замените 50% средних на ежедневной основе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 g показывает передачи света изображение типичного культуры, производные от дикого типа эмбрионов с striated миоцитов и кластеры нейроноподобных клеток, наиболее обильные. Для более легко выявить определенные типы клеток, трансгенные линии с выражением определенного типа клеток флуоресцирующего белка может быть использован (рис. 1 H).
Transfection pCS2 +-на основе плазмида11 кодирования расширенной Зеленый флуоресцентный белок (eGFP)15 в клетки первичной дикого типа эмбрионов приводит к сильным флуоресцентного сигнала на 1 ДАП (рис. 2A). Transfecting pCS2 +-на основе плазмид кодирования флуоресцентные органеллы маркеры например эндоплазматического ретикулума целевой Красного флуоресцирующего белка (ss ЗП-KDEL)16 или ориентированные на митохондрии желтый флуоресцентный белок (MitoTag-рекламы ЯФП)17, 18, внутриклеточных структур могут быть визуализированы в деталях (Рисунок 2Б, C). Совместное трансфекции до трех плазмид позволяет для одновременного анализа субцеллюлярные локализации несколько флуоресцентные синтез белков в же клеток19 таких MitoTag-рекламы ЯФП вместе с маркером микротрубочек человеческого Даблкортин (DCX) 20 сливается в красных флуоресцентных белков tdTomato21 и ядерных маркеров гистона H2B сливается с голубым флуоресцентный белок (H2B-mseCFP)22,23 (Рисунок 2D). Внутриклеточных структур также может быть воспроизведен образ с высоким временным и пространственным разрешением, например движение везикул мембранных маркера связанного везикул мембранных белок 1 (VAMP1) сливается с флуоресцентный белок mCitrine24 , 25 (рис. 3). Морфологические изменения с течением времени можно легко заметить, снабдив весь ячейку с выражением ярких флуоресцентных белков, таких как mClover26 (Рисунок 2 g, я). Однако успешное трансфекции плазмида, основанный на pBluescriptSK костяк кодирования красный, флуоресцентный белок mCherry27 слились с элементом UAS в Главные ячейки производный от двойной трансгенных эмбрионов, перевозящих водитель Gal4 конструкцию и конструкцией эффекторных UAS демонстрирует, что электропорации протокол также подходит для комбинаторной генетики (Рисунок 2E). Кроме того фиксированной Главные ячейки могут быть легко окрашены с помощью иммунофлюоресценции и органелл конкретных флуоресцентных красителей (Рисунок 2F, H).
Рисунок 3: Визуализация промежуток времени внутриклеточных структур. Дикого типа клеток (1 dap) transfected с ПК VAMP1-mCitrine. Выбранные кадры записи промежуток времени (1 кадр был взят каждый 1,68 s) отображаются. Стрел и треков в соответствии цвета выделите субцеллюлярные динамика три различных VAMP1-позитивных везикулы. Шкалы бар = 10 мкм. Промежуток времени был записан с помощью конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Диссоциация техника и основные культуры условия также могут применяться к ткани взрослых рыбок данио. Здесь мы проверили ткани взрослого мозга от дикого типа данио рерио. На рисунке 4A -D показывает прогрессивного развития в сложной сети нейронов как культуры, первоначально мусора покрытием. С помощью взрослого мозга от трансгенной рыбы, перевозящих трансген тг (XITubb: DsRed) zf14828, полностью дифференцированы выражения DsRed нейронов может быть рассмотрен в тесном подробно (Рисунок 4E).
