Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

In Vitro Stell av enslig bier: et verktøy for å vurdere larver risikofaktorer

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57876

Summary

Soppdreper sprayer på blomstrende planter kan utsette ensom bier til høye konsentrasjoner av pollen-borne soppdreper rester. Bruke laboratorie-baserte eksperimenter i vitro-reared bee larvene, denne studien undersøker de interaktive effektene av forbruker soppdreper-behandlet pollen avledet fra verten og ikke-vert.

Abstract

Selv om enslig bier gi avgjørende pollinering tjenester for vill og administrerte avlinger, er artsrike gruppen stort sett oversett i plantevernmidler regulering studier. Risikoen for eksponering for soppdreper rester er sannsynlig å være spesielt høy hvis spray oppstår på eller nær Salix mens biene samler pollen for å klargjøre reiret. For arter av Osmia som bruker pollen fra en utvalgt gruppe av planter (oligolecty), kan kan bruke pollen fra ikke-Salix øke deres risikofaktor for soppdreper-relaterte toksisitet. Dette manuskriptet beskriver protokoller som brukes til vellykket bakre oligolectic mason bier, Osmia ribifloris sensu lato, fra egg til skallet scenen i celle kultur plater under standardisert laboratorieforhold. Den i vitro-reared bier brukes senere til å undersøke virkningene av soppdreper eksponering og pollen kilde på bee fitness. Eksperimentet basert på en 2 × 2 fullt krysset faktoriell design, og undersøker viktigste og interaktive effekter av soppdreper eksponering og pollen kilde på larver fitness, kvantifisert ved skallet biomasse og larver utviklingsmessige tid survivorship. En stor fordel av denne teknikken er som bruker i vitro-reared bier reduserer naturlig bakgrunn variasjon og tillater samtidig manipulering av flere eksperimentelle parametere. Beskrevet protokollen presenterer et fleksibelt verktøy for hypoteser testing som involverer suite av faktorer som påvirker bee helse. For bevaring innsats for å bli møtt med betydelig, varig suksess, slik innsikt i det komplekse samspillet mellom fysiologiske og miljømessige faktorer kjøring bee synker vil vise seg for å være avgjørende.

Introduction

Gitt sin rolle som den dominerende gruppen av insekter pollinatorer1, utgjør globale tap bee bestander en trussel mot matsikkerhet og økosystem stabilitet2,3,4,5,6 ,7. Synkende trender både administrerte og vill bee bestander har blitt tilskrevet flere delte risikofaktorer inkludert habitat fragmentering, nye parasitter og patogener, tap av genetisk mangfold og innføring av invasiv Art3 ,4,7,8,9,10,11,12. Spesielt har den dramatiske økningen i bruk av plantevernmidler, (f.eks neonicotinoids) vært direkte knyttet til skadevirkninger blant bier13,14,15. Flere studier har vist at synergism mellom neonicotinoids og ergosterol-biosyntesen-hemmende (EBI) soppmidler kan føre til høy dødelighet over flere bee arter16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. likevel fungicides, lenge regnet som 'bee-pengeskap', fortsette å sprayes på-bloom avlinger uten mye gransking23. Foraging bier er dokumentert å rutinemessig bringe tilbake pollen laster forurenset med soppdreper rester24,25,26. Forbruket av slike soppdreper-ladenpollen kan forårsake høy dødelighet blant larver bier27,28,29,30og en rekke sub dødelig effekt blant voksne bier16 , 31 , 32 , 33 , 34. en fersk undersøkelse viser at soppmidler kan forårsake bee tap ved å endre det mikrobielle samfunnet i strukturen lagret pollen, dermed forstyrre de kritiske symbioses mellom bier og pollen-borne mikrober35.

Selv om enslig bier er avgjørende for pollinering av flere vill og landbruket36,37,har38, denne mangfoldige gruppen av pollinators fått mye mindre oppmerksomhet i plantevernmidler overvåking studier. Nest av en voksen enslig kvinne inneholder 5-10 forseglet Foreldreomsorg og yngelens chambers, hver utstyrt med en begrenset mengde moderskap samlet pollen og nektar, og en enkelt egg39. Etter klekking avhengige Larvene tilordnede pollen bestemmelsen, og de tilknyttede pollen-borne bakterieflora å få tilstrekkelig ernæring40,41. Fordi de mangler fordelene av en sosial livsstil, kan ensom bier være mer utsatt for plantevernmidler eksponering42. For eksempel, mens underskudd i sosiale bier etter en spray kan bli kompensert for noen utvide av arbeidere og nye Foreldreomsorg og yngelens, at en enkelt voksen enslig kvinne ender alle reproduktive aktivitet43. Slike forskjeller i mottakelighet markere måtte innlemme mangfoldig bee taxa i økotoksikologiske studier å sikre tilstrekkelig beskyttelse for både administrerte og wild bier. Men bortsett fra en håndfull studier, etterforskning virkningene av soppdreper eksponering har primært fokusert på sosial bier18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.

Enslig bier tilhører slekten Osmia (figur 1) har blitt brukt verden over som effektiv pollinators av flere viktige frukt og mutter avlinger39,50,51,53, 53. som med andre administrerte pollinator grupper24,,54,,55,,56,,57,,58, voksen Osmia biene er rutinemessig utsatt for soppmidler sprayet på i bloom avlinger44. Voksne hunner beite på nylig sprayet avlinger kan samle og aksje deres Foreldreomsorg og yngelens kamre med soppdreper-laden pollen, som senere er den eneste dietten for utvikle larvene. Forbruker forurenset pollen bestemmelsene kan senere utsette Larvene til soppdreper rester42. Risikoen for eksponering kan være høyere blant oligolectic arter som grovfôr bare på noen nært beslektede vert planter59,60,61. Visse megachilid bier, vises for eksempel å fortrinnsvis forage for lav kvalitet Asteraceae pollen, som et middel til å redusere parasitism62. Men har omfanget som soppmidler påvirke larver fitness blant oligolectic ensom bier ikke vært empirisk kvantifisert. Målet med denne studien er å utvikle en protokoll for å teste viktigste interaktive effekter av soppdreper eksponering og pollen på fitness in vitro oppdratt ensom bier. For å undersøke, egg av O. ribifloris sensu lato (SL) kan skaffes kommersielt (tabell av materialer). Denne befolkningen er ideelle på grunn av dens betydning som en innfødt pollinator og dens sterk forkjærlighet for nektar-rik Mahonia aquifolium (Oregon grape) funnet i den regionen53,63,64 (Figur 2).

