Summary
선물이 zebrafish 태아 transfection 라이브 셀 이미징 뿐만 아니라 성인 zebrafish 두뇌에서 1 차 셀을 준비 하는 프로토콜의 기본 셀 문화를 준비 하기 위한 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜.
Abstract
Zebrafish 태아 투명 하 고 그대로 고 발전 등뼈 동물에서 동적 생물 학적 과정의 우수한 vivo에서 이미징 되므로 어머니 밖에 서 급속 하 게 개발 합니다. 그러나, 명료한 세포 유형 및 subcellular 구조의 형태학의 상세한 영상 전체 마운트에 제한 됩니다. 따라서, 우리 zebrafish 태아와 성인 조직 문화 라이브 1 차 셀을 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜 설립.
간단 하 게, 2 dpf zebrafish 태아는 dechorionated, deyolked, 살 균, 그리고 콜라와 함께 단일 셀에 해리. 여과 단계 후 1 차 셀 유리 하단 요리에 도금 하 고 몇 일 동안 경작. 신선한 문화로 긴 기간 differenciated, 높은 해상도 confocal 이미징 연구에 사용할 수 있습니다. 문화 전기 myocytes와 폴 리-L-리 신 코팅에 저명한 되 고 신경 다른 셀 형식을 포함 합니다. 특히 라벨 subcellular 구조에 형광 마커 단백질에 의해, 우리는 또한 electroporation 프로토콜 뉴런을 포함 하 여 다른 세포 유형으로 플라스 미드 DNA의 transfection 수 있는 설립. 따라서, 연산자의 정의 된 자극, 복잡 한 셀 동작, 그리고 기본 zebrafish 세포의 세포내 역학 수 부과 높은 공간과 시간 해상도. 또한, 성인 zebrafish 두뇌를 사용 하 여 기본 자란 조건 뿐 아니라 설명된 분리 기술, 또한 성인 zebrafish 조직에 대 한 작업 설명 합니다.
Introduction
제 브라 (Danio rerio, D. rerio) 수많은 분야 기본 및 생물 의학 연구1의 척 추가 있는 인기 모델 이다. Zebrafish 태아 utero 전빠르게 개발, 투명 한, 그리고 따라서 살아있는 유기 체에서 척추 개발을 공부 하 고 우수한 필수 구성 요소를 제공 하는 현미경 적합. Zebrafish2의 유전자 추적성 인해 많은 안정적인 유전자 변형 기자 라인 셀 형식 관련 표현의 다양 한 형광 마커 특정 세포 인구의 관찰에 대 한 수 있도록 설립 되었습니다. Zebrafish 커뮤니티 제공 합성 Kal4TA4 (또는 KalTA3에 해당 GalFF) 표현 transgene 수행 소위 Gal4 드라이버 라인의 광범위 한 다양 한 바이러스 transcriptional 활성화 융합 유전자 효 Gal4 DNA 바인딩 도메인 셀 형식 관련 증강의 통제 도메인. 이러한 드라이버 라인 수행 transgenes는 정의 된 상류 활성화 순서 (UAS) 리포터 유전자를 융합의 구성 된 이펙터 라인을 넘어 있다. Kal4TA4 단백질에 따라서 기자 유전자3,4의 셀 형식 선택적 식 활성화 UAS 요소에 바인딩합니다. 이 방법은 거의 모든 사용 가능한 증강 및 기자 요소 이중 유전자 변형 동물의 매우 다양 한 조합 연구에 대 한 수 있습니다.
그러나 개별 셀 또는 그들의 subcellular 내용을 초점 깊이 있는 라이브 영상 전체 하 고 끊임없이 변화 배아에 제한 됩니다. 높은 해상도와 특정 세포 생물학 질문을 해결 하기 위해 세포 배양의 사용은 종종 바람직. Zebrafish의 일부 셀 라인, 하지만 그들은 무 겁 게으로 선택한5,,67 여겨진다 하 그들의 전파는 종종 시간이 걸리는. 또한, 모든 사용 가능한 셀 라인은 구와 파생, 실험 세포 배양을 사용 하 여 셀의 한 종류에 제한. 따라서 우리 모두는 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜 zebrafish 태아 및 접근 문화의 장 수를 증가 하 고 재배의 다양성을 확대 하기 위해 함께 성인 zebrafish 뇌에서 직접 1 차 셀을 준비 하는 설립 셀 유형입니다. 또한, 선물이 형광 세포 기관이 표식에 대 한 식 구문 가진 배아 1 차 셀 transfect에 절차. 따라서, 세포 형태학 및 subcellular 구조 공간 및 시간에서 고해상도 그들의 주요 기능을 유지 하는 다른 세포 유형으로 분석할 수 있습니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 동물 작업은 법적 규정 (EU-지침 2010/63). 유지 보수 및 물고기의 처리 확정 된 지방 자치 단체 및 동물 복지의 브라운슈바이크 공대와 낮은 색 소니 국가 사무실의 소비자 보호 및 식품 안전 (LAVES, 올덴부르크, 독일; 아리조나 §4 (02.05) TSchB TU 학사).