Рисунок 4: культуры главной ячейки головного мозга взрослых рыбок данио. Светлые области изображения клеток первичного производным от взрослых рыбок данио мозга на (A) 1 ДАП, (B) 3 ДАП, (C) 5 ДАП и (D) 8 ДАП. От 1 до 3 ДАП, мертвые клетки и ткани мусора исчезают, а один или кластеризованный нейрональные клетки становятся более и более очевидной. 3 ДАП, нейрональные клетки начинают формировать первый короткий невритов. От 5 ДАП вперед, это можно наблюдать формирование сети с сотнями хорошо удлиненные невритов. Масштаб баров = 50 µm. клетки были культивировали в плиту 96-луночных поли L-лизин покрытием. (E) культивируемых клеток на 7 удить рыбу от взрослого мозга трансгенной рыбы, выражая трансген тг (XITubb: DsRed) zf148. DsRed выражается в дифференцированных нейронов28. Шкалы бар = 100 µm. клетки были культивировали в пластине 24-ну поли L-лизин покрытием. Все изображения были приобретены в Микроскоп epifluorescent. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем две различные протоколы культуры клетки первичной от 2 dpf zebrafish эмбриона или взрослых рыбок данио мозга.
Подготовка первичного клеточных культур от 2 dpf данио рерио сравнительно легко выполнять для тех, кто с опытом работы в основные клеточные культуры технологии. Однако, чтобы получить хорошие и воспроизводимые результаты, важно достаточное количество эмбрионов как исходного материала (100-это минимум). Во время поднимая эмбрионы, всех возможных источников загрязнения следует избегать чтобы снизить количество микробов и паразитов. Наиболее важных инкубации эмбрионов в этаноле — этот шаг должен быть достаточно долго, для обеспечения тщательной стерилизации, но не слишком долго, либо поскольку этанол является органический растворитель, который повреждает клетки и ткани.
Сроки также важно в течение ферментативных диссоциации ткани мозга или 2 dpf zebrafish эмбриона. Время инкубации не должны превышаться и фермент содержащих среднего снимаются быстро после полной диссоциации одной ячейки этап осуществляется. Тем не менее тип 2 коллагеназы не повредить клеточную мембрану и он не так сильно тормозится FBS, как трипсина33. Благодаря этим свойствам мы смогли выполнить диссоциации присутствии FBS как важным дополнением поддержки жизнеспособности клеток и уменьшения повреждения клеток, что приводит к более высокой доходности и жизнеспособности типы деликатных клеток.
Как показали результаты нашего представителя, типы отдельных клеток может быть либо определены по морфологии или выражением ячейки трансгенов конкретного типа кодировки для флуоресцентных репортеров. Последний является очень удобно при выполнении визуализации живых клеток конкретных клеток населения19. Однако мы настоятельно рекомендуем для проверки выражения соответствующих усилитель 2 эмбрионов dpf, флуоресцентной микроскопии для обеспечения устойчивых результатов.
Чтобы разрешить для визуализации внутриклеточных структур в zebrafish эмбриона Главные ячейки, мы создали электропорации протокол к transfect плазмида ДНК кодирования для выбора флуоресцентные органеллы маркеров. Количество клеток transfected этим методом является относительно низким, но надежный и обеспечивает достаточное число клеток для живых клеток, изображений19. Для успешного трансфекции важнейшим шагом является правильное определение числа клеток в суспензии. В среднем 106 клеток могут быть получены из около 90 2 dpf эмбрионов, но точная ячейка, считая предварительного электропорации обязательным19. Однако по сравнению с общей линии mammalian клетки Cos-7 или HeLa, Главные ячейки от 2 dpf zebrafish эмбриона очень разнообразны по размеру, но достаточно небольшой, в среднем (особенно нейроны), которые могут сделать подсчета в камере Нойбауэр относительно сложным. То же самое верно для последующих графических приложений. Чтобы удовлетворительно визуализировать внутриклеточных структур в этих клетках небольших рыбок данио, расширенный флуоресцентным микроскопом с высоким разрешением требуется, предпочтительно конфокальный лазерный сканирующий микроскоп.
Подготовка первичного клеток мозга взрослого данио рерио более продвинутые, поскольку это требует подготовки в рассекает животного и извлечения ткани мозга14. Кроме того стерильные условия должны поддерживаться уже вне стерильных workbench не загрязнить извлеченные мозга. Однако последующие шаги относительно диссоциации и покрытие сопоставимы с первого протокола и могут также применяться для других тканей взрослых рыб, таких как мышцы или печени.
