Summary
نقدم بروتوكولا فعالة وسهلة الاستخدام لإعداد الثقافات الخلية الابتدائية الأجنة الزرد تعداء وتصوير الخلايا الحية، فضلا عن بروتوكول لإعداد الخلايا الأولية من الدماغ الزرد الكبار.
Abstract
وتتطور بسرعة خارج الأم، مما يسمح لتصوير ممتازة في فيفو للعمليات البيولوجية الحيوية في فقاريات سليمة والنامية الأجنة الزرد تتسم بالشفافية. ومع ذلك، تصوير مفصل مورفولوجيس من أنواع مختلفة من الخلايا والهياكل سوبسيلولار محدودة في يتصاعد كله. ولذلك، أنشأنا بروتوكولا فعالة وسهلة الاستخدام للثقافة الحية الأولية الخلايا من الأجنة الزرد والأنسجة الكبار.
وباختصار، 2 أجنة الزرد إدارة الشرطة الاتحادية ديتشوريوناتيد، دييولكيد، تعقيم، وفصلها إلى الخلايا المفردة مع كولاجيناز. بعد خطوة ترشيح، هي الخلايا الأولية مطلي على الأطباق أسفل الزجاج والمزروعة لعدة أيام. يمكن استخدام الطازجة الثقافات، قدر طويل الأجل ديفيرينسياتيد منها، [كنفوكل] دراسات التصوير عالية الدقة. الثقافة تحتوي على أنواع الخلايا المختلفة، مع striated myocytes ويجري بارزة في طلاء بولي-L-يسين من الخلايا العصبية. على وجه التحديد تسمية الهياكل سوبسيلولار بالبروتينات علامة نيون، أنشأنا أيضا بروتوكولا انهانسر الذي يسمح تعداء بلازميد الحمض النووي إلى أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية. وهكذا، حضور المشغل حوافز محددة وسلوك الخلية المعقدة، والديناميات داخل الخلية من الخلايا الأولية الزرد يمكن تقييم مع عالية الدقة المكانية والزمانية. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام الدماغ الزرد الكبار، علينا أن نظهر أن الأسلوب وصف الانفصال، فضلا عن تثقيف الشروط الأساسية، تعمل أيضا للأنسجة الزرد الكبار.
Introduction
الزرد (دانيو rerio، ريريو دال) نموذج شعبية فقاريات للعديد من المجالات للبحوث الطبية الحيوية والأساسية1. الزرد الأجنة تتطور بسرعة خارج الرحم، وتتسم بالشفافية، وتناسب تحت مجهر، وبالتالي توفير المتطلبات الأساسية ممتازة لدراسة تطوير الفقارية في حي. سبب الصوبة الوراثية لالزرد2، أنشئت خطوط مراسل المعدلة وراثيا مستقرة العديد من الخلية المحددة بنوع التعبير عن مختلف علامات مضيئة السماح لمراقبة السكان خلية معينة. المجتمع الزرد مجموعة متنوعة واسعة من ما يسمى خطوط Gal4--السائق الذي حمل التحوير الإعراب عن Kal4TA4 الاصطناعية (أو جالف ما يعادل KalTA3) الجينات مع المجال Gal4-الحمض النووي-ملزم للخميرة تنصهر فيها تفعيل الترانسكربتي الفيروسية المجالات الخاضعة للخلية المحددة بنوع معززات. وعبرت هذه الخطوط برنامج تشغيل لخطوط المستجيب التي تحمل المتسلسلات تتألف من معرفة المنبع تفعيل تسلسل (UAS) تنصهر فيها جين مراسل. بروتين Kal4TA4 يربط عنصر UAS، وبالتالي تنشيط الخلية التعبير نوع الجنين من3،4الجينات مراسل. ويسمح هذا النهج للدراسات اندماجي شديدة التنوع من تقريبا جميع العناصر المتاحة محسن ومراسل في الحيوانات المحورة وراثيا مزدوجة.
ومع ذلك، محدودة تصوير حية متعمقة مع التركيز على خلايا فردية أو محتوياتها سوبسيلولار في جنينا كامل والمتغيرة باستمرار. ولمعالجة المسائل البيولوجية خلية محددة بدقة أعلى، غالباً ما الأفضل استخدام الثقافات الخلية. توجد بعض خطوط الخلايا من الزرد، ولكن تعتبر بشكل كبير المحدد5،،من67 وما نشر في كثير من الأحيان مضيعة للوقت. وعلاوة على ذلك، جميع خطوط الخلية المتوفرة هي تنتجها الخلايا الليفية المشتقة، يحد من تجارب باستخدام زراعة الخلايا إلى نوع واحد من الخلايا. لذلك، أنشأنا بروتوكولا فعالة وسهلة الاستخدام لإعداد الخلايا الابتدائية مباشرة من الدماغ الكبار الزرد، جنبا إلى جنب مع اتباع نهج لزيادة طول عمر الثقافة وتوسيع تنوع المزروعة والأجنة الزرد أنواع الخلايا. وباﻹضافة إلى ذلك، فإننا نقدم إجراء ترانسفيكت الخلايا الجنينية الأولية مع ثوابت التعبير عن علامات عضية الفلورسنت. وهكذا، يمكن تحليل مورفولوجيس الخلوية وهياكل سوبسيلولار مع عالية الدقة المكانية والزمانية في أنواع الخلايا المتميزة التي تحتفظ بملامحها الرئيسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع أعمال الحيوان الموصوف هنا وفقا للوائح القانونية (الاتحاد الأوروبي-2010 التوجيه/63). صيانة ومناولة الأسماك قد تم وافقت عليها السلطات المحلية ورعاية الحيوان الممثل في "جامعة براونشفايغ للتكنولوجيا" و "انخفاض ساكسونيا الدولة مكتب لحماية المستهلك" و "سلامة الأغذية" (لافيس، أولدنبورغ، ألمانيا؛ بكالوريوس (02.05) تشب تو تصديرها من الألف إلى الياء.).