Figure 1
Figur 1. En høyoppløst bilde av en voksen Osmia ribifloris. Foto kreditt Dr. Jim Cane, forskning entomolog, USDA-ARS Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Phragmite nesting siv av Osmia ribifloris (SL) med en hekkende kvinne i forgrunnen. Kammeret partisjoner og terminal plugger for siv er bygget inn blader. Foto kreditt Mr. Kimball Clark, NativeBees.com Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Det første målet av denne studien er å evaluere effekten av forbruker soppdreper-behandlet pollen på larver fitness (målt i utviklingstid og skallet biomasse). Mens eksponering for vanligvis anvendt soppdreper propiconazole har vært knyttet til økt dødelighet blant voksne bier over flere arter 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,66,67, dens innvirkning på larver bier er mindre kjent. Det andre målet av denne studien er å evaluere effekten av forbruker ikke vert pollen på larver fitness. Tidligere studier indikerer at larvene oligolectic bier mislykkes å utvikle når tvunget til å konsumere ikke vert pollen68. Slike resultater kan tilskrives variasjoner i bee fysiologi69, pollen biokjemi70og gunstig microbiome forbundet med naturlig pollen bestemmelsene71. Tredje målet med denne studien er å evaluere interaktive effekter av soppdreper behandling og kosttilskudd pollen på larver fitness.

Mange biologiske egenskaper inkludert mors kroppsstørrelse, er klargjør rente, foraging strategi og pollen antallet72,73,74,75 kjent for å påvirke larver fitness blant ensom bier. Disse faktorene kan innføre betydelig variasjon mellom Siv, som utgjør en utfordring i å utvikle forsvarlig eksperimentell design ved fastsetting larver helse. Videre, gitt at larver utvikling skjer i forseglet hekkende Siv, effekten av slike variasjoner på avkommet er vanskelig å visualisere og kvantifisert uten å bruke ikke-dødelige teknikker (Figur 3). For å overvinne denne utfordringen, er alle hypoteser i denne studien testet med larver oppdratt utenfor deres hekkende siv. Eksperimentell design representerer en fullt krysset 2 × 2 faktoriell set-ups, med hver faktor som består av 2 nivåer; Faktor 1: Soppdreper eksponering (soppdreper; Ingen soppdreper); Faktor 2: Pollen kilde (vert pollen, ikke vert pollen). Bier er hevet fra egg til skallet scenen i sterilt multiwell celle kultur plater under kontrollerte laboratorieforhold. Hver er godt individuelt lager med en standardisert pollen tilbud og en enkelt egg. Etter klekking Larven lever på tilordnede pollen i brønnen, fullfører larver utvikling og starter pupation. Tidligere studier har vist at uforklarlige dødelighet er lavere blant bier reist innen denne kunstig oppdrett miljø enn i vill49,76. Bruk av in vitro-reared bier har flere fordeler fremfor feltbaserte studier: 1) reduserer forvirrende effekten av naturlig variasjon og ukontrollert faktorer vanligvis assosiert med feltbaserte studier; 2) lar flere nivåer av manipulasjon for hver factor(s) rundt skal testes samtidig over behandlingsgrupper. 3) antall gjentak kan være forhåndsdefinert og eksperimentelle faktorer for hver replikere kan redigeres individuelt; 4) larver svar variabler kan lett visualisert og registrert uavhengig uten forstyrrende tilstøtende Larvene; 5) protokollen kan endres for å tilpasses mer komplekse eksperimentell design som involverer flere faktorer og svar variabler.

Figure 3
Figur 3. Innholdet i en naturlig hekkende siv av Osmia ribifloris (SL). Nærbilde av (A) en dissekert siv viser enkelte kammer, pollen bestemmelser, og partisjoner og (B) ferske høstet pollen bestemmelser og tilknyttede egg (angitt med en svart sirkel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. klargjør Propiconazole løsninger for soppdreper eksponering eksperimenter

  1. Forberede 0,1 x soppdreper løsning ved å løse opp passende mengder kjøpt kommersielt propiconazole 14,3% i sterilt vann dagen av eksperimentet. Sikre at eneste nylagde soppdreper løsningen brukes for alle behandlinger.
  2. Legge til 23 µL 0,1 x soppdreper løsning per gram av pollen bestemmelse å få maksimal konsentrasjon av propiconazole tidligere rapportert fra samlet bee pollen24 (0.361 PPM eller µg av virkestoffet g-1 av pollen).

2. harvest egg og vert Pollen bestemmelser fra Osmia siv

  1. Bruke steriliserte skalpell, dissekere fersk koblet hekkende siv av Osmia, dele den i to deler langs reed å utsette enkelte kammer.
    Merk: Hvert reir kan inneholde mellom 8 til 14 kamre og en enkelt egg i et kammer.
  2. Inspisere siv visuelt for å identifisere chambers som inneholder mannlige egg basert på tidligere publisert retningslinjer77. Bruk en sterilisert bøyd nål fjerne hver pollen bestemmelsen samt tilknyttede egg fra hekkende reed, og plasser i en ren veie båt.
  3. Forsiktig skille egg fra levering med en ren fine maling pensel og registrerer fersk vekten av pollen bestemmelsen og egg ved hjelp av en standard laboratorium balanse. Beregn den gjennomsnittlige vekten av mannlige pollen bestemmelsene.
  4. Utføre de påfølgende trinnene med minimum forsinkelse å redusere sjansene for skade til egg fra eksponering for overskridelse temperaturen og dehydrering.

3. forberedelse verten anlegget Pollen bestemmelser

  1. Visuelt inspisere moderskap samlet næringsplanten pollen gravd fra hekkende kammer å sikre at ingen parasitter er tilstede78. For å redusere potensielle mors skjevheter, Kombiner pollen bestemmelsene i en enkelt masse i et sterilt Petriskål og bland godt med en sterilisert nål.
  2. Dele kombinert massen i nye pollen bestemmelser, at vekten av hver rekonstituert bestemmelse er omtrent lik den gjennomsnittlige vekten av en naturlig tilordnede mannlige bestemmelse (mener ± SE, 0,35 ± 0,01 g, N = 42).
    Merk: Fordi Osmia sp. Tildeler mindre pollen bestemmelsene å mannlig avkom, dette resulterer i lavere kroppen vekter mannlige næringsplante sammenlignet med kvinner77. For å unngå en slik skjevhet som følge av sex-spesifikke forskjeller, bruk kun mannlige egg i forsøkene.