Для обоих протоколов основным ограничением является ограниченным жизнеспособность трудно обрабатывать типы клеток в культуре, как нейроны. После 3 ДАП, с использованием стандартных условий, плотность клеток эмбриона данио рерио начальных сильно уменьшается таким образом ограничить промежуток времени для визуализации эксперименты19. Основном fiboblast подобных клеток выживать в отсутствие специально с учетом способов.
Чтобы улучшить выживаемость культуры в его сложности типов клеток, мы успешно протестированы Лейбовиц в L-15 среде. Далее мы дополнили его с нейрон содействие добавка B-27 для нейронов определенной культуры. Нейрональные клетки были отмечены различия в культуре клеток и выжить в течение нескольких дней, когда производной от всей эмбрионов (Рисунок 2F-я) также, как от взрослого мозга (Рисунок 4E). Кроме того покрытие первичных элементов в высокой плотности (например, 0.25 x 106 клеток / 100 мм2) повышает жизнеспособность клеток в отличие от низкой плотности (G. Руссо, предварительные результаты).
Помимо использования конкретной культуры средств массовой информации и добавки мы сообщали о том, как использование различных субстратов имеет прямое влияние на различные типы клеток, которые составляют окончательный культуры и может использоваться как селективный параметра для содействия росту подмножество ячеек типы. Культура ткани лечение пластика, по сравнению с поли L-лизин покрытия, как представляется, решительно содействовать адгезии фибробластоподобных клеток и распространения (Рисунок 1E, F). В то же время многочисленные типы клеток, которые зависят от поддержки клеток и молекул адгезии конкретных (как нейроны) не соблюдают должным образом, расти, или дифференцировать на лечение пластика, но предпочитают конкретные клей поддержку. Поэтому мы рекомендуем, когда он не предназначен для получения фибробластоподобных или эпителия культуры33, использовать поли L-лизин или другие клетки специфических субстратов для покрытия блюда культуры клеток.
Мы считаем наш протокол отправной точкой для использования культуры главной ячейки как дополнение к данио рерио в vivo исследований, которые могут быть в дальнейшем разработаны и адаптированы для культивирования клеток конкретных типов и используются для многих разнообразных приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим т. Фрич, а. волк-Asseburg, I. Linde и с.-М. Токарски отличный уход за животными и технической поддержки. Мы признательны всем членам Köster лаборатории для интенсивной и полезной дискуссии. Мы с благодарностью признаем, финансирование Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) и федеральной земли Нижняя Саксония, Нижнесаксонская Vorab (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish lines | |||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | ||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | |
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | |
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63X objective | |
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40X objective | |
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device |
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | |
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | |
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | |
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | |
| micro pipettes | Gilson | ||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | |
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | |
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | |
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene |
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic and glass ware | |||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium |
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | |
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation |
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | |
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | |
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | |
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | |
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos |
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | |
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and Reagents | |||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | |
| 4 % paraformaldehyde in 1x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes |
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | |
| methylene blue | Serva | 29198.01 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | |
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | |
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | |
| potasssion chloride | Merck | 104938 | |
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | |
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | |
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C |
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium and solutions for cell culture | |||
| 1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | |
| glutamine 100x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| PenStrep (10,000 U/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).
- Sassen, W. A., Köster, R. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. , 151 (2015).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233, 329-346 (2001).
- Driever, W., Rangini, Z. Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 29A, 749-754 (1993).
- Badakov, R., Jaźwińska, A. Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection. Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).
- Senghaas, N., Köster, R. W. Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon. Eugene. (2007).
- JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).
- Piperno, G., Fuller, M. T. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).
- Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin. European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, E1717 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Stornaiuolo, M. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).
- Lithgow, T. Targeting of proteins to mitochondria. FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).
- Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).
- Horesh, D., et al. Doublecortin, a stabilizer of microtubules. Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).
- Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nature Methods. 5, 339-345 (2008).
- Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2. Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, 407-409 (2013).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133, 916-927 (2008).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, 5069-5079 (2005).
- Jusuf, P. R., Harris, W. A. Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina. Neural Development. 4, 34 (2009).
- Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).
- Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors. Zebrafish. 10, 316-332 (2013).
