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Developmental Biology

Zebrafish प्राथमिक कोशिकाओं की संस् कृति और अभिकर्मक

Published: August 17, 2018 doi: 10.3791/57872
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2, 1, 1
1Division of Cellular and Molecular Neurobiology, Zoological Institute, Braunschweig University of Technology, 2Department of Biotechnology, Institute of Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics, Braunschweig University of Technology

Summary

हम एक कुशल और अभिकर्मक और लाइव सेल इमेजिंग के लिए zebrafish भ्रूण के प्राथमिक सेल संस्कृतियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वयस्क zebrafish मस्तिष्क से प्राथमिक कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल तैयार करने के लिए उपयोग में आसान प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

Zebrafish भ्रूण पारदर्शी और मां के बाहर तेजी से विकसित कर रहे हैं, इस प्रकार एक बरकरार है और विकासशील हड्डीवाला में गतिशील जैविक प्रक्रियाओं के vivo इमेजिंग में उत्कृष्ट के लिए अनुमति देता है । हालांकि, विशिष्ट कोशिका प्रकार और सेलुलर संरचनाओं के morphologies की विस्तृत इमेजिंग पूरे mounts में सीमित है । इसलिए, हम zebrafish भ्रूण और वयस्क ऊतक से संस्कृति रहते प्राथमिक कोशिकाओं के लिए एक कुशल और आसान करने के लिए उपयोग प्रोटोकॉल की स्थापना की ।

संक्षेप में, 2 dpf zebrafish भ्रूण dechorionated, विअसंबद्धी, निष्फल, और collagenase के साथ एकल कोशिकाओं को कर रहे हैं । एक निस्पंदन कदम के बाद, प्राथमिक कोशिकाओं कांच नीचे व्यंजन पर चढ़ाया जाता है और कई दिनों के लिए खेती की जाती है । ताजा संस्कृतियों, जितना दीर्घकालिक differenciated वाले, उच्च संकल्प फोकल इमेजिंग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । संस्कृति विभिंन प्रकार के सेल शामिल हैं, धारीदार myocytes और न्यूरॉन्स के साथ पाली पर प्रमुख जा रहा है-L-lysine कोटिंग । करने के लिए विशेष रूप से फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन द्वारा सेलुलर संरचनाओं लेबल, हम भी एक electroporation प्रोटोकॉल जो विभिंन प्रकार के सेल में प्लाज्मिड डीएनए के अभिकर्मक की अनुमति देता है की स्थापना की, ंयूरॉंस सहित । इस प्रकार, ऑपरेटर परिभाषित उत्तेजनाओं की उपस्थिति में, जटिल सेल व्यवहार, और प्राथमिक zebrafish कोशिकाओं के intracellular गतिशीलता उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा, वयस्क zebrafish मस्तिष्क का उपयोग करके, हम बताते है कि वर्णित पृथक्करण तकनीक, साथ ही साथ बुनियादी संवर्धन शर्तों, वयस्क zebrafish ऊतक के लिए भी काम करते हैं ।

Introduction

zebrafish (ढाणियो rerio, D. rerio) बुनियादी और जैव चिकित्सा अनुसंधान के कई क्षेत्रों के लिए एक लोकप्रिय मॉडल हड्डीवाला है1. Zebrafish भ्रूण तेजी से पूर्व uteroका विकास, पारदर्शी हैं, और एक खुर्दबीन के नीचे फिट, इस प्रकार एक जीवित जीव में हड्डीवाला विकास के अध्ययन के लिए उत्कृष्ट आवश्यकताएं प्रदान करते हैं । zebrafish2के आनुवंशिक पथ की वजह से, सेल प्रकार के साथ कई स्थिर ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों-विभिंन फ्लोरोसेंट मार्करों की विशिष्ट अभिव्यक्ति विशिष्ट कोशिका आबादी के अवलोकन के लिए अनुमति की स्थापना की गई है । zebrafish समुदाय तथाकथित Gal4 की एक व्यापक विविधता प्रदान करता है-चालक लाइनों जो एक सिंथेटिक Kal4TA4 (या KalTA3-समकक्ष GalFF) जीन Gal4-डीएनए-खमीर के बंधन डोमेन वायरल transcriptional सक्रियकरण से जुड़े के साथ एक transgene व्यक्त ले सेल प्रकार विशिष्ट बढ़ाने के नियंत्रण के अंतर्गत डोमेन । ये चालक लाइनें जो एक परिभाषित ऊपर से मिलकर transgenes ले प्रभाव लाइनों को पार कर रहे है अनुक्रम को सक्रिय (यूएएस) एक रिपोर्टर जीन से जुड़े । Kal4TA4 प्रोटीन यूएएस तत्व को बांधता है, इस प्रकार सेल प्रकार-रिपोर्टर जीन3,4के चयनात्मक अभिव्यक्ति सक्रिय । इस दृष्टिकोण लगभग सभी उपलब्ध बढ़ाने और डबल ट्रांसजेनिक जानवरों में रिपोर्टर तत्वों के अत्यधिक विविध मिश्रित अध्ययन के लिए अनुमति देता है ।

हालांकि, में गहराई से लाइव इमेजिंग व्यक्तिगत कोशिकाओं या उनके सेलुलर सामग्री पर ध्यान केंद्रित के साथ एक पूरी में सीमित है और लगातार भ्रूण बदल रहा है । सबसे अधिक संकल्प के साथ विशिष्ट कोशिका जैविक प्रश्नों के समाधान के लिए, सेल संस्कृतियों के उपयोग अक्सर बेहतर है । zebrafish के कुछ सेल लाइनें मौजूद हैं, लेकिन वे के रूप में भारी चुना5,6,7 और उनके प्रचार अक्सर समय लेने वाली है माना जाता है । इसके अलावा, सभी उपलब्ध सेल लाइनों fibroblast प्राप्त कर रहे हैं, कोशिकाओं के एक प्रकार के लिए सेल संस्कृति का उपयोग प्रयोग सीमित । इसलिए, हम स्थापित दोनों एक कुशल और आसान करने के लिए उपयोग प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण और वयस्क zebrafish मस्तिष्क से सीधे प्राथमिक कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, एक साथ दृष्टिकोण के साथ संस्कृति की दीर्घायु बढ़ाने के लिए और खेती की विविधता को व्यापक कक्ष प्रकार । इसके अलावा, हम अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण प्राथमिक कोशिकाओं transfect फ्लोरोसेंट organelle मार्कर के लिए निर्माण करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । इस प्रकार, सेलुलर morphologies और सेलुलर संरचनाओं अलग कोशिका प्रकार है जो उनके प्रमुख सुविधाओं को बनाए रखने में उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ विश्लेषण किया जा सकता है ।

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Protocol

सभी पशु काम यहां वर्णित कानूनी विनियमों के अनुसार में है (यूरोपीय संघ के डायरेक्टर 2010/63) । स्थानीय अधिकारियों द्वारा और मछली के रखरखाव और हैंडलिंग को Braunschweig विश्वविद्यालय के प्रौद्योगिकी और उपभोक्ता संरक्षण और खाद्य सुरक्षा के निचले Saxony राज्य कार्यालय के पशु कल्याण प्रतिनिधि द्वारा अनुमोदित किया गया है (LAVES, ओल्डेनबर्ग, जर्मनी; Az. § 4 (०२.०५) TSchB मं बी एस).

