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इन विट्रो में एकाकी मधुमक्खियों का पालन: लार्वा जोखिम कारकों का आकलन करने के लिए एक उपकरण

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57876
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1,5
1Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agricolas y Pecuarias, 5USDA-ARS, Vegetable Crop Research Unit

Summary

फूल पौधों पर फंजीसाइड स्प्रे पराग जनित फंजीसाइड अवशेषों की उच्च सांद्रता के लिए एकाकी मधुमक्खियों का पर्दाफाश हो सकता है । इन विट्रो मेंशामिल प्रयोगशाला-आधारित प्रयोगों का उपयोग-पीछे मधुमक्खी लार्वा, इस अध्ययन की खपत फंजीसाइड-इलाज पराग मेजबान और गैर मेजबान संयंत्रों से व्युत्पंन के इंटरैक्टिव प्रभाव की जांच ।

Abstract

हालांकि एकांत मधुमक्खियों जंगली और प्रबंधित फसलों के लिए महत्वपूर्ण परागण सेवाएं प्रदान करते हैं, इस प्रजाति के अमीर समूह काफी हद तक कीटनाशक विनियमन अध्ययन में अनदेखी की गई है । फंजीसाइड अवशेषों के लिए जोखिम के जोखिम विशेष रूप से उच्च होने की संभावना है, तो स्प्रे पर होता है, या मेजबान पौधों के पास जबकि मधुमक्खियों पराग अपने घोंसले प्रावधान करने के लिए एकत्रित कर रहे हैं । Osmia की प्रजातियों के लिए है कि पौधों का एक समूह का चयन करें (oligolecty) से पराग भस्म, गैर से पराग का उपयोग करने की अक्षमता-मेजबान संयंत्रों फंजीसाइड के लिए अपने जोखिम कारक विषाक्तता से संबंधित वृद्धि कर सकते हैं । इस पांडुलिपि को सफलतापूर्वक रियर oligolectic मेसन मधुमक्खियों, Osmia ribifloris कामुक लाटो के लिए इस्तेमाल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, अंडा से prepupal मंच के भीतर सेल संस्कृति प्लेटों मानकीकृत प्रयोगशाला शर्तों के तहत । इन विट्रो में-पीछे मधुमक्खियों मधुमक्खी फिटनेस पर फंजीसाइड एक्सपोजर और पराग स्रोत के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । एक 2 × 2 पूरी तरह से कारक डिजाइन को पार कर के आधार पर, प्रयोग फंजीसाइड जोखिम और लार्वा स्वास्थ्य पर पराग स्रोत के मुख्य और इंटरैक्टिव प्रभाव की जांच, prepupal बायोमास, लार्वा विकास के समय से quantified, और उत्तरजीवी । इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ यह है कि इन विट्रो मेंप्रयोग-पीछे मधुमक्खियों प्राकृतिक पृष्ठभूमि परिवर्तनशीलता को कम करता है और कई प्रयोगात्मक मापदंडों के एक साथ हेरफेर की अनुमति देता है । वर्णित प्रोटोकॉल की परिकल्पना के लिए एक बहुमुखी उपकरण प्रस्तुत करता है मधुमक्खी स्वास्थ्य को प्रभावित करने वाले कारकों के सुइट को शामिल परीक्षण । संरक्षण के प्रयासों के लिए महत्वपूर्ण है, स्थाई सफलता के साथ मुलाकात की, शारीरिक और पर्यावरणीय कारकों की जटिल खेल में इस तरह अंतर्दृष्टि मधुमक्खी गिरावट ड्राइविंग महत्वपूर्ण साबित होगा ।

Introduction

कीट1परागण के प्रमुख समूह के रूप में उनकी भूमिका को देखते हुए, मधुमक्खी आबादी में वैश्विक नुकसान खाद्य सुरक्षा और पारिस्थितिकी तंत्र स्थिरता के लिए खतरा बन गया2,3,4,5,6 ,7. दोनों प्रबंधित और जंगली मधुमक्खी की आबादी में गिरावट के रुझान कई साझा जोखिम कारकों को जिंमेदार ठहराया गया है वास विखंडन, उभरते परजीवी और रोगजनकों, आनुवंशिक विविधता के नुकसान, और इनवेसिव प्रजातियों के परिचय सहित3 ,4,7,8,9,10,11,12। विशेष रूप से, कीटनाशकों के उपयोग में नाटकीय वृद्धि, (जैसे, neonicotinoids) सीधे13,14,15मधुमक्खियों के बीच हानिकारक प्रभाव से जुड़ा हुआ है । कई अध्ययनों से पता चला है कि neonicotinoids और ergosterol के बीच तालमेल-(EBI) कवक बाधा एकाधिक मधुमक्खी प्रजातियों में उच्च मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते है16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. फिर भी, कवक, लंबे समय के लिए ' मधुमक्खी सुरक्षित ' माना जाता है, के लिए बहुत जांच23बिना में खिल फसलों पर छिड़काव जारी है । चारा मधुमक्खियों को नियमित रूप से वापस लाने के पराग फंजीसाइड अवशेषों के साथ दूषित लोड24,25,26प्रलेखित किया गया है । इस तरह के फंजीसाइड-ladenpollen की खपत लार्वा मधुमक्खियों के बीच उच्च मृत्यु का कारण बन सकता27,28,29,30, और वयस्क मधुमक्खियों के बीच उप घातक प्रभाव का एक सूट16 , 31 , ३२ , ३३ , ३४. हाल के एक अध्ययन से पता चलता है कि कवक छत्ता-संग्रहीत पराग के भीतर माइक्रोबियल समुदाय में फेरबदल से मधुमक्खी के नुकसान का कारण हो सकता है, जिससे मधुमक्खियों और पराग जनित रोगाणुओं के बीच महत्वपूर्ण symbioses को बाधित३५।

हालांकि एकांत मधुमक्खियों कई जंगली और कृषि संयंत्रों३६,३७,३८, परागण के इस विविध समूह के परागण के लिए महत्वपूर्ण है कीटनाशक निगरानी अध्ययन में बहुत कम ध्यान प्राप्त हुआ है । एक वयस्क एकांत महिला का घोंसला शामिल है 5-10 सील चिंता कक्षों, प्रत्येक मातृ-एकत्र पराग और अमृत के एक परिमित द्रव्यमान के साथ रखता है, और एक भी अंडा३९। सेने के बाद, लार्वा आवंटित पराग प्रावधान पर भरोसा करते हैं, और संबद्ध पराग जनित microbiota को पर्याप्त पोषण४०,४१प्राप्त करने के लिए । क्योंकि वे एक सामाजिक जीवन शैली के लाभों की कमी, एकांत मधुमक्खियों और अधिक कीटनाशक जोखिम४२को कमजोर हो सकता है । उदाहरण के लिए, जबकि एक स्प्रे निंनलिखित सामाजिक मधुमक्खियों में घाटे को मुआवजा दिया जा सकता है कुछ श्रमिकों द्वारा विस्तार और नए उभरते हुए चिंता, एक एकल वयस्क एकाकी महिला की मौत सभी प्रजनन गतिविधि समाप्त होता है४३। संवेदनशीलता में इस तरह के मतभेदों को एक जैसे प्रबंधित और जंगली मधुमक्खियों के लिए पर्याप्त सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए ecotoxicological अध्ययन में विविध मधुमक्खी taxa को शामिल करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला । हालांकि, एक तरफ के अध्ययन के एक मुट्ठी भर से, फंजीसाइड जोखिम के प्रभाव में जांच मुख्य रूप से सामाजिक मधुमक्खियों पर ध्यान केंद्रित किया है18,23,३२,४४,४५ ,४६,४७,४८,४९.

एकाकी मधुमक्खियों जीनस Osmia (चित्रा 1) से संबंधित कई महत्वपूर्ण फल और अखरोट फसलों के कुशल परागण के रूप में दुनिया भर में इस्तेमाल किया गया है३९,५०,५१,५३, ५३. अन्य प्रबंधित परागण समूहों के साथ के रूप में24,५४,५५,५६,५७,५८, वयस्क Osmia मधुमक्खियों नियमित रूप से कर रहे हैं में खिल फसलों४४पर छिड़काव करने के लिए संपर्क किया । वयस्क हाल ही में छिड़काव फसलों पर चारा महिलाओं को इकट्ठा करने और फंजीसाइड-लादेन पराग, जो बाद में विकासशील लार्वा के लिए एकमात्र आहार रूपों के साथ अपने चिंता कक्षों स्टॉक कर सकते हैं । खपत दूषित पराग प्रावधानों के बाद फंजीसाइड अवशेषों को४२लार्वा का पर्दाफाश कर सकते हैं । जोखिम के जोखिम oligolectic प्रजातियों के बीच उच्च हो सकता है कि केवल कुछ निकट संबंधित मेजबान संयंत्रों पर चारा५९,६०,६१। कुछ megachilid मधुमक्खियों, उदाहरण के लिए, कम गुणवत्ता झाड़ पराग के लिए तरजीही चारा के लिए दिखाई देते हैं, parasitism६२को कम करने का एक साधन के रूप में । हालांकि, oligolectic एकांत मधुमक्खियों के बीच जो कवक प्रभाव लार्वा फिटनेस के लिए हद तक empirically quantified नहीं किया गया है । इस अध्ययन के लक्ष्य के लिए फंजीसाइड जोखिम और पराग स्रोत के फिटनेस पर मुख्य और इंटरैक्टिव प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए है इन विट्रो चांगली एकाकी मधुमक्खियों. जांच करने के लिए, ओ ribifloris कामुक लाटो (s.l.) के अंडे वाणिज्यिक प्राप्त किया जा सकता है (सामग्री की तालिका) । यह आबादी एक देशी परागण के रूप में अपने महत्व के आदर्श है, और अमृत के लिए मजबूत predilection-रिच Mahonia aquifolium (ओरेगन अंगूर) क्षेत्र के भीतर पाया५३,६३,६४ (चित्रा 2) ।

Figure 1
चित्र 1. एक वयस्क Osmia ribiflorisकी एक उच्च संकल्प तस्वीर । फोटो क्रेडिट डॉ. जिम केन, अनुसंधान कीटविज्ञानी, USDA-ARS कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. अग्रभूमि में एक घोंसला मादा के साथ Osmia ribifloris (s.l.) के Phragmite नेस्टिंग नरकट। चैंबर विभाजन और नरकट के लिए टर्मिनल प्लग masticated पत्तियों से निर्माण कर रहे हैं । फोटो क्रेडिट श्री Kimball क्लार्क, NativeBees.com कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

इस अध्ययन का पहला उद्देश्य खपत फंजीसाइड के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए है लार्वा स्वास्थ्य पर पराग का इलाज (विकास के समय और prepupal बायोमास के संदर्भ में मापा) । जबकि आमतौर पर लागू फंजीसाइड प्रोपिकोनाज़ोल के लिए जोखिम कई प्रजातियों में वयस्क मधुमक्खियों के बीच वृद्धि हुई मृत्यु दर से जोड़ा गया है 23,24,३२,४४,४५, ५४,५५,५६,५७,५८,६५,६६,६७, लार्वा मधुमक्खियों पर इसका प्रभाव कम है जाना जाता. इस अध्ययन का दूसरा उद्देश्य खपत गैर लार्वा फिटनेस पर मेजबान पराग के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए है । पिछले अध्ययनों से संकेत मिलता है कि oligolectic मधुमक्खियों का लार्वा विकसित करने के लिए जब गैर मेजबान पराग६८का उपभोग करने के लिए मजबूर विफल । इस तरह के परिणाम मधुमक्खी फिजियोलॉजी६९, पराग जैव रसायन७०में बदलाव के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, और लाभकारी प्राकृतिक पराग७१प्रावधानों के साथ जुड़े microbiome । इस अध्ययन का तीसरा उद्देश्य लार्वा फिटनेस पर फंजीसाइड उपचार और आहार पराग के इंटरैक्टिव प्रभावों का मूल्यांकन करना है.

मातृ शरीर के आकार, प्रावधान दर, चारा रणनीति, और पराग मात्रा७२,७३,७४,७५ सहित कई जैविक लक्षण एकांत मधुमक्खियों के बीच लार्वा फिटनेस को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है । इन कारकों नरकट, जो सफ़ाई प्रयोगात्मक डिजाइन जब लार्वा स्वास्थ्य का आकलन विकसित करने में एक चुनौती बन के बीच महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता लागू कर सकते हैं । इसके अलावा, यह देखते हुए कि लार्वा विकास सीलबंद घोंसले के नरकट के अंदर होता है, संतति पर ऐसी परिवर्तनशीलता के प्रभाव को गैर-घातक तकनीकों (चित्रा 3) का उपयोग किए बिना कल्पना और quantified करना कठिन होता है । इस चुनौती को दूर करने के लिए, इस अध्ययन के भीतर सभी परिकल्पनाओं उनके घोंसले के नरकट के बाहर लार्वा मागणी का उपयोग कर परीक्षण कर रहे हैं । प्रयोगात्मक डिजाइन का प्रतिनिधित्व करता है एक पूरी तरह से 2 × 2 कारक सेट अप को पार, प्रत्येक 2 स्तरों से मिलकर कारक के साथ; फैक्टर 1: फंजीसाइड एक्सपोजर (फंजीसाइड; नो फंजीसाइड); 2 फैक्टर: पराग स्रोत (मेजबान पराग, गैर मेजबान पराग) । मधुमक्खियों अंडा से नियंत्रित प्रयोगशाला शर्तों के तहत बाँझ multiwell सेल संस्कृति प्लेटों के भीतर prepupal चरण के लिए उठाया जाता है । प्रत्येक अच्छी तरह से पराग प्रावधान और एक अंडा की एक मानकीकृत राशि के साथ व्यक्तिगत रूप से रखता है । सेने के बाद, लार्वा अच्छी तरह से, लार्वा विकास को पूरा करता है, और pupation शुरू के भीतर आवंटित पराग पर खिलाता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि अस्पष्टीकृत मृत्यु दर इस कृत्रिम पालन वातावरण के भीतर उठाया है कि जंगली४९,७६में सामना करना पड़ा के बीच कम है । में इन विट्रो-पीछे मधुमक्खियों का उपयोग क्षेत्र आधारित अध्ययन पर कई फायदे हैं: 1) यह आम तौर पर क्षेत्र आधारित अध्ययन के साथ जुड़े प्राकृतिक परिवर्तनशीलता और अनियंत्रित कारकों के निराधार प्रभाव को कम करता है; 2) यह ब्याज की प्रत्येक कारक (ओं) के लिए हेरफेर के कई स्तरों उपचार समूहों के पार एक साथ परीक्षण करने की अनुमति देता है; 3) प्रतिकृति की संख्या पूर्व निर्धारित किया जा सकता है, और प्रत्येक दोहराने के लिए प्रयोगात्मक कारकों व्यक्तिगत हेरफेर किया जा सकता है; 4) लार्वा प्रतिक्रिया चर आसानी से visualized और आसन्न लार्वा परेशान बिना स्वतंत्र रूप से दर्ज किया जा सकता है; 5) प्रोटोकॉल को और अधिक जटिल प्रयोगात्मक एकाधिक कारकों और प्रतिक्रिया चर शामिल डिजाइन को समायोजित संशोधित किया जा सकता है ।

Figure 3
चित्र 3. Osmia ribifloris (s.l.) के एक प्राकृतिक घोंसले ईख के भीतर सामग्री । बंद (क) एक विच्छेदन रीड व्यक्तिगत मंडलों, पराग प्रावधानों, और विभाजन दिखा रहा है, और (ख) हौसले से काटा पराग प्रावधानों, और एसोसिएटेड अंडे (एक काले घेरे के साथ संकेत दिया) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Protocol

1. फंजीसाइड एक्सपोज़र प्रयोगों के लिए प्रोपिकोनाज़ोल समाधान तैयार करें

  1. प्रयोग के दिन बाँझ पानी में व्यावसायिक रूप से खरीदी प्रोपिकोनाज़ोल १४.३% की उचित मात्रा को भंग करके 0.1 x फंजीसाइड समाधान तैयार करें । सुनिश्चित करें कि केवल हौसले से तैयार फंजीसाइड समाधान सभी उपचार के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  2. पराग प्रावधान के ग्राम प्रति 0.1 x फंजीसाइड समाधान के 23 µ एल जोड़ें प्रोपिकोनाज़ोल पहले मधुमक्खी एकत्र पराग24 (०.३६१ पीपीएम या सक्रिय संघटक जी-1 के पराग के µ जी से सूचित की अधिकतम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए) ।

2. फसल अंडे और मेजबान पराग Osmia नरकट से प्रावधानों

  1. एक निष्फल स्केलपेल का उपयोग करना, काटना हौसले से Osmiaके घोंसले के नरकट खामियों को दूर किया, यह रीड की लंबाई के साथ दो भागों में बंटवारे को व्यक्तिगत कक्षों को बेनकाब ।
    नोट: प्रत्येक घोंसला एक चैंबर के भीतर 8 से 14 कक्षों और एक एकल अंडा के बीच हो सकता है ।
  2. निरीक्षण नरकट नेत्रहीन पहले प्रकाशित दिशानिर्देश७७के आधार पर पुरुष अंडे युक्त कक्षों की पहचान करने के लिए । एक निष्फल तुला सुई का प्रयोग करें घोंसले के साथ रीड से जुड़े अंडे के साथ प्रत्येक पराग प्रावधान को दूर करने के लिए, और एक साफ वजन नाव में जगह है ।
  3. धीरे से एक साफ ठीक रंग ब्रश का उपयोग कर प्रावधान से अंडा अलग और पराग प्रावधान और एक मानक प्रयोगशाला संतुलन का उपयोग कर अंडे के ताजा वजन रिकॉर्ड । पुरुष पराग प्रावधानों के औसत वजन की गणना ।
  4. अतिरिक्त तापमान और निर्जलीकरण के लिए जोखिम से अंडे को नुकसान की संभावना को कम करने के लिए न्यूनतम देरी के साथ बाद के चरणों का पालन करें ।

3. तैयार मेजबान संयंत्र पराग प्रावधानों

  1. नेत्रहीन का निरीक्षण मातृ एकत्र मेजबान संयंत्र पराग नेस्टिंग कक्षों से खुदाई के लिए सुनिश्चित करें कि कोई परजीवी७८मौजूद हैं । आदेश में किसी भी संभावित मातृ पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, एक बाँझ पेट्री पकवान में एक बड़े पैमाने पर पराग प्रावधानों गठबंधन और अच्छी तरह से एक निष्फल सुई का उपयोग कर मिश्रण ।
  2. नए पराग प्रावधानों में संयुक्त जन विभाजित, यह सुनिश्चित करना है कि प्रत्येक पुनर्गठन प्रावधान का वजन लगभग एक स्वाभाविक रूप से आवंटित पुरुष प्रावधान के औसत वजन के बराबर है (मतलब ± एसई, ०.३५ ± ०.०१ जी, N = ४२) ।
    नोट: क्योंकि Osmia sp. पुरुष वंश के लिए छोटे पराग प्रावधानों आवंटित करता है, पुरुष लार्वा के कम शरीर वजन में यह परिणाम की तुलना में महिलाओं की७७। सेक्स-विशिष्ट मतभेदों से उत्पन्न किसी भी ऐसे पूर्वाग्रह से बचने के लिए, केवल प्रयोगों में पुरुष अंडे का उपयोग करें ।

4. तैयार गैर-मेजबान संयंत्र पराग प्रावधान

  1. एक मानक प्रयोगशाला बॉल-मिल का उपयोग कर एक ठीक पाउडर के लिए व्यावसायिक रूप से शहद मधुमक्खी के एकत्रित पराग को चूर करें ।
  2. मातृ-एकत्र की नमी की सामग्री के आधार पर मेजबान पराग प्रावधानों (~ 20%), ४०% निष्फल चीनी समाधान७९ के उपयुक्त संस्करणों का उपयोग कर पराग पाउडर हाइड्रेट और अच्छी तरह से मिश्रण एक आटा-संगति की तरह बनाने के लिए ।
  3. व्यक्ति पराग आम जनता में विभाजित, एक स्वाभाविक रूप से आवंटित पुरुष प्रावधान के औसत वजन के रूप में लगभग एक ही वजनी ।
    नोट: मातृ एकत्र मेजबान पराग प्रावधानों की नमी सामग्री 30 बेतरतीब ढंग से चयनित पुरुष मंडलों८०से पराग प्रावधानों के ताजा और शुष्क वजन की तुलना करके पहले में मानकीकृत किया जा सकता है । शुष्क वजन प्राप्त करने के लिए, पराग प्रावधानों को फ्रीज किया जाना चाहिए-एक lyophilizer में सूख (७२ एच के लिए १.५ Pa) ।

5. तैयार Multiwell सेल कल्चर प्लेट्स

  1. लाइन बाँझ ४८ के व्यक्तिगत कुओं-autoclaved टिन कप (5 × 9 सेमी) के साथ अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट । यह पराग प्रावधान को समायोजित कर सकते हैं इतना है कि कैप्सूल के शीर्ष रिम बाहर धीरे स्वभाव, बाँझ संदंश का उपयोग करना.
  2. टिन कप के अंदर मेजबान या गैर मेजबान पराग प्रावधान के एक बड़े पैमाने पर जगह बाँझ उपचार समूह के आधार पर उपकरण का उपयोग कर ।
    नोट: क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए, उपचार और नियंत्रण समूहों के लिए अलग प्लेट का उपयोग करें ।

6. कवक जोड़ें

  1. पराग मास के भीतर एक केंद्रीय रखा अवसाद एक बाँझ लकड़ी छड़ी का उपयोग कर । प्रत्येक पराग प्रावधान के लिए एक नई छड़ी का प्रयोग करें ।
  2. फंजीसाइड समाधान (उपचार के लिए), या बाँझ पानी (नियंत्रण के लिए) अवसाद में उपयुक्त मात्रा जोड़ें । फंजीसाइड/बाँझ पानी और अंडे के बीच सतह संपर्क को कम करने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग कर अवसाद के उद्घाटन चुटकी.
  3. सुनिश्चित करें कि कारक सेट प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ संरेखित करता है कि योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (चित्रा 4) में चित्रित किया ।

Figure 4
चित्र 4. प्रयोगात्मक सेटअप के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । प्रयोग एक पूरी तरह से पार 2 × 2 कारक setups का प्रतिनिधित्व करता है । फ़ैक्टर 1 फंजीसाइड एक्सपोज़र का प्रतिनिधित्व करता है और 2 स्तर होते हैं: (i) कोई फंजीसाइड (n = 10), और (ii) फंजीसाइड (n = 10) । 2 फैक्टर पराग स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है और 2 के स्तर के होते हैं: (i) मेजबान पराग (एन = 8), और (ii) गैर मेजबान पराग (n = 8) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

7. रियर और निरीक्षण लार्वा

  1. पराग प्रावधान एक साफ ठीक रंग ब्रश का उपयोग कर के शीर्ष सतह पर एक बेतरतीब ढंग से चयनित पुरुष अंडा प्लेस । एक बार अंडे सभी प्रावधानों पर रखा गया है, सेल संस्कृति की थाली के ढक्कन की जगह, यह कोनों पर लेबलिंग टेप के साथ सुरक्षित ।
  2. एक साफ ट्रे पर अच्छी तरह से प्लेट रखें और सीधे प्रकाश के साथ संपर्क बाधा करने के लिए एक काले कपड़े से कवर । सुखाना को रोकने के लिए ट्रे के भीतर बाँझ पानी की 30 मिलीलीटर युक्त एक 6 अच्छी तरह थाली रखें । गर्मी कमरे के तापमान पर एक मशीन के अंदर परेशान ट्रे छोड़ दें ।
  3. अच्छी तरह से प्लेटों के ढक्कन को हटाने के बिना एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत दैनिक प्लेटों का निरीक्षण । यह सुनिश्चित करें कि लार्वा मूवमेंट के लिए जांच करके जिंदा रहें । यदि कोई आंदोलन का पता चलता है, मृत लार्वा और शेष पराग प्रावधान युक्त टिन कप त्यागें । सभी जीवित लार्वा अच्छी तरह से प्लेटों के भीतर परेशान विकसित करने के लिए जब तक वे prepupal चरण तक पहुँचने की अनुमति दें ।
  4. एक बार यह prepupal चरण४१तक पहुंच जाता है टिन कप से लार्वा निकालें । सिल्क कोकून से किसी भी ख़ारिज को साफ करने के लिए ब्रश का प्रयोग करें । ध्यान से एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रेशम कोकून के माध्यम से कटौती और रबर संदंश के साथ prepupa निकालने ।
  5. prepupa धीरे से संभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि उपकरण नरम शरीर पियर्स नहीं है । prepupa (prepupal बायोमास) और अंडे से prepupal चरण (लार्वा विकासात्मक समय) के लिए विकासात्मक समय के ताजा वजन रिकॉर्ड ।
    नोट: किसी भी मृत लार्वा शव और बचे हुए पराग प्रावधान पर अवांछित माइक्रोबियल विकास को रोकने के लिए तुरंत छोड़ दिया जाना चाहिए । इससे बचे हुए स्वस्थ लार्वा को संक्रमण का खतरा कम हो जाता है ।

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Representative Results

लार्वा स्वास्थ्य quantified तीन मैट्रिक्स (i) लार्वा विकास के समय का उपयोग कर रहा था, (ii) prepupal बायोमास, और (iii) प्रतिशत उत्तरजीवी । एक दो तरह ANOVA फंजीसाइड जोखिम (दो स्तरों: नहीं फंजीसाइड, फंजीसाइड) और पराग स्रोत (दो स्तरों: मेजबान पराग, गैर मेजबान पराग) स्वतंत्र चर के रूप में, और लार्वा निर्भर चर के रूप में विकास के समय का उपयोग कर आयोजित किया गया था । फंजीसाइड एक्सपोजर के लिए मुख्य प्रभाव (एफ1, 28 = १.२४, पी = ०.२८) गैर फंजीसाइड-इलाज के बीच महत्वपूर्ण था (मतलब ± एसई) (२८.१४ ± १.९८ डी, एन = 14), और अनुपचारित (२५.३९ ± १.६५ डी, एन = 18) समूह । पराग स्रोत के लिए मुख्य प्रभाव बहरहाल, मेजबान पराग पर उठाए गए लार्वा के लिए विकास के समय के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर संकेत (२०.०० ± ०.५० डी, एन = 16) और गैर मेजबान पराग (३३.१९ ± ०.८१ डी, एन = 16) (एफ1, 28 = १७९.८३, P < ०.००१) । Bonferroni सही पोस्ट-हॉक तुलना संकेत दिया है कि लार्वा विकास के समय काफी फंजीसाइड-इलाज और अनुपचारित समूहों के बीच मेजबान पर उठाया (पी = ०.५७) और गैर मेजबान (पी = ०.३२) पराग से भिंन नहीं है । हालांकि, लार्वा विकासात्मक समय के लिए काफी कम था मेजबान पराग पर उठाए गए दोनों फंजीसाइड-इलाज (पी < ०.००१) और अनुपचारित (पी < ०.००१) पराग के लिए गैर-होस्ट पराग की तुलना में । संपर्क प्रभाव (फंजीसाइड जोखिम × पराग स्रोत) (एफ1, 28 = ०.०९, पी = ०.७७) महत्वपूर्ण नहीं था । विश्लेषण निर्भर चर के रूप में prepupal बायोमास का उपयोग कर दोहराया गया था । फंजीसाइड जोखिम के लिए मुख्य प्रभाव एक महत्वपूर्ण अंतर का संकेत दिया (एफ1, 28 = ४.६६, पी = ०.०४) के बीच फंजीसाइड-इलाज (०.१२३ ± ०.०१ जी, एन = 14), और अनुपचारित (०.१४९ ± ०.०१ जी, एन = 18) समूह । पराग स्रोत के लिए मुख्य प्रभाव (एफ1, 28 = ५६.३०, पी < ०.००१) ने मेजबान पराग (०.१७० ± ०.०१ जी, एन = 16) और गैर-मेजबान पराग (०.१०५ ± ०.०१ जी, एन = 16) पर उठाए गए लार्वा के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दर्शाया . Bonferroni सही पोस्ट-हॉक तुलना संकेत दिया कि prepupal बायोमास काफी फंजीसाइड-इलाज और अनुपचारित समूहों के बीच मेजबान पर उठाया (पी = ०.२२) और गैर मेजबान (पी = ०.०८) पराग के बीच भिंन नहीं है । हालांकि, prepupal बायोमास दोनों फंजीसाइड-इलाज के लिए गैर मेजबान पराग की तुलना में मेजबान पराग पर उठाया लार्वा के बीच काफी अधिक था (पी < ०.००१) और अनुपचारित (पी < ०.००१) पराग । संपर्क प्रभाव (फंजीसाइड जोखिम × पराग स्रोत) (एफ1, 28 = ०.१३२, पी = ०.७२) महत्वपूर्ण नहीं था । चित्रा 5 और चित्रा 6 के aforementioned विश्लेषण से प्राप्त परिणामों के चित्रमय प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । स्वतंत्र नमूनों टीपरीक्षण लार्वा उत्तरजीवी पर पराग स्रोत का एक महत्वपूर्ण प्रभाव का संकेत (एन = 18, टी9 =-२.४५, पी =०.०४) ।

Figure 5
चित्रा 5. बार ग्राफ लार्वा विकास के समय और prepupal बायोमास के आधार पर लार्वा स्वास्थ्य के लिए मैट्रिक्स दिखा । लार्वा फिटनेस मेट्रिक्स (क) और (ख) पराग स्रोत पर आधारित संकुल रहे हैं; और (ग) और (घ) फंजीसाइड एक्सपोजर. (± 1 एसई मतलब) । P < ०.००१ कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6. लार्वा फिटनेस मेट्रिक्स के लिए इंटरेक्शन प्लाट । फंजीसाइड एक्सपोजर और पराग स्रोत पर (क) लार्वा विकासात्मक समय, और (ख) prepupal बायोमास के इंटरएक्टिव प्रभाव । (± 1 एसई मतलब) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Pearsons सहसंबंध लार्वा विकासात्मक समय और prepupal बायोमास (चित्रा 7) के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । सभी उपचार समूहों (r =-०.८३, p < ०.००१, N = ३२) में एक महत्वपूर्ण नकारात्मक सहसंबंध नोट किया गया था, और फंजीसाइड उपचार (कोई फंजीसाइड: r =-०.७६, p < ०.००१, n = 18; फंजीसाइड: r =-०.९२, P < ०.००१, N = 14) । जबकि गैर-होस्ट पराग पर उठाए गए लार्वा के लिए एक महत्वपूर्ण नकारात्मक सहसंबंध था (r =-०.६४, p < ०.०१, N = 16), होस्ट-पराग पर उठाए गए लार्वा के लिए ऐसा कोई संबंध नहीं देखा गया था (r =-०.०१, p = ०.९८, N = 16).

Figure 7
चित्रा 7. लार्वा विकास के समय और prepupal बायोमास के बीच संबंध । विकास के समय और prepupal के बीच पियरसन सहसंबंध (A) सभी उपचार समूह (p < ०.००१) ( B) पराग स्रोत (होस्ट पराग: p = ०.९८, गैर-होस्ट पराग: p < ०.०१); (C) फंजीसाइड एक्सपोज़र (कोई फंजीसाइड: p < ०.००१, फंजीसाइड: p < ०.००१) । पैनलों (ख) और (ग) के लिए, ट्रेंडलाइंस चित्रा लीजेंड में प्रतीकों के साथ रंग-मिलान कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video 1
एनिमेटेड चित्रा 1 । पांचवां चरण एक multiwell प्लेट के एक ही कुआं के भीतर ओ. ribifloris के लार्वा instar । लार्वा pupation के लिए तैयार करने में एक मुलगा कोकून कताई शुरू कर दिया है करने के लिए उल्लेख किया है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

उनके प्राकृतिक घोंसले के नरकट बाहर पीछे मधुमक्खियों, प्रयोगशाला शर्तों के तहत, लार्वा फिटनेस से संबंधित कई परिकल्पनाओं के परीक्षण की अनुमति देता है । इस हद तक कि अज्ञात कारकों को मधुमक्खी मृत्यु का कारण जारी है, जोखिम मूल्यांकन इन विट्रो प्रयोगों का उपयोग करने में मदद कर सकते है संभावित खतरों की पहचान और इस प्रजाति-जंगली परागण के अमीर समूह के लिए प्रबंधन प्रथाओं को सूचित 12 ,३८,४९,७६,८१,८२।

सामांय में, छोटे विकास के समय और उच्च prepupal बायोमास उच्च लार्वा फिटनेस के साथ जुड़ा हुआ है । सभी उपचार के पार, लार्वा विकास की अवधि नकारात्मक prepupal बायोमास के साथ संबंधित था । हालांकि, चार समूहों में लार्वा विकास और prepupal बायोमास की अवधि के बीच महत्वपूर्ण अंतर थे । लार्वा है कि किसी भी कवक प्राप्त नहीं किया और मेजबान पराग भस्म की अनुमति दी गई सबसे कम लार्वा विकास के समय था, और उच्चतम prepupal बायोमास । इसके विपरीत, उन लार्वा कि भस्म फंजीसाइड गैर-मेजबान पराग इलाज, लार्वा विकास को पूरा करने के लिए सबसे लंबे समय तक ले लिया, और सबसे कम prepupal बायोमास था । हालांकि, लार्वा उत्तरजीवी के लिए रुझान कम स्पष्ट थे, मृत्यु दर के साथ ही फंजीसाइड-इलाज मेजबान पराग पर उठाया समूह के लिए उल्लेख किया जा रहा है । फंजीसाइड जोखिम और पराग स्रोत के मुख्य और संपर्क प्रभाव का निर्माण से पता चला कि: (i) फंजीसाइड इलाज पराग का मुख्य प्रभाव prepupal बायोमास पर एक महत्वपूर्ण नकारात्मक प्रभाव था, लेकिन नहीं लार्वा विकास की अवधि । जबकि एक पिछले अध्ययन उच्च सांद्रता पर वयस्क Osmia में तीव्र मौखिक विषाक्तता का प्रदर्शन किया है, इन परिणामों का सुझाव है कि अब तक कम एकाग्रता पर प्रोपिकोनाज़ोल के लिए मौखिक जोखिम prepupal बायोमास 23 को कम करने से स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हैं . (२) उपभोक्ता गैर-मेजबान पराग के मुख्य प्रभाव लार्वा फिटनेस पर प्रतिकूल प्रभाव डालते हैं. इन परिणामों के पहले प्रकाशित अध्ययनों के अनुरूप है कि पराग गुणवत्ता का सुझाव (यानी, विषाक्त पदार्थों की उपस्थिति, सुरक्षात्मक यौगिकों, आवश्यक पोषक तत्वों की कमी), और मधुमक्खी फिजियोलॉजी में मतभेद गैर मेजबान पराग का उपयोग करने से मधुमक्खियों को प्रतिबंधित कर सकते हैं६८ . यह भी संभावना है कि लाभप्रद microbiota आम तौर पर मेजबान से प्राप्त की अनुपस्थिति-पराग और/या मधुमक्खी की फसल इस प्रभाव को बढ़ा सकता है । (iii) लार्वा फिटनेस पर फंजीसाइड एक्सपोजर और पराग सोर्स के बीच कोई महत्वपूर्ण बातचीत नहीं हुई । दोनों फंजीसाइड-इलाज और अनुपचारित समूहों के पार, लार्वा लेने गैर मेजबान पराग काफी कम prepupal बायोमास और लंबे समय तक लार्वा विकास की मेजबानी पराग पर उठाए गए लार्वा की तुलना में । पराग स्रोत की परवाह किए बिना, लार्वा फंजीसाइड-इलाज प्रावधानों काफी कम अनुपचारित पराग पर उठाया लार्वा की तुलना में prepupal बायोमास था । महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव के अलावा, दोनों कारकों के इंटरैक्टिव प्रभाव additive मॉडल के अनुरूप है, यानी, फंजीसाइड एक्सपोजर और लार्वा फिटनेस पर पराग प्रकार के नकारात्मक प्रभाव synergistic नहीं थे । मधुमक्खी के स्वास्थ्य के विभिंन निर्धारकों की पुनरावृत्ति से उत्पंन होने वाली अनिश्चितताओं (के रूप में यहां विस्तृत), परागण प्रबंधन रणनीतियों की प्रभावशीलता को नियंत्रित । कई जोखिम कारकों के इंटरैक्टिव प्रभाव की भविष्यवाणी में मदद करके, इसी तरह प्रयोगशाला से परिणाम आधारित प्रयोगों मधुमक्खी संरक्षण के प्रयासों में इस लंबे समय से चुनौती दरकिनार मदद कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम है कि प्रयोग के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं । जब भी संभव हो, यह कार्बनिक पराग का उपयोग करें कि कीटनाशक अवशेषों से मुक्त है सलाह दी जाती है । अज्ञात स्रोतों से पराग का उपयोग करने से विभिन्न किटनाशक के साथ संदूषण का खतरा बढ़ जाता है, जिससे प्रयोगात्मक निष्कर्षों को पाया जा सकता है । यह नए सिरे से खामियों को दूर Osmia नेस्टिंग नरकट इतना है कि केवल unhatch अंडे या बहुत युवा लार्वा अध्ययन में उपयोग किया जाता है प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह सुनिश्चित करता है कि लार्वा लगभग पूरी तरह से इरादा पराग उपचार प्रकार पर उठाया जाता है । घोंसले के साथ ईख एक उथले चीरा का उपयोग कर विच्छेदित किया जाना चाहिए, जो विफल पराग प्रावधानों और अंडे फसल कटाई के दौरान क्षतिग्रस्त हो सकता है । एक बार अंडे हटा दिया गया है वे धीरे से नियंत्रित किया जाना चाहिए नुकसान को रोकने और एक शांत अंधेरे स्वच्छ वातावरण में वजन नौकाओं में बनाए रखा (जैसे, सुरक्षा कैबिनेट) जब तक वे स्थानांतरित कर रहे हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंडे की गुणवत्ता से समझौता न किया जाए, यह होल्डिंग समय ंयूनतम (< 30 मिनट) तक रखा जाना चाहिए । सभी प्रक्रियाओं को एक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए एक स्वच्छ काम वातावरण सुनिश्चित करने और संदूषण की संभावना को कम । उनकी प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए, केवल उपचार के लिए हौसले से तैयार फंजीसाइड समाधान का उपयोग करें । यह देखते हुए कि पराग hydrophobic है, फंजीसाइड समाधान/पराग प्रावधानों के भीतर बने अवसाद में पानी की शुरुआत की जानी चाहिए । यह प्रावधान के माध्यम से तरल permeating की मात्रा अधिकतम । हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि अवसाद के प्रावधान की पूरी गहराई पियर्स नहीं है, क्योंकि यह कैप्सूल फर्श का पालन समाधान से मात्रा के नुकसान में परिणाम होगा । व्यक्तिगत उपचार और नियंत्रण अलग अच्छी तरह से किया जाना चाहिए प्लेटों में अस्थिर यौगिकों और/या पराग जनित microbiota से पार संदूषण की संभावना को कम करने के लिए । तह टेप के टुकड़े प्लेट के किनारों के लिए संलग्न किया जाना चाहिए करने के लिए पर्याप्त हवा के अंतराल की अनुमति एक बार ढक्कन जगह में हैं । दैनिक टिप्पणियों के दौरान, प्लेटें लार्वा को कम करने के लिए धीरे से नियंत्रित की जानी चाहिए । टिप्पणियों को न्यूनतम हल्की तीव्रता के साथ माइक्रोस्कोप के तहत किया जाना चाहिए, और जब तक कि मृत लार्वा को छोड़ने के लिए ढक्कन नहीं हटाया जाना चाहिए । अप्रत्याशित व्यापक मृत्यु दर के मामले में, दोनों लार्वा और उनके पराग प्रावधानों का निरीक्षण किया जाना चाहिए और संक्रमण के लक्षण के लिए जांच करने के लिए । अच्छी तरह से समझौता किया दोहराने युक्त प्लेटें तुरंत खारिज कर दिया जाना चाहिए, कार्यक्षेत्र संक्रमित, और उपकरणों के संक्रमण के प्रसार को रोकने के लिए निष्फल ।

इसके व्यापक आवेदन के बावजूद, इस विधि के लिए कुछ सीमाएं हैं । उदाहरण के लिए, जबकि यह सबसे अच्छा करने के लिए कार्बनिक पराग का उपयोग अभ्यास जब भी उपलब्ध है, एक ग्रीनहाउस स्थापना के भीतर पौधों की स्थापना के लिए शुद्ध दूषित पराग की पर्याप्त मात्रा में उपज है रसद निषेध । ऐसे मामलों में, जंगली एकत्र पराग इस्तेमाल किया जा सकता है, बशर्ते कि यह कीटनाशक अवशेषों की उपस्थिति के लिए जांच की है । एक और जब जंगली एकत्र पराग का उपयोग करने के लिए प्रदूषण के जोखिम को कम करने की रणनीति है एक स्रोत है कि कम करने के लिए छिड़काव किया गया है की संभावना है से पराग प्राप्त है (जैसे, प्राचीन परेशान क्षेत्रों कृषि खेतों से दूर स्थित) । मेजबान पराग इस अध्ययन में इस्तेमाल किया घोंसले के नरकट कि प्राकृतिक वुडलैंड्स और घास के मैदानों में Kaysville, यूटा के पास Wasatch रेंज की तलहटी के आसपास रखा गया था से प्राप्त किया गया था । यह देखते हुए कि इस क्षेत्र के जंगली, अप्रबंधित प्राकृतिक जंगलों से अभी तक किसी भी व्यावसायिक कृषि क्षेत्रों पर हावी है, और है कि इन मधुमक्खियों के रूप में जहां तक शहद मधुमक्खियों जब८३,८४,८५चारा के रूप में उड़ नहीं है, यह बहुत संभावना नहीं है कि पराग वे एकत्र होगा छिड़काव किया गया है । इस प्रकार, यहां एकत्र पराग के भीतर कीटनाशक अवशेषों को तुच्छ होने की संभावना है । इस तरह के जंगली परिदृश्य में चारा, वयस्क महिला को दूषित पराग मुठभेड़, लार्वा के बीच जोखिम के जोखिम को कम करने की संभावना कम है । इस अध्ययन में प्रयुक्त व्यावसायिक रूप से खरीदा मधुप पराग उत्तरी विस्कॉंसिन और मिशिगन में प्राकृतिक वन क्षेत्रों से एकत्र किया जाता है । मानव उपभोग के लिए विपणन, सार्वजनिक रूप से उपलब्ध जानकारी और आपूर्तिकर्ता के साथ व्यक्तिगत संचार इंगित करता है कि पित्ती रासायनिक इलाज नहीं कर रहे हैं, और पराग किसी भी संशोधनों८६के बिना अपनी प्राकृतिक, कच्चे रूप में बेचा जाता है । इसलिए, यह मानना है कि व्यावसायिक रूप से खरीदा मधुप पराग में contaminant लोड कम हो जाएगा उचित है । अध्ययन है कि जंगली प्राकृतिक वनस्पति के साथ अप्रबंधित क्षेत्रों से पराग प्राप्त नहीं है के लिए, यह पराग रसायन विश्लेषण से प्रत्यक्ष अनुभवजंय सबूत सुनिश्चित करने के लिए कि पराग जोखिम परख में इस्तेमाल किया है contaminant मुक्त है सलाह दी जाती है । एक और सीमा कृत्रिम पालन पर्यावरण द्वारा शुरू की तरक़ीब शामिल है । सर्वोत्तम प्रयासों के बावजूद, यह एक प्राकृतिक घोंसले में रीड (जैसे, नमी, ऑक्सीजन एकाग्रता, तीन आयामी संरचना व्यक्तिगत कक्षों की), जो प्रभाव हो सकता है के भीतर सटीक microenvironment को दोहराने के लिए रसद संभव नहीं है लार्वा अज्ञात डिग्री के लिए फिटनेस । defensibly प्राकृतिक आहार की विशेषताओं अनुकरण करने के लिए, घोंसले के नरकट से प्रारंभिक डेटा इन विट्रो आहार हेरफेर अध्ययन करने से पहले प्राप्त किया जाना चाहिए । हालांकि गैर मेजबान पराग इस अध्ययन में इस्तेमाल किया क्षेत्रों से प्राप्त की है, जहां ओरेगन अंगूर अनुपस्थित या दुर्लभ८७है, वहां मेजबान पराग के निशान व्यावसायिक रूप से खरीदा पराग के भीतर मिश्रित हो सकता है, संभावित परिणाम को प्रभावित । इस तकनीक का एक और दोष यह है कि प्रायोगिक अवधि के दौरान हैंडलिंग तनाव मधुमक्खियों पर प्रतिकूल प्रभाव पैदा कर सकता है । अंत में, जबकि यह प्रकृति६३में unhatch अंडे मुठभेड़ आम है, प्रयोगशाला शर्तों के तहत यह पता लगाने के लिए कि क्या विफल हैच तनाव से निपटने के कारण था मुश्किल है, प्रयोगात्मक उपचार, या प्राकृतिक कारणों का एक परिणाम है । चूंकि इन कारकों के अध्ययन में पूर्वाग्रह के अज्ञात डिग्री लागू कर सकते हैं, एक सावधानी का उपयोग करें, जबकि प्राप्त परिणामों की व्याख्या करना चाहिए ।

कारकों है कि पूर्वाग्रह प्रयोगात्मक परिणाम प्रदर्शन कर सकते है के लिए नियंत्रित करके (जैसे, मातृ चारा क्षमता७५, सेक्स-विशिष्ट रूपांतरों७७, और आहार पराग६८,७२), वर्णित प्रोटोकॉल प्रदान करता है पहले प्रकाशित तकनीकों७६पर पर्याप्त सुधार, और परिकल्पना परीक्षण के लिए एक और अधिक कठोर रूपरेखा प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, इन विट्रो मेंप्रयोग-पीछे मधुमक्खियों xenobiotic उपचार के लिए सेक्स विशिष्ट प्रतिक्रियाओं में जांच की अनुमति देता है, जो अंयथा गुहा की जंगली आबादी के बीच अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण होगा-नेस्टिंग मधुमक्खियों४९,८८। जोड़ तोड़ और कई बातचीत कारकों का परीक्षण करने के लिए संभावित (जैसे, आहार गुणवत्ता और मात्रा, आहार से जुड़े microbiota, synergistic कीटनाशकों के संपर्क), मधुमक्खी स्वास्थ्य के प्रमुख निर्धारकों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । प्रोटोकॉल का लचीलापन आसानी से संशोधनों की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, अलग आकार का उपयोग करने के लिए विभिंन आकारों के लार्वा को समायोजित प्लेटें, प्रकार और आहार की राशि बदल), यह एकाकी मधुमक्खियों और ततैया के कई अंय प्रजातियों के साथ प्रयोग के लिए उत्तरदायी बना ७६. इस अध्ययन के दूध पिलाने की अवस्था में विकास और उत्तरजीवी के आधार पर फिटनेस का मूल्यांकन किया है, जबकि, कीड़ों उद्भव दर, भोजन करने के लिए शरीर रूपांतरण, और बाद उद्भव दीर्घायु पर अतिरिक्त डेटा प्राप्त करने के लिए उद्भव तक हो सकता है ४९. इस जानकारी विषाक्तता परख में उपचार के उप घातक प्रभाव का आकलन करने में मदद कर सकते हैं । पराग-microbiome के समारोह में बढ़ती रुचि के साथ, प्रयोगशाला आधारित अध्ययन उनके पराग microbiota७१के आधार पर संवेदनशील बनाम प्रतिरोधी मधुमक्खी प्रजातियों की पहचान कर सकते हैं । मधुमक्खी समूहों के पार फंजीसाइड संवेदनशीलता में मतभेद पित्ती संग्रहीत पराग के भीतर microbiota अनुक्रमण द्वारा पता लगाया जा सकता है । यह मदद कर सकते है xenobiotic तनाव के प्रतिरोध के डिग्री बदलती प्रदान में पराग microbiome की भूमिका का पता लगाने । भविष्य के अध्ययन भी मेजबान और गैर मेजबान पराग के प्राकृतिक microbiota के बीच मतभेद की पहचान में मदद कर सकते है जो एक अंतर्निहित का चयन करें मधुमक्खी प्रजातियों के भीतर oligolectic व्यवहार ड्राइविंग कारक के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

लार्वा एकांत मधुमक्खियों का पालन इन विट्रो में जंगली में अनुभवी प्राकृतिक परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रण में मदद कर सकते हैं, जिससे व्यक्ति की भूमिका delineating और मधुमक्खी स्वास्थ्य को प्रभावित करने में कारकों बातचीत । यह सुलभ और सस्ती तकनीक कई मापदंडों, जो आसानी से विशिष्ट अनुसंधान के उद्देश्यों को संबोधित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है की हेरफेर के लिए अनुमति देकर ' entomologists toolkit फैलता है । यदि इन विट्रो प्रयोगों में से सबूत की पहचान में मदद कर सकते है जोखिम वाली आबादी, मधुमक्खी संरक्षण रणनीतियों पर प्रभाव पर्याप्त होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने लैब, डीआरएस में सहायता के लिए Osmia नेस्टिंग नरकट, मेरेडिथ Nesbitt और मौली Bidwell प्रदान करने के लिए Kimball क्लार्क और टिम Krogh का शुक्रिया अदा किया । कैमरून क्यूरी, Christelle Guédot, टेरी Griswold, माइकल Branstetter और के लिए तीन अनाम समीक्षक उनकी उपयोगी टिप्पणी है कि पांडुलिपि में सुधार । यह काम USDA-कृषि अनुसंधान सेवा विनियोजित कोष द्वारा समर्थित (वर्तमान अनुसंधान सूचना प्रणाली #3655-21220-001), विस्कॉंसिन कृषि, व्यापार, और उपभोक्ता संरक्षण (#197199), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (के अंतर्गत अनुदान सं. देब-१४४२१४८), डो ग्रेट झीलों, ऊर्जा अनुसंधान केंद्र (विज्ञान के डो कार्यालय मांक डी-FC02-07ER64494) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reeds Nativebees.com NA Freshly plugged reeds
Dissection set VWR 89259-964 Sterilize before use
Long Nose Pliers Husky 1006
6 well culture plates VWR 10062-892 Sterile sealed
48 well culture plates VWR 10062-898 Sterile sealed
Petri dishes VWR 25373100 Sterile sealed
Square Weighing Boats VWR 10770-448
Camel Hair Brush Bioquip 1153A
Tin capsules EA Consumables D1021 Sterilize before use
Sucrose VWR 470302-808
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Honey bee pollen Bee energised 897098001244 Untreated, natural, raw pollen
Microbalance VWR 10204-990
Pulverisette LAB SYNERGY INC. 30334913
Wooden sticks VWR 470146908 Sterilize before use
Sealing tape VWR 89097-912
Microscope VWR 89403-384
Planting tray VWR 470150-632
Ethanol VWR BDH1158-4LP
Centrifuge tube VWR 21008936
Microsyringe Cole-Palmer UX-07940-07
Rubber tweezer Amazon B0135HWPN4
Syringe needles VWR 89219-334
Freeze drier Labcono LFZ-1L
Statistical software SPSS Version 21.0

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Dharampal, P. S., Carlson, C. M., Diaz-Garcia, L., Steffan, S. A. In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors. J. Vis. Exp. (137), e57876, doi:10.3791/57876 (2018).

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