1-إعداد الخلايا الأولية من الأجنة الزرد
- إعداد 2 يوما بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) الأجنة الزرد
- يوم 1: إعداد معابر عدة من سلالة الزرد الاختيار ووفقا للمواصفات الخاصة بك مدير مرفق الزرد8.
- يوم 2: رفيقه الأسماك وجمع البيض8 مباشرة بعد التفريخ في 10 سم طبق بتري (البلاستيك). إزالة البيض الميت أو الملوثة مع ماصة باستور (البلاستيك). أغسل البيض س 1 مع دانيو 30 في المائة (5.8 مم كلوريد الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم 0.07 مم، سلفات المغنزيوم 0.04 مم، نترات الكالسيوم 0.06 مم، حمض 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2)8 مع أزرق الميثيلين 0.0001% (w/v). تبادل على المديين المتوسط ودانو 30% دون الميثيلين الأزرق، منذ الميثيلين الأزرق قد يسبب أوتوفلوريسسينسي، واحتضان البيض طوال الليل في 28 درجة مئوية.
ملاحظة: تبدأ بحد أدنى من 100 بيضة في خط الأسماك بغية الحصول على كمية كافية من الخلايا. ولم تثر الأجنة أكثر من 150 في طبق بتري واحد. - يوم 3: إزالة أجنة ميتة أو ملوثة وتبادل على المديين المتوسط ودانو 30%. تحديد عدد الأجنة عن طريق العد. تبني الأجنة طوال الليل في 28 درجة مئوية.
ملاحظة: عند استخدام خط المعدلة وراثيا معربا عن مراسل فلورسنت، قد يكون الفحص في إدارة الشرطة الاتحادية 1 أو 2 إدارة الشرطة الاتحادية اللازمة.
ملاحظة: للحصول على كميات أكبر من الأجنة، من المستحسن أن تتخذ صورة أبيض وأسود لكل منهما طبق بتري (الشكل 1A) وتحديد عدد الأجنة مع برنامج تصوير. - يوم 4: الأجنة هي الآن 2 إدارة الشرطة الاتحادية. لإزالة تشوريونس وإضافة برنس 1 مل بتركيز 1 ملغ/مل 10 مل من دانو 30%8 واحتضان الأجنة في شاكر في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تشوريونس كل فصل (20-40 دقيقة حسب درجة الحرارة المحيطة). أغسل مع دانو 30% إزالة كل من برنس وتشوريونس والحفاظ على الأجنة في درجة حرارة الغرفة حتى استخدامها مرة أخرى.
- إعداد أطباق أسفل زجاج مصقول بولي-L-يسين القابل لإعادة الاستخدام
ملاحظة: الزجاج المتاحة تجارياً أسفل الأطباق مصممة لاستخدام واحد فقط وهي مكلفة. يصف الإجراء التالي كيفية إعداد أطباق أسفل الزجاج عصامي القابل لإعادة الاستخدام من مواد المختبر القياسية.- حفر حفرة قطرها 10 مم في الجزء السفلي من الخلية القياسية ثقافة الأطباق (قطر 6 سم، بلاستيكية) (الشكل 1B). أغسل القيعان الطبق جيدا بماء الصنبور لإزالة الغبار الحفر.
- انتشار الشحوم سيليكون حول الثقب في الجانب السفلي قيعان طبق وإرفاق ساترة استخدام الشحوم كالغراء. تأكد من أن الشحوم الأختام الفجوة بين أسفل الطبق وساترة.
ملاحظة: تأكد من أن سمك كوفيرسليبس المستخدمة مناسبة للتطبيق في وقت لاحق من التصوير. - غسل الأطباق أسفل الزجاج عصامي تماما، ولكن بعناية، مع الاستفادة من المياه الباردة والصابون. شطف الزجاج أسفل الأطباق ثلاث مرات مع المياه لإزالة الصابون. أيردري أغطية طبق وطبق القيعان وتخزينها في علبة نظيفة حتى استخدامها مرة أخرى.
- في اليوم لإعداد الثقافة (يوم 4، انظر 1.1.4): ترطيب داخل كل طبق الأغطية وطبق قيعان مع الإيثانول 70% (v/v). ضع الصحن الأغطية وطبق القيعان مواجهة الجانب الداخلي في هيئة عمل عقيمة مع الاندفاق الصفحي وضوء الأشعة فوق البنفسجية. أيردري حتى يتبخر في الإيثانول، ثم تطبيق الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة 20 دقيقة. بعد هذا العلاج، تجميع الأطباق ويعتبر معقم.
- لطلاء، "الماصة؛" 200 ميليلتر من بولي-L-يسين (0.1 مغ/مل) في وسط كل طبق أسفل الزجاج وانتشار السائل على ساترة عن طريق كسر التوتر السطحي مع تلميح ماصة. واسمحوا جافة لمدة 60 دقيقة، ثم يغسل x 1 مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). إزالة السائل. تبقى الأطباق تحت مقاعد البدلاء حتى استخدامها مرة أخرى.
ملاحظة: يمكن اختبار الدهانات الأخرى تبعاً للهدف من هذه التجربة. وجدنا بولي-L-يسين كافية لدعم نمو الخلايا العصبية، بينما تعامل البلاستيك دون أي طلاء إضافية ملائمة لنمو الخلايا مثل تنتجها الخلايا الليفية (الشكل 1E، و) على ما يبدو.
ملاحظة: يمكن استخدام الزجاج عصامي أسفل الأطباق مرات عديدة. لتبادل ساترة، تغسل بماء الصنبور الحار وعناية فصل ساترة وإزالة الشحوم المتبقية مع الإيثانول 70% (v/v) والصابون.