1. Zebrafish भ्रूण से प्राथमिक कोशिकाओं की तैयारी

  1. 2 दिन की तैयारी के बाद निषेचन (dpf) zebrafish भ्रूण
    1. 1 दिन: चुनाव के zebrafish तनाव के कई पार सेट और अपने zebrafish सुविधा प्रबंधक8के विनिर्देशों के अनुसार ।
    2. 2 दिवस: मेट मछली और अंडे8 इकट्ठा सीधे एक 10 सेमी पेट्री डिश (प्लास्टिक) में अंडे के बाद । एक पाश्चर पिपेट (प्लास्टिक) के साथ मृत या दूषित अंडे निकालें । धो अंडे 1x Danieau 30% के साथ (५.८ mM सोडियम क्लोराइड, ०.०७ मिमी पोटेशियम क्लोराइड, ०.०४ मिमी मैग्नीशियम सल्फेट, ०.०६ मिमी कैल्शियम नाइट्रेट, 5 मिमी 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethanesulfonic एसिड, पीएच ७.२)8 के साथ ०.०००१% (डब्ल्यू/वी) methylene नीला । मध्यम मुद्रा methylene नीले रंग के बिना 30% Danieau करने के लिए, के बाद से methylene नीले autofluorescence कारण हो सकता है, और रात को 28 डिग्री सेल्सियस पर अंडे की गर्मी ।
      नोट: करने के लिए कोशिकाओं की एक पर्याप्त राशि प्राप्त करने के क्रम में मछली लाइन प्रति १०० अंडे की एक ंयूनतम के साथ शुरू करो । एक पेट्री डिश में १५० से अधिक भ्रूण बढ़ा मत करो ।
    3. 3 दिन: मृत या दूषित भ्रूण को हटाने और मध्यम Danieau 30% करने के लिए विनिमय । गिनती करके भ्रूण की संख्या का निर्धारण करते हैं । 28 डिग्री सेल्सियस पर रात में भ्रूण की मशीन ।
      नोट: जब एक ट्रांसजेनिक एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर एक्सप्रेस लाइन का उपयोग कर, 1 dpf या 2 dpf पर स्क्रीनिंग आवश्यक हो सकता है ।
      नोट: भ्रूण की बड़ी मात्रा के लिए, यह संबंधित पेट्री डिश (आंकड़ा 1a) के एक काले और सफेद छवि लेने के लिए और एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ भ्रूण की संख्या यों तो सिफारिश की है ।
    4. 4 दिन: भ्रूण अब 2 dpf हैं । चोरियों को दूर करने के लिए, 1 मिलीग्राम/एमएल Danieau 30%8 के 10 मिलीलीटर के लिए एक एकाग्रता के साथ 1 मिलीलीटर pronase जोड़ें और कमरे के तापमान पर एक शेखर पर भ्रूण की मशीन जब तक सभी चोरियों (20-40 मिनट परिवेश के तापमान के आधार पर) अलग कर रहे हैं । Danieau 30% के साथ धोने के लिए दोनों pronase और चोरियों को दूर करने और आगे का उपयोग करें जब तक कमरे के तापमान पर भ्रूण रखने के लिए ।
  2. पुन: प्रयोज्य पाली की तैयारी-एल-lysine लेपित ग्लास नीचे व्यंजन
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ग्लास नीचे व्यंजन एकल उपयोग के लिए डिजाइन किए है और महंगे हैं । निम्न कार्यविधि मानक प्रयोगशाला सामग्री से पुन: प्रयोज्य स्वयं निर्मित गिलास नीचे व्यंजन तैयार करने के लिए कैसे का वर्णन करता है ।
    1. मानक सेल संस्कृति व्यंजन (व्यास 6 सेमी, प्लास्टिक) (आंकड़ा 1b) के तल में 10 मिमी के व्यास के साथ एक छेद ड्रिल । नल का पानी के साथ अच्छी तरह से डिश नीचे से धो ड्रिलिंग धूल को दूर करने के लिए ।
    2. पकवान नीचे से नीचे के छेद के चारों ओर सिलिकॉन तेल फैला है और एक गोंद के रूप में तेल का उपयोग coverslip देते हैं । सुनिश्चित करें कि तेल जवानों डिश नीचे और coverslip के बीच अंतर है ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि उपयोग किए गए coverslips की मोटाई बाद में इमेजिंग अनुप्रयोग के लिए उपयुक्त है ।
    3. आत्म-निर्मित गिलास नीचे व्यंजन अच्छी तरह से धो लें, लेकिन ध्यान से, ठंडे नल के पानी और साबुन के साथ । कुल्ला गिलास नीचे व्यंजन तीन बार पानी के साथ साबुन हटाने के लिए । एयर सूखी डिश ढक्कन और डिश नीचे से और उंहें एक साफ बॉक्स में आगे का उपयोग करें जब तक स्टोर ।
    4. संस्कृति की तैयारी के दिन (4 दिवस, 1.1.4 देखें): दोनों पकवान ढक्कन और डिश नीचे से नीचे से ७०% के अंदर गीला (v/ डिश ढक्कन और डिश नीचे की ओर लामिना प्रवाह और यूवी प्रकाश के साथ एक बाँझ काम बेंच में भीतरी तरफ का सामना करना पड़ जगह है । हवा सूखा जब तक इथेनॉल सुखाया है, तो 20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश लागू होते हैं । इस उपचार के बाद, पकवान इकट्ठा और बाँझ के रूप में माना जाता है ।
    5. कोटिंग के लिए, पिपेट २०० µ एल के पाली-एल-lysine (०.१ मिलीग्राम/एमएल) प्रत्येक ग्लास नीचे पकवान के बीच में और एक पिपेट टिप के साथ सतह तनाव को तोड़ने के द्वारा coverslip पर तरल फैल गया । ६० मिनट के लिए सूखी चलो, तो बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ 1x धो लो । तरल निकालें । आगे इस्तेमाल होने तक बेंच के नीचे बर्तन रखें ।
      नोट: अंय कोटिंग्स प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर परीक्षण किया जा सकता है । हमने पाया पाली-L-lysine न्यूरॉन्स के विकास का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है, जबकि किसी भी अतिरिक्त कोटिंग के बिना इलाज प्लास्टिक fibroblast की तरह कोशिकाओं के विकास के लिए अनुकूल होना दिखाई दिया (चित्रा 1E, एफ).
      नोट: सेल्फ मेड ग्लास बॉटम डिश का इस्तेमाल कई बार किया जा सकता है । coverslip आदान प्रदान करने के लिए, गर्म नल का पानी के साथ धोने, ध्यान से coverslip अलग और ७०% (v/वी) इथेनॉल और साबुन के साथ शेष तेल हटा दें ।
  3. तैयारी और प्राथमिक कोशिकाओं के चढ़ाना
    1. संस्कृति तैयारी के दिन (4 दिवस, 1.1.4 देखें): एक ताजा प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके एक बाँझ कोशिका संस्कृति पकवान (व्यास 6 सेमी) में भ्रूण स्थानांतरण । तरल कदम वार निकालें जब तक सभी भ्रूण के बारे में 2 सेमी या उससे कम के एक व्यास के साथ एक बड़ी गिरावट में इकट्ठे हुए हैं ।
    2. बाँझ काम बेंच में भ्रूण के साथ पकवान प्लेस और सह2-स्वतंत्र माध्यम जोड़ने (10% के साथ पूरक (वी/) छानने वाला गोजातीय सीरम, 1 x glutamine और १.२% (वी/v) १०,००० U पेनिसिलिन-Streptomycin; सभी पूरक के साथ मध्यम निम्नलिखित में है "कोशिका संस्कृति मध्यम" के रूप में निर्दिष्ट) जब तक पकवान आधा भर है ।
      नोट:2-स्वतंत्र माध्यम के विकल्प के लिए प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर परीक्षण किया जा सकता है, उदाहरण के लिए के रूप में neurobasal मध्यम, DMEM मध्यम या Leibovitz के एल-15 मध्यम । co2-स्वतंत्र माध्यम और Leibovitz एल-15 मध्यम एक सह2 मशीन की आवश्यकता नहीं का लाभ है ।
    3. की जर्दी को दूर करने के लिए, पिपेट भ्रूण ऊपर और नीचे एक २०० µ l-पिपेट टिप का उपयोग कर । मध्यम से झाई युक्त द्वारा सफल की पहचान की जा सकती है ।
    4. ७०% (v/v) इथेनॉल और ताजा सेल संस्कृति माध्यम के साथ एक और सेल संस्कृति पकवान के साथ एक सेल संस्कृति पकवान भरें । एक कट-ऑफ १,००० µ एल-पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए संभाल के साथ एक बाँझ सेल छलनी में भ्रूण हस्तांतरण (४० µm; चित्रा 1C). संभाल द्वारा छलनी ले लो और यह इथेनॉल के साथ पकवान में डुबकी इतना है कि सभी भ्रूण 5 एस के लिए जलमग्न हो तुरंत बाद, ताजा सेल संस्कृति माध्यम के साथ पकवान में भ्रूण के साथ छलनी जलमग्न ।
      नोट: सेल उपभेदों फिर से कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है । नल का पानी चल रहा है के तहत एक नरम ब्रश के साथ साफ, उंहें ७०% इथेनॉल में स्टोर, और शुष्क और यूवी-उपयोग से पहले उंहें बाँझ काम बेंच के तहत सीधे इलाज (भी 1.2.4 देखें) ।
    5. बाँझ में भ्रूण स्थानांतरण १.५ मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूबों (लगभग १०० एक ट्यूब में भ्रूण). 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा में 4 मिलीग्राम/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए सेल संस्कृति माध्यम में पतला collagenase (प्रकार 2) जोड़ें । कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए प्रति मिनट 30 क्रांतियों के साथ एक ऊर्ध्वाधर ट्यूब रोटेटर पर भ्रूण के साथ मशीन ट्यूब ।
    6. भ्रूण pipetting-collagenase मिश्रण अप और एक १,००० µ एल पिपेट टिप के साथ नीचे से अलग कर देना शेष सेल झुरमुट । तो निकाल स्लॉट के साथ एक बाँझ सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर (४० µm; चित्र 1 d) एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में । ताजा सेल संस्कृति माध्यम के लगभग 10 मिलीलीटर के साथ छलनी कुल्ला ।
    7. १८० एक्स जीमें 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं गोली लगभग अदृश्य हो सकता है । ध्यान से supernatant निकालें और २०० µ l ताजा सेल संस्कृति मध्यम प्रति 30 मूल रूप से भ्रूणों में कोशिकाओं resuspend ।
      नोट: एक दृश्य गोली प्राप्त करने के लिए, यह १०० भ्रूण की एक ंयूनतम के साथ शुरू करने के लिए सिफारिश की है ।
    8. पिपेट २०० µ एल सेल निलंबन के एक स्वयं के ग्लास क्षेत्र पर सीधे कदम 1.3.7 में प्राप्त पाली-एल-lysine-लेपित ग्लास नीचे पकवान (१.२ देखें) । बाँझ काम बेंच के तहत कमरे के तापमान पर ६० मिनट के लिए मशीन । ताजा सेल संस्कृति मध्यम के 6 मिलीलीटर जोड़ें और 28 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक कोशिकाओं गर्मी ।
    9. 28 डिग्री सेल्सियस पर एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वांछित इमेजिंग आवेदन प्रदर्शन. सेल कल्चर मीडियम रोज एक्सचेंज करते हैं । संस्कृतियों (डीएपी) चढ़ाना के बाद कई दिनों के लिए इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: zebrafish भ्रूण के प्राथमिक सेल संस्कृति । (क) 1 डीएपी भ्रूण के काले और सफेद छवि, जो भ्रूण की संख्या का विश्लेषण करने के लिए एक सॉफ्टवेयर उपकरण द्वारा संसाधित किया जा सकता है । (ख) कोशिका संस्कृति व्यंजन (व्यास 6 सेमी) एक ड्रिल्ड होल (व्यास 10 मिमी) के साथ पुन: प्रयोज्य स्वयं निर्मित गिलास नीचे व्यंजन तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है । (ग) एक सरल संभाल के साथ सेल उपभेदों (४० µm) के रूप में इस्तेमाल किया जाता है "लैंडिंग जाल" के लिए इथेनॉल में और उंहें जल्दी से ताजा सेल संस्कृति माध्यम को हस्तांतरण करने के लिए मृत भ्रूण डुबकी । (घ) सेल उपभेदों (४० µm) वेंट स्लॉट के साथ collagenase-मध्यस्थता पृथक्करण के बाद कोशिकाओं को फिल्टर करने के लिए उपयोग किया जाता है । (ङ) 5 डीएपी के बाद, प्राथमिक कोशिकाओं को पाली के साथ लेपित गिलास पर बीज-एल-lysine मुख्य रूप से स्पष्ट एक्सटेंशन के साथ ंयूरॉंस फार्म । स्केल बार = १०० µm । (च) कोटिंग के बिना इलाज प्लास्टिक पर 5 डीएपी के बाद, fibroblast की तरह कोशिकाओं संस्कृति को तबदील । स्केल बार = १०० µm. (E) और (F) एक epifluorescent माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहीत किए गए थे. (छ) 1 डीएपी पर जंगली प्रकार zebrafish से व्युत्पंन प्राथमिक कोशिकाओं की प्रकाश छवि संचारित । धारीदार myocytes और पतले प्रक्रियाओं का विस्तार न्यूरॉन्स के समूहों को आसानी से मनाया जा सकता है । स्केल बार = ५० µm. (ज) ट्रांसजेनिक लाइन टीजी (ptf1a: eGFP) jh1, जो eGFP में ज्यादातर progenitors न्यूरॉन्स के ंयूरॉन GABAergic में hindbrain एक्सप्रेस और रेटिना सेल का एक सबसेट के प्रसंस्कृत कोशिकाओं29आबादी, 30 , 31. स्केल बार = ५० µm. (छ) और (ज) एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के रूप में बनाया कांच नीचे व्यंजन का उपयोग करके अधिग्रहीत किया गया (ख) में सचित्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