4. forberede ikke-verten anlegget Pollen bestemmelse

  1. Pulverisere kjøpt kommersielt honey bee samlet pollen til et fint pulver bruker en standard laboratorium ball-mølle.
  2. Basert på vanninnhold moderskap samlet vert pollen bestemmelser (~ 20%), hydrat pollen pulver med passende mengder 40% sterilisert sukker løsning79 og bland grundig danner en dough konsistens.
  3. Del i individuelle pollen massene, hver veier omtrent det samme som den gjennomsnittlige vekten av en naturlig tilordnede mannlige bestemmelse.
    Merk: Fuktighetsinnhold av moderskap samlet vert pollen bestemmelser kan standardiseres i før ved å sammenligne ferske og tørre vekten av pollen fra 30 tilfeldig valgt mannlige kamre80. For å få den tørr vekten, pollen bestemmelsene skal frysetørket i en lyophilizer (1,5 Pa 72 h).

5. klargjør Multiwell celle kultur plater

  1. Linje individuelle brønner av sterile 48-vel kultur plate med autoklaveres tinn kopper (5 × 9 cm). Ved hjelp av sterile pinsett, forsiktig flair ut overkanten av kapselen slik at det kan huse pollen bestemmelsen.
  2. Plass en enkelt masse vert eller ikke vert pollen bestemmelsen inne i tinn cup bruker sterilt verktøy basert på behandling gruppen.
    Merk: For å unngå kryss-kontaminering, bruke separate plater for behandling og kontroll grupper.

6. Legg soppmidler

  1. Gjøre en sentralt plassert depresjon i pollen massen bruker en steril trestav. Bruk en ny pinne for hver pollen bestemmelsen.
  2. Legge til passende mengder soppdreper løsning (for behandling) eller sterilt vann (for kontroller) i depresjon. Knip åpning av depresjonen ved hjelp av sterile pinsett for å minimere overflate kontakt mellom soppdreper / sterilt vann og egg.
  3. Sikre at faktoriell oppsettet av eksperimentell design enkeltarket som avbildet i skjematisk representasjon (Figur 4).

Figure 4
Figur 4. Skjematisk fremstilling av eksperimentelle. Eksperimentet representerer en fullt-krysset 2 × 2 faktoriell oppsett. Faktor 1 representerer soppdreper eksponering og består av 2 nivåer: (i) ingen soppdreper (N = 10), og (ii) soppdreper (N = 10). Faktor 2 representerer Pollen kilde og består av 2 nivåer: (i) vert pollen (N = 8), og (ii) ikke vert pollen (N = 8). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

7. bak og observere larver

  1. Plass en tilfeldig valgt mannlige egg på overflaten av pollen levering med en ren fine maling pensel. Når eggene har blitt plassert på samtlige bestemmelser, ombytte lokket av celle kultur plate, sikre med merking tape på hjørnene.
  2. Plasser godt platene på et rent brett og dekke det med en mørk klut til å hindre kontakt med lys. Sted en 6 vel plate som inneholder 30 mL sterilt vann i skuffen for å hindre uttørking. La inkubasjon skuffer uforstyrret inne en inkubator ved romtemperatur.
  3. Observere bra plater daglig under dissecting mikroskop uten å fjerne lokket på godt platene. Kontroller at larvene er i live ved å merke av for bevegelse. Hvis ingen bevegelse blir oppdaget, kast den tinn cup som inneholder døde larvene og gjenværende pollen bestemmelsen. Tillat alle overlevende Larvene å utvikle uforstyrret i godt platene til de når skallet scenen.
  4. Fjern Larven fra tinn cup når den når skallet fasen41. Bruk en børste til å rengjøre noen defekt fra silke kokongen. Forsiktig skjære gjennom silke kokongen bruker dissecting mikroskop og ekstra prepupa med gummi tang.
  5. Håndtere prepupa forsiktig for å sikre at verktøyene ikke pierce den myke kroppen. Post frisk vekten av prepupa (skallet biomasse) og utviklingsmessige tiden fra egg til skallet scenen (larver utviklingsmessige tid).
    Merk: Noen døde Larven skal kasseres umiddelbart for å hindre uønskede mikrobiell vekst på cadaver og leftover pollen bestemmelsen. Dette reduserer risikoen for smitte til gjenværende sunn larvene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Larver fitness ble kvantifisert tre beregninger (i) larver utviklingsmessige tid, (ii) skallet biomasse og (iii) prosent survivorship. En toveis VARIANSANALYSE ble gjennomført ved hjelp soppdreper eksponering (to nivåer: ingen soppdreper, soppdreper) og Pollen kilde (to nivåer: verten pollen, ikke vert pollen) som uavhengige variablene og larver utviklingsmessige tid som den avhengige variabelen. Det hovedavdeling bevirke for soppdreper eksponering (F1,28 = 1.24, P = 0.28) var ikke betydning mellom den soppdreper-behandlet (gjennomsnittlig ± SE) (28.14 ±1.98 d, N = 14), og ubehandlet (25.39 ± 1.65 d, N = 18) grupper. Det hovedavdeling bevirke for pollen kilde imidlertid angitt en betydelig forskjell mellom utviklingsmessige tid for Larvene reist på verten pollen (20.00 ± 0,50 d, N = 16) og ikke-vert pollen (33.19 ±0.81 d, N = 16) (F1,28 = 179.83, P < 0,001). Bonferroni korrigert Post-hoc sammenligninger indikerte at larver utviklingsmessige tid ikke varierer betydelig mellom soppdreper behandlet og ubehandlet grupper reist på verten (P = 0.57) og ikke-vert (P = 0,32) pollen. Larver utviklingsmessige tid var imidlertid betydelig kortere for Larvene reist på verten pollen sammenlignet med ikke-vert pollen både soppdreper-behandlet (P < 0,001) og ubehandlet (P < 0,001) pollen. Samhandling effekten (soppdreper eksponering × Pollen kilde) var ikke signifikant (F1,28 = 0.09, P = 0,77). Analysen ble gjentatt med skallet biomasse som den avhengige variabelen. Det hovedavdeling bevirke for soppdreper eksponering angitt en betydelig forskjell (F1,28 = 4.66, P = 0,04) mellom soppdreper-behandlet (0.123 ±0.01 g, N = 14), og ubehandlet (0.149 ± 0,01 g, N = 18) grupper. Det hovedavdeling bevirke for Pollen kilde (F1,28 = 56.30, P < 0,001) angitt en betydelig forskjell mellom Larvene reist på verten pollen (0.170 ± 0,01 g, N = 16) og ikke-vert pollen (0.105 ±0.01 g, N = 16) . Bonferroni korrigert Post-hoc sammenligninger indikerte at skallet biomasse ikke varierer betydelig mellom soppdreper behandlet og ubehandlet grupper reist på verten (P = 0.22) og ikke-vert (P = 0,08) pollen. Men skallet biomasse var signifikant høyere blant Larvene reist på verten pollen sammenlignet med ikke-vert pollen både soppdreper-behandlet (P < 0,001) og ubehandlet (P < 0,001) pollen. Samhandling effekten (soppdreper eksponering × Pollen kilde) var ikke signifikant (F1,28 = 0.132, P = 0.72). Figur 5 og figur 6 er grafiske fremstillinger av resultatene fra nevnte analysen. Uavhengige prøver t-test angitt en signifikant effekt av pollen kilde på larver survivorship (N = 18, t9 =-2.45, P =0,04).