1. 1 차 셀 Zebrafish 태아에서의 준비
- 2 일의 준비 게시물 수정 (dpf) zebrafish 태아
- 주 1: 여러 교차점 zebrafish 스트레인 및 당신의 zebrafish 시설 관리자8의 사양에 따라 선택의의 설정 합니다.
- 제 2 일: 친구 물고기 및 10 cm 배양 접시 (플라스틱)에 산란 후 직접 계란8 를 수집 합니다. 파스퇴르 피 펫 (플라스틱)와 함께 죽 었 거 나 오염 된 계란을 제거 합니다. 워시는 Danieau 30% (5.8 m m 염화 나트륨, 염화 칼륨 0.07 m m, 0.04 m m 마그네슘 황산 염, 0.06 m m 칼슘 질산염, 5 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 산, pH 7.2)8 0.0001% (w/v) 메 틸 렌 블루 1 x 달걀. Danieau 매체 교환 없이 메 틸 렌 블루, 메 틸 렌 블루 수 있습니다 autofluorescence, 원인과 28 ° c.에 밤 알을 품 어 이후 30%
참고: 셀의 충분 한 양을 얻기 위하여 물고기 라인 당 100 계란의 최소 시작. 한 페 트리 접시에 150 개 이상의 배아를 발생 하지 않습니다. - 제 3 일: 죽 었 거 나 오염 된 배아를 제거 하 고 교환 매체 Danieau에 30%. 계산 하 여 배아의 수를 결정 합니다. 28 ° c.에 밤에 태아를 품 어
참고: 표현 형광 성 취재 원 유전자 변형 라인을 사용 하 여, 심사 1 dpf 또는 2 dpf에 필요할 수 있습니다.
참고: 많은 양의 태아, 그것 것이 좋습니다 각 페 트리 접시 (그림 1A)의 흑백 이미지 하 고 이미징 소프트웨어와 배아의 수를 정할 수 있습니다. - 제 4 일: 태아는 이제 2 dpf. Chorions 제거, Danieau 308 의 10 mL을 1 mg/mL의 농도와 1 mL 나 추가 및 모든 chorions 때까지 실 온에서 통에 태아를 품 어 하 (주위 온도 따라 20-40 분)를 분리 합니다. Danieau와 세척 30% 나 및 chorions 제거 및 추가 사용 때까지 실 온에서 배아를 유지.
- 재사용 가능한 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 하단 요리 준비
참고: 상용 유리 하단 요리 단일 사용만을 위해 디자인 되 고 비싸다. 다음 절차에서는 표준 연구소 재료에서 재사용 성가 유리 하단 요리를 준비 하는 방법을 설명 합니다.- 표준 셀 문화 요리 (직경 6 cm, 플라스틱) (그림 1B)의 하단에 직경 10 mm의 구멍을 드릴 합니다. 접시 바닥 드릴링 먼지를 제거 하 수돗물으로 깨끗이 씻는 다.
- 접시 바닥의 밑면에 있는 구멍의 주위에 실리콘 그리스를 확산 하 고 coverslip 접착제로는 그리스를 사용 하 여 연결 합니다. 그리스 요리 바닥과 coverslip 사이의 격차 물개 다는 것을 확인 하십시오.
참고: 사용된 coverslips의 두께 나중 이미징 응용 프로그램에 대 한 적절 한 있는지 확인 합니다. - 수돗물 찬물과 비누로 성가 유리 하단 요리 철저 하 게, 하지만 신중 하 게 씻어. 유리 하단 요리 세 번 비누를 제거 하는 이온된 수와 린스. 요리 뚜껑을 건조 하 고 바닥 접시 추가 사용까지 깨끗 한 상자에 보관.
- 문화 준비의 날에 (주 4 참조 1.1.4): 둘 다의 내부를 축 축 하 게 뚜껑을 접시와 70% (v/v) 에탄올과 바닥 접시. 요리 뚜껑을 배치 하 고 층 류와 자외선 살 균 작업 벤치에서 안쪽을 향하도록 바닥 접시. 에탄올, 증발 될 때까지 건조 다음 20 분 동안 자외선을 적용 합니다. 이 치료 후, 요리는 조립 하 고 살 균으로 간주 됩니다.
- 코팅, 폴 리-L-리 신 (0.1 mg/mL) 각 유리 하단 접시 중간의 200 µ L 플라스틱 및 피 펫 팁 표면 장력을 끊어서는 coverslip에 액체를 확산. 60 분 동안 건조 하자 다음 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1 x. 액체를 제거 합니다. 추가 사용까지 벤치에서 요리를 계속.
참고: 다른 코팅 실험의 목표에 따라 테스트 될 수 있습니다. 우리 폴 리-L-리 신 뉴런의 성장을 지원 하기 위해 충분 한 발견, 없이 플라스틱을 처리 하는 반면 어떤 추가 코팅 섬유 모양의 세포 (그림 1E, F)의 성장에 유리한 것으로 나타났다.
참고: 성가 유리 하단 요리 여러 번 사용할 수 있습니다. coverslip 교환, 따뜻한 수돗물으로 씻어 신중 하 게는 coverslip 분리 하 고 70% (v/v) 에탄올과 비누와 나머지 그리스를 제거.
- 준비 및 1 차 셀의 도금
- 문화 준비의 날에 (주 4 참조 1.1.4): 살 균 세포 배양 접시에 배아를 전송 (직경 6 cm) 신선한 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여. 모든 태아는 약 2 cm 이하의 직경을 가진 큰 드롭에서 수집 될 때까지 액체를 현명한 제거 합니다.
- 무 균 작업 벤치에 배아와 접시를 놓고 공동2-독립 매체 (보충 10% (v/v) 만들어지고 소 혈 청 글루타민 및 1.2% (v/v) 10000 x 1 U 페니실린-스; 다음에는 모든 보충제와 매체 "세포 배양 매체"로 함) 요리 반 가득 될 때까지.
참고: 대안 공동2-독립 매체 예 neurobasal 매체, DMEM 매체 또는 Leibovitz의 L-15 매체 실험의 목표에 따라 테스트할 수 있습니다. CO2-독립 매체 그리고 Leibovitz의 L-15 매체 CO2 배양 기를 요구 하지 않기의 이점이 있다. - 노른자위를 제거 하려면 200 µ L-피 펫 팁을 사용 하 여 위아래로 배아 플라스틱. 성공적인 deyolking 매체의 흐려 의해 인식 될 수 있습니다.
- 70% (v/v) 에탄올과 셀 문화 요리와 신선한 세포 배양 매체와 다른 셀 문화 접시를 채우십시오. 컷오프 1000 µ L-피 펫 팁을 사용 하 여 핸들 (40 µ m; 멸 균 셀 여과기에 배아를 전송 그림 1C)입니다. 손잡이 스 트레이너 하 고 있도록 모든 배아 5 잠긴 에탄올과 접시에 찍어 s. 즉시 나중에, 신선한 세포 배양 매체와 함께 접시에 배아와 여과기를 잠수함.
참고: 셀 멤브레인 수 재사용 여러 번. 수돗물, 70% 에탄올에 그들 및 건조 및 UV 치료 실행 부드러운 브러시로 깨끗 한 살 균 작업에서 그들 사용 하기 전에 직접 벤치 (1.2.4 참조). - 살 균 1.5 mL 반응 튜브 (1 개의 관에 약 100 배아) 배아를 전송 합니다. 콜라 (2 형) 4 mg/mL 1 mL의 총 볼륨에서의 최종 농도에 세포 배양에 희석을 추가 합니다. 튜브 실 온에서 45 분 동안 분 당 30 혁명 수직 튜브 회전자에 태아를 품 어.
- 1000 µ L-피 펫 팁 배아 콜라 혼합물을 아래로 pipetting으로 나머지 세포 덩어리를 분리. 그런 다음 배기 슬롯 (40 µ m; 멸 균 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 그림 1D) 으로 50 mL 원뿔 튜브. 신선한 세포 배양 매체의 약 10 mL와 여과기를 헹 구 십시오.
- 180 x g에서 3 분 동안 원심 분리 하 여 셀을 펠 렛. 펠 릿 거의 볼 수 있습니다. 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 30 원래 사용된 배아 당 200 µ L 신선한 세포 배양 매체에서 셀 resuspend.
참고: 표시 펠 렛을 얻기 위해이 좋습니다 100 배아의 최소와 함께 시작 하. - 플라스틱의 자 폴 리-L-리 신-코팅 유리 하단 접시 유리 영역에 직접 1.3.7 단계에서 얻은 세포 현 탁 액의 200 µ L (1.2 참조). 무 균 작업 벤치에서 실 온에서 60 분 동안 품 어. 6 mL 신선한 세포 배양 매체의 추가 28 ° c.에 1 차 셀을 품 어
- 28 ° c.에는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 원하는 이미징 응용 프로그램 수행 매일 세포 배양 매체를 교환 합니다. 문화는 이미징 (dap) 도금 후 몇 일 동안 사용할 수 있습니다.
그림 1: zebrafish 태아의 1 차 셀 문화. (A) 1의 흑백 이미지 튐 배아, 배아의 수를 분석 하는 소프트웨어 도구에 의해 처리 수 있습니다. (B) 세포 문화 요리 (직경 6 cm) 드릴 된 구멍 (직경 10 m m) 재사용 성가 유리 하단 요리를 준비 하는 데 사용 됩니다. (C) 간단한 핸들 셀 멤브레인 (40 µ m)로 사용 됩니다 "방문 그물" 에탄올으로 deyolked 배아를 찍어 신선한 세포 배양 매체를 신속 하 게 그들을 전송. (D) 셀 슬롯 배기와 멤브레인 (40 µ m)는 콜라 중재 분리 후 셀을 필터링 하는 데 사용 됩니다. (E) 5 튐 후, 1 차 셀 폴 리-L-리 신 주로 코팅 유리에 시드 발음 확장명이 뉴런을 형성. 눈금 막대 = 100 µ m. (F) 후 코팅, 섬유 아 세포와 같은 세포 자라 다 문화 없이 5 대우 플라스틱에 튐. 눈금 막대 = 100 µ m. (E)와 (F) epifluorescent 현미경에 의해 인수 했다. (G) 기본 셀 1에 야생 타입 제 브라에서 파생 된 빛 이미지 튐. 전기 myocytes 및 얇은 프로세스를 확장 하는 뉴런의 클러스터 쉽게 관찰 될 수 있다. 눈금 막대 = 50 µ m. (H) 배양된 세포의 유전자 변형 라인 안내 (ptf1a: eGFP) eGFP는 hindbrain에 주로 GABAergic 신경의 신경 창시자와 망막 세포 인구29, 의 하위 집합을 표현 하는 jh1 30 , 31. 눈금 막대 = 50 µ m. (G)와 (H) confocal 레이저 스캐닝 현미경 (B)에서 볼 수 있듯이 만든 유리 하단 요리를 사용 하 여 인수 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
2. 기본 transfection 플라스 미드 DNA와 세포
- Resuspend 만들어지고 그리고 수송과 세포에서 세포 배양 매체 대신 1 x PBS에서 1.3.7 단계. Trypan 파랑 세 실9셀 수를 결정 하는 세포 현 탁 액의 약 수를 얼룩.
- 10 µ g 울트라 순수 플라스 미드 DNA 1.5 mL 반응 관에 0.5 백만 셀 혼합 하 고 총 볼륨 1 x PBS 가진 100 µ L 조정 합니다.
참고: 우리의 실험에 대 한 우리 주로 사용 식 구문을 기반으로 플라스 미드 pCS2 +10. PCS2 +의 다중 복제 사이트에 복제 하는 열려있는 독서 프레임 표현의 인간의 세포 (CMV 발기인)의 유비 쿼터 스 발기인에 의해 구동 됩니다. 다른 식 구문 및 발기인 (또한 대표 결과 및 그림 2 및 그림 3참조) 테스트 될 수 있습니다. - 전송 셀 DNA 혼합 즉시 electroporation 베트 (0.4 c m), electroporation 장치 및 다음 설정으로 electroporate는 베트 배치: 1 회 펄스, 지 수 감퇴, 280 V, 950 µ F.
- Electroporation, 후 직접 세포 DNA 혼합 신선한 세포 배양 매체의 300 µ L와 1.5 mL 반응 관에 전송 합니다.
- 1.3.8에 설명 된 대로 세포 현 탁 액의 200 µ L 플레이트 및 진행 사용된 식 구문에 따라 1.3.9에 설명 된 대로 형광 단백질의 표현 수 있습니다 감지 몇 시간 후 또는 다음 날에.
3. 고정된 1 차 셀의 얼룩
참고: Subcellular 구조 또한 형광 성 융해 단백질 기자를 사용 하는 대신 고전적인 immunostaining에 의해 구상 될 수 있다. Zebrafish 1 차 셀에 대 한 우리 형광 마커 모범적인 얼룩 핵, F-말라와 acetylated tubulin에 다음과 같은 표준 프로토콜을 사용합니다.
- 폴 리-L-리 신 코팅된 커버 슬립에 판 전지 (참조 1.3.8) 위에서 설명한 대로 셀 문화 접시 또는 multiwell 격판덮개에 배치 합니다.
- 고정, 매체를 제거 하 고 4% paraformaldehyde 1 x PBS에 있는 셀을 커버. 셀 통에 4 ° C에서 10 분 동안 품 어. 워시 5 분 각 실 온에서 1 x PBS 가진 3 배 세포. 1 x PBS 셀을 완전히 덮는 다는 것을 확인 하 고 통에 세척 단계를 수행 합니다.
- 차단 하 고 5% 탈지 우유와 0.3%를 포함 하는 1 x PBS와 셀 커버 고정된 세포를 permeabilize 트라이 톤 X-100. 통에 실 온에서 10 분에 대 한 셀을 놓습니다. 3.2에 설명 된 대로 세포를 씻어.
- Acetylated tubulin, axons11, 마커를 포함 하는 1% 탈지 우유 1 x PBS에서 1 차적인 항 체 1:2,000 희석. 이 솔루션으로 세포를 커버 하 고 통에 4 ° C에서 밤에 그들을 품 어. 다음 날, 3.2에 설명 된 대로 세포를 씻어.
- 1% 탈지 우유를 포함 하는 1 x PBS에 녹색 fluorochrom fluorescein isothiocyanate (FITC) 배율을 사용으로 활용 된 이차 항 체를 희석 하 고 어둠 속에서 실 온에서 1 h이 솔루션으로 셀을 품 어 (는 요리 예 상자 커버 또는 알루미늄 호 일) 통에. 3.2에 설명 된 대로 세포를 씻어.
- 동시에 말라 골격 및 핵 얼룩, Phalloidin12 붉은 형광 색소 (1:50)와 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)13 (100 ng/mL) 룸에서 10 분 활용으로 보충 1 x PBS에 셀을 품 어 통에 어둠 속에서 온도입니다. 3.2에 설명 된 대로 세포를 씻어.
- 준비 하려면 세포 이미징, 깨끗 한 표면에 유리 개체 캐리어 (현미경 슬라이드)를 넣어 하 고 그것에 설치 매체의 드롭에 놓습니다. 핀셋을 사용 하 여 접시에 꺼내 고정 및 스테인드 셀 커버 슬립 하 고 제자리에 드롭 개체 캐리어를 직면 하는 셀. 그 설치 매체 확산 커버 슬립의 전체 지역에 다는 것을 확인 하십시오. 어둠 속에서 건조 보자입니다.
- 스토어 고정 하 고 원하는 이미징 응용 프로그램 수행 될 때까지 4 ° C에서 어둠 속에서 셀을 탑재.
그림 2: electroporation 여 Transfection 식의 구성. (A) 1 Pc eGFP와 페 Putative 신경 튐. (B) 전기 myocyte (2 튐) ss-RFP-KDEL 바인딩과 그물 타겟 단백질을 표현. 클러스터 내에 신경 2 Pc-MitoTag-YFP와 페 (C) 두 개의 뉴런 튐. (D) 셀 (2 튐) Pc와 트리플 페-DCX-tdTomato, Pc-MitoTag-YFP 및 Pc-H2B-mseCFP. (E) pSK-transgenes Tg를 들고 더블 유전자 변형 태아에서 파생 된 1 차 셀 (1 튐)에 UAS:mCherry electroporated (atoh1a: Gal4TA4) hzm222 및 안내 (4xUAS:KGFPGI) hzm332 에 GFP 식 결과 신경은 hindbrain의 창시자입니다. 스케일 바 = 10 µ m. (A-E) 의해 인수 됐다 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 사용 하 여 만든 그림 1B에서 볼 수 있듯이 유리 하단 요리. (F) 형광 얼룩 고정된 zebrafish 기본 신경의 5에 튐. 블루: DAPI (핵); 빨간색: Phalloidin (F-말라); 녹색: Acetylated tubulin (신경). 눈금 막대 = 10 µ m. (G) 같은 신경 세포 Pc mClover와 페. 2에서 dap, 확장자 표시 됩니다. 5에서 dap, neurite 같은 구조를 형성 했다. 눈금 막대 = 25 µ m. (H) (F), 셀과 같은 준비에서 신경 섬유 아 세포와 같은 세포에 의해 둘러싸여. 눈금 막대 = 10 µ m. (나) 신경 transgene Tg를 들고 유전자 변형 태아에서 파생 된 (XITubb: DsRed) Pc mClover와 zf14828 페. 12과 15 사이의 튐는 neurites 대규모 변성을 받 다. 눈금 막대 = 100 µ m. 셀 (F-나)에 표시 된 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 (F, H)에 시드 했다 또는 플라스틱 (G, I), 10% 존재 L-15 매체에서 만들어지고 둔감 한 혈 청 및 신경 보충 B-27 (희석된 1:50)와 epifluorescent 현미경으로 몇 군데. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
4. 1 차 셀 Zebrafish 뇌에서의 준비
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뇌 추출
- 90 일 이상 성인 물고기를 선택 합니다. 특정 셀 형식 사용 해야 하는 경우 유전자 변형 라인 있는 셀 전용 형광 기자 식 있게 시각화 원하는 셀을 선택 합니다.
- 30 %Danieau 가득한 마 취 Tricaine8 (0.2%)의 200 mL 비 커에 생선을 넣습니다. 물고기 이동 중지 될 때까지 기다립니다. 담가 15 분 그것을 안락사 200ml 얼음 물으로 채워진 비 커에서 마 취 물고기.
- 페 트리 접시를 채우기 (직경 6 cm) 70% (v/v) 에탄올과. 물고기 꼬리 핀셋의 쌍을 가진 고 에탄올으로 그것을 찍어. 물고기는 5에 대 한 에탄올에 완전히 빠져들 수 있도록 s.
- 굽타와 멀 린14 다음 적응의 프로토콜에 따라 뇌를 추출: 압력가 마로 소독 또는 멸 균 포장 도구만을 사용 하 고 살 균 1 x PBS에 머리를 해 부.
- 직접 추출 후 배양 접시에서 두뇌를 배치 (직경 3 cm) 살 균 1 x PBS로 가득 하 고 세포 배양에 대 한 살 균 작업 벤치 아래 접시를 이동.
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뇌 분리 및 1 차 셀의 도금
- 장소 2 세트 핀셋 (압력가) 살 균, 멸 균 페 트리 접시 (직경 6 cm) 70% (v/v) 에탄올, 무 균 배양 접시 가득 (직경 10 cm) Leibovitz의 L-15 매체 10% 보충으로 가득 (v/v) 만들어지고 소 혈 청 B-27 (1:50), 1.2% (v / v) 10000 U 페니실린-스와 핸들 (40 µ m; 한 멸 균 셀 스 트레이너 그림 1 c) 아래 깨끗 한 벤치.
- 페 트리 접시에 셀 스 트레이너 에탄올으로 가득 장소와 액체 레벨은 적어도 5 mm는 여과기의 바닥 보다 높은 수 있도록.
- 족집게의 첫 번째 집합을 사용 하 여, 이미 에탄올에 배치 하는 여과기로 두뇌를 전송 하 고 그것은 완전히 액체에 의해 덮여 확인 합니다. 1 후 s, 전송 위의 Leibovitz의 L-15 매체를 포함 하는 배양 접시에 두뇌와 여과기 보충 설명.
- 족집게의 두 번째 세트를 사용 하 여 전송 위의 500 µ L Leibovitz L-15 매체 살 균 1.5 mL 반응 관에 뇌 가득 보충 설명. 4 mg/mL 1 mL의 총 볼륨에서의 최종 농도에 콜라 (유형 2)를 추가 합니다.
- 실 온에서 35 분 동안 분 당 30 혁명 수직 튜브 회전자에 튜브를 품 어. 기계적으로 분리 과정을 돕기 위해 1000 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 나머지 조직 덩어리를 분리.
- 보이는 파티클이 솔루션에 남아 때 분리를 중지 합니다. 배기 슬롯 (40 µ m; 멸 균 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 그림 1D) 으로 50 mL 원뿔 튜브. 신선한 세포 배양 매체의 약 10 mL와 여과기를 헹 구 십시오.
참고: 단일 셀 서 스 펜 션, 달성 하는 경우 여과 단계는 배아 분리의 경우 필요에 따라 없습니다. 두뇌는 부드러운 조직 이며 같은 그것은 더 균질 단일 세포 현 탁 액에 해리 될 경향이. - 180 x g 에 5 분 동안 원심 분리 하 여 세포를 작은 고 위의 설명된 보조 제와 함께 신선한 Leibovitz L-15 매체의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
- 1 자 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 하단 접시에 세포 현 탁 액 (50% 획득된)의 500 µ L 플라스틱 (1.2 참조) 또는 24-잘 접시의 우물에서. 작은 표면 (즉, 125 µ L 솔루션 96 잘 접시의 우물)의 경우 방향을. 무 균 작업 벤치에서 실 온에서 60 분 동안 품 어. 특정 컨테이너를 28 ° c.에 1 차 셀을 품 어 신선한 매체의 필요한 볼륨 추가
- 28 ° c.에는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 원하는 이미징 응용 프로그램 수행 문화는 이미징 도금 후 몇 일 동안 사용할 수 있습니다. 매일 매체의 50%를 교체 합니다.
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Representative Results
그림 1G紋 myocytes 및 신경 같은 입자로 가장 풍부한의 클러스터 야생 타입 배아에서 파생 된 일반적인 문화의 전송된 빛 이미지를 보여줍니다. 더 쉽게 특정 세포 유형 식별, 유전자 변형 라인 형광 단백질의 세포 유형 특정 식이 될 수 있습니다 (그림 1 H)을 사용.
PCS2 +의 transfection-플라스 미드11 향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP)15 야생 타입 배아 결과 1에서 강한 형광 신호에서의 1 차 셀에 튐 인코딩 (그림 2A)을 기반으로. Transfecting pCS2 +-바인딩과 그물-타겟 붉은 형광 단백질 (ss-RFP-KDEL)16 등 미토 콘 드리 아 표적으로 노란 형광 성 단백질 (MitoTag-YFP)17, 형광 세포 기관이 마커를 인코딩 하는 플라스 미드를 기반으로 18, subcellular 구조 (그림 2B, C) 아주 자세하게에서 구상 될 수 있다. 동일한 셀19 MitoTag YFP 같은 microtubule 표식 함께 여러 형광 성 융해 단백질의 subcellular 지 방화의 동시 분석에 대 한 최대 3 개의 플라스 미드의 공동 transfection 허용 인간 Doublecortin (DCX) 빨간 형광 단백질 tdTomato21 20 융합 하 고 핵 마커 히스톤 H2B 시안색 형광 단백질을 융합 (H2B-mseCFP)22,23 (그림 2D). Subcellular 구조는 또한 높은 시간적, 공간적 해상도, 예를 들면 소포 막 마커 소포 관련 막 단백질 1에 대 한 긍정적인의 움직임 (VAMP1) 형광 단백질 mCitrine24 에 융합 몇 군데 수 있습니다. , 25 (그림 3). 시간이 지남에 형태학 상 변화는 밝은 형광 단백질 mClover26 (그림 2G, 나) 등의 식으로 전체 셀 라벨 쉽게 관찰할 수 있습니다. 그러나 형광 단백질 mCherry27 일차 전지에는 UAS에 융합 레드 인코딩 pBluescriptSK 백본 기반 플라스 미드의 성공적인 transfection 모두 Gal4 드라이버를 들고 더블 유전자 변형 태아에서 파생 하는, 구문 및 UAS 이펙터 구문 electroporation 프로토콜 조합 유전학 (그림 2E) 적합도 보여 줍니다. 또한, 고정된 1 차 셀 면역 형광 세포 기관이 특정 형광 염료 (그림 2F, H)를 사용 하 여 쉽게 얼룩이 질 수 있다.
그림 3: subcellular 구조의 시간 경과 영상. 야생 타입 셀 (1 튐) Pc-VAMP1-mCitrine와 페. 시간 경과 기록의 프레임을 선정 (1 프레임 마다 1.68 찍은 s) 표시 됩니다. 화살표 머리와 트랙 색상에 따라 세 가지 VAMP1 양성 vesicles의 subcellular 역학을 강조 했다. 눈금 막대 = 10 µ m. 시간 경과 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 기록 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
분리 기술 및 기본적인 문화 조건 또한 성인 zebrafish의 조직에 적용할 수 있습니다. 여기, 우리는 야생 타입 제 브라에서 성인 뇌 조직 테스트. 그림 4A -D 는 복잡 한 신경 같은 네트워크에 처음 파편 코팅 문화의 진보적인 개발을 보여줍니다. 유전자 변형 물고기 들고 transgene Tg에서에서 뇌를 사용 하 여 (XITubb: DsRed) zf14828, 완전히 차별화 된 DsRed을 표현 하는 신경 주변 상세 (그림 4E)에서 시험 될 수 있다.
그림 4: 성인 zebrafish 뇌의 1 차 셀 문화. 1 차 셀의 밝은 필드 이미지에서 성인 zebrafish 뇌에서 파생 된 (A) 1 튐, (B) 3 dap, (C) 5 튐 및 (D) 8 튐. 3 1에서 dap, 죽은 세포와 조직 파편 사라질 동안 단일 또는 클러스터 된 신경 세포가 점점 더 명백한. 3 dap, 신경 세포 첫 번째 짧은 neurites 형성 하기 시작. 5에서 이후 튐, 잘 길쭉한 neurites의 네트워크의 형성을 관찰 가능 하다. 스케일 바 = 50 µ m 셀 폴 리-L-리 신-코팅 96 잘 접시에 배양 했다. 7 (E) 배양된 세포 transgene Tg를 표현 하는 유전자 변형 물고기의 성인 두뇌에서 dap (XITubb: DsRed) zf148. DsRed는 차별화 된 뉴런28로 표시 됩니다. 눈금 막대 = 100 µ m 셀 폴 리-L-리 신-코팅 24-잘 접시에 배양 했다. 모든 이미지는 epifluorescent 현미경에 의해 인수 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리의 현재 두 개의 서로 다른 프로토콜 문화 1 차 셀 2 dpf zebrafish 태아 또는 성인 zebrafish 두뇌에서.
1 차 셀 문화 2 dpf zebrafish에서 준비 기본 셀 문화 기술에 경험을 가진 사람에 대 한 수행 상대적으로 쉽습니다. 그러나, 좋은 하 고 재현 가능한 결과 얻으려면 시작 물자로 배아의 충분 한 수는 중요 한 (100은 최소). 배아의 발생 하는 동안 모든 가능한 소스 오염 세균과 기생충의 금액을 가능한 한 낮게 유지 하 피해 야 한다. 가장 중요 한은 에탄올에 배아의 부 화-이 단계 필요가 충분히 보장 철저 한 살 균, 하지만 너무 오래 하거나 에탄올 이기 때문에 세포와 조직을 손상 하는 유기 용 매.
타이밍 2 dpf zebrafish 태아의 뇌 조직을 효소 분리 하는 동안 필수입니다. 부 화 기간을 초과 한다 그리고 단일 셀 단계로 완전 한 분리를 달성 되 면 효소 포함 된 매체 신속 하 게 제거 되어야 한다. 그럼에도 불구 하 고, 2 형 콜라 세포 막 손상 하지 않습니다 그리고 그것은 강력 하 게 하는 것으로 하지에 의해 저해 FBS, 트립 신33. 이러한 속성 있었습니다 세포 생존 능력을 지 원하는 세포 손상을 줄이고 필수적인 보충으로 FBS의 분리를 수행할 수 있는 높은 수율과 종류의 섬세 한 세포 생존 능력의 결과로.
우리의 대표 결과 의해 같이 다른 세포 유형 중 형태학 또는 셀 형식별 transgenes 형광 기자에 대 한 인코딩 식으로 식별 될 수 있습니다. 후자는 매우 편리 하 게 수행 하는 특정 세포 인구19의 라이브 셀 이미징입니다. 그러나, 우리 매우 일관 된 결과 보장 하기 위해 형광 현미경 검사 법에 의해 2 dpf 배아에서 각각 증강의 식 패턴을 확인 것이 좋습니다.
수 있도록 배아 zebrafish 1 차 셀 subcellular 구조 시각화, electroporation 프로토콜 transfect 플라스 미드 DNA 형광 세포 기관이 표시의 선택에 대 한 인코딩을 설립 했습니다. 이 메서드에서 transfected 세포의 비율은 상대적으로 낮은 하지만 신뢰할 수 있는 이며 라이브 셀 이미징19에 대 한 충분 한 세포 수를 제공 합니다. 성공적인 transfection에 대 한 중요 한 단계에에서 셀 수의 정확한 결심 이다. 평균, 106 세포는 약 90 2 dpf 배아에서 얻어질 수 있다 하지만 이전 electroporation 계산 하는 정확한 셀 필수19. 그러나, Cos-7 또는 헬러 등 일반적인 포유류 세포 라인에 비해, 2 dpf zebrafish 태아에서 1 차 셀은 매우 다양 한 크기, 아주 작은 평균 (특히 신경), 만들 수 있는 상대적으로 어려운 Neubauer 챔버에 세. 같은 후속 이미징 응용 프로그램에 대 한 사실 이다. 만족 스럽게 작은 제 브라 셀에 subcellular 구조를 시각화 하려면 높은 해상도 고급 형광 현미경 필요 하다 선호 confocal 레이저 스캐닝 현미경.
그것은 훈련을 필요로 하기 때문에 성인 zebrafish 두뇌에서 1 차 셀의 준비 더 고급 동물을 해 부하 고14뇌 조직 추출에서. 또한, 멸 균 조건 추출된 뇌를 오염 하지를 무 균 작업 대에 밖에 서 이미 유지 될 필요가 있다. 그러나, 분리 및 도금 후속 단계는 첫 번째 프로토콜에 비해 있으며 근육 이나 간 등 성인 물고기의 다른 조직에도 적용 될 수 있습니다.
두 프로토콜에 대 한 주요 한계는의 문화, 신경 세포 처럼 세포 유형 육성 하기 어려운 제한 된 생존 이다. 3 dap 표준 조건을 사용 하 여, 후 배아 zebrafish 1 차 셀의 밀도 실험19이미징에 대 한 시간 범위를 제한 하는 따라서 강하게 감소 된다. 주로 fiboblast 같은 셀 맞춤된 수법이 구체적으로의 부재에서 살아남기.
종류의 세포의 복잡성에 문화의 생존 율을 개선 하기 위해, 우리는 성공적으로 Leibovitz의 L-15 매체 테스트. 더 우리가 신경 특정 문화권에 대 한 신경 촉진 첨가제 B-27 그것 보충. 세포 배양에서을 분화 하 고 몇 일 동안 생존 신경 세포 관찰 되었습니다 전체 배아에서 파생 된 경우 (그림 2F-난) 뿐만 아니라 성인 뇌 (그림 4E)에서. 또한, 높은 밀도 (예를 들어, 0.25 x 106 셀 100 m m2당)에 1 차 셀의 도금 낮은 밀도 (G. 루소, 예비 결과) 달리 세포 생존 능력을 향상 시킵니다.
특정 문화 미디어와 보충제의 사용, 옆에 우리 보고 어떻게 다른 기판의 사용은 다양 한 종류의 세포는 최종 문화를 구성 하 고 세포의 부분 집합의 성장을 촉진 선택적 매개 변수로 사용할 수 있습니다에 직접적인 영향 유형입니다. 조직 문화 취급 플라스틱 폴 리-L-리 신 코팅에 비해 강하게 구와 같은 세포 접착 및 확산 (그림 1E, F)을 촉진 하기 위하여 보인다. 같은 시간에 의존 하는 수많은 세포 유형 지원 세포 및 특정 접착 분자 (신경) 처럼 제대로 준수 하지 않습니다, 성장, 또는 대우 플라스틱에 분화 하지만 선호 하는 특정 접착제 지원. 따라서이 좋습니다, 그것은 아니며 섬유 또는 상피-같은 문화33, 셀 문화 요리 코팅 폴 리-L-리 신 또는 다른 셀 전용 기판 사용 하 여 얻을 때.
우리 고려 우리의 프로토콜 기본 세포 배양의 사용에 대 한 시작 지점 학문 vivo에서 zebrafish, 추가 될 수 있는 보완 개발 하 고 특정 종류의 재배에 적응 많은 다양 한 응용 프로그램에 사용 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사 합니다 T. Fritsch, A. 늑대-Asseburg, I. Linde와 미-M. 우수 동물 관리 및 기술 지원에 대 한 Tokarski입니다. 우리는 강렬 하 고 유용한 토론에 대 한 Köster 연구소의 모든 구성원에 게 감사입니다. 우리는 기꺼이 도이치 가운데 (코 1949/5-1)와 Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) 저 색 소니의 연방 정부에 의해 자금을 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish lines | |||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | ||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | |
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | |
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63X objective | |
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40X objective | |
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device |
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | |
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | |
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | |
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | |
| micro pipettes | Gilson | ||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | |
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | |
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | |
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene |
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic and glass ware | |||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium |
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | |
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation |
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | |
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | |
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | |
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | |
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos |
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | |
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and Reagents | |||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | |
| 4 % paraformaldehyde in 1x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes |
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | |
| methylene blue | Serva | 29198.01 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | |
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | |
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | |
| potasssion chloride | Merck | 104938 | |
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | |
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | |
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C |
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium and solutions for cell culture | |||
| 1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | |
| glutamine 100x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| PenStrep (10,000 U/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
References
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