2. प्लाज्मिड डीएनए वाले प्राथमिक कोशिकाओं का अभिकर्मक

  1. सेल कल्चर मीडियम के बजाय 1x पंजाब में स्टेप 1.3.7 में प्राप्त छानने और छर्रों वाले कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें । Trypan नीले रंग के साथ सेल निलंबन के एक aliquot एक मतगणना कक्ष9में सेल संख्या निर्धारित दाग ।
  2. एक १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में 10 µ जी अल्ट्रा शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए के साथ ५००,००० कोशिकाओं को मिलाएं और 1x पंजाबियों के साथ १०० µ l को कुल मात्रा समायोजित करें ।
    नोट: हमारे प्रयोगों के लिए, हम मुख्य रूप से इस्तेमाल किया अभिव्यक्ति प्लाज्मिड pCS2 +10के आधार पर constructs. ओपन रीडिंग pCS2 के मल्टीपल क्लोनिंग साइट में क्लोन फ्रेम की अभिव्यक्ति + मानव cytomegalovirus (सीएमवी प्रमोटर) के सर्वव्यापी प्रमोटर द्वारा संचालित है । अंय अभिव्यक्ति का निर्माण और प्रमोटरों का परीक्षण किया जा सकता है (यह भी प्रतिनिधि परिणाम और चित्रा 2 और चित्रा 3देखें) ।
  3. एक electroporation cuvette (०.४ cm) के लिए सेल-डीएनए मिश्रण तुरंत स्थानांतरण, cuvette एक electroporation डिवाइस में जगह और निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ electroporate: एक बार नाड़ी, घातीय क्षय, २८० वी, ९५० µF.
  4. सीधे electroporation के बाद, ताजा सेल संस्कृति माध्यम के ३०० µ एल के साथ एक १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में सेल डीएनए मिश्रण स्थानांतरण ।
  5. प्लेट २०० µ सेल निलंबन के एल के रूप में 1.3.8 में वर्णित है और आगे बढ़ना के रूप में इस्तेमाल किया अभिव्यक्ति के निर्माण के आधार पर 1.3.9 में वर्णित है, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति कुछ घंटों के बाद या अगले दिन में detectable हो सकता है ।

3. फिक्स्ड प्राथमिक कोशिकाओं के दाग

नोट: सेलुलर संरचनाओं भी फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन पत्रकारों का उपयोग कर के बजाय क्लासिक immunostaining द्वारा visualized किया जा सकता है । zebrafish प्राथमिक कोशिकाओं के लिए, हम अनुकरणीय दाग नाभिक, एफ actin और फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ acetylated tubulin के लिए निंनलिखित मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।

  1. पाली-एल-lysine लेपित आवरण पर प्लेट कोशिकाओं एक कोशिका संस्कृति डिश या multiwell प्लेट में रखा के रूप में ऊपर वर्णित (1.3.8 देखें) फिसल जाता है ।
  2. फिक्सिंग के लिए, मध्यम निकालें और 1x पंजाबियों में 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को कवर । एक शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन । कमरे के तापमान पर 1x पंजाबियों के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3x कोशिकाओं को धो लें । सुनिश्चित करें कि 1x पंजाबियों को पूरी तरह से कोशिकाओं को शामिल किया है और एक शेखर पर धुलाई कदम प्रदर्शन करते हैं ।
  3. ब्लॉक करने के लिए और तय कोशिकाओं permeabilize करने के लिए, 5% स्किम दूध और ०.३% ट्राइटन एक्स-१०० युक्त 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को कवर किया । एक शेखर पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं प्लेस । ३.२ में बताए गए अनुसार कक्ष धोएं ।
  4. acetylated tubulin,11axons के लिए एक मार्कर लेबल करने के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी 1:2000 1x पंजाब में 1% स्किम दूध युक्त में पतला । इस समाधान के साथ कोशिकाओं को कवर और रात में उन्हें एक शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी । अगले दिन, ३.२ में बताए गए अनुसार कक्ष धोएं ।
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित के साथ ग्रीन fluorochrom fluorescein isothiocyanate (FITC) 1:100 1x में 1% से अधिक दूध स्किम और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए इस समाधान के साथ कोशिकाओं को गर्मी (एक बॉक्स या के साथ पकवान उदा कवर) । एल्यूमीनियम पंनी) एक शेखर पर । ३.२ में बताए गए अनुसार कक्ष धोएं ।
  6. एक साथ actin cytoskeleton और नाभिक दाग, 1x पंजाब में एक लाल संयुग्मित (1:50) और 4 ', 6-fluorochrome-2-diamidino (phenylindole)13 (१०० एनजी/एमएल) के साथ Phalloidin12 DAPI के साथ पूरक में कोशिकाओं गर्मी 10 मिनट के लिए कमरे में एक शेखर पर अंधेरे में तापमान । ३.२ में बताए गए अनुसार कक्ष धोएं ।
  7. इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, एक साफ सतह और उस पर बढ़ते माध्यम की बूंद पर जगह पर एक गिलास वस्तु वाहक (माइक्रोस्कोप स्लाइड) डाल दिया । चिमटी का उपयोग कर एक डिश से बाहर फिक्स्ड और दाग कोशिकाओं के साथ एक कवर पर्ची ले लो और यह वस्तु वाहक का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ ड्रॉप पर जगह है । सुनिश्चित करें कि बढ़ते मध्यम आवरण स्लिप के पूरे क्षेत्र पर फैलता है । अंधेरे में सूखने दें ।
  8. वांछित इमेजिंग आवेदन किया जाता है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में फिक्स्ड और घुड़सवार कोशिकाओं की दुकान.

Figure 2
चित्र 2: electroporation द्वारा अभिकर्मक अभिव्यक्ति का निर्माण । (क) पीसीएस-eGFP के साथ ख्यात न्यूरॉन transfected पर 1 डीएपी. (ख) धारीदार myocyte (२ डीएपी) endoplasmic जालिका-लक्षित प्रोटीन ss-आरएफपी-KDEL व्यक्त करना. (ग) एक न्यूरॉन क्लस्टर के भीतर दो न्यूरॉन्स transfected के साथ पीसीएस-MitoTag-YFP पर 2 डीएपी. (घ) सैल (२ डीएपी) के साथ ट्रिपल-transfected पीसीएस-DCX-tdTomato, पीसीएस-MitoTag-YFP और पीसीएस-H2B-mseCFP. (ङ) pSK-यूएएस: mCherry electroporated में प्राथमिक कोशिकाओं (1 डीएपी) से प्राप्त दोहरे-ट्रांसजेनिक transgenes टीजी (atoh1a: Gal4TA4)hzm222 और टीजी (4xUAS: KGFPGI) hzm3३२ में GFP अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप ले जाने वाले भ्रूण से व्युत्पंन hindbrain के न्यूरॉन progenitors. स्केल बार्स = 10 µm. (a-E) एक फोकल लेजर द्वारा प्राप्त कर रहे थे माइक्रोस्कोपी के रूप में चित्र 1bमें सचित्र बनाया कांच नीचे व्यंजन का उपयोग कर । (च) 5 डीएपी में फिक्स्ड zebrafish प्राथमिक ंयूरॉंस की फ्लोरोसेंट धुंधला । नीला: DAPI (नाभिक); लाल: Phalloidin (F-actin); हरा: Acetylated tubulin (न्यूरॉन्स) । स्केल बार = 10 µm. (G) न्यूरॉन-एक्टिविटी सेल transfected विथ पीसीएस-mClover. पर 2 डीएपी, कोई विस्तार नहीं दिख रहा है । 5 डीएपी पर, एक neurite तरह संरचना का गठन किया है । स्केल बार = 25 µm. (ज) न्यूरॉन सेल के रूप में समान तैयारी से (F), fibroblasts-तरह कोशिकाओं से घिरा हुआ. स्केल बार = 10 µm. (I) न्यूरॉन एक ट्रांसजेनिक भ्रूण ले जाने से व्युत्पंन transgene टीजी (XITubb:D sred) zf14828 transfected पीसीएस-mClover के साथ । 12 और 15 के बीच डीएपी, neurites बड़े पैमाने पर अध... स्केल बार = १०० µm. कोशिकाओं में दिखाया (एफ-I) पाली-एल-lysine लेपित कांच (एफ, एच) या प्लास्टिक (जी, मैं), 10% निस्पंदन सीरम और की उपस्थिति में एल-15 मध्यम में खेती पर वरीयता प्राप्त थे न्यूरॉन अनुपूरक बी-27 (पतला 1:50) और एक epifluorescent माइक्रोस्कोप के साथ imaged. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

4. वयस्क Zebrafish मस्तिष्क से प्राथमिक कोशिकाओं की तैयारी

  1. मस्तिष्क निष्कर्षण
    1. का चयन करें एक वयस्क मछली की उंर के कम से ९० दिन । यदि किसी विशिष्ट कक्ष प्रकार के साथ कार्य करना आवश्यक है, तो एक ट्रांसजेनिक रेखा चुनें जिसमें कक्ष-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रिपोर्टर व्यंजक वांछित कक्षों को विज़ुअलाइज़ करने की अनुमति देगा.
    2. Danieau 30% में संवेदनाहारी Tricaine8 (०.२%) के २०० मिलीलीटर से भरा एक चोंच में मछली प्लेस । रुको जब तक मछली चलती बंद हो जाता है । इसे euthanize करने के लिए 15 मिनट के लिए २०० मिलीलीटर बर्फ के पानी से भरे यूरिन में anesthetized फिश को विसर्जित करें ।
    3. ७०% (v/v) इथेनॉल के साथ एक पेट्री डिश (व्यास 6 सेमी) भरें । चिमटी की एक जोड़ी के साथ पूंछ द्वारा मछली पकड़ो और यह इथेनॉल में डुबकी । सुनिश्चित करें कि मछली पूरी तरह से 5 एस के लिए इथेनॉल में डूब गया है ।
    4. गुप्त और Mullins के प्रोटोकॉल के अनुसार मस्तिष्क निकालें निंनलिखित रूपांतरों के साथ14 : केवल autoclaved या बाँझ पैक उपकरणों का उपयोग करें और बाँझ 1x पंजाबियों में सिर काटना ।
    5. सीधे निष्कर्षण के बाद, एक पेट्री डिश में मस्तिष्क प्लेस (व्यास 3 सेमी) बाँझ 1x पंजाबियों के साथ भरा हुआ है और सेल संस्कृति के लिए एक बाँझ काम बेंच के तहत पकवान ले जाएँ ।
  2. मस्तिष्क पृथक्करण और प्राथमिक कोशिकाओं के चढ़ाना
    1. बाँझ चिमटी (autoclaved) के दो सेट प्लेस, एक बाँझ पेट्री डिश (व्यास 6 सेमी) ७०% से भरा (v/एक बाँझ पेट्री डिश (व्यास 10 सेमी) Leibovitz एल के साथ भरा-15 मध्यम 10% के साथ पूरक (वी/) छानने वाला गोजातीय सीरम, बी-27 (1:50) और १.२% (वी/ v) १०,००० U पेनिसिलिन-Streptomycin और संभाल के साथ एक बाँझ सेल छलनी (४० µm; चित्रा 1C) स्वच्छ पीठ के तहत ।
    2. इथेनॉल से भरे पेट्री डिश में सेल छलनी रखें और सुनिश्चित करें कि तरल स्तर छलनी के नीचे से 5 मिमी अधिक है ।
    3. चिमटी के पहले सेट का उपयोग करना, पहले से ही इथेनॉल में रखा छलनी में मस्तिष्क हस्तांतरण और यह पूरी तरह से तरल द्वारा कवर किया जाता है सुनिश्चित. 1 एस के बाद, ऊपर वर्णित की खुराक के साथ Leibovitz एल-15 मध्यम युक्त पेट्री डिश में मस्तिष्क के साथ छलनी हस्तांतरण ।
    4. चिमटी के दूसरे सेट का उपयोग करना, ऊपर वर्णित की खुराक के साथ ५०० µ एल Leibovitz के एल-15 माध्यम से भरा एक बाँझ १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में मस्तिष्क हस्तांतरण । 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा में 4 मिलीग्राम/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए collagenase (प्रकार 2) जोड़ें ।
    5. कमरे के तापमान पर ३५ मिनट के लिए प्रति मिनट 30 क्रांतियों के साथ एक ऊर्ध्वाधर ट्यूब रोटेटर पर ट्यूब की मशीन । यांत्रिक अलग कर देना शेष ऊतक के झुरमुट के ऊपर और नीचे एक १,००० µ l पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए पृथक्करण प्रक्रिया सहायता द्वारा pipetting ।
    6. पृथक्करण बंद करो जब कोई दिखाई कणों समाधान में रहते हैं । सेल निलंबन एक बाँझ सेल छलनी के माध्यम से निकाल स्लॉट के साथ फ़िल्टर (४० µm; चित्र 1 d) एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में । ताजा सेल संस्कृति माध्यम के लगभग 10 मिलीलीटर के साथ छलनी कुल्ला ।
      नोट: जब एकल सेल निलंबन प्राप्त किया जाता है, निस्पंदन कदम के रूप में भ्रूण पृथक्करण के मामले में के रूप में आवश्यक नहीं है । मस्तिष्क एक नरम ऊतक है और इस तरह के रूप में यह एक सेल निलंबन में homogeneously असंबद्ध होने का खतरा अधिक है ।
    7. १८० x जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं और इसके बाद के संस्करण की खुराक के साथ ताजा है Leibovitz एल के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend-15 मध्यम ।
    8. पिपेट ५०० सेल निलंबन के µ एल (प्राप्त कोशिकाओं के ५०%) एक आत्म पर बनाया पाली-एल-lysine लेपित ग्लास नीचे पकवान (१.२ देखें) या एक अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से थाली में । Downscale छोटी सतहों के मामले में (यानी, एक अच्छी तरह से एक ९६ प्लेट के लिए १२५ µ l समाधान). बाँझ काम बेंच के तहत कमरे के तापमान पर ६० मिनट के लिए मशीन । फिर विशिष्ट कंटेनर को भरने के लिए और 28 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक कोशिकाओं की गर्मी के लिए ताजा माध्यम की आवश्यक मात्रा में जोड़ें ।
    9. 28 डिग्री सेल्सियस पर एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वांछित इमेजिंग आवेदन प्रदर्शन. संस्कृतियों चढ़ाना के बाद कई दिनों के लिए इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक दैनिक आधार पर माध्यम के ५०% की जगह ।

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Representative Results

चित्रा 1G एक ठेठ धारीदार myocytes के साथ जंगली प्रकार के भ्रूण से व्युत्पंन संस्कृति और ंयूरॉन के समूहों की तरह कोशिकाओं की एक प्रेषित प्रकाश छवि से पता चलता है सबसे प्रचुर मात्रा में जा रहा है । कुछ सेल प्रकार की पहचान करने के लिए और अधिक आसानी से, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ एक ट्रांसजेनिक लाइन (चित्रा ज) इस्तेमाल किया जा सकता है ।

एक pCS2 के अभिकर्मक +-प्लाज्मिड11 एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत में जंगली प्रकार के भ्रूण परिणाम के प्राथमिक कोशिकाओं में संवर्धित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP)15 एंकोडिंग 1 डीएपी (चित्रा 2a) । transfecting pCS2 +-आधारित plasmids एंकोडिंग फ्लोरोसेंट organelle मार्करों जैसे endoplasmic जालिका-लक्षित रेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ss-आरएफपी-KDEL)16 या mitochondria-लक्षित पीली फ्लोरोसेंट प्रोटीन (MitoTag-YFP)17, 18, सेलुलर संरचनाओं महान विस्तार में visualized किया जा सकता है (चित्रा बी1, सी) । सह-अभिकर्मक अप करने के लिए तीन plasmids एक ही सेल19 में कई फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण के एक साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देता है जैसे MitoTag-YFP साथ microtubule मार्कर मानव Doublecortin (DCX) 20 लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन tdTomato21 से जुड़े और परमाणु मार्कर हिस्टोन H2B एक सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (H2B-mseCFP)22,23 (चित्रा 2d) से जुड़े । सेलुलर संरचनाओं को भी उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ imaged किया जा सकता है, उदाहरण के लिए के रूप में झिल्ली मार्कर पुटिका के लिए सकारात्मक बुलबुले के आंदोलन-जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 (VAMP1) फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े हुए24 mCitrine , 25 (चित्रा 3). समय के साथ रूपात्मक परिवर्तन आसानी से इस तरह के26 mClover (चित्रा 2 जी, मैं) के रूप में एक चमकदार फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा पूरे सेल लेबल द्वारा मनाया जा सकता है । हालांकि, एक pBluescriptSK के आधार पर प्लाज्मिड के सफल अभिकर्मक-लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन mCherry27 प्राथमिक कोशिकाओं में एक यूएएस तत्व से जुड़े हुए डबल-ट्रांसजेनिक दोनों एक Gal4 चालक ले जाने के भ्रूण से व्युत्पंन की रीढ़ एंकोडिंग निर्माण और एक यूएएस प्रभाव का निर्माण दर्शाता है कि electroporation प्रोटोकॉल भी मिश्रित आनुवंशिकी (चित्रा 2E) के लिए उपयुक्त है । इसके अलावा, फिक्स्ड प्राथमिक कोशिकाओं को आसानी से इम्यूनोफ्लोरेसेंस और organelle-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंजक (चित्रा 2F, एच) का उपयोग करके दाग किया जा सकता है ।

Figure 3
चित्रा 3: सेलुलर संरचनाओं के समय चूक इमेजिंग । वाइल्ड टाइप सेल (1 डीएपी) पीसीएस-VAMP1-mCitrine के साथ transfected । एक समय चूक रिकॉर्डिंग के चयनित फ्रेम (1 फ्रेम हर १.६८ एस लिया गया था) दिखाया जाता है । तीर सिर और अनुसार रंग में पटरियों तीन अलग VAMP1-सकारात्मक बुलबुले के उपसेलुलर गतिशीलता पर प्रकाश डाला । स्केल बार = 10 µm । समय चूक एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दर्ज किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पृथक्करण तकनीक और बुनियादी संस्कृति की स्थिति को भी वयस्क zebrafish के टिशू पर लागू किया जा सकता है. यहां, हम जंगली प्रकार zebrafish से वयस्क मस्तिष्क ऊतक का परीक्षण किया । चित्र 4a -डी एक जटिल न्यूरॉन-नेटवर्क की तरह एक शुरू में मलबे लेपित संस्कृति के प्रगतिशील विकास से पता चलता है । एक ट्रांसजेनिक मछली transgene टीजी (XITubb:D sred)28zf148 ले जाने से वयस्क मस्तिष्क का उपयोग करके, पूरी तरह से विभेदित DsRed-एक्सप्रेस न्यूरॉन्स करीब विस्तार (चित्रा 4E) में जांच की जा सकती है.

Figure 4
चित्रा 4: वयस्क zebrafish मस्तिष्क की प्राथमिक कोशिका संस्कृति । (क) 1 डीएपी, (ख) 3 डीएपी, (ग) 5 डीएपी और (घ) 8 डीएपी में वयस्क zebrafish मस्तिष्क से व्युत्पंन प्राथमिक कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र छवियां । 1 से 3 डीएपी, मृत कोशिकाओं और ऊतक मलबे गायब हो जाते हैं, जबकि एकल या संकुल ंयूरॉन कोशिकाओं अधिक से अधिक स्पष्ट हो जाते हैं । 3 डीएपी पर, न्यूरॉन कोशिकाओं को पहली छोटी neurites फार्म शुरू करते हैं । 5 डीएपी आगे से, यह अच्छी तरह से लम्बी neurites के सैकड़ों के साथ एक नेटवर्क के गठन का निरीक्षण करने के लिए संभव है । स्केल बार्स = ५० µm. कक्ष एक पाली-एल-lysine-लेपित ९६-वेल प्लेट में कल्चर्ड थे । (ङ) transgene टीजी (XITubb:D sred) zf148 व्यक्त एक ट्रांसजेनिक मछली के वयस्क मस्तिष्क से 7 डीएपी में प्रसंस्कृत कोशिकाओं । DsRed विभेदित न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है28. स्केल बार = १०० µm. कक्ष एक पाली-एल-lysine-लेपित 24-वेल प्लेट में कल्चर्ड थे । सभी छवियों को एक epifluorescent माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहीत किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां, हम या तो 2 dpf zebrafish भ्रूण या वयस्क zebrafish मस्तिष्क से संस्कृति प्राथमिक कोशिकाओं के लिए दो अलग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

2 dpf zebrafish से प्राथमिक सेल संस्कृतियों की तैयारी अपेक्षाकृत बुनियादी सेल संस्कृति तकनीक में अनुभव के साथ किसी के लिए प्रदर्शन करने के लिए आसान है । हालांकि, अच्छे और reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रारंभिक सामग्री के रूप में भ्रूण की एक पर्याप्त संख्या महत्वपूर्ण है (१०० ंयूनतम है) । भ्रूण की परवरिश के दौरान, संदूषण के सभी संभव स्रोतों को कीटाणुओं और परजीवी की मात्रा को यथासंभव कम रखने के लिए बचा जाना चाहिए । सबसे महत्वपूर्ण इथेनॉल में भ्रूण की गर्मी है-इस कदम के लिए लंबे समय तक पूरी तरह से नसबंदी सुनिश्चित करने की जरूरत है, लेकिन नहीं भी लंबे समय या तो इथेनॉल के बाद से एक कार्बनिक विलायक कि नुकसान कोशिकाओं और ऊतक है ।

समय भी मस्तिष्क ऊतक या 2 dpf zebrafish भ्रूण के एंजाइमी पृथक्करण के दौरान आवश्यक है । मशीन समय पार नहीं किया जाएगा और एंजाइम युक्त मध्यम जल्दी से एक सेल चरण के लिए पूरा पृथक्करण एक बार हटा दिया जाएगा पूरा हो गया है । फिर भी, प्रकार 2 collagenase कोशिका झिल्ली नुकसान नहीं है और यह के रूप में दृढ़ता से FBS द्वारा हिचक नहीं है, trypsin३३के रूप में । इन गुणों के लिए धंयवाद, हम एक आवश्यक सेल व्यवहार्यता का समर्थन पूरक के रूप में FBS की उपस्थिति में पृथक्करण प्रदर्शन करने में सक्षम थे और कोशिका क्षति को कम करने, उच्च उपज और नाजुक कोशिका प्रकार की व्यवहार्यता में जिसके परिणामस्वरूप ।

हमारे प्रतिनिधि परिणामों द्वारा दिखाए गए के रूप में, विशिष्ट कोशिका प्रकार या तो आकृति विज्ञान द्वारा या फ्लोरोसेंट पत्रकारों के लिए सेल प्रकार विशिष्ट transgenes एंकोडिंग की अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की जा सकती है । बाद बहुत सुविधाजनक है जब विशिष्ट कोशिका19आबादी के लाइव सेल इमेजिंग प्रदर्शन । हालांकि, हम अत्यधिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा 2 dpf भ्रूण में संबंधित बढ़ाने की अभिव्यक्ति पैटर्न सत्यापित करने के लिए लगातार परिणाम सुनिश्चित करने के लिए सलाह देते हैं.

भ्रूण zebrafish प्राथमिक कोशिकाओं में सेलुलर संरचनाओं के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए, हम फ्लोरोसेंट organelle मार्करों की एक चयन के लिए transfect प्लाज्मिड डीएनए एंकोडिंग के लिए एक electroporation प्रोटोकॉल की स्थापना की । इस विधि द्वारा transfected कोशिकाओं की दर अपेक्षाकृत कम है लेकिन विश्वसनीय और लाइव सेल इमेजिंग19के लिए पर्याप्त सेल नंबर प्रदान करता है । एक सफल अभिकर्मक के लिए, एक महत्वपूर्ण कदम निलंबन में कोशिकाओं की संख्या का सही निर्धारण है । औसत में, 106 कोशिकाओं के बारे में ९० २ dpf भ्रूण से प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन सटीक सेल पहले electroporation गिनती19अनिवार्य है । हालांकि, जैसे आम स्तनधारी सेल लाइनों की तुलना में जैसे-7 या हेला, 2 dpf zebrafish भ्रूण से प्राथमिक कोशिकाओं के आकार में बहुत विविध हैं, लेकिन औसत में काफी छोटे (विशेष रूप से ंयूरॉंस), जो एक Neubauer कक्ष में गिनती अपेक्षाकृत मुश्किल कर सकते हैं । एक ही बाद इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए सच है । करने के लिए ड्यूटियां उन छोटे zebrafish कोशिकाओं में सेलुलर संरचनाओं कल्पना, उच्च संकल्प के साथ एक उंनत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है, अधिमानतः एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप ।

वयस्क zebrafish मस्तिष्क से प्राथमिक कोशिकाओं की तैयारी और अधिक उन्नत है क्योंकि यह पशु विदारक में प्रशिक्षण की आवश्यकता है और मस्तिष्क ऊतक निकालने14. इसके अलावा, बाँझ शर्तों पहले से ही बाँझ कार्यक्षेत्र बाहर निकाले मस्तिष्क दूषित नहीं करने के लिए बनाए रखा जा करने के लिए की जरूरत है । हालांकि, बाद में पृथक्करण और चढ़ाना के बारे में कदम पहले प्रोटोकॉल के लिए तुलनीय है और यह भी मांसपेशियों या जिगर के रूप में वयस्क मछली के अंय ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है ।

दोनों प्रोटोकॉल के लिए, मुख्य सीमा मुश्किल की सीमित व्यवहार्यता के लिए संस्कृति में कोशिका प्रकार, ंयूरॉंस की तरह खेती है । 3 डीएपी के बाद मानक शर्तों का उपयोग, भ्रूण zebrafish प्राथमिक कोशिकाओं के घनत्व दृढ़ता से इस प्रकार इमेजिंग प्रयोगों19के लिए समय अवधि सीमित कम है । ज्यादातर fiboblast की तरह कोशिकाओं को विशेष रूप से सिलवाया समीचीन के अभाव में जीवित रहते हैं ।

सेल प्रकार की अपनी जटिलता में संस्कृति के जीवित रहने की दर में सुधार करने के लिए, हम सफलतापूर्वक Leibovitz के एल-15 मध्यम का परीक्षण किया । इसके अलावा हम इसे ंयूरॉन के साथ पूरक-ंयूरॉन विशिष्ट संस्कृति के लिए बी-27 को बढ़ावा देने । न्यूरॉन कोशिकाओं कोशिका संस्कृति में अंतर करने के लिए और कई दिनों के लिए जीवित रहने के लिए मनाया गया है, जब पूरे भ्रूण (चित्रा 2F-I) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वयस्क मस्तिष्क (चित्रा 4E) से व्युत्पंन. इसके अलावा, उच्च घनत्व में प्राथमिक कोशिकाओं के चढ़ाना (जैसे, ०.२५ x 10 १०० mm2प्रति6 कोशिकाओं) कम घनत्व (जी. रूस, प्रारंभिक परिणाम) के विपरीत में कोशिका व्यवहार्यता में सुधार ।

विशिष्ट संस्कृति मीडिया और पूरक आहार के उपयोग के अलावा, हम रिपोर्ट कैसे विभिंन सब्सट्रेट के उपयोग के सेल प्रकार है जो अंतिम संस्कृति का गठन और चयनात्मक पैरामीटर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है सेल के एक सबसेट के विकास को बढ़ावा देने की विविधता पर सीधा प्रभाव पड़ता है प्रकार. ऊतक संस्कृति-पाली-एल-lysine कोटिंग की तुलना में प्लास्टिक का इलाज करने के लिए दृढ़ता से fibroblast की तरह सेल आसंजन और प्रसार की सुविधा के लिए लगता है (चित्रा 1E, एफ) । एक ही समय में, कई कोशिका प्रकार है कि समर्थन कोशिकाओं पर निर्भर करता है और विशिष्ट आसंजन अणुओं (न्यूरॉन्स की तरह) ठीक से पालन नहीं करते, बढ़ने, या इलाज प्लास्टिक पर अंतर है, लेकिन विशिष्ट चिपकने वाला समर्थन पसंद करते हैं. इसलिए हम अनुशंसा करते हैं, जब यह एक fibroblast-या उपकला की तरह संस्कृति३३प्राप्त करने के लिए इरादा नहीं है, पाली-L-lysine या अन्य सेल-विशिष्ट सब्सट्रेट के लिए कोटिंग सेल संस्कृति व्यंजन का उपयोग करने के लिए.

हम अपने प्रोटोकॉल पर विचार करने के लिए एक पूरक के रूप में प्राथमिक सेल संस्कृति के उपयोग के लिए एक प्रारंभिक बिंदु zebrafish vivo अध्ययन, जो आगे विकसित किया जा सकता है और विशिष्ट कोशिका प्रकार की खेती के लिए अनुकूलित और कई विविध अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Fritsch, ए. भेड़िया-Asseburg, Linde और एस.-एम । उत्कृष्ट पशु देखभाल और तकनीकी सहायता के लिए Tokarski । हम गहन और उपयोगी विचार विमर्श के लिए Köster लैब के सभी सदस्यों के लिए आभारी हैं । हम आभार ड्यूश Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) और लोअर Saxony, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) के संघीय राज्य द्वारा धन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fish lines
AB (wild-type) established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC)
Tg(ptf1a:eGFP)jh1 stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007)
Tg(XITubb:DsRed)zf148 stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed  (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008)
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
centrifuge Eppendorf model 5804 R
ChemiDoc MP imaging system BioRad model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos
confocal laser scanning microscope Leica microsystems model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63X objective
epifluorescent microscope Leica microsystems model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40X objective
Gene Pulser Xcell with capacitance extender BioRad 1652661 electroporation device
Horizontal shaker GFL model 3011
incubator for cell culture (28 °C) Memmert model incubator I
incubator for embryos (28 °C) Heraeus type B6120
light microscope Zeiss model TELAVAL 31
micro pipettes Gilson
sterile work bench Bio Base with laminar flow and UV light
tweezers Dumont Style 5, Inox
vertical tube rotator Labinco B.V. model LD-79
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image Lab Software BioRad for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad
ImageJ National Institutes of Health used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).
LAS X Leica Microsystems for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pCS-DCX-tdTomato Köster Lab # 1599 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-eGFP Köster Lab # 7 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-H2B-mseCFP Köster Lab # 2379 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-mClover Köster Lab # 3865 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-MitoTag-YFP Köster Lab # 2199 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-ss-RFP-KDEL Köster Lab # 4330 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-VAMP1-mCitrine Köster Lab # 2291 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pSK-UAS:mCherry Köster Lab # 1062 based on the pBluescript-backbone of Stratagene
Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request.
Name Company Catalog Number Comments
Plastic and glass ware
BD Falcon Cell Strainer (40 µm) FALCON REF 352340 distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium
1.5 mL reaction tubes Sarstedt 72690550
24-well plate Sarstedt 83.3922
50 mL falconic tube Sarstedt 62.547.004
96-well plate Sarstedt 83.3924.005
EasyStrainer (40 µm) Greiner Bio-One 542 040 with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation
electroporation cuvette (0.4 cm) Kisker 4905022
glass coverslips Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1051201
Microscope slides Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) 631-0845
Neubauer chamber Henneberg-Sander GmbH 9020-01
Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) A. Hartenstein PP05
Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) Sarstedt 821473 for zebrafish embryos
pipette tips Sarstedt Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) TPP Techno Plastic Products AG 93040
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) Sarstedt 72690550
sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) Sarstedt 83.3902 for brain dissection
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals and Reagents
sodium chloride Roth 0601.1
4 % paraformaldehyde in 1x PBS Sigma-Aldrich 16005
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
calcium nitrate tetrahydrate Sigma-Aldrich C1396
ethanol p.a. 100% Sigma-Aldrich 46139
goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated Thermo Fisher Scientific 31547
HEPES Roth 9105.4
high vacuum grease DOW CORNING 3826-50 silicon grease used for self-made glass bottom dishes
magnesium sulfate heptahydrate Merck 105886
methylene blue Serva 29198.01
Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody Sigma-Aldrich T6793
Aqua-Poly/Mount (mounting medium) Polyscience 18606
poly-L-lysine Biochrom L 7240
potasssion chloride Merck 104938
Skim milk Roth 68514-61-4
Texas Red-X Phalloidin Thermo Fisher Scientific T7471
Tricaine Sigma-Aldrich E10521 Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate
Triton X-100 BioRad 1610407
Trypan Blue Gibco by Life Technologies 15250061
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
collagenase (Type 2) Thermo Fisher Scientific 17101015 dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C
pronase (from Streptomyces griseus) Roche 11459643001 distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C
Name Company Catalog Number Comments
Medium and solutions for cell culture
1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Gibco by Life Technologies 14190-169 distributed by Thermo Fisher Scientific
CO2-independent medium Gibco by Life Technologies 18045054 distributed by Thermo Fisher Scientific
filtrated bovine serum (FBS) PAN-Biotech individual batch
glutamine 100x Gibco by Life Technologies 25030081 distributed by Thermo Fisher Scientific
Leibovitz's L-15 medium Gibco by Life Technologies 11415049 distributed by Thermo Fisher Scientific
PenStrep (10,000 U/mL) Gibco by Life Technologies 15140148 distributed by Thermo Fisher Scientific

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References

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Russo, G., Lehne, F., Pose Méndez, S. M., Dübel, S., Köster, R. W., Sassen, W. A. Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells. J. Vis. Exp. (138), e57872, doi:10.3791/57872 (2018).

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