- إعداد وطلاء الخلايا الأولية
- في اليوم لإعداد الثقافة (يوم 4، انظر 1.1.4): نقل الأجنة إلى طبق ثقافة خلية عقيمة (قطرها 6 سم) باستخدام ماصة باستور جديدة بلاستيكية. إزالة السائل المجوعات حتى جمعت جميع الأجنة في قطره كبيرة قطرها حوالي 2 سم أو أقل.
- ضع الطبق مع الأجنة في مقاعد البدلاء عمل عقيم وإضافة CO2-المتوسطة مستقلة (تستكمل مع 10% (v/v) filtrated المصل البقري، 1 x الجلوتامين و 1.2% (v/v) 10,000 يو البنسلين-ستربتوميسين؛ المتوسطة مع جميع الملاحق في ما يلي يشار إلى "خلية الثقافة المتوسطة") حتى يصبح الطبق مملوءة إلى النصف.
ملاحظة: بدائل CO2-يمكن اختبار المتوسطة مستقلة تبعاً للهدف من هذه التجربة، على سبيل المثال نيوروباسال المتوسطة أو المتوسطة دميم أو المتوسطة L-15 ليبوفيتش في. CO2-المستقلة المتوسطة والمتوسطة L-15 ليبوفيتش الذي لديها ميزة لا تتطلب من حاضنة2 CO. - لإزالة صفار البيض، "الماصة؛" الأجنة صعودا وهبوطاً باستخدام تلميح 200 ميليلتر-ماصة. يمكن التعرف على دييولكينج الناجح قبل تلقي بظلالها على المتوسط.
- ملء طبق ثقافة خلية مع الإيثانول 70% (v/v) وآخر طبق ثقافة الخلية مع خلية جديدة الثقافة المتوسطة. استخدام تلميح ميليلتر ماصة وقف 1,000 لنقل الأجنة إلى مصفاة خلية عقيمة مع مؤشر (40 ميكرومتر؛ الشكل 1). تأخذ المصفاة بالمقبض وتراجع ذلك في الطبق مع الإيثانول حيث أن جميع الأجنة مغمورة ل 5 س فورا بعد ذلك، تغرق في المصفاة مع الأجنة في الطبق مع خلية جديدة الثقافة المتوسطة.
ملاحظة: مصافي خلية يمكن إعادة استخدامها عدة مرات. تنظيف بفرشاة ناعمة تحت تشغيل مياه الحنفية والمتجر بهم في الإيثانول 70%، والجافة والأشعة فوق البنفسجية-علاج لهم في إطار عمل عقيم مقاعد البدلاء مباشرة قبل الاستخدام (انظر أيضا 1.2.4). - نقل الأجنة في معقم 1.5 مل رد فعل أنابيب (حوالي 100 الأجنة في أنبوبة واحدة). إضافة كولاجيناز (النوع 2) المخفف في خلية ثقافة المتوسطة إلى تركيز نهائي 4 مغ/مل في إجمالي حجم 1 مل. احتضان أنابيب مع الأجنة في دوار أنبوب عمودي مع 30 ثورات لكل دقيقة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- ننأى بكتل الخلايا المتبقية من بيبيتينج الخليط الجنين-كولاجيناز صعودا وهبوطاً مع تلميح 1,000 ميليلتر-ماصة. قم بتصفية تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية عقيمة مع فتحه التنفيس (40 ميكرومتر؛ الشكل 1) في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. شطف في المصفاة مع حوالي 10 مل من خلية جديدة الثقافة المتوسطة.
- بيليه الخلايا بالطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 180 x ز. بيليه قد تكون غير مرئية تقريبا. بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في خلية جديدة ميليلتر 200 الثقافة المتوسطة الواحدة والأجنة المستخدمة أصلاً 30.
ملاحظة: للحصول على بيليه مرئية، ينصح أن تبدأ مع الحد ني أجنة 100. - "الماصة؛" ميليلتر 200 تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.7 مباشرة في مجال الزجاج طبق أسفل الزجاج عصامي بولي-L-يسين-المغلفة (انظر 1-2). احتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت مقاعد البدلاء العمل العقيمة. إضافة 6 مل مستنبت الخلية الطازجة واحتضان الخلايا الأولية عند 28 درجة مئوية.
- أداء التطبيق التصوير المطلوب باستخدام مجهر مقلوب عند 28 درجة مئوية. تبادل مستنبت الخلية يوميا. يمكن استخدام الثقافات للتصوير لعدة أيام بعد الطلاء (حزب العمل الديمقراطي).
رقم 1: زراعة الخلايا الابتدائية للأجنة الزرد. (أ) صورة أبيض وأسود 1 حزب العمل الديمقراطي للأجنة، التي يمكن معالجتها بواسطة أداة حاسوبية لتحليل عدد الأجنة. (ب) خلية ثقافة الأطباق (قطرها 6 سم) مع وجود ثقب حفر (قطرها 10 ملم) تستخدم لإعداد أطباق أسفل الزجاج عصامي القابل لإعادة الاستخدام. (ج) تستخدم مصافي الخلية (40 ميكرومتر) مع مؤشر بسيط كشبكات "الهبوط" تراجع دييولكيد الأجنة في الإيثانول ونقلها بسرعة إلى خلية جديدة الثقافة المتوسطة. (د) خلية تستخدم مصافي (40 ميكرومتر) مع فتحات تهوية لتصفية الخلايا بعد الانفصال كولاجيناز بوساطة. (ه) بعد 5 حزب العمل الديمقراطي، المصنف الخلايا الأولية على الزجاج مغلفة ببولي-L-يسين أساسا شكل الخلايا العصبية مع ملحقات وضوحاً. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (و) بعد 5 حزب العمل الديمقراطي على البلاستيك المعالجة دون خلايا الطلاء، تنتجها الخلايا الليفية مثل كسا الثقافة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ه) و (و) تم الحصول عليها من قبل مجهر ابيفلوريسسينت. (ز) صورة الخفيفة المنقولة من الخلايا الأولية المستمدة من الزرد نوع البرية في 1 حزب العمل الديمقراطي. يمكن بسهولة ملاحظة striated myocytes ومجموعات من الخلايا العصبية توسيع العمليات رقيقة. شريط المقياس = الخلايا المستزرعة 50 ميكرومتر. (ح) السطر المعدلة وراثيا تيراغرام (ptf1a: اجفب) jh1، التي تعرب عن اجفب في المتكفل العصبية معظمهم جابايرجيك الخلايا العصبية في هيندبرين ومجموعة فرعية من الخلية الشبكية السكان29، 30 , 31-شريط مقياس = 50 ميكرومتر. (ز) و (ح) تم الحصول عليها بليزر [كنفوكل] المسح مجهر استخدام الأطباق أسفل الزجاج كما هو موضح في (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
2-تعداء الابتدائية الخلايا مع بلازميد الحمض النووي
- فيلتراتيد ريسوسبيند والأعلاف الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.7 في برنامج تلفزيوني 1 x بدلاً من خلية الثقافة المتوسطة. وصمة عار قاسمة تعليق خلية مع تريبان الأزرق لتحديد عدد الخلايا في دائرة عد9.
- مزيج الخلايا 0.5 مليون مع 10 ميكروغرام نقية فائقة بلازميد الحمض النووي في أنبوب رد فعل 1.5 مل وضبط الحجم الكلي إلى 100 ميليلتر مع برنامج تلفزيوني 1 x.
ملاحظة: لتجاربنا، استخدمنا أساسا بنيات التعبير استناداً إلى بلازميد pCS2 +10. تعبير عن القراءة فتح إطارات المستنسخة في موقع الاستنساخ متعددة من pCS2 + تحركها مروج الفيروس المضخم للخلايا البشرية (مروج CMV) في كل مكان. قد يكون اختبار أخرى التعبير بنيات والمروجين (انظر أيضا نتائج الممثل و الشكل 2 و الشكل 3). - ميكس نقل الخلية-الحمض النووي فورا إلى ومبومو انهانسر (0.4 سم)، مكان في ومبومو في الجهاز انهانسر واليكتروبوراتي مع الإعدادات التالية: نبض مرة واحدة، وتحلل أسي، 280 الخامس، 950 µF.
- مباشرة بعد انهانسر، نقل مزيج الحمض النووي الخلية في أنبوب 1.5 مل رد فعل مع 300 ميليلتر من مستنبت خلايا جديدة.
- لوحة 200 ميليلتر من تعليق خلية كما هو موضح في 1.3.8 والمضي قدما كما هو موضح في 1.3.9 اعتماداً على بنية التعبير المستخدمة، قد يكون تعبير بروتينات الفلورية يمكن اكتشافها بعد بضع ساعات أو في اليوم التالي.
3-تلطيخ الخلايا الأولية الثابتة
ملاحظة: هياكل سوبسيلولار يمكن أيضا تصور طريق immunostaining الكلاسيكية بدلاً من استخدام الصحفيين البروتين الانصهار الفلورسنت. للخلايا الابتدائية الزرد، نحن نستخدم بروتوكول القياسية التالية نواة وصمة عار المثالية، واكتين و tubulin أسيتيلاتيد مع علامات مضيئة.
- وضع لوحة الخلايا في بولي-L-يسين المغلفة بغطاء كشوف في لوحة صحن أو مولتيويل ثقافة خلية كما هو موضح أعلاه (انظر 1.3.8).
- لتحديد، إزالة المتوسطة وتغطي الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني x 1. احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية على شاكر. أغسل الخلايا x 3 ل 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1 x في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن برنامج تلفزيوني 1 x يغطي الخلايا تماما ونفذ الخطوات الغسيل على شاكر.
- لمنع وبيرميبيليزي الخلايا الثابتة، وتغطي الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x التي تحتوي على اللبن المقشود 5% و 0.3% X-100 تريتون. مكان الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر. تغسل الخلايا كما هو موضح في 3.2.
- لتسمية توبولين أسيتيلاتيد، تمييع علامة لمحاور عصبية11، 1:2,000 جسم الأولية في 1 x PBS المحتوية على اللبن المقشود 1%. تغطية الخلايا مع هذا الحل واحتضانها لهم طوال الليل في 4 درجات مئوية على شاكر. وفي اليوم التالي، غسل الخلايا كما هو موضح في 3.2.
- تضعف جسم الثانوي مترافق مع فلوروتشروم الأخضر fluorescein isothiocyanate (فيتك) 1: 100 في برنامج تلفزيوني 1 x التي تحتوي على اللبن المقشود 1% واحتضان الخلايا مع هذا الحل ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام (تغطي طبق مثلاً مع مربع أو رقائق الألومنيوم) في شاكر. تغسل الخلايا كما هو موضح في 3.2.
- لوصمة عار في نفس الوقت cytoskeleton أكتين ونوى، الخلايا في برنامج تلفزيوني 1 x وتستكمل مع فالويدين12 مترافق مع فلوروتشرومي أحمر (01:50) 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)13 (100 نانوغرام/مل) لمدة 10 دقائق في غرفة واحتضان درجة الحرارة في الظلام على شاكر. تغسل الخلايا كما هو موضح في 3.2.
- لإعداد الخلايا للتصوير، وضع ناقل زجاج كائن (مجهر الشريحة) على سطح نظيف ومكان على قطره متوسطة المتصاعدة على ذلك. تأخذ بكشف الغطاء مع الخلايا الثابتة والملون من طبق استخدام الملقط ووضعه على القطرة مع الخلايا التي تواجه الناقل الكائن. تأكد من أن تلك الوسيلة تصاعد ينتشر في المنطقة كلها من كشف الغطاء. الجافة في الظلام.
- مخزن ثابت وتركيبة الخلايا في الظلام في 4 درجات مئوية حتى يتم تنفيذ التطبيق التصوير المطلوب.
رقم 2: بنيات تعداء للتعبير انهانسر- (أ) العصبية Putative transfected مع أجهزة الكمبيوتر--اجفب في 1 حزب العمل الديمقراطي. (ب) Striated ميوسيتي (2 سماد) التعبير عن البروتين المستهدفة هيولى ss-RFP-KDEL. (ج) اثنين من الخلايا العصبية داخل كتلة الخلايا العصبية transfected مع أجهزة الكمبيوتر-ميتوتاج-يفب في 2 حزب العمل الديمقراطي. (د) خلية (حزب العمل الديمقراطي 2) ثلاثية transfected مع أجهزة الكمبيوتر-DCX-تدتوماتو، يفب-ميتوتاج--أجهزة الكمبيوتر وأجهزة الكمبيوتر-H2B-مسيكفب. (ﻫ) pSK-اليكتروبوراتيد UAS:mCherry في الخلايا الأولية (حزب العمل الديمقراطي 1) المستمدة من الأجنة المعدلة وراثيا مزدوجة تحمل المتسلسلات تيراغرام (atoh1a: Gal4TA4) hzm222 وتيراغرام (4xUAS:KGFPGI) hzm332 أسفر عن تعبير بروتينات فلورية خضراء في الخلايا العصبية موروث من هيندبرين. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. (ألف-هاء) اقتنيت بليزر [كنفوكل] الفحص المجهري باستخدام الأطباق أسفل الزجاج كما هو موضح في الشكل 1 باء. (و) الفلورسنت تلطيخ الخلايا العصبية الأولية الزرد الثابتة في 5 حزب العمل الديمقراطي. الأزرق: DAPI (نواة)؛ الأحمر: فالويدين (واكتين)؛ الأخضر: أسيتيلاتيد توبولين (الخلايا العصبية). شريط المقياس = 10 ميكرون. (ز) العصبية مثل الخلية transfected مع أجهزة الكمبيوتر--مكلوفير. 2 حزب العمل الديمقراطي، أي ملحق مرئياً. 5 حزب العمل الديمقراطي، وشكلت بنية تشبه نورت. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. (ح) العصبية من إعداد نفسها بوصفها الخلية (F)، محاطة بالخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية. شريط المقياس = 10 ميكرون. (أنا) العصبية المستمدة من جنينا المحورة وراثيا تحمل التحوير تيراغرام (إكسيتوب: دسريد) zf14828 transfected مع أجهزة الكمبيوتر--مكلوفير. بين 12 و 15 مديرية إدارة السجون، والخضوع نيوريتيس تنكس ضخمة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الخلايا تظهر في (و--أنا) كانت تبذر في بولي-L-يسين المغلفة الزجاج (و، ح) أو البلاستيك (ز، أنا)، يزرع في المتوسط L-15 حضور 10% فيلتراتيد المصل البقري الملحق العصبية B-27 (المخفف 01:50) وتصويرها مجهر ابيفلوريسسينت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4-إعداد الخلايا الأولية من الكبار الزرد الدماغ
-
استخراج الدماغ
- حدد أسماك الكبار لمدة 90 يوما على الأقل من العمر. إذا كان مطلوباً العمل مع نوع خلية محددة، اختر خط المعدلة وراثيا التي تسمح التعبير مراسل الفلورسنت الخاصة بخلية لتصور الخلايا المطلوب.
- ضع السمك في كوب مليئة 200 مل تريكايني مخدر8 (0.2 ٪) في دانيو 30%. انتظر حتى يتوقف الأسماك تتحرك. تزج السمك أنيسثيتيزيد في كوب مليء بالماء المثلج 200 مل لمدة 15 دقيقة euthanize أنها.
- ملء طبق بتري (قطرها 6 سم) مع الإيثانول 70% (v/v). عقد السمك من ذيله مع زوج من ملاقط وتراجع إلى الإيثانول. ضمان الأسماك هو مغمورة تماما في الإيثانول 5 s.
- استخراج المخ وفقا للبروتوكول غوبتا ومولينز14 مع أدابتيونس التالية: استخدام أدوات فقط يعقم أو معبأة العقيمة وتشريح الرأس في برنامج تلفزيوني x 1 العقيمة.
- مباشرة بعد الاستخراج، ضع الدماغ في طبق بتري (قطرها 3 سم) مليئة ببرنامج تلفزيوني x 1 العقيمة وتحريك الطبق تحت منضدة عمل عقيمة لزراعة الخلايا.
-
الانفصال من الدماغ وطلاء الخلايا الأولية
- يحدد مكان اثنين من ملاقط معقمة (يعقم)، طبق بتري معقم (قطرها 6 سم) مليئة الإيثانول 70% (v/v)، طبق بتري معقم (قطرها 10 سم) مليئة المتوسطة L-15 ليبوفيتش لتستكمل مع 10% (v/v) filtrated المصل البقري، B-27 (01:50) و 1.2% (v/ v) 10,000 يو البنسلين-ستربتوميسين ومصفاة العقيمة خلية واحدة مع مؤشر (40 ميكرومتر؛ الشكل 1) تحت مقاعد البدلاء نظيفة.
- مكان مصفاة خلية في صحن بتري مليئة الإيثانول وضمان مستوى السائل أعلى من أسفل المصفاة 5 مم على الأقل.
- تستخدم المجموعة الأولى من ملاقط، نقل الدماغ في مصفاة وضعت بالفعل في الإيثانول وضمان أنه مغطى تماما بالسائل. بعد 1 ثانية، نقل المصفاة مع الدماغ في طبق بتري يحتوي على المتوسطة L-15 ليبوفيتش لما ورد أعلاه وصف المكملات الغذائية.
- استخدام المجموعة الثانية من ملاقط، نقل الدماغ في أنبوب رد فعل معقم 1.5 مل مليئة L-15 المتوسطة في 500 ميليلتر ليبوفيتش مع ما ورد أعلاه وصف المكملات الغذائية. إضافة كولاجيناز (نوع 2) بتركيز نهائي 4 مغ/مل في إجمالي حجم 1 مل.
- احتضان الأنبوب في دوار أنبوب عمودي مع 30 ثورات لكل دقيقة لمدة 35 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ميكانيكيا ننأى بكتل الأنسجة المتبقية من بيبيتينج صعودا وهبوطاً باستخدام تلميح ماصة ميليلتر 1,000 للمساعدة في عملية الانفصال.
- وقف الانفصال عندما تظل لا جزيئات مرئية في الحل. تصفية تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية عقيمة مع فتحه التنفيس (40 ميكرومتر؛ الشكل 1) في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. شطف في المصفاة مع حوالي 10 مل من خلية جديدة الثقافة المتوسطة.
ملاحظة: عندما يتم تعليق خلية مفردة، خطوة الترشيح ليس عند الضرورة كما في حالة الانفصال من الأجنة. الدماغ أنسجة لينة، وعلى هذا النحو أكثر عرضه لأن تنفصل البلوتينيوم في تعليق خلية مفردة. - بيليه الخلايا بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 180 x ز وريسوسبيند بيليه الخلية إلى 1 مل من L-15 المتوسطة الطازجة ليبوفيتش مع المكملات الموصوفة أعلاه.
- "الماصة؛" 500 ميليلتر من تعليق خلية (50% الخلايا التي تم الحصول عليها) على صحن واحد في أسفل عصامي بولي-L-يسين المغلفة الزجاج (انظر 1-2) أو في بئر صفيحة 24-جيدا. المتناقصة في حالة الأسطح أصغر (أي، 125 الحل ميليلتر لبئر صفيحة 96-جيدا). احتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت مقاعد البدلاء العمل العقيمة. قم بإضافة وحدة التخزين اللازمة متوسطة جديدة تعبئة الحاوية المحددة واحتضان الخلايا الأولية عند 28 درجة مئوية.
- أداء التطبيق التصوير المطلوب باستخدام مجهر مقلوب عند 28 درجة مئوية. يمكن استخدام الثقافات للتصوير لعدة أيام بعد الطلاء. يستعاض عن 50 في المائة المتوسط على أساس يومي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 صورة خفيفة منقولة عن ثقافة نموذجية المستمدة من الأجنة نوع البرية مع striated myocytes ومجموعات من الخلايا العصبية مثل يجري الأكثر وفرة. للتعرف على بعض أنواع الخلايا بسهولة أكبر، يمكن أن يكون خط المحورة وراثيا مع الخلية المحددة بنوع التعبير بروتين فلوري المستخدمة (الشكل 1 ح).
تعداء pCS2 +-أساس بلازميد11 ترميز الأخضر المحسن الفلورسنت البروتين (اجفب)15 إلى الخلايا الابتدائية نتائج أجنة نوع البرية في إشارة فلورسنت قوية في 1 حزب العمل الديمقراطي (الشكل 2A). من pCS2 ترانسفيكتينج +-أساس والبلازميدات ترميز علامات عضية الفلورسنت مثل البروتين الفلورسنت الأحمر استهدف هيولى (ss-RFP-KDEL)16 أو17بروتين فلوري الصفراء استهدفت الميتوكوندريا (ميتوتاج-يفب)، 18، يمكن تصور الهياكل سوبسيلولار بقدر كبير من التفصيل (الشكل 2، ج). تعداء المشارك من البلازميدات يصل إلى ثلاثة يسمح للتحليل المتزامن لتوطين عدة بروتينات الفلورسنت الانصهار في نفس الخلية19 مثل ميتوتاج-يفب جنبا إلى جنب مع علامة ميكروتوبولي سوبسيلولار دوبليكورتين البشرية (DCX) 20 تنصهر فيها تدتوماتو البروتين الفلورسنت الأحمر21 وهيستون العلامة النووي H2B تنصهر فيها بروتين فلوري سماوي (H2B-مسيكفب)،من2223 (الشكل 2D). كما يمكن تصويرها هياكل سوبسيلولار مع الزماني والمكاني دقة عالية، وعلى سبيل المثال حركة الحويصلات إيجابية للبروتين غشاء المرتبطة حويصلة ماركر غشاء 1 (VAMP1) تنصهر فيها مسيتريني بروتين فلوري24 , 25 (الشكل 3). يمكن بسهولة ملاحظة التغييرات الشكلية على مر الزمن بوصفها الخلية كاملة بالتعبير عن البروتين الفلورسنت مشرق مثل مكلوفير26 (الشكل 2، وأنا). ومع ذلك، تعداء ناجحة من بلازميد استناداً إلى العمود الفقري ببلويسكريبتسك ترميز الأحمر بروتين فلوري مشري27 تنصهر فيها عنصر UAS داخل الخلايا الأولية المستمدة من الأجنة المعدلة وراثيا مزدوجة تحمل كل برنامج تشغيل Gal4 بناء وإنشاء المستجيب UAS يوضح أن البروتوكول انهانسر أيضا مناسبة لعلم الوراثة اندماجي (الشكل 2E). وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة الملون ثابت الابتدائية الخلايا باستخدام الفلورة والأصباغ الفلورية عضية على حدة (الشكل 2 واو، ح).
الشكل 3: تصوير مرور الوقت هياكل سوبسيلولار. خلية نوع البرية (1 سماد) transfected مع أجهزة الكمبيوتر--VAMP1-مسيتريني. تحديد أطر لتسجيل مرور الوقت (الإطار 1 اتخذ كل 1.68 s) ترد. رؤساء السهم والمسارات في منح ألوان تبرز دينامية سوبسيلولار ثلاث حويصلات VAMP1 إيجابية متميزة. شريط المقياس = 10 ميكرون. تم تسجيل الفاصل الزمني باستخدام ليزر [كنفوكل] مجهر مسح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
يمكن أيضا تطبيق تقنية الانفصال وشروط الثقافة الأساسية لانسجة الزرد الكبار. هنا، نحن اختبار أنسجة المخ الكبار من النوع المتوحش الزرد. الشكل 4A د- يبين التطور التدريجي لثقافة المغلفة بالحطام في البداية إلى شبكة معقدة من الخلايا العصبية مثل. باستخدام الدماغ الكبار من أسماك المحورة وراثيا تحمل التحوير تيراغرام (إكسيتوب: دسريد) zf14828، متباينة تماما يمكن دراسة الخلايا العصبية معربا عن دسريد بالتفصيل الوثيق (4E الشكل).
الشكل 4: زراعة الخلايا الابتدائية للدماغ الزرد الكبار- الصور الميدانية مشرق من الخلايا الأولية المستمدة من الدماغ الزرد الكبار في (A) 1 حزب العمل الديمقراطي، (ب) 3 حزب العمل الديمقراطي، (ج) حزب العمل الديمقراطي 5 و (د) 8 حزب العمل الديمقراطي. من 1 إلى 3 وحزب العمل الديمقراطي، والحطام الأنسجة والخلايا الميتة تختفي في حين الخلايا العصبية وحيدة أو متفاوت المسافات أصبح من الواضح أكثر فأكثر. 3 حزب العمل الديمقراطي، تبدأ الخلايا العصبية لتشكيل نيوريتيس القصيرة الأولى. 5 مديرية إدارة السجون فصاعدا، فمن الممكن لمراقبة تكوين شبكة مع مئات نيوريتيس ممدود جيدا. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. خلايا تم مثقف في صفيحة 96-جيدا بولي-L-يسين-المغلفة. حزب العمل الديمقراطي (ه) الخلايا المستزرعة في 7 من الدماغ الكبار من الأسماك المحورة وراثيا معربا عن التحوير تيراغرام (إكسيتوب: دسريد) zf148. يتم التعبير عن دسريد في الخلايا العصبية متمايزة28. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. خلايا تم مثقف في صفيحة 24-جيدا بولي-L-يسين-المغلفة. جميع الصور تم الحصول عليها مجهر ابيفلوريسسينت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نقدم اثنين من البروتوكولات المختلفة لثقافة الخلايا الأولية من إدارة الشرطة الاتحادية 2 الزرد الأجنة أو الدماغ الزرد الكبار.
إعداد الثقافات الخلية الأولية من 2 إدارة الشرطة الاتحادية الزرد من السهل نسبيا لإجراء لأي شخص لديه خبرة في مجال تقنيات ثقافة الخلية الأساسية. للحصول على نتائج جيدة واستنساخه، عدد كاف من الأجنة كابتداء من المواد غير حاسمة (100 هو الحد الأدنى). أثناء تربية الأجنة، ويجب تجنب جميع المصادر المحتملة للتلوث الحفاظ على كمية من الجراثيم والطفيليات منخفضة قدر الإمكان. الأكثر حسما الحضانة الأجنة في الإيثانول-هذه الخطوة بحاجة إلى أن تكون طويلة بما يكفي لضمان تعقيم شامل، ولكن لم يفت طويلة أما أن الإيثانول هو مذيب عضوي يضر بالخلايا والأنسجة.
توقيت ضروري أيضا أثناء تفكك الانزيمية من أنسجة المخ أو 2 أجنة الزرد إدارة الشرطة الاتحادية. يجب عدم تجاوز فترة الحضانة والمتوسطة المحتوية على إنزيم ترفع بسرعة حالما يتحقق الانفصال الكامل للمرحلة خلية مفردة. ومع ذلك، لا ضرر كولاجيناز 2 نوع غشاء الخلية وهو ليس كقوة إعاقة طريق FBS، التربسين33. وبفضل هذه الخصائص، كنا قادرين على تنفيذ الانفصال حضور FBS كملحق أساسي من دعم بقاء الخلية، والحد من تلف الخلايا، مما أدى إلى ارتفاع العائد والجدوى من أنواع الخلايا الحساسة.
أنواع الخلايا متميزة كما يتضح من النتائج التي توصلنا إليها الممثل، يمكن أن تكون أما تحديد مورفولوجيا أو التعبير عن خلية المتسلسلات الخاصة بنوع الترميز للصحفيين الفلورسنت. هذا الأخير مريحة للغاية عند إجراء تصوير الخلايا الحية من خلية معينة السكان19. ومع ذلك، نوصي بشدة بالتحقق من نمط التعبير محسن كل منهما في 2 إدارة الشرطة الاتحادية الأجنة بالأسفار الفحص المجهري ضمان الحصول على نتائج متسقة.
للسماح لتصور هياكل سوبسيلولار في الخلايا الجنينية الزرد الابتدائية، أنشأنا بروتوكولا انهانسر ترانسفيكت بلازميد الحمض النووي لمجموعة مختارة من عضية نيون علامات ترميز. معدل الخلايا ترانسفيكتيد بهذا الأسلوب هو منخفض نسبيا ولكن موثوق بها وتوفر إعداد كافية من الخلايا للخلية الحية التصوير19. تعداء ناجح، هو خطوة حاسمة الصحيح تحديد عدد الخلايا في التعليق. في المتوسط، يمكن الحصول على 106 خلايا من الأجنة حوالي 90 2 إدارة الشرطة الاتحادية، لكن خلية دقيقة عد انهانسر مسبقة إلزامية19. ، مقارنة بخطوط خلايا الثدييات المشتركة مثل كوس-7 أو هيلا، الخلايا الأولية من 2 أجنة الزرد إدارة الشرطة الاتحادية متنوعة جداً في الحجم ولكن التي صغير جداً في المتوسط (خاصة الخلايا العصبية)، يمكن أن تجعل العد في دائرة نويباور صعبة نسبيا. نفس الشيء صحيح بالنسبة لتطبيقات التصوير اللاحقة. بصورة مرضية تصور الهياكل سوبسيلولار في تلك الخلايا الصغيرة الزرد، مجهر الأسفار متقدمة مع ارتفاع القرار مطلوب، يفضل ليزر [كنفوكل] مجهر مسح.
إعداد الخلايا الأولية من الدماغ الزرد الكبار أكثر تقدما نظراً لأنه يتطلب التدريب في تشريح الحيوان واستخراج أنسجة الدماغ14. وبالإضافة إلى ذلك، تحتاج إلى ظروف معقمة الإبقاء على الفعل خارج منضدة عقيمة لعدم تلويث الدماغ المستخرجة. ومع ذلك، الخطوات اللاحقة فيما يتعلق بالانفصال وتصفيح قابلة للمقارنة للبروتوكول الأول ويمكن تطبيقها أيضا على الأنسجة الأخرى من الأسماك الكبار مثل العضلات أو الكبد.
بالنسبة إلى القيد الرئيسي كلا البروتوكولين، صلاحية مقيدة من الصعب على زراعة أنواع الخلايا في الثقافة، مثل الخلايا العصبية. بعد 3 مديرية إدارة السجون باستخدام الشروط القياسية، يتم تقليل كثافة الخلايا الجنينية الزرد الابتدائية بشدة مما يحد من فترة زمنية للتصوير تجارب19. معظمها فيبوبلاست-مثل الخلايا البقاء على قيد الحياة في غياب الوسائل مصممة على وجه التحديد.
لتحسين معدل البقاء على قيد الحياة للثقافة في تعقيدها أنواع الخلايا، اختبرنا بنجاح المتوسطة L-15 ليبوفيتش. كذلك نحن تستكمل مع B-27 المضافة العصبية-الترويج لثقافة محددة الخلايا العصبية. الخلايا العصبية وقد لوحظ أن يميز في خلية ثقافة والبقاء على قيد الحياة لعدة أيام، عندما المستمدة من الأجنة كله (الشكل 2 واو--أنا) كذلك من الدماغ الكبار (4E الشكل). وباﻹضافة إلى ذلك، يحسن طلاء الخلايا الأولية في كثافات عالية (مثلاً، 0.25 × 106 خلايا الواحدة 100 مم2) بقاء الخلية على النقيض منخفضة الكثافة (غ. روسو، النتائج الأولية).
بجانب استخدام وسائط ثقافة معينة، والمكملات الغذائية، أبلغنا بكيفية استخدام ركائز مختلفة له تأثير مباشر على مجموعة متنوعة أنواع الخلايا التي تشكل ثقافة النهائي ويمكن استخدامها كمعلمة انتقائية لتعزيز النمو لمجموعة فرعية خلية أنواع. المعالجة بزراعة الأنسجة من البلاستيك مقارنة بطلاء بولي-L-يسين يبدو أن تيسير بشدة التصاق الخلية مثل تنتجها الخلايا الليفية وانتشار (الشكل 1E، و). في الوقت نفسه، العديد من أنواع الخلايا التي تعتمد على دعم خلايا وجزيئات الالتصاق محددة (مثل الخلايا العصبية) لا تتقيد بشكل صحيح، تنمو، أو التفريق في المعالجة من البلاستيك، ولكن يفضل دعم لاصقة محددة. ولذلك، نوصي، عندما لا يعتزم الحصول على تنتجها الخلايا الليفية أو طلائي مثل ثقافة33، ﻻستخدام بولي-L-يسين أو غيرها من ركائز خلية على حدة لطلاء أطباق الثقافة الخلية.
ونحن نعتبر البروتوكول لدينا نقطة انطلاق لاستخدام زراعة الخلايا الابتدائية تكملة الزرد في فيفو الدراسات، التي يمكن أن تكون زيادة تطويرها وتكييفها لزراعة أنواع محددة من الخلايا واستخدام العديد من التطبيقات المتنوعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر فريتش ت. وينده أولاً وألف وولف-عاصيبورج س. م. توكارسكي للرعاية الحيوانية الممتازة والدعم التقني. ونحن ممتنون لجميع الأعضاء في مختبر Köster لإجراء مناقشات مكثفة ومفيدة. ونعترف مع الامتنان التمويل الأوقيانوغرافية ألماني (كو عام 1949/5-1) والدولة الاتحادية من ساكسونيا السفلي، Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish lines | |||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | ||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | |
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | |
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63X objective | |
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40X objective | |
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device |
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | |
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | |
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | |
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | |
| micro pipettes | Gilson | ||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | |
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | |
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | |
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene |
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic and glass ware | |||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium |
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | |
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation |
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | |
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | |
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | |
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | |
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos |
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | |
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and Reagents | |||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | |
| 4 % paraformaldehyde in 1x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes |
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | |
| methylene blue | Serva | 29198.01 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | |
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | |
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | |
| potasssion chloride | Merck | 104938 | |
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | |
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | |
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C |
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium and solutions for cell culture | |||
| 1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | |
| glutamine 100x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| PenStrep (10,000 U/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).
- Sassen, W. A., Köster, R. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. , 151 (2015).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233, 329-346 (2001).
- Driever, W., Rangini, Z. Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 29A, 749-754 (1993).
- Badakov, R., Jaźwińska, A. Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection. Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).
- Senghaas, N., Köster, R. W. Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon. Eugene. (2007).
- JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).
- Piperno, G., Fuller, M. T. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).
- Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin. European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, E1717 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Stornaiuolo, M. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).
- Lithgow, T. Targeting of proteins to mitochondria. FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).
- Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).
- Horesh, D., et al. Doublecortin, a stabilizer of microtubules. Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).
- Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nature Methods. 5, 339-345 (2008).
- Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2. Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, 407-409 (2013).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133, 916-927 (2008).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, 5069-5079 (2005).
- Jusuf, P. R., Harris, W. A. Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina. Neural Development. 4, 34 (2009).
- Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).
- Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors. Zebrafish. 10, 316-332 (2013).