Figure 5
Figur 5. Stolpediagrammet viser beregninger for larver fitness basert på larver utviklingsmessige tid og skallet biomasse. Larver fitness beregninger klynger basert på (A) og (B) Pollen kilde; og (C) og (D) soppdreper eksponering. (Gjennomsnittlig ± 1 SE). P < 0,001 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Samhandling plott for larver fitness beregninger. Interaktive effekter soppdreper og Pollen kilde (A) larver utviklingsmessige tid, og (B) skallet biomasse. (Gjennomsnittlig ± 1 SE). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Pearsons korrelasjon ble brukt til utforske forholdet mellom larver utviklingsmessige tid og skallet biomasse (figur 7). En betydelig negativ korrelasjon ble bemerket alle behandling grupper (r =-0.83, P < 0,001, N = 32), og over soppdreper behandlinger (ingen soppdreper: r =-0.76, P < 0,001, N = 18; Soppdreper: r =-0.92, P < 0,001, N = 14). Mens det var en betydelig negativ korrelasjon for Larvene reist på ikke-vert pollen (r =-0.64, P < 0,01, N = 16), ingen slike forhold var observert for Larvene reist på verten-pollen (r =-0.01, P = 0.98, N = 16).

Figure 7
Figur 7. Forholdet mellom larver utviklingsmessige tid og skallet biomasse. Pearson sammenheng mellom utviklingsmessige tid og skallet biomasse over (A) alle behandlingsgrupper (P < 0,001) (B) Pollen kilde (vert pollen: P = 0,98, ikke vert pollen: P < 0,01); (C) soppdreper eksponering (ingen soppdreper: P < 0,001, soppdreper: P < 0,001). Paneler er (B) og (C), trendlinjer farge-matchet med symboler i figur forklaringen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1
Animert figur 1. Femte scenen larver skikkelsen av O. ribifloris innen en enkelt godt av en multiwell plate. Larven er kjent å ha begynt å spinne en silken kokong i forberedelse til pupation. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oppdrett bier utenfor deres naturlige hekkende Siv, under laboratorieforhold, gjør testing av flere hypoteser knyttet til larver fitness. I den grad at uidentifisert faktorer fortsette å føre bee dødelighet, risiko vurdering studier kan bruker i vitro eksperimenter å identifisere potensielle trusler og informere ledelsesmetoder for denne artsrike gruppen av vill pollinators 12 ,,38,,49,,76,,81,,82.

Vanligvis er kortere utviklingsmessige ganger og høyere skallet biomasse assosiert med høyere larver fitness. Over alle behandlinger, ble varigheten av larver utviklingen negativt korrelert med skallet biomasse. Det var imidlertid betydelige forskjeller mellom varigheten av larver utviklingen og skallet biomasse over fire gruppene. Larver som mottok ikke noen soppmidler og fikk lov til å konsumere vert pollen hadde korteste larver utviklingsmessige tid og høyeste skallet biomasse. Derimot de Larvene som forbrukes soppdreper-behandlet ikke vert pollen, tok den lengste komplett larver utvikling, og hadde den laveste skallet biomassen. Trendene for larver survivorship var imidlertid mindre klar med dødelighet blir registrert bare for gruppen soppdreper-behandlet reist på verten pollen. Nedbygging main og samhandling effektene soppdreper og Pollen kilde avslørt at: (i) av forbruker soppdreper-behandlet pollen hadde betydelig negativ innvirkning på skallet biomasse, men ikke larver utviklingsmessige varighet. Mens en tidligere studie har vist akutt oral toksisitet i voksen Osmia på høyere konsentrasjoner, tyder disse resultatene på at muntlig eksponering for propiconazole på langt lavere konsentrasjon kan påvirke fitness ved å redusere skallet biomasse23 . (ii) det viktigste effekten av å konsumere ikke vert pollen har en negativ effekt på larver fitness. Disse resultatene er konsistente med tidligere publiserte studier som tyder pollen kvalitet (dvs. tilstedeværelsen av giftstoffer, beskyttende forbindelser, mangel på essensielle næringsstoffer) og forskjellene i bee fysiologi kan begrense bier bruker ikke vert pollen68 . Også er det sannsynlig at fravær av gunstig microbiota vanligvis ervervet fra verten-pollen og/eller bee avling forverre denne effekten. (iii) det var ingen betydelig interaksjon mellom soppdreper eksponering og Pollen kilde på larver fitness. Over både soppdreper behandlet og ubehandlet grupper hadde Larvene spiser ikke vert pollen betydelig lavere skallet biomasse og lenger larver utviklingsmessige tid i forhold til Larvene reist på verten pollen. Uavhengig av pollen kilde hadde Larvene forbruker soppdreper-behandlet bestemmelsene betydelig lavere skallet biomasse forhold til Larvene reist på ubehandlet pollen. Bortsett fra de betydelige viktigste effektene, interaktive effekten av begge faktorer likedannet additiv modellen, dvs., de negative effektene av soppdreper eksponering og pollen på larver fitness var ikke synergistisk. Usikkerhet som følge av samspillet mellom ulike faktorer for bee helse (som beskrevet her), begrense effektiviteten av pollinator forvaltningstiltak. Ved å hjelpe forutsi de interaktive effektene av flere risikofaktorer, kan resultater fra lignende laboratorie-baserte eksperimenter bidra til å omgå denne langvarige utfordringen bee bevaring innsats.

Det er flere viktige skritt i denne protokollen som kan påvirke utfallet av eksperimentet. Mulig det er tilrådelig å bruke organisk pollen som uten plantevernmidler rester. Pollen øker fra ukjente kilder risikoen for forurensning med ulike plantevernmidler, som kan forvirre eksperimentelle resultatene. Det er viktig å få ferske plugget Osmia hekker siv slik at bare unhatched egg eller svært unge larver brukes i studien. Dette sikrer at larvene er hevet nesten utelukkende på hvilken tiltenkte pollen behandling. Hekkende reed bør være dissekert bruke en grunne snitt, sviktende som pollen bestemmelser og egg kan bli skadet under høstingen. Når egg er fjernet må de håndteres forsiktig for å unngå skade og beholdt i veie båter i et kjølig mørkt hygienisk miljø (f.eks, biosafety kabinett) før de overføres. Dette holder tid bør holdes til et minimum (< 30 min) å sikre at kvaliteten på egg ikke er i fare. Alle prosedyrer bør utføres i en biosafety regjering å sikre en ren arbeider miljø og redusere sjansene for forurensning. For å sikre deres effekt, bare bruke nylagde soppdreper løsninger for behandlinger. Gitt at pollen er hydrofobe, soppdreper løsningen / sterilt vann bør innføres i depresjon innen pollen bestemmelser. Dette maksimerer volumet av væske gjennomsyre gjennom bestemmelsen. Det er imidlertid viktig at depresjon ikke pierce hele dybden av bestemmelsen, som det vil resultere i tap av volum fra løsningen følge kapsel gulvet. Enkelte behandlinger og kontroller bør gjennomføres på separate godt plater å redusere sjansene for kryss-kontaminering fra flyktige forbindelser og/eller pollen-borne bakterieflora. Stykker foldet bånd skal være knyttet til kantene av plate å tillate tilstrekkelig luftspalte når dekslene er på plass. Under daglige observasjoner, skal platene behandles forsiktig for å minimere forstyrrelser til larvene. Observasjoner bør gjøres under mikroskopet med minimum lysintensiteten, og lokkene bør ikke fjernes med mindre forkaste døde larver. I tilfelle av uventede utbredt dødelighet, må både larvene og deres pollen bestemmelser utsettes for å se etter tegn på infeksjon og infestation. Vel platene som inneholder de kompromitterte gjentak skal umiddelbart forkastet, arbeidsområdet desinfiseres og steriliseres verktøy for å forhindre spredning av smitte.

Til tross for bredt omfattende programmet finnes det visse begrensninger til denne metoden. For eksempel, mens det er best å bruke organisk pollen når det er tilgjengelig, er heve planter i drivhus omgivelser å gi tilstrekkelig mengder rent forurenset pollen logistisk prohibitive. I slike tilfeller kan vill-samlet pollen brukes forutsatt at det er vist for tilstedeværelsen av plantevernmidler rester. En annen strategi for å redusere risikoen for forurensning ved vill-samlet pollen er å skaffe pollen fra en kilde som er mindre sannsynlig å ha blitt sprayet (f.eksuberørte uforstyrret områder langt fra landbruket gårder). Verten pollen brukt i denne studien er Hentet fra hekkende siv som ble plassert i naturlig skog og gressletter rundt foten av fjellkjeden Wasatch nær Kaysville, Utah. Gitt at denne regionen er dominert av vill, uovervåkede naturlige skoger langt fra kommersielle landbruket områder, og at disse biene ikke fly så langt som honning bier når beite83,84,85, er det svært usannsynlig at pollen de samlet ville har blitt sprayet. Dermed, plantevernmidler rester pollen samlet her er sannsynlig å være trivielt. Beite i slike vilt landskap, er den voksne kvinnelige mindre sannsynlig å møte forurenset pollen, redusere risikoen for eksponering larver. Kjøpt kommersielt honeybee pollen brukt i denne studien samles fra naturlige skogkledde områder i nordlige Wisconsin og Michigan. Markedsført for menneskelig konsum, angir offentlig tilgjengelig informasjon og personlig kommunikasjon leverandøren at elveblest ikke er kjemisk behandlet og pollen selges i sin naturlige, rå form uten noen modifikasjoner86. Det er derfor rimelig å anta at miljøgifter belastningen i kjøpt kommersielt honeybee pollen vil være minimal. For studier som ikke får pollen fra uforvaltet områder med vill naturlig vegetasjon, er det tilrådelig å ha direkte empiriske bevis fra pollen kjemi analyse for å sikre at pollen i risiko analyser er miljøgifter gratis. En annen begrensning innebærer påfunn introdusert av kunstige oppdrett miljøet. Til tross for beste innsats, er det ikke logistisk mulig å gjenskape den eksakte microenvironment innenfor et naturlig hekkende siv (f.eks., fuktighet, oksygen konsentrasjon, tredimensjonale strukturen i enkelte kammer), som kan påvirke larver egnethet til ukjent grader. For å simulere defensibly egenskapene til den naturlige dietten, må foreløpige data fra neste siv hentes før i vitro kosthold manipulasjon studier. Selv om ikke vert pollen brukt i denne studien hentes fra områder hvor Oregon druen er fraværende eller sjeldne87, kan det hende spor av verten pollen blandet pollen kjøpt kommersielt, potensielt påvirker resultatene. En annen ulempe med denne teknikken er at håndtere stress i eksperimentell perioden kan forårsake bivirkninger på bier. Til slutt, mens det er vanlig å møte unhatched egg i naturen63, under laboratorieforhold er det vanskelig å fastslå om å klekkes skyldtes håndtere stress, eksperimentell behandling eller et resultat av naturlige årsaker. Siden disse faktorene kan introdusere ukjent grader skjevhet i studien, må man bruke forsiktig mens tolke resultatene.

Ved å kontrollere for faktorer som kan påviselig skjevhet eksperimentelle utfall (f.eks mors foraging effektivitet75, sex-spesifikke varianter77og kosttilskudd pollen68,72), beskrevet protokollen betydelige forbedringer over tidligere publisert teknikker76, og tilbyr en strengere ramme for hypoteser testing. For eksempel bruker i vitro-reared bier gjør undersøkelser i sex-spesifikke Svar å xenobiotic oval behandling, som ellers ville være utfordrende for å studere ville bestander av hulrom-hekkende bier49,88. Potensialet manipulerer og teste flere samspill faktorer (f.eks, kosthold kvalitet og kvantitet, kosthold-assosiert bakterieflora, eksponering for synergistiske plantevernmidler), kan gi verdifull innsikt i de viktigste determinantene av bee fitness. Fleksibiliteten til protokollen tillater lett endringer (f.eks ved hjelp av ulike størrelse bra plater til Larvene av varierende størrelser, endre typen og mengden av diett), noe som gjør det mottakelig for bruk med flere andre arter av enslig bier og veps 76. under denne studien evalueres fitness basert på utvikling og survivorship på fôring scenen, insekter kan være ruges før fremveksten å få ytterligere data på fremveksten rate, mat til kropp konvertering og etter fremveksten levetid 49. denne informasjonen kan hjelpe vurdere sub dødelige effekten av behandlinger i toksisitet analyser. Med økende interesse i funksjonen av pollen-microbiome, kan laboratorie-baserte studier identifisere følsom mot resistente bee arter basert på deres pollen bakterieflora71. Forskjeller i soppdreper mottakelighet over bee grupper kan utforskes ved sekvensering bakterieflora i strukturen lagret pollen. Dette kan hjelpe undersøke rollen pollen microbiome i overdragelse varierende grad av motstand mot xenobiotic oval stressfaktorer. Fremtidige studier kan også identifisere forskjeller mellom den naturlige bakterieflora av verten og ikke vert pollen, som kan tjene som en underliggende faktor oligolectic atferd innenfor Velg bee arter.

I vitro oppdrett av larver ensom bier kan hjelpe kontroll for naturlig variasjon opplevd i naturen, og dermed skildre rollen som individuelle og samspill faktorer påvirker bee fitness. Denne tilgjengelig og rimelig Teknikken bygger Entomologer toolkit ved at for manipulering av flere parametere som kan enkelt endres til adressen spesifikk forskning mål. Hvis bevis fra i vitro eksperimenter kan bidra til å identifisere i risikosonen bestander, være innvirkning på bee bevaringsstrategiene betydelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Kimball Clark og Tim Krogh for å gi Osmia hekkende Siv, Meredith Nesbitt og Molly Bidwell for hjelp i laboratoriet, Dr. Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter og tre anonym korrekturlesere deres nyttige kommentarer som forbedret manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av USDA-Agricultural Research Service bevilget midler (nåværende forskning Information System #3655-21220-001), Wisconsin Department of Agriculture, Trade og Consumer Protection (#197199), National Science Foundation (under Grant nr. DEB-1442148), DOE Great Lakes bioenergi Research Center (DOE kontoret av vitenskap BER DE-FC02-07ER64494).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reeds Nativebees.com NA Freshly plugged reeds
Dissection set VWR 89259-964 Sterilize before use
Long Nose Pliers Husky 1006
6 well culture plates VWR 10062-892 Sterile sealed
48 well culture plates VWR 10062-898 Sterile sealed
Petri dishes VWR 25373100 Sterile sealed
Square Weighing Boats VWR 10770-448
Camel Hair Brush Bioquip 1153A
Tin capsules EA Consumables D1021 Sterilize before use
Sucrose VWR 470302-808
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Honey bee pollen Bee energised 897098001244 Untreated, natural, raw pollen
Microbalance VWR 10204-990
Pulverisette LAB SYNERGY INC. 30334913
Wooden sticks VWR 470146908 Sterilize before use
Sealing tape VWR 89097-912
Microscope VWR 89403-384
Planting tray VWR 470150-632
Ethanol VWR BDH1158-4LP
Centrifuge tube VWR 21008936
Microsyringe Cole-Palmer UX-07940-07
Rubber tweezer Amazon B0135HWPN4
Syringe needles VWR 89219-334
Freeze drier Labcono LFZ-1L
Statistical software SPSS Version 21.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klein, A. -M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. P Roy Soc Lond B Bio. 274 (1608), 303-313 (2007).
  2. Biesmeijer, J. C. J., et al. Parallel declines in pollinators and insect-pollinated plants in Britain and the Netherlands. Science. 313 (5785), 351-354 (2006).
  3. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evol. 25 (6), 345-353 (2010).
  4. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. P Natl Acad Sci USA. 108 (2), 662-667 (2011).
  5. Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissière, B. E. Economic valuation of the vunerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecol Econ. 68 (3), 810-821 (2009).
  6. Fontaine, C., Dajoz, I., Meriguet, J., Loreau, M. Functional diversity of plant-pollinator interaction webs enhances the persistence of plant communities. Plos Biol. 4 (1), 0129-0135 (2006).
  7. Kluser, S., Peduzzi, P. Global pollinator decline: a literature review. , UNEP/GRID Europe. (2007).
  8. Brown, M. J. F., Paxton, R. J. The conservation of bees: a global perspective. Apidologie. 40 (3), (2009).
  9. Lebuhn, G., et al. Detecting insect pollinator declines on regional and global scales. Conserv Biol. 27 (1), (2013).
  10. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. , Suppl 103. S80-S95 (2010).
  11. Pettis, J. S., Delaplane, K. S. Coordinated responses to honey bee decline in the USA. Apidologie. 41 (3), 256-263 (2010).
  12. Sandrock, C., Tanadini, L. G., Pettis, J. S., Biesmeijer, J. C., Potts, S. G., Neumann, P. Sublethal neonicotinoid insecticide exposure reduces solitary bee reproductive success. Agr Forest Entomol. 16 (2), (2014).
  13. Van der Sluijs, J. P., Simon-Delso, N., Goulson, D., Maxim, L., Bonmatin, J. M., Belzunces, L. P. Neonicotinoids, bee disorders and the sustainability of pollinator services. Curr Opin Env Sust. 5 (3), (2013).
  14. Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), (2015).
  15. Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity - USA. Apidologie. 41 (3), (2010).
  16. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
  17. Glavan, G., Bozic, J. The synergy of xenobiotics in honey bee Apis mellifera: mechanisms and effects. Acta Biol. Slov. 56, 11-27 (2013).
  18. Biddinger, D. J., et al. Comparative toxicities and synergism of apple orchard pesticides to Apis mellifera (L.) and Osmia cornifrons (Radoszkowski). PLoS ONE. 8 (9), e72587 (2013).
  19. Thompson, H. M., Fryday, S. L., Harkin, S., Milner, S. Potential impacts of synergism in honeybees (Apis mellifera) of exposure to neonicotinoids and sprayed fungicides in crops. Apidologie. 45 (5), 545-553 (2014).
  20. Jansen, J. -P., Lauvaux, S., Gruntowy, J., Denayer, J. Possible synergistic effects of fungicide-insecticide mixtures on beneficial arthropods. IOBC-WPRS Bulletin. 125, 28-35 (2017).
  21. Robinson, A., Hesketh, H., et al. Comparing bee species responses to chemical mixtures: Common response patterns? PLoS ONE. 12 (6), (2017).
  22. Sgolastra, F., Medrzycki, P., et al. Synergistic mortality between a neonicotinoid insecticide and an ergosterol-biosynthesis-inhibiting fungicide in three bee species. Pest Management Science. 73 (6), 1236-1243 (2017).
  23. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  24. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PloS one. 5 (3), e9754 (2010).
  25. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PloS one. 8 (7), e70182 (2013).
  26. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  27. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PloS one. 9 (1), e77547 (2014).
  28. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  29. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. P Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1809), 20150299-20150299 (2015).
  30. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  31. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J Exp Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  32. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), e0135688 (2015).
  33. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pestic Biochem Phys. 51 (1), 1-11 (1995).
  34. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of pyrethroid insecticide toxicity to honey bees (Hymenoptera: Apidae) by cytochrome P450 monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (4), 1046-1050 (2006).
  35. Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L. A., Currie, C. R., Zalapa, J. E., Hittinger, C. T. Empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health. JoVE. (128), e54631 (2017).
  36. Batra, S. W. T. Solitary bees. Sci Am. 250 (2), 120-127 (1984).
  37. Linsley, E. G. The ecology of solitary bees. Hilgardia. 27 (19), 543-599 (1958).
  38. Garibaldi, L. A., et al. Wild Pollinators Enhance Fruit Set of Crops Regardless of Honey Bee Abundance. Science. 339 (6127), 1608-1611 (2013).
  39. Bosch, J., Kemp, W. P. How to manage the blue orchard bee. , Sustainable Agriculture Network. Washington, DC. (2001).
  40. Keller, A., Grimmer, G., Steffan-Dewenter, I. Diverse microbiota identified in whole intact nest chambers of the red mason bee Osmia bicornis (Linnaeus 1758). PLoS ONE. 8 (10), e78296 (2013).
  41. Bosch, J., Kemp, W. P. Development and Emergence of the Orchard Pollinator Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae). Environmental Entomology. 29 (1), 8-13 (2000).
  42. Brittain, C., Potts, S. G. The potential impacts of insecticides on the life-history traits of bees and the consequences for pollination. Basic and Applied Ecology. 12 (4), 321-331 (2011).
  43. Arena, M., Sgolastra, F. A meta-analysis comparing the sensitivity of bees to pesticides. Ecotoxicology. 23 (3), 324-334 (2014).
  44. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Foraging and nesting behavior of Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae) in the presence of fungicides: cage studies. J Econ Entomol. 101 (3), 647-653 (2008).
  45. Huntzinger, A. C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide tests on adult alfalfa leafcutting bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  46. Tsvetkov, N., et al. Chronic exposure to neonicotinoids reduces honey bee health near corn crops. Science. 356 (6345), 1395-1397 (2017).
  47. Mao, W., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Disruption of quercetin metabolism by fungicide affects energy production in honey bees (Apis mellifera). P Natl Acad Sci. 114 (10), 2538-2543 (2017).
  48. Blacquière, T., Smagghe, G., Van Gestel, C. A. M., Mommaerts, V. Neonicotinoids in bees: A review on concentrations, side-effects and risk assessment. Ecotoxicology. 21 (4), 973-992 (2012).
  49. Sgolastra, F., Tosi, S., Medrzycki, P., Porrini, C., Burgio, G. Toxicity of spirotetramat on solitary bee larvae, Osmia cornuta (Hymenoptera: Megachilidae), in laboratory conditions. Journal of Apicultural Science. 59 (2), 73-83 (2015).
  50. Mader, E., Spivak, M., Evans, E. Managing Alternative Pollinators. , Sustainable Agriculture Research and Education (SARE), US Dept. of Agriculture. (2010).
  51. Bosch, J., Kemp, W. P. Developing and establishing bee species as crop pollinators: the example of Osmia spp.(Hymenoptera: Megachilidae) and fruit trees. B Entomol Res. 92 (1), 3-16 (2002).
  52. Sampson, B. J., Rinehart, T. A., Kirker, G. T., Stringer, S. J., Werle, C. T. Phenotypic variation in fitness traits of a managed solitary bee, Osmia ribifloris (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 108 (6), 2589-2598 (2015).
  53. Sampson, B. J., Cane, J. H., Kirker, G. T., Stringer, S. J., Spiers, J. M. Biology and management potential for three orchard bee species (Hymenoptera: Megachilidae): Osmia ribifloris Cockerell, O. lignaria (Say) and O.chalybea Smith with emphasis on the former. Acta Hort. 810, 549-555 (2009).
  54. Hladik, M. L., Vandever, M., Smalling, K. L. Exposure of native bees foraging in an agricultural landscape to current-use pesticides. Sci Total Environ. 542, 469-477 (2016).
  55. Long, E. Y., Krupke, C. H. Non-cultivated plants present a season-long route of pesticide exposure for honey bees. Nat Commun. 7, (2016).
  56. Krupke, C. H., Hunt, G. J., Eitzer, B. D., Andino, G., Given, K. Multiple routes of pesticide exposure for honey bees living near agricultural fields. PLoS ONE. 7 (1), e29268 (2012).
  57. Stoner, K. A., Eitzer, B. D. Using a hazard quotient to evaluate pesticide residues detected in pollen trapped from honey bees (Apis mellifera) in Connecticut. PLoS ONE. 8 (10), e77550 (2013).
  58. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  59. Steffan-Dewenter, I., Klein, A. -M., Gaebele, V., Alfert, T., Tscharntke, T. Bee diversity and plant-pollinator interactions in fragmented landscapes. Specialization and generalization in plant-pollinator interactions. , 387-410 (2006).
  60. Kremen, C., Ricketts, T. Global perspectives on pollination disruptions. Conserv Biol. 14 (5), 1226-1228 (2000).
  61. Memmott, J., Waser, N. M., Price, M. V. Tolerance of pollination networks to species extinctions. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1557), 2605-2611 (2004).
  62. Spear, D. M., Silverman, S., Forrest, J. R. K. Asteraceae pollen provisions protect Osmia mason bees (Hymenoptera: Megachilidae) from brood parasitism. The American Naturalist. 187 (6), 797-803 (2016).
  63. Rust, R. W. Biology of Osmia (Osmia) ribifloris Cockerell (Hymenoptera: Megachilidae). J Kansas Entomol Soc. 59, 89-94 (1986).
  64. Torchio, P. F. Osmia ribifloris, a native bee species developed as a commercially managed pollinator of highbush blueberry (Hymenoptera: Megachilidae). J Kansas Entomol Soc. 63 (633), 427-436 (1990).
  65. Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees - A risk assessment. PLoS ONE. 9 (4), e94482 (2014).
  66. Kasiotis, K. M., Anagnostopoulos, C., Anastasiadou, P., Machera, K. Pesticide residues in honeybees, honey and bee pollen by LC-MS/MS screening: Reported death incidents in honeybees. Sci Total Environ. 485 (1), 633-642 (2014).
  67. Stanley, J., Sah, K., Jain, S. K., Bhatt, J. C., Sushil, S. N. Evaluation of pesticide toxicity at their field recommended doses to honeybees, Apis cerana and A. mellifera through laboratory, semi-field and field studies. Chemosphere. 119, 668-674 (2015).
  68. Praz, C. J., Müller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen? Ecology. 89 (3), 795-804 (2008).
  69. Sedivy, C., Müller, A., Dorn, S. Closely related pollen generalist bees differ in their ability to develop on the same pollen diet: Evidence for physiological adaptations to digest pollen. Funct Ecol. 25 (3), 718-725 (2011).
  70. Williams, N. M. Use of novel pollen species by specialist and generalist solitary bees (Hymenoptera: Megachilidae). Oecologia. 134, (2003).
  71. Graystock, P., Rehan, S. M., McFrederick, Q. S. Hunting for healthy microbiomes: determining the core microbiomes of Ceratina, Megalopta, and Apis bees and how they associate with microbes in bee collected pollen. Conserv Genet. 18 (3), 1-11 (2017).
  72. Bosch, J., Vicens, N. Relationship between body size, provisioning rate, longevity and reproductive success in females of the solitary bee Osmia cornuta. Behav Ecol Sociobiol. 60 (1), 26-33 (2006).
  73. Bosch, J., Vicens, N. Body size as an estimator of production costs in a solitary bee. Ecol Entomol. 27 (2), 129-137 (2002).
  74. Radmacher, S., Strohm, E. Factors affecting offspring body size in the solitary bee Osmia bicornis (Hymenoptera, Megachilidae). Apidologie. 41 (2), 169-177 (2010).
  75. Seidelmann, K. Open-cell parasitism shapes maternal investment patterns in the Red Mason bee Osmia rufa. Behav Ecol. 17 (5), (2006).
  76. Becker, M. C., Keller, A. Laboratory rearing of solitary bees and wasps. Insect Science. 23 (6), 918-923 (2016).
  77. Bosch, J. The nesting behaviour of the mason bee Osmia cornuta (Latr) with special reference to its pollinating potential (Hymenoptera, Megachilidae). Apidologie. 25, 84-93 (1994).
  78. Krunić, M., Stanisavljević, L., Pinzauti, M., Felicioli, A. The accompanying fauna of Osmia cornuta and Osmia rufa and effective measures of protection. B Insectol. 58 (2), 141-152 (2005).
  79. Elliott, S. E., Irwin, R. E., Adler, L. S., Williams, N. M. The nectar alkaloid, gelsemine, does not affect offspring performance of a native solitary bee, Osmia lignaria (Megachilidae). Ecol Entomol. 33 (2), 298-304 (2008).
  80. Toby Mordkoff, J. The Assumption(s) of Normality. , Available from: http://www2.psychology.uiowa.edu/faculty/mordkoff/GradStats/part 1/I.07 normal.pdf (2016).
  81. Hendriksma, H. P., Härtel, S., Steffan-Dewenter, I. Honey bee risk assessment: New approaches for in vitro larvae rearing and data analyses. Methods Ecol and Evol. 2 (5), 509-517 (2011).
  82. Aupinel, P., et al. Improvement of artificial feeding in a standard in vitro method for rearing Apis mellifera larvae. B Insectol. 58 (2), 107-111 (2005).
  83. Beekman, M., Ratnieks, F. L. W. Long-range foraging by the honey-bee, Apis mellifera L. Funct Ecol. 14 (4), 490-496 (2000).
  84. Gathmann, A., Tscharntke, T. Foraging ranges of solitary bees. J Anim Ecol. 71 (5), 757-764 (2002).
  85. Greenleaf, S. S., Williams, N. M., Winfree, R., Kremen, C. Bee foraging ranges and their relationship to body size. Oecologia. 153 (3), 589-596 (2007).
  86. Bee Pollen Supplement - Bee Rescued. , Available from: https://beerescued.com/product/bee-rescued-bee-pollen-supplement/ (2018).
  87. Holly-Leaf Oregon-Grape (Mahonia aquifolium) Species Details and Allergy Info, Teton county, Wyoming. , Available from: http://www.pollenlibrary.com/Local/Specie/Mahonia+aquifolium/in/Teton County/WY/ (2018).
  88. Cane, J. H., Griswold, T., Parker, F. D. Substrates and Materials Used for Nesting by North American Osmia Bees (Hymenoptera: Apiformes: Megachilidae). Annals of the Entomological Society of America. 100 (3), 350-358 (2007).

Tags

Miljøfag problemet 137 bee nedgang kosthold manipulasjon soppdreper eksponering pollen preferanse larver fitness mason bier
<em>In Vitro</em> Stell av enslig bier: et verktøy for å vurdere larver risikofaktorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dharampal, P. S., Carlson, C. M.,More

Dharampal, P. S., Carlson, C. M., Diaz-Garcia, L., Steffan, S. A. In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors. J. Vis. Exp. (137), e57876, doi:10.3791/57876 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter