Summary
Presentamos un protocolo eficiente y fácil de usar para la preparación de cultivos celulares primarios de células de embriones de pez cebra para transfección celular directo imágenes así como un protocolo para preparar células primarias del cerebro del pez cebra adulto.
Abstract
Embriones de pez cebra son transparentes y se desarrollan con rapidez fuera de la madre, lo que permite excelente en vivo la proyección de imagen de los procesos biológicos dinámicos en un vertebrado intacto y en desarrollo. Sin embargo, la proyección de imagen detallada de las morfologías de tipos celulares distintos y estructuras subcelulares es limitada en montajes de todo. Por lo tanto, establecimos un protocolo eficiente y fácil de usar a cultura primaria en células de embriones de pez cebra y el tejido adulto.
En Resumen, 2 embriones de pez cebra de PD son dechorionated, deyolked, esterilizados y disociar a las células con colagenasa. Después de un paso de filtración, células primarias son plateadas sobre platos de fondo de cristal y cultivadas durante varios días. Nuevas culturas, tanto como largo plazo destacan los, pueden utilizarse para estudios de proyección de imagen confocal de alta resolución. La cultura contiene diferentes tipos de células, con miocitos estriados y las neuronas siendo prominentes en la capa de poly-L-lisina. A específicamente etiqueta estructuras subcelulares por proteínas del marcador fluorescente, también establecimos un protocolo de electroporación que permite la transfección del plásmido ADN en diferentes tipos de células, incluyendo neuronas. Así, en presencia del operador estímulos definidos, comportamiento de la célula compleja y dinámica intracelular de las células primarias de pez cebra puede evaluarse con alta resolución espacial y temporal. Además, utilizando el pez cebra adulto cerebro, demostramos que la técnica de disociación descrito, así como las condiciones básicas de cultivo, también trabajan para el tejido del pez cebra adulto.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio, D. rerio) es un modelo popular vertebrado para numerosos campos de investigación básica y biomédica1. Embriones de pez cebra desarrollar rápidamente ex útero, transparente y forma bajo un microscopio, lo que proporciona excelentes condiciones para el estudio del desarrollo de vertebrados en un organismo vivo. Debido a la maleabilidad genética del pez cebra2, se han establecido muchas líneas estable reportero transgénicas con expresión de diversos marcadores fluorescentes tipo-específicas de la célula que permite la observación de poblaciones celulares específicas. La comunidad de pez cebra ofrece una amplia variedad de supuesto líneas de Gal4-conductor que llevan un transgen expresando el Kal4TA4 sintético (o el GalFF de KalTA3-equivalente) gene con el dominio de unión a DNA-Gal4 de levadura fundida a la activación transcripcional viral Dominios bajo el control de potenciadores de tipo específico de célula. Estas líneas de controlador se cruzan líneas efectoras que llevan los transgenes que consta de una secuencia activadora arriba definida (UAS) fusionada a un gen reportero. La proteína Kal4TA4 se une al elemento de UAS, activando así la expresión selectiva de tipo célula del reportero gene3,4. Este enfoque permite altamente diversos estudios combinatorios de casi todos los elementos potenciador y reportero disponibles en animales dobles transgénicos.
Sin embargo, la proyección de imagen vivo profundo con enfoque en células individuales o sus contenidos subcelulares está limitada en un embrión entero y constantemente cambiante. Para hacer frente a cuestiones biológicas celulares específicas con resolución más alta, el uso de cultivos celulares a menudo es preferible. Existen algunas líneas de células de pez cebra, pero son considerados como fuertemente seleccionados5,6,7 y su propagación es a menudo desperdiciadora de tiempo. Además, todas las líneas celulares disponibles son fibroblastos derivados, limitar los experimentos con cultivos celulares a un tipo de células. Por lo tanto, establecimos un protocolo eficiente y fácil de usar para preparar células primarias directamente en embriones de pez cebra y el cerebro del pez cebra adulto, junto con métodos para aumentar la longevidad de la cultura y ampliar la diversidad de cultivo tipos de la célula. Además, presentamos un procedimiento para transfectar las células embrionarias primarias con construcciones de la expresión de los marcadores fluorescentes organelo. Por lo tanto, morfologías celulares y estructuras subcelulares pueden ser analizadas con alta resolución espacial y temporal en tipos celulares diferentes que conservan sus características clave.
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Protocol
Todos los trabajos animales descritos aquí está de acuerdo con las regulaciones legales (EU-Directiva 2010/63). Mantenimiento y manejo de peces ha sido aprobado por las autoridades locales y por el bienestar de los animales representativo de la Universidad Tecnológica de Braunschweig, Baja Sajonia Estatal Oficina de protección al consumidor y seguridad alimentaria (LAVES, Oldenburg, Alemania; BS de TU TSchB (02.05) §4 AZ.).
1. preparación de células primarias de embriones de pez cebra
- Preparación de 2 días post fertilización (dpf) de embriones de pez cebra
- Día 1: Configurar varios cruces de la cepa de pez cebra de elección y de acuerdo a las especificaciones de tu pez cebra facility manager8.
- Día 2: Compañero peces y recoger huevos8 directamente después del desove en una placa de Petri (plástico) de 10 cm. Retirar los huevos muertos o contaminados con una pipeta de Pasteur (plástico). Lavado de huevos 1 x con Danieau 30% (5,8 mM cloruro sódico, cloruro de potasio 0,07 mM, sulfato de magnesio 0,04 mM, 0.06 mM nitrato de calcio, ácido 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 mM, pH 7,2)8 con azul de metileno de un 0,0001% (w/v). Cambio medio a Danieau 30% sin el azul de metileno, azul de metileno puede causar Autofluorescencia e incubar los huevos durante la noche a 28 ° C.
Nota: Comience con un mínimo de 100 huevos por línea de los pescados con el fin de obtener una cantidad suficiente de células. No levante más de 150 embriones en una placa de Petri. - Día 3: Eliminar embriones muertos o contaminados y cambiar el medio para Danieau 30%. Determinar el número de embriones por contar. Incubar embriones durante la noche a 28 ° C.
Nota: Cuando utilice una línea transgénica expresando un reportero fluorescente, proyección en 1 dpf o 2 PD puede ser necesario.
Nota: Para grandes cantidades de embriones, se recomienda tomar una imagen en blanco y negro de la respectiva placa de Petri (figura 1A) y cuantificar el número de embriones con un software de proyección de imagen. - Día 4: Los embriones son ahora 2 PD. Para quitar chorions, añadir pronasa de 1 mL con una concentración de 1 mg/mL a 10 mL de Danieau 30%8 e incubar embriones en un agitador a temperatura ambiente hasta que estén todos chorions independiente (20 – 40 min dependiendo de la temperatura ambiente). Lave con Danieau 30% para eliminar el pronasa y chorions y no embriones a temperatura ambiente hasta su uso posterior.
- Preparación de platos de fondo de vidrio reutilizable poly-L-lisina
Nota: Platos de fondo de vidrio disponibles en el mercado están diseñados para un solo uso y son caros. El siguiente procedimiento describe cómo preparar los platos de fondo vidrio reutilizable hecho de materiales de laboratorio estándar.- Taladre un agujero con un diámetro de 10 mm en la parte inferior de los platos de la cultura de célula estándar (diámetro de 6 cm, plástico) (figura 1B). Lavar el plato fondos meticulosamente con agua del grifo para quitar el polvo de perforación.
- Untar grasa de silicona alrededor del agujero en la parte inferior de la parte inferior del plato y coloque un cubreobjetos usando la grasa como pegamento. Asegúrese de que la grasa sella el espacio entre el fondo del plato y cubreobjetos.
Nota: Asegúrese de que el espesor de los cubreobjetos usado es apropiado para la aplicación más tarde proyección de imagen. - Lavar platos de fondo de vidrio hecho a sí mismo completamente, pero con cuidado, con agua fría y jabón. Enjuague los platos de fondo de cristal tres veces con agua desionizada para eliminar el jabón. Deje secar al aire las tapas del plato y plato fondos y guardarlos en una caja limpia hasta su uso posterior.
- En el día de la preparación de la cultura (día 4, véase 1.1.4): humedecer el interior de ambas tapas del plato y plato de fondo con etanol al 70% (v/v). Coloque las tapas del plato y plato de fondo hacia el lado interno arriba en un banco de trabajo estéril con flujo laminar y luz UV. Deje secar al aire hasta que se evapore el etanol, luego aplicar UV luz durante 20 minutos. Después de este tratamiento, platos montados y considerados como estériles.
- Para la capa, pipetee 200 μL de poli-l-lisina (0,1 mg/mL) en el centro de cada plato de fondo de cristal y transmite el líquido sobre el cubreobjetos por romper la tensión superficial con una punta de pipeta. Dejar secar durante 60 min, luego lavar 1 x estéril 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Extraer el líquido. Mantener los platos debajo del Banco hasta su uso posterior.
Nota: Otros revestimientos pueden analizarse según el objetivo del experimento. Nos encontramos con poli-l-lisina suficiente para apoyar el crecimiento de las neuronas, mientras que tratado plástico sin cualquier revestimiento adicional parece ser favorable para el crecimiento de fibroblasto-como las células (Figura 1E, F).
Nota: Platos de fondo de vidrio hecho a sí mismo pueden ser utilizados muchas veces. Para intercambiar el cubreobjetos, lavar con agua caliente del grifo, cuidadosamente separe el cubreobjetos y quitan la grasa restante con etanol al 70% (v/v) y jabón.
- Preparación y revestimiento de células primarias
- En el día de la preparación de la cultura (día 4, véase 1.1.4): transferencia de embriones en una placa de cultivo de células estériles (diámetro 6 cm) utilizando una pipeta de Pasteur plástica fresca. Quite el líquido step-wise hasta que todos los embriones son reunidos en una gota grande con un diámetro de unos 2 cm o menos.
- Coloque el plato con los embriones en el Banco de trabajo estéril y añadir CO2-medio independiente (suplementado con 10% (v/v) filtrado de suero bovino, 1 x glutamina y 1,2% (v/v) 10.000 U de penicilina-estreptomicina; medio con todos los suplementos está en el siguiente conocido como "medio de cultivo celular") hasta que el plato esté lleno hasta la mitad.
Nota: Alternativas al CO2-medio independiente puede analizarse según el objetivo del experimento, como por ejemplo medio de neurobasal, medio DMEM o L-15 medio de Leibovitz. CO2-medio independiente y medio de L-15 de Leibovitz tienen la ventaja de no requerir un incubador de CO2 . - Para quitar la yema de huevo, pipetee embriones arriba y abajo utilizando una 200 μL de pipeta. Deyolking exitosa puede ser reconocido por el enturbiamiento del medio.
- Llenar un plato de cultura de célula con etanol al 70% (v/v) y otra placa de cultivo de células con medio de cultivo celular fresco. Utilizar una corte 1.000 μl-pipeta para transferir los embriones a un filtro estéril de la célula con la manija (40 μm; Figura 1). Tomar el filtro por el mango y mojar en el plato con etanol para que todos los embriones son sumergidos durante 5 s. inmediatamente luego, sumerja el colador con los embriones en el plato con medio de cultivo celular fresco.
Nota: Los filtros de la célula puede volver a utilizar varias veces. Limpie con un cepillo suave bajo un chorro de agua del grifo, tienda en etanol al 70% y seco y UV de tratar bajo el trabajo estéril Banco directamente antes de su uso (véase también 1.2.4). - Transferencia de embriones en tubos de reacción de 1,5 mL estéril (aproximadamente 100 embriones en un tubo). Añadir la colagenasa (tipo 2) diluido en medio de cultivo celular a una concentración final de 4 mg/mL en un volumen total de 1 mL. Incubar los tubos con los embriones en un tubo vertical de los rotadores con 30 revoluciones por minuto durante 45 minutos a temperatura ambiente.
- Disociar los restantes grupos de célula transfiriendo la mezcla del embrión-colagenasa hacia arriba y hacia abajo con una 1.000 μl de pipeta. Luego filtrar la suspensión de células a través de un filtro estéril de la célula con la ranura de ventilación (40 μm; Figura 1) en un tubo cónico de 50 mL. Enjuague el filtro con aproximadamente 10 mL de medio de cultivo celular fresco.
- Pellet de células por centrifugación durante 3 min a 180 x g. El pellet puede ser casi invisible. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender las células en 200 μL célula fresca de medio de cultivo por 30 embriones originalmente utilizados.
Nota: Para obtener un pellet visible, se recomienda comenzar con un mínimo de 100 embriones. - Pipetee 200 μL de la suspensión celular obtenida en el paso 1.3.7 directamente a la superficie de vidrio de un plato de fondo de vidrio poly-L-lisina-recubrimiento hecho a sí mismo (véase 1.2). Incubar por 60 min a temperatura ambiente bajo el Banco de trabajo estéril. Añadir 6 mL de medio de cultivo celular fresco e incubar células primarias a 28 ° C.
- Realizar la aplicación imagen deseada usando un microscopio invertido a 28 ° C. Cambio el medio de cultivo celular diariamente. Culturas pueden utilizarse para obtener imágenes durante varios días después de la galjanoplastia (dap).
Figura 1: cultivo de células primarias de embriones de pez cebra. (A) imagen en blanco y negro de 1 dap embriones, que pueden ser procesados por una herramienta de software para analizar el número de embriones. (B) platos de cultura de la célula (diámetro de 6 cm) con un agujero (diámetro 10 mm) se utilizan para preparar platos de fondo de vidrio reutilizable hecho a sí mismo. (C) filtros de la célula (40 μm) con una manija simple se utilizan como "redes" para sumergir los embriones deyolked de etanol y para transferir rápidamente al medio de cultivo celular fresco. (D) células (40 μm) los filtros con ranuras de ventilación se utilizan para filtrar las células después de disociación mediada por la colagenasa. (E) después de 5 dap, células primarias sembradas en vidrio recubierto con poli-L-lisina principalmente forman las neuronas con extensiones pronunciadas. Barra de escala = 100 μm. (F) después de 5 dap en plástico tratado sin capa, fibroblasto-como las células cubran la cultura. Barra de escala = 100 μm. (E) y (F) fueron adquiridas por un microscopio epifluorescente. (G) transmisión ligera imagen de células primarias derivadas de pez cebra de tipo salvaje en 1 dap. Miocitos estriados y racimos de neuronas ampliar procesos delgados se pueden observar fácilmente. Barra de escala = 50 μm. (H) las células cultivadas de la línea transgénica Tg (ptf1a: eGFP) jh1, que expresa eGFP en trasplante de precursores neuronales de sobre todo GABAergic neuronas en el cerebelo y un subconjunto de células retinianas poblaciones29, 30 , 31. barra de escala = 50 μm. (G) y (H) fueron adquiridas por un láser confocal de barrido microscopio usando el vidrio inferior platos como se muestra en (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. transfección de primaria de las células con ADN plásmido
- Resuspenda cuidadosamente filtrados y concentrados las células obtenidas en el paso 1.3.7 en PBS 1 x en vez de medio de cultivo celular. La mancha una parte alícuota de la suspensión celular con azul de tripano para determinar el número de celular en una cuenta de cámara9.
- Mezclar 0,5 millones de células con 10 μg ultra puro ADN plásmido en un tubo de reacción de 1,5 mL y ajustar el volumen total a 100 μl con PBS 1 x.
Nota: Para nuestros experimentos, utilizan principalmente construcciones de expresión basadas en el plásmido pCS2 +10. Expresión de marcos de lectura abierto clonado en el sitio de clonación múltiple de pCS2 + es conducido por el omnipresente promotor de citomegalovirus humano (promotor del CMV). Otras construcciones de la expresión y los promotores pueden ser analizados (ver también resultados de representante y la figura 2 y figura 3). - Mezcla de transferencia del ADN de la célula inmediatamente a una cubeta de electroporación (0,4 cm), colocar la cubeta en un aparato de electroporación y electroporate con los siguientes parámetros: pulso una sola vez, decaimiento exponencial, 280 V, 950 μF.
- Directamente después de la electroporación, transferir la mezcla de ADN de la célula en un tubo de reacción de 1,5 mL con 300 μL de medio de cultivo celular fresco.
- 200 μL de la suspensión de células de la placa como se describe en 1.3.8 y proceder como se describe en 1.3.9 dependiendo de la construcción de la expresión usada, expresión de proteínas fluorescentes puede ser detectable después de unas horas o al día siguiente.
3. tinción de células primarias fijo
Nota: Estructuras subcelulares pueden visualizarse también immunostaining clásico en lugar de utilizar reporteros de proteínas fluorescentes de fusión. Para pilas de pez cebra, usamos el siguiente protocolo estándar mancha ejemplar núcleo, F-actina y tubulina acetilada con marcadores fluorescentes.
- Las células de la placa cubreobjetos recubiertos de poli-l-lisina se colocan en una placa de cultivo celular plato o multiwell como se describe arriba (véase 1.3.8).
- Para la fijación, quitarlo del medio y cubre las células con paraformaldehído al 4% de 1 x PBS. Incube las células durante 10 min a 4 ° C en un agitador. Lavar las células 3 x 5 min con 1 x PBS a temperatura ambiente. Asegúrese de que la PBS 1 x cubre totalmente las células y realizar los pasos de lavado en una coctelera.
- Para bloquear y para permeabilizar las células fijas, cubre las células con PBS 1 x con 5% de leche descremada y un 0.3% Tritón X-100. Coloque las células durante 10 min a temperatura ambiente en un agitador. Lavar las células como se describe en 3.2.
- Para etiqueta de tubulina acetilada, un marcador para axones11, diluir el anticuerpo primario 1:2,000 en PBS de x 1 con un 1% de leche descremada. Cubrir las células con esta solución e incubar durante la noche a 4 ° C en un agitador. Al día siguiente, lave las células como se describe en 3.2.
- Diluir el anticuerpo secundario conjugado con el verde fluorochrom fluoresceína isotiocianato (FITC) 1: 100 en PBS 1 x con 1% de leche descremada e incubar las células con esta solución durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad (cubrir el plato por ejemplo, con una caja o papel de aluminio) en una coctelera Boston. Lavar las células como se describe en 3.2.
- Para teñir simultáneamente los núcleos y citoesqueleto de actina, incubar las células en PBS 1 x con Phalloidin12 conjugado con un fluorocromo rojo (1:50) y 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)13 (100 ng/mL) durante 10 minutos en la sala de temperatura en la oscuridad en una coctelera Boston. Lavar las células como se describe en 3.2.
- Para preparar las células para la proyección de imagen, poner un portador del objeto de vidrio (portaobjetos) sobre una superficie limpia y coloque sobre la gota de medio de montaje en él. Sacar un cubreobjetos con las células fijas y teñidas de un plato con unas pinzas y coloque sobre la gota con las células hacia el portador del objeto. Asegúrese de que ese medio de montaje se extiende por toda el área de la hoja de cubierta. Déjelo secar en la oscuridad.
- Tienda fija y monta las células en la oscuridad a 4 ° C hasta que se realiza la aplicación de la imagen deseada.
Figura 2: transfección de expresión se construye por la electroporación. (A) dap Putative neurona, transfected con PC-eGFP en 1. Miocito estriado (B) expresar la proteína orientada a retículo endoplasmático ss-RFP-KDEL (2 dap). (C) dos neuronas dentro de un grupo neuronal transfectadas con PC-MitoTag-YFP en 2 dap. (D) célula (2 dap) triple-transfected con PC-DCX-tdTomato, PC-MitoTag-YFP y PC-H2B-mseCFP. PSK (E)-electroporated de UAS:mCherry en células primarias (DDS 1) derivadas de embriones dobles transgénicos que los transgenes Tg (atoh1a: Gal4TA4) hzm222 y Tg (4xUAS:KGFPGI) hzm332 dando por resultado la expresión de GFP en trasplante de precursores neuronales del cerebelo. Barras de la escala = 10 μm. (A-E) fueron adquiridas por un láser confocal de barrido microscopía utilizando el vidrio inferior platos tal como se ilustra en la figura 1B. (F) tinción fluorescente de las neuronas primarias pez cebra fijo en 5 dap. Azul: DAPI (núcleo); Rojo: Phalloidin (F-actina); Verde: Acetilado tubulina (neuronas). Barra de escala = 10 μm. (G) neurona-como células transfected con PC-mClover. 2 dap, extensión no es visible. 5 dap, ha formado una estructura neurita. Barra de escala = 25 μm. (H) la neurona desde la misma preparación como la célula en (F), rodeada por células como los fibroblastos. Barra de escala = 10 μm. () la neurona deriva de un embrión transgénico que el transgén Tg (XITubb: DsRed) zf14828 transfected con PC-mClover. Entre 12 y 15 DDS, los neurites sufren degeneración masiva. Barra de escala = 100 μm. las células se muestra en la (F-) fueron sembradas en vidrio recubierto de poli-l-lisina (F, H) o plástico (G, ), cultivado en medio L-15 en presencia de 10% de suero bovino de filtrado y la suplemento neuronal B-27 (diluido 1:50) y fotografiada con un microscopio epifluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. preparación de células primarias del cerebro del pez cebra adulto
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Extracción de cerebro
- Seleccione un peces adultos de al menos 90 días de edad. Si se requiere trabajar con un tipo de célula específica, elegir una línea transgénica que expresión reportero fluorescente específica de la célula permitirá visualizar las células deseadas.
- Coloque el pescado en un vaso de precipitados con 200 mL del anestésico Tricaine8 (0,2%) en Danieau 30%. Espere hasta que el pez deja de moverse. Sumergir los peces anestesiados en un vaso de precipitados con 200 mL de agua hielo durante 15 min a la lo eutanasia.
- Llenar un plato de Petri (diámetro de 6 cm) con etanol al 70% (v/v). Sostener el pescado por la cola con un par de pinzas y sumergir en el etanol. Asegurar que el pescado esté totalmente sumergido en etanol durante 5 s.
- Extraer el cerebro según el protocolo de Gupta y Mullins14 con las siguientes adaptaciones: use sólo herramientas de autoclave o estéril embalado y disecar la cabeza estéril de 1 x PBS.
- Directamente después de la extracción, colocar el cerebro en una placa Petri (diámetro 3 cm) relleno con estéril de 1 x PBS y mover el plato en un banco de trabajo estéril para cultivo celular.
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Disociación del cerebro y placas de células primarias
- Coloque dos juegos de pinzas estériles (esterilizadas), una placa de Petri estéril (diámetro de 6 cm) con etanol al 70% (v/v), una placa de Petri estéril (diámetro 10 cm) llenos L-15 suplementado de Leibovitz con 10% (v/v) de filtrado suero bovino, B-27 (1:50) y 1.2% (v / v) 10.000 U de penicilina-estreptomicina y un filtro estéril de la célula con mango (40 μm; Figura 1) debajo de la mesa de trabajo limpia.
- El filtro de la celda en la caja Petri lleno de etanol y el nivel de líquido esté por lo menos 5 mm mayor que la parte inferior de la coladera.
- Utilizando el primer sistema de pinzas, transfiera el cerebro en el filtro ya colocado en el etanol y asegurarse de que está completamente cubierto por el líquido. Después de 1 s, transferencia el colador con el cerebro en la placa Petri conteniendo medio de L-15 de Leibovitz con lo anterior descrito suplementos.
- Utilizando el segundo conjunto de pinzas, transfiera lleno del cerebro en un tubo de reacción de 1.5 mL estériles con medio de L-15 de 500 μl Leibovitz con lo anterior descrito suplementos. Añadir colagenasa (tipo 2) a una concentración final de 4 mg/mL en un volumen total de 1 mL.
- Incubar el tubo a un tubo vertical de los rotadores con 30 revoluciones por min 35 min a temperatura ambiente. Disocian mecánicamente los restantes grupos de tejido mediante pipeteo arriba y abajo utilizando una pipeta de 1000 μL para facilitar el proceso de disociación.
- Detener la disociación cuando partículas visibles no permanecen en solución. Filtrar la suspensión de células a través de un filtro estéril de la célula con la ranura de ventilación (40 μm; Figura 1) en un tubo cónico de 50 mL. Enjuague el filtro con aproximadamente 10 mL de medio de cultivo celular fresco.
Nota: Cuando se logra la suspensión de células individuales, el paso de filtración no es tan necesario como en el caso de la disociación de los embriones. El cerebro es un tejido blando y como tal es más propenso a homogéneo puede disociarse en suspensión unicelular. - Pellet de células por centrifugación durante 5 min a 180 x g y resuspender el precipitado de células en 1 mL de L-15 medio dulce de Leibovitz con los suplementos anteriormente descritos.
- Pipetear 500 μl de suspensión celular (50% de las células obtenidas) en un plato de fondo de vidrio revestido de poli-l-lisina hecho a sí mismo (véase 1.2) o en un pozo de una placa de 24 pocillos. Según en el caso de superficies pequeñas (es decir, 125 μl solución un pozo de una placa de 96 pocillos). Incubar por 60 min a temperatura ambiente bajo el Banco de trabajo estéril. Luego añadir el volumen necesario de medio fresco para llenar el contenedor e incubar células primarias a 28 ° C.
- Realizar la aplicación imagen deseada usando un microscopio invertido a 28 ° C. Culturas pueden utilizarse para obtener imágenes durante varios días después de la galjanoplastia. Reemplazar el 50% de la media sobre una base diaria.
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Representative Results
Figura 1 muestra una imagen de luz transmitida de una típica cultura derivada de embriones de tipo salvaje con miocitos estriados y racimos de células neurona-como ser más abundante. Para identificar más fácilmente a ciertos tipos de células, una línea transgénica con la expresión de una proteína fluorescente tipo-específicas de la célula puede ser utilizado (figura 1 H).
La transfección de un pCS2 +-basado en el plásmido11 codificación el verde mayor proteína fluorescente (eGFP)15 en células primarias de tipo salvaje resultados de embriones en una fuerte señal fluorescente en 1 dap (figura 2A). Por transferencia pCS2 +-basado en plásmidos codifican marcadores fluorescentes organelo como proteína fluorescente roja orientada en el retículo endoplasmático (ss-RFP-KDEL)16 o proteína fluorescente amarilla orientada a las mitocondrias (MitoTag-YFP)17, 18, estructuras subcelulares pueden visualizarse con gran detalle (figura 2B, C). La transfección de plásmidos de hasta tres permite el análisis simultáneo de la localización subcelular de varias proteínas fluorescentes de fusión en la misma célula19 como MitoTag-YFP junto con el marcador de microtúbulos humanos doblecortina (DCX) 20 fusionado a la proteína fluorescente roja tdTomato21 y la histona H2B de marcador nuclear había unida a una proteína fluorescente ciánica (H2B-mseCFP)22,23 (Figura 2D). Estructuras subcelulares también pueden ser reflejadas con alta resolución temporal y espacial, como por ejemplo el movimiento de vesículas positivas para la proteína de membrana asociada a vesículas de membrana marcador 1 (VAMP1) fusionada a la proteína fluorescente mCitrine24 , 25 (figura 3). Cambios morfológicos en el tiempo pueden ser fácilmente observados por etiqueta el celular todo por la expresión de una proteína fluorescente brillante como mClover26 (figura 2, I). Sin embargo, exitosa transfección de un plásmido en pBluescriptSK-espina dorsal rojo proteína fluorescente mCherry27 fusionados a un elemento de la UAS en células primarias de codificación base derivados de embriones transgénicos doble que un controlador de Gal4 construir y una construcción de efector UAS demuestra que el protocolo de electroporación es también conveniente para la combinatoria genética (Figura 2E). Además, fija las células primarias puede fácilmente teñidas mediante inmunofluorescencia y tintes fluorescentes específicos de organelas (figura 2F, H).
Figura 3: imágenes de lapso de tiempo de estructuras subcelulares. Células de tipo salvaje (DDS 1) transfected con PC-VAMP1-mCitrine. Selecciona los fotogramas de una grabación de lapso de tiempo (1 marco fue tomado cada 1.68 s) se muestran. Cabezas de la flecha y pistas según colores destacan la dinámica subcelular de tres distintas vesículas de VAMP1 positivo. Barra de escala = 10 μm. El lapso de tiempo fue grabado usando un láser confocal de barrido microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La técnica de la disociación y las condiciones de cultivo básicos pueden aplicarse también en el tejido del pez cebra adulto. Aquí, probamos el tejido del cerebro adulto de pez cebra de tipo salvaje. Figura 4A -D muestra el desarrollo progresivo de una cultura inicialmente cubrió de escombros a una compleja red neuronal similar. Usando el cerebro adulto de un pez transgénico lleva el transgén Tg (XITubb: DsRed) zf14828, completamente diferenciadas neuronas expresan DsRed pueden ser examinadas en detalle cercano (figura 4E).
Figura 4: cultivo de células primarias del cerebro del pez cebra adulto. Imágenes de campo claro de células primarias derivan de cerebro de pez cebra adulto en (A) 1 dap, (B) 3 dap, (C) 5 dap y (D) 8 dap. De 1 a 3 dap, las células muertas y restos de tejido desaparecen mientras que células neuronales individuales o agrupadas se vuelven cada vez más evidentes. 3 dap, células neuronales comienzan a formar el primer corto neurites. 5 dap hacia adelante, es posible observar la formación de una red con cientos de neurites bien alargados. Barras de escala = 50 μm. las células fueron cultivadas en una placa de 96 pocillos poly-L-lisina-revestida. (E) las células cultivadas en 7 dap del cerebro adulto de un pez transgénico que expresan el transgén Tg (XITubb: DsRed) zf148. DsRed se expresa en neuronas diferenciadas28. Barra de escala = 100 μm. las células fueron cultivadas en una placa de 24 pocillos poly-L-lisina-revestida. Todas las imágenes fueron adquiridas por un microscopio epifluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, presentamos dos protocolos diferentes para células en cultivo primario de 2 embriones de pez cebra de PD o de cerebro de pez cebra adulto.
La preparación de las culturas de célula primaria de pez cebra de PD 2 es relativamente fácil de realizar para cualquier persona con experiencia en técnicas de cultivo de célula básica. Sin embargo, para obtener buenos resultados reproducibles, un número suficiente de embriones como material de partida es crucial (100 es el mínimo). Durante la crianza de los embriones, todas las fuentes posibles de contaminación deben evitarse para mantener al mínimo posible la cantidad de gérmenes y parásitos. Más crítica es la incubación de los embriones en etanol: este paso tiene que ser lo suficientemente larga para garantizar la esterilización completa, pero no demasiado bien larga ya que el etanol es un solvente orgánico que daña las células y tejidos.
Tiempo es también esencial durante la disociación enzimática de tejido cerebral o de 2 embriones de pez cebra de PD. No se puede superar el tiempo de incubación y medio que contiene la enzima debe ser removido rápidamente una vez que se logra la completa disociación a etapa unicelular. Sin embargo, colagenasa tipo 2 no daña la membrana celular y no tan fuertemente inhibida por el FBS, tripsina33. Gracias a estas propiedades, hemos sido capaces de realizar la disociación en presencia de SBF como un suplemento esencial apoyar la viabilidad de las células y reduciendo el daño celular, dando como resultado mayor rendimiento y viabilidad de los tipos de células delicadas.
Como se muestra en nuestros resultados representativos, tipos de células distintas pueden ser que bien identificado por morfología o por la expresión de la célula los transgenes específicos de tipo codificación de reporteros fluorescentes. Este último es muy conveniente cuando se realiza la proyección de imagen de células vivas de células específicas poblaciones19. Sin embargo, se recomienda para verificar el patrón de expresión de lo respectivo potenciador en 2 embriones de PD por microscopía de fluorescencia para asegurar resultados consistentes.
Para permitir la visualización de las estructuras subcelulares en células primarias de embrión de pez cebra, se estableció un protocolo de electroporación para transfectar plásmido ADN codificación para una selección de marcadores fluorescentes orgánulo. La tasa de células transfectadas por este método es relativamente baja pero fiable y proporciona un número suficiente de células para celular directo imágenes19. Para una exitosa transfección, un paso crítico es la determinación correcta del número de células en suspensión. En promedio, 106 células pueden obtenerse de embriones de alrededor de 90 2 PD, pero exacta célula contando electroporación previo es obligatorio19. Sin embargo, en comparación con las líneas comunes de células de mamífero como Cos-7 o HeLa, células primarias de 2 embriones de pez cebra de PD son muy diversas en tamaño, pero bastante pequeño en promedio (sobre todo las neuronas), que puede hacer la cuenta en una cámara de Neubauer relativamente difícil. Lo mismo vale para posteriores aplicaciones. Para visualizar satisfactoriamente estructuras subcelulares en esas células de pequeño pez cebra, un microscopio de fluorescencia avanzada con alta resolución es necesario, preferiblemente un láser confocal de barrido microscopio.
La preparación de células primarias del cerebro del pez cebra adulto está más avanzada ya que requiere entrenamiento en disección del animal y la extracción del tejido de cerebro14. Además, las condiciones de esterilidad necesitan mantenimiento ya fuera de la mesa de trabajo estéril para no contaminar el cerebro extraído. Sin embargo, los pasos siguientes con respecto a la disociación y la galjanoplastia son comparables en el primer Protocolo y pueden aplicarse también a otros tejidos de peces adultos como músculo o hígado.
Para ambos protocolos, la principal limitación es la limitada viabilidad de difícil de cultivar los tipos de células en cultivo, como las neuronas. Después de 3 dap con condiciones normales, la densidad de células primarias de embrión de pez cebra se reduce fuertemente lo que limita el intervalo de tiempo para la proyección de imagen experimentos19. Sobre todo fiboblast-como las células sobreviven en ausencia de expedientes específicamente adaptados.
Para mejorar la tasa de supervivencia de la cultura en su complejidad de tipos de la célula, probado con éxito mediano de L-15 de Leibovitz. Además lo complementamos con la promoción de neurona B-27 aditivo de cultura específica neuronal. Se han observado células neuronales diferenciar en cultivo celular y sobrevivir durante varios días, cuando derivado de embriones enteros (figura 2F-I) así como de cerebro adulto (figura 4E). Además, la galjanoplastia de células primarias a altas densidades (por ejemplo, 0.25 x 106 células por 100 mm2) mejora la viabilidad de las células en contraste con bajas densidades (G. Russo, resultados preliminares).
Al lado de la utilización de medios de cultivo específicos y suplementos, nos informó de cómo el uso de diferentes sustratos tiene un impacto directo en la variedad de tipos de células que constituyen la cultura final y puede utilizarse como parámetro selectiva para promover el crecimiento de un subconjunto de células tipos. Plástico tratado con cultivo de tejidos en comparación con la capa del poly-L-lisina parece fuertemente facilitar adhesión fibroblasto-como celular y proliferación (Figura 1E, F). Al mismo tiempo, apoyan de los numerosos tipos de células que dependen de las células y moléculas de adhesión específicas (como las neuronas) no se adhieren correctamente, crecen, o diferencian en plástico Tratado, pero prefieren soporte adhesivo específico. Recomendamos por lo tanto, cuando no se pretende obtener un fibroblasto o epiteliales como cultura33, utiliza poli-l-lisina u otros sustratos específicos de la célula para platos de cultivo celular de la capa.
Consideramos que nuestro protocolo de punto de partida para el uso del cultivo celular primario como un complemento de pez cebra en vivo los estudios, que puede ser más desarrollado y adaptado a la cultivación de tipos celulares específicos y utilizado para muchos usos diversificados.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a T. Fritsch, A. Lobo-Asseburg, Linde de I. y S. M. Tokarski para el excelente cuidado de los animales y soporte técnico. Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Köster debates intensos y provechosos. Agradecemos la financiación por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) y el Estado Federal de baja Sajonia, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish lines | |||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | ||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | |
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | |
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63X objective | |
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40X objective | |
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device |
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | |
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | |
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | |
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | |
| micro pipettes | Gilson | ||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | |
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | |
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | |
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene |
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic and glass ware | |||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium |
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | |
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation |
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | |
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | |
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | |
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | |
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos |
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | |
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and Reagents | |||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | |
| 4 % paraformaldehyde in 1x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes |
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | |
| methylene blue | Serva | 29198.01 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | |
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | |
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | |
| potasssion chloride | Merck | 104938 | |
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | |
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | |
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C |
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium and solutions for cell culture | |||
| 1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | |
| glutamine 100x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| PenStrep (10,000 U/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
References
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