Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

In Vitro Opdræt af ensomme bier: et værktøj til vurdering af larve risikofaktorer

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57876
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1,5
1Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agricolas y Pecuarias, 5USDA-ARS, Vegetable Crop Research Unit

Summary

Fungicid sprays på blomsterplanter kan udsætte ensomme bier for høje koncentrationer af pollen-bårne fungicid restkoncentrationer. Ved hjælp af laboratoriebaserede eksperimenter, der involverer in vitro--opdrættet bee larver, dette studie undersøger de interaktive effekter af forbrugende fungicid behandlet pollen stammer fra vært og ikke-vært planter.

Abstract

Selv om ensomme bier tjenesteydelser afgørende bestøvning for vilde og administrerede afgrøder, har denne artsrige gruppe i høj grad blevet overset i pesticid forordning undersøgelser. Risikoen for eksponering for fungicid rester forventes at være særlig stor hvis spray opstår på eller i nærheden af værtsplanter mens bierne indsamler pollen til at klargøre deres reder. For arter af Osmia , der forbruger pollen fra en udvalgt gruppe af planter (oligolecty), kan manglende evne til at bruge pollen fra ikke-værtsplanter øge deres risikofaktor for fungicid-relateret toksicitet. Dette manuskript beskriver protokoller, der bruges til med held bageste oligolectic mason bier, Osmia ribifloris sensu lato, fra æg til prepupal fase inden for celle kultur plader under standardiserede laboratorieforhold. Til i vitro-opdrættet bier bruges efterfølgende til at undersøge virkningerne af fungicid eksponering og pollen kilde på bee fitness. Baseret på et 2 × 2 krydsede fuldt faktordesign, undersøger eksperimentet vigtigste og interaktive virkningerne af fungicid eksponering og pollen kilde på larve fitness, kvantificeres ved prepupal biomasse, larve udviklingsmæssige tid og efterladte. En stor fordel ved denne teknik er at bruge in vitro--opdrættet bier reducerer naturlige baggrund variabilitet og tillader den samtidige manipulation af flere eksperimentelle parametre. Den beskrevne protokol præsenterer et alsidigt værktøj til hypoteser test involverer suite af faktorer, der påvirker biers sundhed. For bevarelse bestræbelser på at blive mødt med betydelig, varig succes, sådan indsigt i den komplekse samspil mellem fysiologiske og miljømæssige faktorer køre bee falder vil vise sig for at være kritisk.

Introduction

I betragtning af deres rolle som den dominerende gruppe af insekt bestøvere1, udgør den globale tab i bibestandene en trussel mod fødevaresikkerheden og økosystem stabilitet2,3,4,5,6 ,7. De faldende tendenser i både administrerede og vilde bibestandene er blevet tilskrevet flere fælles risikofaktorer, herunder habitat fragmentering, nye parasitter og patogener, tab af genetisk mangfoldighed og indførelsen af invasive arter3 ,4,7,8,9,10,11,12. Især den dramatiske stigning i brugen af pesticider, (f.eks. neonicotinoids) har været direkte forbundet med skadelige virkninger blandt bier13,14,15. Flere undersøgelser har vist, at synergi mellem neonicotinoids og ergosterol-biosyntesen-hæmmende (EBI) fungicider kan føre til høj dødelighed på tværs af flere bee arter16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. dog fungicider, længe anset for at være 'bi-safe', fortsat skal sprøjtes på-bloom afgrøder uden megen kontrol23. Fouragering bier har dokumenteret at rutinemæssigt bringe tilbage pollen belastninger forurenet med fungicid restkoncentrationer24,25,26. Forbruget af sådanne fungicid-ladenpollen kan forårsage høj dødelighed blandt larve bier27,28,29,30, og en række subletale virkninger blandt voksne bier16 , 31 , 32 , 33 , 34. en nylig undersøgelse antyder, at fungicider kan forårsage bee tab ved at ændre den mikrobielle samfund inden for hive-gemt pollen, dermed forstyrre de kritiske symbioser mellem bier og pollen-bårne mikrober35.

Selv om ensomme bier er af afgørende betydning for bestøvningen af flere vilde og landbruget planter36,37,har38, denne forskelligartede gruppe af bestøvere fået langt mindre opmærksomhed i pesticid overvågning undersøgelser. Rede af en voksen ensom kvinde indeholder 5-10 forseglet yngel kamre, hver fyldt med en begrænset masse maternally indsamlet pollen og nektar og et enkelt æg39. Efter klækning afhængige larverne af, at den tildelte pollen bestemmelse, og den tilknyttede pollen-bårne mikrobiota at få tilstrækkelig ernæring40,41. Fordi de mangler fordelene ved en social livsstil, kan ensomme bier være mere sårbare over for pesticider eksponering42. For eksempel, mens underskud i sociale bier efter en spray kan udlignes til nogle udvide af arbejdstagere og nyopstået yngel, død af en enkelt voksen ensom kvinde slutter alle reproduktiv aktivitet43. Sådanne forskelle i modtagelighed behovet for at inkorporere forskellige bee taxa i økotoksikologiske undersøgelser for at sikre tilstrækkelig beskyttelse for administrerede og vilde bier ens. Men, bortset fra en håndfuld af undersøgelser, undersøgelser af virkningerne af fungicid eksponering har primært fokuseret på sociale bier18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.

Ensomme bier tilhører slægten Osmia (figur 1) er blevet anvendt over hele verden som effektivt bestøvere af flere vigtige frugt og nut afgrøder39,50,51,53, 53. som med andre administrerede bestøver grupper24,54,55,56,57,58, voksen Osmia bier er rutinemæssigt udsat for fungicider, der sprøjtes på i bloom afgrøder44. Voksne hunner fouragering for nylig sprøjtede afgrøder kan indsamle og lagerføre deres yngel kamre med fungicid-laden pollen, som senere danner den eneste kost for udviklingslandene larverne. Forbrugende forurenet pollen bestemmelser kan efterfølgende udsætte larverne til fungicid restkoncentrationer42. Risikoen for eksponering kan blive højere blandt oligolectic arter, at fouragere kun på et par nært beslægtede vært planter59,60,61. Visse megachilid bier, for eksempel vises at fortrinsvis fouragere for lav kvalitet Asteraceae pollen, som et middel til at reducere parasitisme62. Imidlertid har i omfang som fungicider påvirke larve fitness blandt oligolectic ensom bier ikke været empirisk kvantificeret. Målet med denne undersøgelse er at udvikle en protokol for at afprøve hovedsagen og interaktive virkningerne af fungicid eksponering og pollen kilde på fitness af in vitro- opdrættet ensomme bier. For at undersøge, æg af O. ribifloris sensu lato (s.l.) kan være fremstillet kommercielt (tabel af materialer). Denne population er ideelt på grund af dens betydning som en native bestøvere, og dens stærk forkærlighed for nektar-rige Mahonie aquifolium (Oregon grape) fundet i region53,63,64 (Figur 2).

Figure 1
Figur 1. En høj opløsning billede af en voksen Osmia ribifloris. Foto kredit Dr. Jim Cane, forskning entomolog, USDA-ARS venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Phragmite nesting siv af Osmia ribifloris (s.l.) med en rugende kvinde i forgrunden. Salen partitioner og terminal stik for rørene er konstrueret af masticated blade. Foto kredit Mr. Kimball Clark, NativeBees.com venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Det første mål for denne undersøgelse er at evaluere effekten af forbrugende fungicid behandlet pollen på larve fitness (målt i udviklingstid og prepupal biomasse). Mens udsættelse for almindeligt anvendte fungicid propiconazol har været forbundet med øget dødelighed blandt voksne bier på tværs af flere arter 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,66,67, dens indvirkning på larve bier er mindre kendt. Det andet formål med denne undersøgelse er at evaluere virkningerne af forbrugende ikke-vært pollen på larve fitness. Tidligere undersøgelser viser, at larver af oligolectic bier undlader at udvikle når tvunget til at forbruge ikke-vært pollen68. Sådanne resultater kan henføres til variationer i bee fysiologi69, pollen biokemi70og den gavnlige microbiome forbundet med naturlige pollen bestemmelser71. Det tredje mål i denne undersøgelse er at vurdere interaktive virkningerne af fungicidbehandling og kosten pollen på larve fitness.

Mange biologiske træk herunder maternel kropsstørrelse, er tilførselssats, fouragering strategi og pollen mængde72,73,74,75 kendt for at påvirke larve fitness blandt ensomme bier. Disse faktorer kan indføre betydelig variation mellem siv, som udgør en udfordring i at udvikle forsvarligt eksperimentelle design ved vurderingen af larve sundhed. Desuden, eftersom larve udvikling opstår inde i forseglet nesting siv, virkningerne af sådanne udsving på afkommet er svært at visualisere og kvantificerede uden brug af ikke-dødelige teknikker (figur 3). For at overvinde denne udfordring, er alle hypoteser inden for denne undersøgelse testet ved hjælp af larver opdrættes uden for deres nesting siv. Den eksperimentelle design repræsenterer en fuldt krydsede 2 × 2 factorial set-ups, med hver faktor, bestående af 2 niveauer; Faktor 1: Fungicid eksponering (fungicid; Ingen fungicid); Faktor 2: Pollen kilde (vært pollen, Non-vært pollen). Bier er rejst fra ægget den prepupal fase inden for steril multiwell celle kultur plader under kontrollerede laboratorieforhold. Hver er individuelt velforsynet med et standardiseret beløb af pollen bestemmelse og et enkelt æg. Efter klækning, larve feeds på den tildelte pollen i brønden, fuldender larve udvikling og indleder pupation. Tidligere undersøgelser har vist, at uforklarlige dødeligheden er lavere blandt bier rejst i denne kunstige opdræt miljø end den, der opstod i vilde49,76. Brug af in vitro-opdrættet bier har flere fordele sammenlignet med felt-baserede studier: 1) det minimerer de forstyrrende effekter af naturlig variabilitet og ukontrolleret faktorer typisk forbundet med felt-baserede undersøgelser; 2) det giver mulighed for flere niveauer af manipulation for hver faktor(med) af interesse skal testes samtidigt på tværs af behandlingsgrupper; 3) antallet af gentagelser kan være forudbestemt, og eksperimenterende faktorer for hver replikat kan bearbejdes individuelt; 4) larve svar variabler kan nemt visualiseres og registreret selvstændigt uden forstyrrende tilstødende larver; 5) protokollen kan ændres til at rumme mere komplekse eksperimentelle design med flere faktorer og svar variabler.

Figure 3
Figur 3. Indholdet i en naturlig nesting reed af Osmia ribifloris (s.l.). Nærbillede af (A) en dissekeret reed viser individuelle kamre, pollen bestemmelser, og partitioner og (B) frisk høstet pollen bestemmelser, og de tilknyttede æg (angivet med en sort cirkel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered propiconazol løsninger for fungicid eksponering eksperimenter

  1. Forberede 0,1 x fungicid løsning ved at opløse passende mængder af kommercielt købt propiconazol 14,3% i sterilt vand dag i eksperimentet. Sikre, at kun frisklavede fungicid opløsningen anvendes til alle behandlinger.
  2. Tilføje 23 µL af 0,1 x fungicid løsning per gram af pollen bestemmelse at opnå den maksimale koncentration af propiconazol tidligere rapporteret fra bee-indsamlet pollen24 (0.361 PPM eller µg af aktive ingrediens g-1 pollen).

2. høst æg og vært Pollen bestemmelser fra Osmia siv

  1. Ved hjælp af en steriliseret skalpel, dissekere frisk tilsluttet nesting siv af Osmia, opdele den i to dele langs længden af reed at eksponere de enkelte kamre.
    Bemærk: Hver reden kan indeholde mellem 8 til 14 kamre og et enkelt æg i et kammer.
  2. Inspicere rørene visuelt for at identificere de kamre, der indeholder mandlige æg baseret på tidligere offentliggjort retningslinjer77. Brug en steriliseret bøjet nål til at fjerne hver pollen bestemmelse sammen med de tilknyttede æg fra den rugende reed, og anbringes i en ren vejer båden.
  3. Forsigtigt adskille ægget fra ved hjælp af en ren fine pensel og optage friske vægten af pollen bestemmelse og æg ved hjælp af en standard laboratorium balance. Beregn den gennemsnitlige vægt af de mandlige pollen bestemmelser.
  4. Udføre de efterfølgende trin med minimal forsinkelse at mindske risikoen for skader til ægget fra eksponering til overskydende temperatur og dehydrering.

3. Forbered vært plante Pollen bestemmelser

  1. Inspicér visuelt maternally indsamlede vært-plante pollen udgravet fra nesting kamre til at sikre, at ingen parasitter er nuværende78. For at mindske eventuelle potentielle mødre bias, kombinere pollen bestemmelser i en enkelt massen i en steril petriskål og bland godt med en steriliseret nål.
  2. Opdele den samlede masse i nye pollen bestemmelser, at sikre, at vægten af hver rekonstitueret bestemmelse er omtrent lig med den gennemsnitlige vægt af en naturligt tildelte mandlige bestemmelse (betyde ± SE, 0,35 ± 0,01 g, N = 42).
    Bemærk: Fordi Osmia sp. allokerer mindre pollen bestemmelser til de mandlige afkom, dette resulterer i lavere organ vægte af mandlige larverne sammenlignet med kvinder77. For at undgå enhver sådan bias som følge af kønsspecifikke forskelle, brug kun mandlige æg i eksperimenter.

4. klargør ikke-vært plante Pollen bestemmelse

  1. Pulverisere kommercielt købt honey bee-indsamlet pollen til et fint pulver ved hjælp af en standard laboratorium bold-mill.
  2. Baseret på vandindholdet i maternally indsamlet vært pollen bestemmelser (~ 20%), fugte pollen pulver ved hjælp af passende mængder af 40% steriliseret sukker løsning79 og bland grundigt for at danne en dej-lignende konsistens.
  3. Opdele i individuelle pollen masserne, hver vejer ca det samme som den gennemsnitlige vægt af en naturligt tildelte mandlige bestemmelse.
    Bemærk: Vandindhold i maternally indsamlede vært pollen bestemmelser kan standardiseres i forud ved at sammenligne den frisk og tør vægt af pollen bestemmelser fra 30 tilfældigt udvalgte mandlige kamre80. For at opnå tørvægt, pollen bestemmelser bør frysetørret i en lyophilizer (1,5 Pa for 72 h).

5. Forbered flerhuls celle kultur plader

  1. Line individuelle brønde af sterile 48-godt kultur plade med autoklaveres tin kopper (5 × 9 cm). Med steril pincet, forsigtigt flair ud den øverste rand af kapslen, så det kan rumme pollen bestemmelse.
  2. Placer en enkelt masse vært eller ikke-vært pollen bestemmelse inde den tin kop ved hjælp af steril værktøjer baseret på gruppen behandling.
    Bemærk: For at undgå krydskontaminering, bruge separate plader for behandling og kontrolgrupper.

6. Tilføj fungicider

  1. Gøre en centralt placeret depression inden for pollen massen ved hjælp af en steril træpind. Brug en ny pind for hver pollen udførelse.
  2. Tilføj passende mængder af fungicid løsning (for behandling) eller sterilt vand (for kontrolelementer) i depression. Knivspids åbning af depression ved hjælp af steril pincet til at minimere overflade kontakt mellem fungicid / sterilt vand og ægget.
  3. Sikre at den factorial set-up af forsøgets udformning flugter med der afbildet skematisk repræsentation (figur 4).

Figure 4
Figur 4. Skematisk fremstilling af opsætningen af eksperimenterende. Eksperimentet repræsenterer en fuldt krydsede 2 × 2 factorial opsætninger. Faktor 1 repræsenterer fungicid eksponering og består af 2 etager: a ingen fungicid (N = 10), og (ii) fungicid (N = 10). Faktor 2 repræsenterer Pollen kilde og består af 2 etager: a værten pollen (N = 8), og (ii) ikke-vært pollen (N = 8). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

7. bag og observere larver

  1. Placer en tilfældigt udvalgte mandlige æg på oversiden af pollen bestemmelse ved hjælp af en ren fine pensel. Når æggene er blevet placeret på alle bestemmelserne, erstatte låget af celle kultur plade, sikre det med mærkning tape på hjørnerne.
  2. Placer de godt plader på en ren bakke og dække det med en mørk klud til at hindre kontakt med direkte lys. Sted en 6 nå plade indeholdende 30 mL sterilt vand i bakken til at forhindre udtørring. Forlade inkubation bakker uforstyrret inde i en inkubator ved stuetemperatur.
  3. Observere godt plader dagligt under en dissekere mikroskop uden at fjerne låget af godt pladerne. Sikre, at larverne er i live ved at kontrollere for bevægelse. Hvis ingen bevægelse er opdaget, kassere den tin kop der døde larverne og resterende pollen. Tillad alle overlevende larver at udvikle uforstyrret inden for godt pladerne, indtil de når den prepupal fase.
  4. Fjerne larve fra tin kop, når den når den prepupal fase41. Brug en børste til at rense enhver defecate fra silke kokonen. Forsigtigt skære igennem den silk cocoon ved hjælp af en dissekere mikroskop og uddrag prepupa med gummi pincet.
  5. Håndtere prepupa forsigtigt for at sikre, at værktøjerne ikke gennembore den bløde krop. Optage friske vægten af prepupa (prepupal biomasse) og udviklingsmæssige tiden fra æg til den prepupal fase (larve udviklingsmæssige tid).
    Bemærk: Enhver død larve skal kasseres straks for at undgå uønsket mikrobiel vækst på Kadaver og sidesten pollen bestemmelse. Dette reducerer risikoen for smitte til de resterende sunde larver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Larve fitness var kvantificeres ved hjælp af tre målinger a larve udviklingsmæssige tid, (ii) prepupal biomasse og (iii) procent efterladte. En to-vejs ANOVA blev udført ved hjælp af fungicid eksponering (to niveauer: ingen fungicid, fungicid) og Pollen kilde (to niveauer: vært pollen, Non-vært pollen) som de uafhængige variabler og larver udviklingsmæssige tid som den afhængige variabel. Den største effekt for fungicid eksponering (F1,28 = 1,24, P = 0,28) var ikke væsentlig mellem den fungicid behandlet (gennemsnit ± SE) (28.14 ±1.98 d, N = 14), og ubehandlet (25.39 ± 1.65 d, N = 18) grupper. Den største effekt for pollen kilde viste dog en væsentlig forskel mellem udviklingsmæssige tid for larver rejst på vært pollen (20,00 ± 0,50 d, N = 16) og ikke-vært pollen (33.19 ±0.81 d, N = 16) (F1,28 = 179.83, P < 0,001). Bonferroni korrigeret Post-hoc sammenligninger angivet at larve udviklingsmæssige tid ikke varierer betydeligt mellem fungicid behandlet og ubehandlet grupper rejst på værten (P = 0,57) og ikke-vært (P = 0,32) pollen. Larve udviklingsmæssige tid var dog betydeligt kortere for larver rejst på vært pollen i forhold til ikke-vært pollen for begge fungicid behandlet (P < 0,001) og ubehandlet (P < 0,001) pollen. Interaktion effekt (fungicid eksponering × Pollen kilde) var ikke signifikant (F1,28 = 0,09, P = 0,77). Analysen blev gentaget ved hjælp af prepupal biomasse som den afhængige variabel. Den største effekt for fungicid eksponering viste en signifikant forskel (F1,28 = 4.66, P = 0,04) mellem den fungicid behandlet (0.123 ±0.01 g, N = 14), og ubehandlet (0.149 ± 0,01 g, N = 18) grupper. Den vigtigste effekt for Pollen kilde (F1,28 = 56.30, P < 0,001) viste en betydelig forskel mellem larverne rejst på vært pollen (0.170 ± 0,01 g, N = 16) og ikke-vært pollen (0,105 ±0.01 g, N = 16) . Bonferroni korrigeret Post-hoc sammenligninger angivet at prepupal biomasse ikke varierer betydeligt mellem fungicid behandlet og ubehandlet grupper rejst på værten (P = 0,22) og ikke-vært (P = 0,08) pollen. Dog prepupal biomasse var signifikant højere blandt larver rejst på vært pollen i forhold til ikke-vært pollen for begge fungicid behandlet (P < 0,001) og ubehandlet (P < 0,001) pollen. Interaktion effekt (fungicid eksponering × Pollen kilde) var ikke signifikant (F1,28 = 0.132, P = 0.72). Figur 5 og figur 6 er grafiske repræsentationer af resultaterne fra de ovennævnte analyse. Uafhængige prøver t-test viste en signifikant effekt af pollen kilde på larve efterladte (N = 18, t9 =-2.45, P =0,04).

Figure 5
Figur 5. Søjlediagrammet viser målinger for larver fitness baseret på larve udviklingsmæssige tid og prepupal biomasse. Larve fitness metrics er grupperet baseret på (A) og (B) Pollen kilde; og (C) og (D) fungicid eksponering. (Gennemsnit ± 1 SE). P < 0,001 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Interaktion plot for larver fitness målinger. Interactive virkningerne af fungicid eksponering og Pollen kilde på (A) larve udviklingsmæssige tid, og (B) prepupal biomasse. (Gennemsnit ± 1 SE). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Pearsons korrelation blev brugt til at undersøge forholdet mellem larve udviklingsmæssige tid og prepupal biomasse (figur 7). En signifikant negativ korrelation blev noteret på tværs af alle behandlingsgrupper (r =-0.83, P < 0,001, N = 32), og på tværs af fungicid behandlinger (ingen fungicid: r =-0.76, P < 0,001, N = 18; Fungicid: r =-0.92, P < 0,001, N = 14). Mens der var en signifikant negativ korrelation til larver rejst på ikke-vært pollen (r =-0.64, P < 0,01, N = 16), ingen sådanne forhold blev observeret for larver rejst på host-pollen (r =-0.01, P = 0,98, N = 16).

Figure 7
Figur 7. Forholdet mellem larve udviklingsmæssige tid og prepupal biomasse. Pearson korrelation mellem udviklingsmæssige tid og prepupal biomasse på tværs af (A) alle behandlingsgrupper (P < 0,001) (B) Pollen kilde (vært pollen: P = 0,98, Non-vært pollen: P < 0,01); (C) fungicid eksponering (ingen fungicid: P < 0,001, fungicid: P < 0,001). Paneler er (B) og (C), tendenslinjer farve-matchede med symbolerne i figur forklaringen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1
Animeret figur 1. Femte fase larve instar af O. ribifloris inden for et enkelt godt af en multiwell plade. Larve bemærkes, at er begyndt spinning en silken kokon som forberedelse til pupation. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Opdræt bier uden for deres naturlige nesting siv, under laboratorieforhold, giver mulighed for afprøvning af flere hypoteser vedrørende larve fitness. At uidentificerede faktorer fortsat forårsage bidødelighed, risiko vurdering undersøgelser kan ved hjælp af in vitro- eksperimenter hjælpe identificere potentielle trusler og informere forvaltningspraksis for denne artsrige gruppe af vilde bestøvere 12 ,38,49,76,81,82.

Generelt er kortere udviklingsmæssige gange og højere prepupal biomasse forbundet med højere larve fitness. På tværs af alle behandlinger, var varighed af larve udvikling negativt korreleret med prepupal biomasse. Men der var betydelige forskelle mellem varigheden af larve udvikling og prepupal biomasse på tværs af de fire grupper. Larver, der ikke har modtaget nogen fungicider og fik lov til at forbruge vært pollen havde den korteste larve udviklingsmæssige tid, og højeste prepupal biomasse. Derimod de larver, der forbruges fungicid behandlet ikke-vært pollen, tog den længste til komplet larve udvikling, og havde den laveste prepupal biomasse. Tendenser for larver efterladte var dog mindre klar, med dødelighed at blive bemærket kun for gruppen fungicid behandlet rejst på vært pollen. Deconstructing main og interaktion virkningerne af fungicid eksponering og Pollen kilde afslørede at: (i) den vigtigste virkning af forbrugende fungicid behandlet pollen havde en betydelig negativ indvirkning på prepupal biomasse, men ikke larver udviklingsmæssige varighed. Mens en tidligere undersøgelse har påvist akut oral toksicitet i voksen Osmia ved højere koncentrationer, tyder disse resultater på, at oral eksponering for propiconazol ved langt lavere koncentration kan påvirke fitness ved at reducere prepupal biomasse23 . (ii) den vigtigste effekt af forbrugende ikke-vært pollen har en negativ virkning på larve fitness. Disse resultater er konsistente med tidligere offentliggjorte undersøgelser, der tyder på pollen kvalitet (dvs. tilstedeværelse af toksiner, beskyttende stoffer, mangel på essentielle næringsstoffer), og forskelle i bee fysiologi kan begrænse bier i at udnytte ikke-vært pollen68 . Det er også sandsynligt, at fraværet af gavnlige mikrobiota typisk erhverves fra vært-pollen og/eller bee afgrøde kan forværre denne effekt. (iii) der var ingen betydelig interaktion mellem fungicid eksponering og Pollen kilde på larve fitness. På tværs af både fungicid behandlet og ubehandlet grupper havde larver forbrugende ikke-vært pollen betydeligt lavere prepupal biomasse og længere larve udviklingsmæssige tid i forhold til larver rejst på vært pollen. Uanset pollen kilde havde larver forbrugende fungicid behandlet bestemmelser signifikant lavere prepupal biomasse i forhold til larver rejst på ubehandlet pollen. Bortset fra de betydelige vigtigste virkninger, interaktive virkningen af begge faktorer i overensstemmelse med den additive model, dvs., de negative virkninger af fungicid eksponering og pollen type larve fitness var ikke synergistisk. Usikkerhed som følge af samspillet mellem forskellige faktorer, der påvirker biers sundhed (nemlig indgåendeher ovre), begrænse effektiviteten af bestøver forvaltningsstrategier. Ved at hjælpe forudsige de interaktive effekter af flere risikofaktorer, kan resultater fra lignende laboratoriebaserede eksperimenter hjælpe omgå denne mangeårige udfordring i bee bevarelse indsats.

Der er flere vigtige skridt i denne protokol, der kan påvirke resultatet af eksperimentet. Når det er muligt, er det tilrådeligt at bruge økologisk pollen, der er fri for pesticidrester. Ved hjælp af pollen fra ukendte kilder øger risikoen for kontaminering med forskellige agrokemikalier, som kan forvirre eksperimentelle resultater. Det er vigtigt at få frisk sat Osmia nesting siv, således at kun unhatched æg eller meget unge larver er anvendt i undersøgelsen. Dette sikrer, at larverne er rejst næsten udelukkende på den tilsigtede pollen behandling type. Den nesting reed bør blive dissekeret ved hjælp af en lavvandet indsnit, som pollen bestemmelser og æg kan blive beskadiget under høsten. Når æggene er blevet fjernet skal de håndteres forsigtigt for at forebygge skader og bevaret i veje både i en cool mørke hygiejnisk miljø (fx, biosikkerhed kabinet), indtil de overføres. Denne bedrift tid bør holdes på et minimum (< 30 min.) at sikre, at kvaliteten af ægget ikke bringes i fare. Alle procedurer bør udføres i en biosikkerhed kabinet til at sikre et rent arbejdsmiljø og reducere risikoen for forurening. For at sikre deres effektivitet, kun bruge frisklavede fungicid løsninger til behandlinger. Pollen er hydrofobe, fungicid løsning / sterilt vand bør indføres i depression inden for pollen bestemmelser. Dette maksimerer mængden af flydende trænger gennem tilvejebringelse. Det er dog vigtigt, at depressionen ikke punkteres hele dybden af bestemmelsen, da det ville resultere i tab af volumen fra løsning overholde kapsel gulvet. Individuelle behandlinger og kontrol bør foretages i separate godt plader til at reducere risikoen for krydskontaminering fra flygtige forbindelser og/eller pollen-bårne mikrobiota. Stykker af foldede bånd skal knyttes til kanten af pladen at give tilstrækkelig luftmellemrummet når lågene er på plads. Under daglige observationer, skal pladerne håndteres forsigtigt for at minimere forstyrrelser at larverne. Undersøgelser skal foretages under mikroskop med minimum lysintensitet, og lågene bør ikke fjernes, medmindre at kassere døde larver. I tilfælde af uventede udbredte dødelighed, skal både larver og deres pollen bestemmelser inspiceres visuelt for at kontrollere for tegn på infektion og angreb. Godt pladerne indeholdende de kompromitterede replikater bør straks kasseres, arbejdsområdet desinficeres, og værktøjer steriliseret til at forhindre spredning af infektionen.

Uanset dets vidtrækkende program er der visse begrænsninger for denne metode. For eksempel, mens det er bedste praksis at bruge økologisk pollen når det er muligt, er at hæve planter inden for en drivhus indstilling til at give tilstrækkelige mængder af ren uforurenet pollen logistisk uoverkommelige. I sådanne tilfælde kan vilde-indsamlet pollen anvendes, forudsat at det er screenet for forekomst af pesticidrester. En anden strategi til at reducere risikoen for forurening, når du bruger wild-indsamlet pollen er at opnå pollen fra en kilde, der er mindre tilbøjelige til at have været sprøjtet (fxuberørte uforstyrret områder ligger langt fra landbruget gårde). Den vært pollen, som bruges i denne undersøgelse blev indhentet fra nesting siv, der var placeret i naturlige skove og overdrev omkring foden af Wasatch nær Kaysville, Utah. Givet at dette område er domineret af vilde, ikke-administreret naturlige skove langt fra enhver kommerciel landbrugsområder, og at disse bier ikke flyve så langt som honningbier når fouragering83,84,85, det er ekstremt usandsynligt at pollen indsamlet de ønsker er blevet sprøjtet. Således er pesticidrester i pollen indsamlet her tilbøjelige til at være trivielt. Fouragere i disse vilde landskaber, er den voksne kvindelige mindre tilbøjelige til at opstå forurenet pollen, mindske risikoen for eksponering blandt larver. Den kommercielt købt honningbien pollen, som bruges i denne undersøgelse er indsamlet fra naturlige skovområder i det nordlige Wisconsin og Michigan. Markedsføres til konsum, angiver offentligt tilgængelige oplysninger og personlig kommunikation med leverandøren, at bistaderne ikke er kemisk behandlet, og pollen er solgt i sin naturlige, rå form uden nogen ændringer86. Derfor er det rimeligt at antage, at forurenende last i kommercielt købt honningbien pollen ville være minimal. For undersøgelser, der ikke opnår pollen fra ikke-administreret områder med vilde naturlige vegetation, er det tilrådeligt at have direkte empiriske beviser fra pollen kemi analyse til at sikre, at pollen, som bruges i risiko assays forurenende gratis. En anden begrænsning indebærer påfund indført af den kunstige opdræt miljø. Trods for bedste indsats, det er ikke logistisk muligt at kopiere den nøjagtige mikromiljø inden for en naturlig nesting reed (fx., fugt, iltkoncentration, tre-dimensionelle struktur af individuelle kamre), som kan påvirke larve Fitness til ukendt grader. Defensibly simulere Karakteristik af den naturlige kost, skal foreløbige data fra nesting rørene indhentes forud for in vitro- kost manipulation undersøgelser. Selv om den ikke-vært pollen, som bruges i denne undersøgelse stammer fra områder, hvor Oregon drue er fraværende eller sjældne87, kan der være spor af vært pollen blandet inden for kommercielt købt pollen, potentielt påvirker resultaterne. En anden ulempe ved denne teknik er, at håndtering af stress under forsøgsperioden kan forårsage uønskede virkninger på bier. Endelig, mens det er almindeligt at støde unhatched æg i naturen63, under laboratorieforhold det er vanskeligt at fastslå, om den manglende at klække var på grund af håndtering af stress, eksperimentel behandling eller et resultat af naturlige årsager. Da disse faktorer kan introducere ukendte grader af bias i undersøgelsen, skal man bruge forsigtig mens fortolkningen af resultaterne.

Ved at kontrollere for faktorer, der kan beviseligt bias eksperimentelle resultat (fx maternel fouragering effektivitet75, sex-specifikke variationer77og kosten pollen68,72), beskrives protokollen giver væsentlige forbedringer over tidligere offentliggjort teknikker76, og tilbyder en fastere rammer for hypoteser test. For eksempel, ved hjælp af in vitro--opdrættet bier tillader undersøgelser af sex-specifikke svar til xenobiotiske behandling, som ellers ville være en udfordring for at studere blandt vilde populationer af hulrum nesting bier49,88. Mulighederne for at manipulere og afprøvning flere interagerende faktorer (f.eks.kost kvalitet og mængde, kost-associerede mikrobiota, eksponering for pesticider, synergistiske), kan give værdifuld indsigt i de vigtigste determinanter for bi fitness. Fleksibiliteten i protokollen let tillader ændringer (f.eks. ved hjælp af forskellige størrelse godt plader til at rumme larver af varierende størrelser, ændring af type og mængde af kost), hvilket gør den modtagelig for brug sammen med flere andre arter af ensomme bier og hvepse 76. samtidig med denne undersøgelse vurderes egnethed baseret på udvikling og efterladte på stadiet fodring, insekter kan blive udruget indtil fremkomsten at opnå yderligere data om fremkomsten sats, mad til kroppen konvertering og efter fremkomsten levetid 49. disse oplysninger kan hjælpe med at vurdere de subletale virkninger af behandlinger i toksicitet assays. Med stigende interesse i funktionen af pollen-microbiome, kan laboratorie-baserede studier identificere følsomme versus resistente bee arter baseret på deres pollen mikrobiota71. Forskelle i fungicid modtagelighed på tværs af bee grupper kan udforskes af sekventering mikrobiota inden for hive-gemt pollen. Dette kan hjælpe fastslå rolle af pollen microbiome i giver varierende grader af modstand mod xenobiotiske stressfaktorer. Fremtidige undersøgelser kan også hjælpe med at identificere forskelle mellem den naturlige mikrobiota vært og ikke-vært pollen, som kan tjene som en grundlæggende faktor kørsel oligolectic adfærd inden for udvalgte bee arter.

In vitro- opdræt af larve ensomme bier kan hjælpe med at kontrollere for den naturlige variabilitet oplevet i naturen, dermed skildrer rollen af individuelle og interagerende faktorer, der påvirker bee fitness. Denne tilgængelig og billig teknik udvider entomologists' toolkit af giver mulighed for manipulation af flere parametre, som nemt kan redigeres til adresse specifikke forskningsmål. Hvis beviser fra in vitro- eksperimenter kan hjælpe med at identificere udsatte befolkninger, vil indvirkningen på bee bevarelsesstrategier være betydelige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Kimball Clark og Tim Krogh for at levere Osmia nesting siv, Meredith Nesbitt og Molly Bidwell for bistand i laboratoriet, Drs. Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter og tre anonym korrekturlæsere for deres nyttige bemærkninger, at forbedret håndskriftet. Dette arbejde blev støttet af USDA-Agricultural Research Service bevilgede midler (nuværende forskning informationssystem #3655-21220-001), Wisconsin Landbrugsministeriet, handel og forbrugerbeskyttelse (#197199), National Science Foundation (under Grant nr. DEB-1442148), DOE Great Lakes bioenergi Research Center (DOE kontor for videnskab BER DE-FC02-07ER64494).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reeds Nativebees.com NA Freshly plugged reeds
Dissection set VWR 89259-964 Sterilize before use
Long Nose Pliers Husky 1006
6 well culture plates VWR 10062-892 Sterile sealed
48 well culture plates VWR 10062-898 Sterile sealed
Petri dishes VWR 25373100 Sterile sealed
Square Weighing Boats VWR 10770-448
Camel Hair Brush Bioquip 1153A
Tin capsules EA Consumables D1021 Sterilize before use
Sucrose VWR 470302-808
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Honey bee pollen Bee energised 897098001244 Untreated, natural, raw pollen
Microbalance VWR 10204-990
Pulverisette LAB SYNERGY INC. 30334913
Wooden sticks VWR 470146908 Sterilize before use
Sealing tape VWR 89097-912
Microscope VWR 89403-384
Planting tray VWR 470150-632
Ethanol VWR BDH1158-4LP
Centrifuge tube VWR 21008936
Microsyringe Cole-Palmer UX-07940-07
Rubber tweezer Amazon B0135HWPN4
Syringe needles VWR 89219-334
Freeze drier Labcono LFZ-1L
Statistical software SPSS Version 21.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klein, A. -M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. P Roy Soc Lond B Bio. 274 (1608), 303-313 (2007).
  2. Biesmeijer, J. C. J., et al. Parallel declines in pollinators and insect-pollinated plants in Britain and the Netherlands. Science. 313 (5785), 351-354 (2006).
  3. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evol. 25 (6), 345-353 (2010).
  4. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. P Natl Acad Sci USA. 108 (2), 662-667 (2011).
  5. Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissière, B. E. Economic valuation of the vunerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecol Econ. 68 (3), 810-821 (2009).
  6. Fontaine, C., Dajoz, I., Meriguet, J., Loreau, M. Functional diversity of plant-pollinator interaction webs enhances the persistence of plant communities. Plos Biol. 4 (1), 0129-0135 (2006).
  7. Kluser, S., Peduzzi, P. Global pollinator decline: a literature review. , UNEP/GRID Europe. (2007).
  8. Brown, M. J. F., Paxton, R. J. The conservation of bees: a global perspective. Apidologie. 40 (3), (2009).
  9. Lebuhn, G., et al. Detecting insect pollinator declines on regional and global scales. Conserv Biol. 27 (1), (2013).
  10. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. , Suppl 103. S80-S95 (2010).
  11. Pettis, J. S., Delaplane, K. S. Coordinated responses to honey bee decline in the USA. Apidologie. 41 (3), 256-263 (2010).
  12. Sandrock, C., Tanadini, L. G., Pettis, J. S., Biesmeijer, J. C., Potts, S. G., Neumann, P. Sublethal neonicotinoid insecticide exposure reduces solitary bee reproductive success. Agr Forest Entomol. 16 (2), (2014).
  13. Van der Sluijs, J. P., Simon-Delso, N., Goulson, D., Maxim, L., Bonmatin, J. M., Belzunces, L. P. Neonicotinoids, bee disorders and the sustainability of pollinator services. Curr Opin Env Sust. 5 (3), (2013).
  14. Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), (2015).
  15. Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity - USA. Apidologie. 41 (3), (2010).
  16. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
  17. Glavan, G., Bozic, J. The synergy of xenobiotics in honey bee Apis mellifera: mechanisms and effects. Acta Biol. Slov. 56, 11-27 (2013).
  18. Biddinger, D. J., et al. Comparative toxicities and synergism of apple orchard pesticides to Apis mellifera (L.) and Osmia cornifrons (Radoszkowski). PLoS ONE. 8 (9), e72587 (2013).
  19. Thompson, H. M., Fryday, S. L., Harkin, S., Milner, S. Potential impacts of synergism in honeybees (Apis mellifera) of exposure to neonicotinoids and sprayed fungicides in crops. Apidologie. 45 (5), 545-553 (2014).
  20. Jansen, J. -P., Lauvaux, S., Gruntowy, J., Denayer, J. Possible synergistic effects of fungicide-insecticide mixtures on beneficial arthropods. IOBC-WPRS Bulletin. 125, 28-35 (2017).
  21. Robinson, A., Hesketh, H., et al. Comparing bee species responses to chemical mixtures: Common response patterns? PLoS ONE. 12 (6), (2017).
  22. Sgolastra, F., Medrzycki, P., et al. Synergistic mortality between a neonicotinoid insecticide and an ergosterol-biosynthesis-inhibiting fungicide in three bee species. Pest Management Science. 73 (6), 1236-1243 (2017).
  23. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  24. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PloS one. 5 (3), e9754 (2010).
  25. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PloS one. 8 (7), e70182 (2013).
  26. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  27. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PloS one. 9 (1), e77547 (2014).
  28. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  29. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. P Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1809), 20150299-20150299 (2015).
  30. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  31. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J Exp Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  32. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), e0135688 (2015).
  33. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pestic Biochem Phys. 51 (1), 1-11 (1995).
  34. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of pyrethroid insecticide toxicity to honey bees (Hymenoptera: Apidae) by cytochrome P450 monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (4), 1046-1050 (2006).
  35. Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L. A., Currie, C. R., Zalapa, J. E., Hittinger, C. T. Empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health. JoVE. (128), e54631 (2017).
  36. Batra, S. W. T. Solitary bees. Sci Am. 250 (2), 120-127 (1984).
  37. Linsley, E. G. The ecology of solitary bees. Hilgardia. 27 (19), 543-599 (1958).
  38. Garibaldi, L. A., et al. Wild Pollinators Enhance Fruit Set of Crops Regardless of Honey Bee Abundance. Science. 339 (6127), 1608-1611 (2013).
  39. Bosch, J., Kemp, W. P. How to manage the blue orchard bee. , Sustainable Agriculture Network. Washington, DC. (2001).
  40. Keller, A., Grimmer, G., Steffan-Dewenter, I. Diverse microbiota identified in whole intact nest chambers of the red mason bee Osmia bicornis (Linnaeus 1758). PLoS ONE. 8 (10), e78296 (2013).
  41. Bosch, J., Kemp, W. P. Development and Emergence of the Orchard Pollinator Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae). Environmental Entomology. 29 (1), 8-13 (2000).
  42. Brittain, C., Potts, S. G. The potential impacts of insecticides on the life-history traits of bees and the consequences for pollination. Basic and Applied Ecology. 12 (4), 321-331 (2011).
  43. Arena, M., Sgolastra, F. A meta-analysis comparing the sensitivity of bees to pesticides. Ecotoxicology. 23 (3), 324-334 (2014).
  44. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Foraging and nesting behavior of Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae) in the presence of fungicides: cage studies. J Econ Entomol. 101 (3), 647-653 (2008).
  45. Huntzinger, A. C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide tests on adult alfalfa leafcutting bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  46. Tsvetkov, N., et al. Chronic exposure to neonicotinoids reduces honey bee health near corn crops. Science. 356 (6345), 1395-1397 (2017).
  47. Mao, W., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Disruption of quercetin metabolism by fungicide affects energy production in honey bees (Apis mellifera). P Natl Acad Sci. 114 (10), 2538-2543 (2017).
  48. Blacquière, T., Smagghe, G., Van Gestel, C. A. M., Mommaerts, V. Neonicotinoids in bees: A review on concentrations, side-effects and risk assessment. Ecotoxicology. 21 (4), 973-992 (2012).
  49. Sgolastra, F., Tosi, S., Medrzycki, P., Porrini, C., Burgio, G. Toxicity of spirotetramat on solitary bee larvae, Osmia cornuta (Hymenoptera: Megachilidae), in laboratory conditions. Journal of Apicultural Science. 59 (2), 73-83 (2015).
  50. Mader, E., Spivak, M., Evans, E. Managing Alternative Pollinators. , Sustainable Agriculture Research and Education (SARE), US Dept. of Agriculture. (2010).
  51. Bosch, J., Kemp, W. P. Developing and establishing bee species as crop pollinators: the example of Osmia spp.(Hymenoptera: Megachilidae) and fruit trees. B Entomol Res. 92 (1), 3-16 (2002).
  52. Sampson, B. J., Rinehart, T. A., Kirker, G. T., Stringer, S. J., Werle, C. T. Phenotypic variation in fitness traits of a managed solitary bee, Osmia ribifloris (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 108 (6), 2589-2598 (2015).
  53. Sampson, B. J., Cane, J. H., Kirker, G. T., Stringer, S. J., Spiers, J. M. Biology and management potential for three orchard bee species (Hymenoptera: Megachilidae): Osmia ribifloris Cockerell, O. lignaria (Say) and O.chalybea Smith with emphasis on the former. Acta Hort. 810, 549-555 (2009).
  54. Hladik, M. L., Vandever, M., Smalling, K. L. Exposure of native bees foraging in an agricultural landscape to current-use pesticides. Sci Total Environ. 542, 469-477 (2016).
  55. Long, E. Y., Krupke, C. H. Non-cultivated plants present a season-long route of pesticide exposure for honey bees. Nat Commun. 7, (2016).
  56. Krupke, C. H., Hunt, G. J., Eitzer, B. D., Andino, G., Given, K. Multiple routes of pesticide exposure for honey bees living near agricultural fields. PLoS ONE. 7 (1), e29268 (2012).
  57. Stoner, K. A., Eitzer, B. D. Using a hazard quotient to evaluate pesticide residues detected in pollen trapped from honey bees (Apis mellifera) in Connecticut. PLoS ONE. 8 (10), e77550 (2013).
  58. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  59. Steffan-Dewenter, I., Klein, A. -M., Gaebele, V., Alfert, T., Tscharntke, T. Bee diversity and plant-pollinator interactions in fragmented landscapes. Specialization and generalization in plant-pollinator interactions. , 387-410 (2006).
  60. Kremen, C., Ricketts, T. Global perspectives on pollination disruptions. Conserv Biol. 14 (5), 1226-1228 (2000).
  61. Memmott, J., Waser, N. M., Price, M. V. Tolerance of pollination networks to species extinctions. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1557), 2605-2611 (2004).
  62. Spear, D. M., Silverman, S., Forrest, J. R. K. Asteraceae pollen provisions protect Osmia mason bees (Hymenoptera: Megachilidae) from brood parasitism. The American Naturalist. 187 (6), 797-803 (2016).
  63. Rust, R. W. Biology of Osmia (Osmia) ribifloris Cockerell (Hymenoptera: Megachilidae). J Kansas Entomol Soc. 59, 89-94 (1986).
  64. Torchio, P. F. Osmia ribifloris, a native bee species developed as a commercially managed pollinator of highbush blueberry (Hymenoptera: Megachilidae). J Kansas Entomol Soc. 63 (633), 427-436 (1990).
  65. Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees - A risk assessment. PLoS ONE. 9 (4), e94482 (2014).
  66. Kasiotis, K. M., Anagnostopoulos, C., Anastasiadou, P., Machera, K. Pesticide residues in honeybees, honey and bee pollen by LC-MS/MS screening: Reported death incidents in honeybees. Sci Total Environ. 485 (1), 633-642 (2014).
  67. Stanley, J., Sah, K., Jain, S. K., Bhatt, J. C., Sushil, S. N. Evaluation of pesticide toxicity at their field recommended doses to honeybees, Apis cerana and A. mellifera through laboratory, semi-field and field studies. Chemosphere. 119, 668-674 (2015).
  68. Praz, C. J., Müller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen? Ecology. 89 (3), 795-804 (2008).
  69. Sedivy, C., Müller, A., Dorn, S. Closely related pollen generalist bees differ in their ability to develop on the same pollen diet: Evidence for physiological adaptations to digest pollen. Funct Ecol. 25 (3), 718-725 (2011).
  70. Williams, N. M. Use of novel pollen species by specialist and generalist solitary bees (Hymenoptera: Megachilidae). Oecologia. 134, (2003).
  71. Graystock, P., Rehan, S. M., McFrederick, Q. S. Hunting for healthy microbiomes: determining the core microbiomes of Ceratina, Megalopta, and Apis bees and how they associate with microbes in bee collected pollen. Conserv Genet. 18 (3), 1-11 (2017).
  72. Bosch, J., Vicens, N. Relationship between body size, provisioning rate, longevity and reproductive success in females of the solitary bee Osmia cornuta. Behav Ecol Sociobiol. 60 (1), 26-33 (2006).
  73. Bosch, J., Vicens, N. Body size as an estimator of production costs in a solitary bee. Ecol Entomol. 27 (2), 129-137 (2002).
  74. Radmacher, S., Strohm, E. Factors affecting offspring body size in the solitary bee Osmia bicornis (Hymenoptera, Megachilidae). Apidologie. 41 (2), 169-177 (2010).
  75. Seidelmann, K. Open-cell parasitism shapes maternal investment patterns in the Red Mason bee Osmia rufa. Behav Ecol. 17 (5), (2006).
  76. Becker, M. C., Keller, A. Laboratory rearing of solitary bees and wasps. Insect Science. 23 (6), 918-923 (2016).
  77. Bosch, J. The nesting behaviour of the mason bee Osmia cornuta (Latr) with special reference to its pollinating potential (Hymenoptera, Megachilidae). Apidologie. 25, 84-93 (1994).
  78. Krunić, M., Stanisavljević, L., Pinzauti, M., Felicioli, A. The accompanying fauna of Osmia cornuta and Osmia rufa and effective measures of protection. B Insectol. 58 (2), 141-152 (2005).
  79. Elliott, S. E., Irwin, R. E., Adler, L. S., Williams, N. M. The nectar alkaloid, gelsemine, does not affect offspring performance of a native solitary bee, Osmia lignaria (Megachilidae). Ecol Entomol. 33 (2), 298-304 (2008).
  80. Toby Mordkoff, J. The Assumption(s) of Normality. , Available from: http://www2.psychology.uiowa.edu/faculty/mordkoff/GradStats/part 1/I.07 normal.pdf (2016).
  81. Hendriksma, H. P., Härtel, S., Steffan-Dewenter, I. Honey bee risk assessment: New approaches for in vitro larvae rearing and data analyses. Methods Ecol and Evol. 2 (5), 509-517 (2011).
  82. Aupinel, P., et al. Improvement of artificial feeding in a standard in vitro method for rearing Apis mellifera larvae. B Insectol. 58 (2), 107-111 (2005).
  83. Beekman, M., Ratnieks, F. L. W. Long-range foraging by the honey-bee, Apis mellifera L. Funct Ecol. 14 (4), 490-496 (2000).
  84. Gathmann, A., Tscharntke, T. Foraging ranges of solitary bees. J Anim Ecol. 71 (5), 757-764 (2002).
  85. Greenleaf, S. S., Williams, N. M., Winfree, R., Kremen, C. Bee foraging ranges and their relationship to body size. Oecologia. 153 (3), 589-596 (2007).
  86. Bee Pollen Supplement - Bee Rescued. , Available from: https://beerescued.com/product/bee-rescued-bee-pollen-supplement/ (2018).
  87. Holly-Leaf Oregon-Grape (Mahonia aquifolium) Species Details and Allergy Info, Teton county, Wyoming. , Available from: http://www.pollenlibrary.com/Local/Specie/Mahonia+aquifolium/in/Teton County/WY/ (2018).
  88. Cane, J. H., Griswold, T., Parker, F. D. Substrates and Materials Used for Nesting by North American Osmia Bees (Hymenoptera: Apiformes: Megachilidae). Annals of the Entomological Society of America. 100 (3), 350-358 (2007).

Tags

Miljøvidenskab sag 137 bee tilbagegang kost manipulation fungicid eksponering pollen præference larve fitness mason bier
<em>In Vitro</em> Opdræt af ensomme bier: et værktøj til vurdering af larve risikofaktorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dharampal, P. S., Carlson, C. M.,… More

Dharampal, P. S., Carlson, C. M., Diaz-Garcia, L., Steffan, S. A. In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors. J. Vis. Exp. (137), e57876, doi:10.3791/57876 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter