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In Vitro Criação de abelhas solitárias: uma ferramenta para avaliar os fatores de risco Larval

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57876
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1,5
1Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agricolas y Pecuarias, 5USDA-ARS, Vegetable Crop Research Unit

Summary

Sprays de fungicida em plantas de floração podem expor abelhas solitárias para altas concentrações de resíduos do fungicida transmitidas pelo pólen. Usando experimentos baseados em laboratório, envolvendo-se em vitro-larvas de abelha criados, este estudo investiga os efeitos interativos de consumir pólen tratada com fungicida derivado de host e host não plantas.

Abstract

Embora as abelhas solitárias fornecem serviços de polinização crucial para culturas selvagens e gerenciados, este grupo de ricos em espécies foi negligenciado em grande parte em estudos de regulamento de pesticidas. O risco de exposição a resíduos do fungicida é provável que seja especialmente elevado se o spray ocorre em ou perto de plantas hospedeiras, enquanto as abelhas estão coletando pólen para provisionar seus ninhos. Para espécies de Osmia que consomem pólen de um seleto grupo de plantas (oligolecty), a incapacidade de usar o pólen de plantas não-hospedeiras pode aumentar seu fator de risco para toxicidade relacionadas com fungicida. Este manuscrito descreve protocolos usados com sucesso criar abelhas oligolectic mason Osmia ribifloris sensu lato, do ovo à fase prepupal em placas de cultura de células em condições laboratoriais padronizados. O em vitro-abelhas criadas posteriormente são usadas para investigar os efeitos da fonte de exposição e pólen de fungicida na aptidão de abelha. Baseado em um experimento fatorial 2 x 2 totalmente atravessado, o experimento examina os efeitos principais e interativos da fonte de exposição e pólen de fungicida na aptidão larval, quantificada por biomassa prepupal, tempo de desenvolvimento larval e sobrevivência. Uma grande vantagem desta técnica é que usando em vitro-abelhas criadas reduz a variabilidade natural de fundo e permite a manipulação simultânea de vários parâmetros experimentais. O protocolo descrito apresenta uma ferramenta versátil para hipóteses testes envolvendo o conjunto de fatores que afetam a saúde das abelhas. Para os esforços de conservação a ser cumprido com sucesso significativo e duradouro, tais insights sobre a complexa interação de fatores fisiológicos e ambientais que levam a abelha declínios provarão para ser crítico.

Introduction

Dado o seu papel como o grupo dominante de insetos polinizadores1, a perda global em populações de abelhas é uma ameaça para a segurança alimentar e o ecossistema estabilidade2,3,4,5,6 ,7. As tendências em declínio em ambas as populações de abelhas gerenciado e selvagens têm sido atribuídas a vários factores de risco compartilhados, incluindo fragmentação de habitat, emergentes, parasitas e agentes patogénicos, perda de diversidade genética e a introdução de espécies invasoras3 ,,4,7,8,9,10,11,12. Em particular, o aumento dramático no uso de pesticidas, (por exemplo, neonicotinoides) tem sido diretamente associado a efeitos prejudiciais entre abelhas13,14,15. Vários estudos têm mostrado que o sinergismo entre neonicotinoides e fungicidas de (EBI) inibindo a biossíntese de ergosterol pode levar a alta mortalidade entre múltiplos abelha espécie16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. não obstante, fungicidas, consideradas por muito tempo para ser 'abelha-safe', continuam a ser pulverizado nas culturas no-flor sem muito controlo23. As abelhas operárias foram documentadas para rotineiramente trazer cargas de pólen contaminadas com resíduos de fungicida24,25,26. O consumo de tal fungicida-ladenpollen pode causar alta mortalidade larval abelhas27,28,29,30e um conjunto de efeitos sub-letais entre abelhas adultas16 , 31 , 32 , 33 , 34. um estudo recente sugere que fungicidas podem causar perdas de abelha, alterando a comunidade microbiana na colmeia-armazenado o pólen, rompendo assim, a crítica simbiose entre abelhas e pólen transmitidas por micróbios35.

Embora as abelhas solitárias são vitais para a polinização de diversas plantas silvestres e agrícolas36,37,38, este grupo diverso de polinizadores tem recebido muito menos atenção em estudos de monitoramento de pesticidas. O ninho de uma fêmea solitária adulta contém câmaras ninhadas seladas de 5-10, cada abastecida com uma massa finita de maternalmente coleta de pólen e néctar e um único ovo39. Após a eclosão, as larvas dependem da prestação de pólen alocado e a microbiota associada transmitidas por pólen para obter uma nutrição adequada40,41. Porque eles não possuem os benefícios de um estilo de vida social, as abelhas solitárias podem ser mais vulneráveis à exposição de pesticidas42. Por exemplo, enquanto os défices em abelhas sociais seguindo um spray podem ser compensados para estendem a alguns trabalhadores e novos emergentes, ninhada, a morte de uma única fêmea solitária adulta termina todas as atividade reprodutiva43. Tais diferenças de susceptibilidade destacam a necessidade de incorporar táxons de abelha diversificada em estudos ecotoxicológicos para garantir proteção adequada para as abelhas selvagens e gerenciadas parecidas. No entanto, além de um punhado de estudos, investigações sobre os efeitos da exposição de fungicida tem focado principalmente nas abelhas sociais18,23,32,44,45 ,46,,47,,48,49.

Abelhas solitárias, pertencentes ao gênero Osmia (Figura 1) têm sido utilizadas no mundo inteiro como polinizadores eficientes de vários frutos importantes e porca culturas39,50,,51,53, 53. como com outros polinizadores gerenciado grupos24,54,55,56,57,58, abelhas adultas Osmia são rotineiramente expostos aos fungicidas pulverizadas sobre as culturas em-flor44. Fêmeas adultas forrageamento em culturas recentemente pulverizadas podem coletar e estocar seus aposentos ninhados com fungicida-carregado de pólen, que posteriormente forma a dieta exclusiva para as larvas em desenvolvimento. Consumir as disposições de pólen contaminados posteriormente pode expor as larvas de fungicida resíduos42. O risco de exposição pode ser maior entre espécies de oligolectic que forragem somente em alguns anfitrião estreitamente relacionadas plantas59,60,61. Certos megachilid de abelhas, por exemplo, parecem preferencialmente forragem para o pólen de Asteraceae de baixa qualidade, como um meio de reduzir o parasitismo62. No entanto, a extensão a que fungicidas impacto larval adequação entre abelhas solitárias oligolectic não foi empiricamente quantificada. O objetivo deste estudo é desenvolver um protocolo para testar as principais e efeitos interativos da fonte de exposição e pólen de fungicida na aptidão do in vitro criadas abelhas solitárias. Para investigar, ovos de ribifloris o. sensu lato (s.l.) podem ser obtidos comercialmente (tabela de materiais). Esta população é ideal por causa de sua importância como um polinizadores nativos e sua forte predileção para o néctar rico Mahonia aquifolium (uva de Oregon) encontrado dentro da região53,63,64 (Figura 2).

Figure 1
Figura 1. Uma foto de alta resolução de um adulto Osmia ribifloris. Foto de crédito Dr. Jim Cane, pesquisa entomologista, USDA-ARS , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Aninhamento de palhetas de Osmia ribifloris (s.l.) com uma fêmea de nidificação em primeiro plano,. de Phragmite Partições de câmara e buchas terminais para as palhetas são construídas a partir de folhas mastigadas. Foto crédito Sr. Kimball Clark, NativeBees.com , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O primeiro objectivo deste estudo é avaliar o efeito de consumir pólen tratada com fungicida na aptidão larval (medido em termos de tempo de desenvolvimento e biomassa de prepupal). Enquanto a exposição para o propiconazol fungicida comumente aplicada tem sido associada ao aumento da mortalidade entre abelhas adultas através de várias espécies de 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,,66,67, seu impacto sobre as abelhas larvas é menor conhecido. O segundo objectivo deste estudo é avaliar os efeitos de consumir pólen não-host na aptidão larval. Estudos anteriores indicam que as larvas de abelhas oligolectic não conseguem desenvolver quando forçado a consumir pólen host não68. Tais resultados podem ser atribuídos às variações na fisiologia de abelha69, pólen bioquímica70e o benéfico microbiome associado com pólen natural disposições71. O terceiro objectivo deste estudo é avaliar os efeitos interativos de tratamento fungicida e pólen dietético na aptidão larval.

Numerosos traços biológicos, incluindo o tamanho do corpo materno, provisionamento de taxa, estratégia de forrageamento e pólen quantidade72,73,,74,75 são conhecidos por afetar a aptidão larval entre abelhas solitárias. Esses fatores podem introduzir variabilidade significativa entre juncos, que constitui um desafio no desenvolvimento de projetos experimentais defensáveis quando avaliação saúde larval. Além disso, dado que desenvolvimento larval ocorre dentro de juncos aninhamento selados, os efeitos de tal variabilidade na progenitura são difíceis de Visualizar e quantificados sem o uso de técnicas não-letais (Figura 3). Para superar este desafio, todas as hipóteses dentro deste estudo são testados usando larvas criadas fora suas linguetas de aninhamento. O delineamento experimental representa um totalmente cruzados 2 × 2 fatorial set-ups, com cada fator, consistindo em 2 níveis; Fator 1: Exposição fungicida (fungicida; Nenhum fungicida); Fator 2: Fonte de pólen (Host pólen, pólen de Non-host). As abelhas são disparadas do ovo à fase prepupal placas de cultura de célula do multiwell estéril sob condições controladas de laboratório. Cada um bem individualmente é abastecido com uma quantidade padronizada de um único ovo e disposições de pólen. Após a eclosão, a larva alimenta-se o pólen alocado dentro do poço, conclui desenvolvimento larval e inicia a pupa. Após estudos têm mostrado que inexplicáveis de mortalidade é menor entre abelhas levantadas dentro deste ambiente de criação artificial do que o encontrado no selvagem49,,76. O uso do in vitro-abelhas criadas tem diversas vantagens sobre os estudos de campo baseada: 1) minimiza os efeitos de confundimento de variabilidade natural e descontrolados fatores associados tipicamente com os estudos de campo baseada; 2) permite que vários níveis de manipulação para cada factor de interesse a serem testadas simultaneamente em grupos de tratamento; 3) o número de repetições pode ser predeterminado, e fatores experimentais para cada replicar podem ser manipulados individualmente; 4) variáveis resposta larval podem ser facilmente visualizadas e gravadas independentemente sem perturbadoras larvas adjacentes; 5) o protocolo pode ser modificado para acomodar mais complexos desenhos experimentais envolvendo múltiplos fatores e variáveis de resposta.

Figure 3
Figura 3. Conteúdo dentro de uma palheta de nidificação natural de Osmia ribifloris (s.l.). Perto da (A) um reed dissecado mostrando câmaras individuais, disposições de pólen e as partições e (B) recém colhidas disposições de pólen e os ovos associados (indicados com um círculo preto). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

1. prepare soluções propiconazol para experimentos de exposição de fungicida

  1. Prepare 0,1 x solução fungicida dissolvendo volumes adequados de propiconazol adquiridos comercialmente 14,3% em água estéril no dia do experimento. Certifique-se de que a única solução recentemente preparada de fungicida é usada para todos os tratamentos.
  2. Adicione 23 µ l de 0,1 x solução fungicida por grama de provisão de pólen para obter a concentração máxima de propiconazol anteriormente relatado de pólen de abelha-coletados24 (0,361 PPM ou µ g de ingrediente ativo g-1 de pólen).

2. colher ovos e disposições de pólen Host de Osmia juncos

  1. Usando um bisturi esterilizado, disse recém ligado aninhando canas de Osmia, dividi-la em duas partes ao longo do comprimento da cana para expor as câmaras individuais.
    Nota: Cada ninho pode conter entre 8 a 14 câmaras e um ovo dentro de uma câmara.
  2. Inspecione os juncos visualmente para identificar as câmaras contendo ovos masculinos com base em diretrizes previamente publicados77. Uso uma agulha esterilizada dobrada para remover cada disposição de pólen juntamente com o ovo associado o nidificação reed e coloque em um ambiente limpo pesar o barco.
  3. Suavemente separa a prestação usando um pincel limpo bem o ovo e gravar o peso fresco de uma prestação pólen e utilizando uma balança de laboratório padrão do ovo. Calcule o peso médio das disposições pólen masculino.
  4. Execute as etapas subsequentes com prazo mínimo para reduzir as chances de danos para o ovo da exposição à temperatura excessiva e desidratação.

3. prepare a disposições de pólen de plantas de Host

  1. Inspecione visualmente o pólen planta hospedeira maternalmente coletados escavado das câmaras de nidificação para não garantir que nenhum parasitas presentes78. A fim de reduzir qualquer potencial viés materna, combinar as disposições de pólen em uma massa única em uma placa de Petri estéril e misture bem, usando uma agulha esterilizada.
  2. Divida a massa combinada em novas disposições de pólen, garantindo que o peso de cada prestação reconstituído é aproximadamente igual ao peso médio de uma disposição masculina naturalmente alocada (média ± SE, 0,35 ± 0,01 g, N = 42).
    Nota: Porque Osmia sp. aloca menores disposições de pólen para a prole masculina, isso resulta em menor peso corporal das larvas masculinas comparadas de fêmeas77. Para evitar qualquer tal preconceito resultantes de diferenças específicas do sexo, apenas use ovos masculinos nos experimentos.

4. prepare a planta hospedeira não provisão de pólen

  1. Pulverizamos adquiridos comercialmente mel abelha coleta pólen a um pó fino, usando um padrão de laboratório com moinho de esfera.
  2. Com base no teor de umidade disposições de pólen coletado maternalmente anfitrião (~ 20%), hidrate o pó de pólen usando volumes adequados de solução de açúcar de 40% esterilizado79 e misture cuidadosamente para formar uma consistência de massa.
  3. Divida em massas de pólen individuais, cada um pesando aproximadamente o mesmo que o peso médio de uma disposição masculino naturalmente alocado.
    Nota: De humidade do pólen de anfitrião maternalmente coletados disposições podem ser padronizadas em antes comparando o peso fresco e seco, de disposições de pólen de 30 câmaras masculino selecionado aleatoriamente80. Para obter o peso seco, disposições de pólen devem ser liofilizadas em um Liofilizador (1,5 Pa para 72 h).

5. preparar placas de cultura de células do Multiwell

  1. Poços individuais de linha da placa de cultura de 48-bem estéril com copos de estanho autoclavados (5 × 9 cm). Usando a pinça estéril, toque suavemente para fora da borda superior da cápsula para que ele pode acomodar a provisão de pólen.
  2. Coloque uma massa única de host ou o host não prestação de pólen dentro do copo lata usando ferramentas estéril com base no grupo de tratamento.
    Nota: Para evitar contaminação cruzada, use chapas separadas por grupos tratamento e controle.

6. Adicione fungicidas

  1. Faça uma depressão centralmente posicionada dentro da massa de pólen usando uma vara de madeira estéril. Use um stick para cada prestação de pólen.
  2. Adicione volumes adequados de solução fungicida (para tratamento), ou água esterilizada (para controles) para a depressão. Beliscar a abertura da depressão usando Pinças esterilizadas para minimizar o contato entre o fungicida de superfície / estéril água e o ovo.
  3. Certifique-se de que a afinação fatorial do design experimental alinha com isso retratado na representação esquemática (Figura 4).

Figure 4
Figura 4. Representação esquemática da instalação experimental. O experimento representa um totalmente cruzada 2 × 2 fatorial configurações. Fator 1 representa a exposição do fungicida e consiste em 2 níveis: (i) nenhum fungicida (N = 10) e (ii) fungicida (N = 10). Fator 2 representa a fonte de pólen e consiste em 2 níveis: pólen (i) Host (N = 8) e (ii) não-acolhimento de pólen (N = 8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. traseira e observar larvas

  1. Coloque um ovo masculino selecionado aleatoriamente na superfície superior da prestação pólen utilizando um pincel limpo bem. Uma vez que os ovos foram colocados em todas as disposições, substitua a tampa da placa de cultura de célula, fixando-a com fita nas esquinas de rotulagem.
  2. Coloque as placas bem em uma bandeja limpa e cubra com um pano escuro para obstruir o contato com luz direta. Lugar um poço 6 placa contendo 30 mL de água estéril dentro da bandeja para evitar a dessecação. Bandejas de incubação deixe intacta dentro de uma incubadora à temperatura ambiente.
  3. Observe bem placas diariamente sob um microscópio dissecação sem retirar a tampa das placas bem. Certifique-se de que as larvas estão vivas, verificando para o movimento. Se nenhum movimento for detectado, descarte a caneca contendo as larvas mortas e a restante oferta de pólen. Permitir que todas as larvas sobreviventes desenvolver imperturbado dentro as placas bem até que eles atinjam o estágio de prepupal.
  4. Remova a larva do copo de estanho quando atinge o estágio prepupal41. Usar uma escova para limpar os defecar no casulo de seda. Cuidadosamente corte através do casulo de seda usando um microscópio de dissecação e extrair o prepupa com pinça de borracha.
  5. Manipule o prepupa suavemente para garantir que as ferramentas não perfurar o corpo mole. Registro do peso fresco do prepupa (prepupal biomassa) e o tempo do desenvolvimento do ovo à fase prepupal (tempo do desenvolvimento larval).
    Nota: Qualquer larva morta deve ser descartado imediatamente para evitar o crescimento microbiano indesejável sobre o cadáver e disposição de restos de pólen. Isso reduz o risco de infecção para as restantes larvas saudáveis.

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Representative Results

Aptidão larval foi quantificada utilizando três métricas (i) larval tempo do desenvolvimento, (ii) prepupal biomassa e sobrevivência (iii) por cento. Uma ANOVA de duas vias foi realizada utilizando exposição fungicida (dois níveis: nenhum fungicida, fungicida) e fonte de pólen (dois níveis: Host pólen, pólen de Non-host) como variáveis independentes e tempo de desenvolvimento larval como variável dependente. O principal efeito para exposição de fungicida (F1,28 = 1,24, P = 0,28) não foi significativa entre os tratados com fungicida (média ± SE) (28.14 ±1.98 d, N = 14) e não tratada (25.39 ± 1,65 d, N = 18) grupos. O efeito principal para a fonte de pólen indicado no entanto, uma diferença significativa entre o tempo do desenvolvimento para larvas gerado no pólen de anfitrião (20,00 ± 0,50 d, N = 16) e não-host pólen (33.19 ±0.81 d, N = 16) (F1,28 = 179.83, P < 0,001). Bonferroni corrigidas comparações Post-hoc indicaram que tempo do desenvolvimento larval não variou significativamente entre tratados com fungicida e não tratado gerados no acolhimento de grupos (P = 0,57) e não-host (P = 0,32) pólen. No entanto, o tempo do desenvolvimento larval foi significativamente menor para larvas geradas no pólen de anfitrião comparado ao pólen não-host para ambos tratados com fungicida (P < 0,001) e não tratados (P < 0,001) pólen. O efeito de interação (fonte de pólen do × de exposição de fungicida) não foi significativo (F1,28 = 0,09, P = 0,77). A análise foi repetida usando biomassa prepupal como variável dependente. O principal efeito para exposição de fungicida indicado uma diferença significativa (F1,28 = 4,66, P = 0,04) entre os tratados com fungicida (0.123 0,01 g, N = 14) e não tratada (0.149 ± 0,01 g, N = 18) grupos. O efeito principal para a fonte de pólen (F1,28 = 56.30, P < 0,001) indicaram uma diferença significativa entre as larvas gerado no pólen de acolhimento (0.170 ± 0,01 g, N = 16) e não-host pólen (0,105 0,01 g, N = 16) . Bonferroni corrigidas comparações Post-hoc indicaram que a biomassa prepupal não variou significativamente entre tratados com fungicida e não tratado gerados no acolhimento de grupos (P = 0,22) e não-host (P = 0,08) pólen. No entanto, a biomassa prepupal foi significativamente maior entre as larvas geradas no pólen de anfitrião comparado ao pólen não-host para ambos tratados com fungicida (P < 0,001) e não tratados (P < 0,001) pólen. O efeito de interação (fonte de pólen do × de exposição de fungicida) não foi significativo (F1,28 = 0,132, P = 0.72). Figura 5 e Figura 6 são representações gráficas dos resultados obtidos a partir da análise acima mencionada. Independente de amostras t-teste indicado um efeito significativo na sobrevivência larval de fonte de pólen (N = 18, t9 =-2.45, P =0,04).

Figure 5
Figura 5. Gráfico de barras mostrando métricas para fitness larval baseado no tempo do desenvolvimento larval e biomassa prepupal. Métricas de aptidão larval são agrupadas com base em (A) e (B) fonte de pólen; e (C) e (D) fungicida exposição. (Média ± 1 SE). P < 0,001 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. Enredo de interação para métricas de aptidão larval. Efeitos interativos da exposição de fungicida e fonte de pólen na hora do desenvolvimento larval do (A) e (B) biomassa prepupal. (Média ± 1 SE). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Correlação de Pearson foi usada para explorar a relação entre o tempo do desenvolvimento larval e biomassa de prepupal (Figura 7). Observou-se uma correlação negativa significativa entre todos os grupos de tratamento (r =-0.83, P < 0,001, N = 32) e através de tratamentos de fungicida (nenhum fungicida: r =-0.76, P < 0,001, N = 18; Fungicida: r =-0.92, P < 0,001, N = 14). Enquanto houve uma correlação negativa significativa para larvas gerado no host não pólen (r =-0.64, P < 0,01, N = 16), essa coligação não foi observada para larvas geradas no anfitrião-pólen (r =-0.01, P = 0.98, N = 16).

Figure 7
Figura 7. Relação entre o tempo do desenvolvimento larval e biomassa prepupal. Correlação de Pearson entre o tempo de desenvolvimento e prepupal biomassa através de (A) todos os grupos de tratamento (P < 0,001) fonte de pólen (B) (Host pólen: P = 0,98, pólen de Non-host: P < 0,01); (C) exposição de fungicida (nenhum fungicida: P < 0,001, fungicida: P < 0,001). Para os painéis (B) e (C), linhas de tendência são cores combinadas com símbolos da lenda de figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Video 1
Animado Figura 1. Quinto estágio larval ínstar do . ribifloris dentro de um único poço de uma placa do multiwell. A larva é anotada para ter começado a girar um casulo de seda em preparação para pupa. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

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Discussion

Criação de abelhas do lado de fora seus juncos de nidificação naturais, sob condições de laboratório, permite o teste de múltiplas hipóteses relativas à aptidão larval. Na medida em que fatores não identificados continuam a causar mortalidade das abelhas, os estudos de avaliação de risco usando em vitro experiências podem ajudar a identificar ameaças potenciais e informar as práticas de gestão para este grupo de ricos em espécies de polinizadores selvagens 12 ,38,,49,76,81,82.

Em geral, os tempos de desenvolvimento mais curtos e maior biomassa prepupal está associado com maior aptidão larval. Em todos os tratamentos, duração do desenvolvimento larval correlacionou-se negativamente com biomassa prepupal. No entanto, houve diferença significativa entre a duração do desenvolvimento larval e biomassa prepupal em quatro grupos. As larvas que não recebeu qualquer fungicidas e foram autorizadas a consumir pólen anfitrião tinham o menor tempo de desenvolvimento larval e a maior biomassa prepupal. Em contraste, as larvas que consumiu o pólen de host não tratada com fungicida, levou mais tempo para desenvolvimento larval completo e teve a menor biomassa prepupal. No entanto, as tendências para a sobrevivência larval foram menos claras, com mortalidade sendo observada apenas para o grupo tratada com fungicida gerado no pólen de anfitrião. Desconstruir os efeitos principais e interação de exposição de fungicida e fonte de pólen revelou que: (i) o principal efeito de consumir pólen tratada com fungicida teve um impacto negativo significativo na biomassa prepupal, mas a duração do desenvolvimento larval não. Enquanto um estudo anterior demonstrou toxicidade oral aguda em adultos Osmia em altas concentrações,, estes resultados sugerem que exposição oral a propiconazol em concentração muito baixa pode afetar a aptidão reduzindo a biomassa prepupal23 . (ii) o principal efeito de consumir pólen host não tem um efeito adverso na aptidão larval. Estes resultados são consistentes com estudos publicados anteriormente que sugerem a qualidade de pólen (ou seja, presença de toxinas, compostos de proteção, falta de nutrientes essenciais), e as diferenças na fisiologia da abelha podem restringir a abelhas utilizando pólen não-host68 . Também é provável que a ausência da microbiota benéfica normalmente adquirido a partir da colheita de acolhimento-pólen e/ou abelha pode exacerbar este efeito. (iii) não houve nenhuma interação significativa entre a exposição de fungicida e fonte de pólen na aptidão larval. Do outro lado grupos fungicida-tratados e não tratados, larvas consumindo pólen de host não tiveram significativamente menor biomassa prepupal e larval do desenvolvimento tempo comparado com larvas geradas no pólen de anfitrião. Independentemente da fonte de pólen, larvas consumindo tratada com fungicida disposições tinham significativamente menor biomassa prepupal comparada com larvas geradas no pólen não tratada. Além dos principais efeitos significativos, o efeito interativo de ambos os fatores em conformidade com o modelo aditivo, ou seja, os efeitos negativos do tipo de exposição e pólen de fungicida na aptidão larval não foram sinérgicos. As incertezas decorrentes da interação de vários determinantes da saúde das abelhas (como detalhado aqui), restringir a eficácia das estratégias de gestão de polinizadores. Ajudando a prever os efeitos interativos de múltiplos fatores de risco, resultados de experimentos semelhantes baseados em laboratório podem ajudar a contornar este desafio de longa data nos esforços de conservação de abelha.

Existem várias etapas críticas no âmbito do presente protocolo que possam influenciar o resultado do experimento. Sempre que possível, é aconselhável usar pólen orgânico que é livre de resíduos de pesticidas. Usar pólen de fontes desconhecidas aumenta o risco de contaminação com diversos agrotóxicos, que pode confundir os resultados experimentais. É importante obter recentemente conectado Osmia canas de nidificação para que apenas unhatched ovos ou larvas muito jovens são utilizadas no estudo. Isso garante que as larvas são geradas quase inteiramente sobre o tipo de tratamento pretendido pólen. O aninhamento reed deve ser dissecado usando uma incisão superficial, sem o que as disposições de pólen e ovos podem ser danificados durante a colheita. Uma vez que os ovos foram removidos devem ser manipulados com cuidado para evitar danos e retidos nos barcos pesam em um ambiente higiênico escuro fresco (por exemplo, do gabinete de biossegurança) até que eles são transferidos. Este tempo de armazenagem deve ser mantido a um mínimo (< 30 min) para garantir que a qualidade do ovo não é comprometida. Todos os procedimentos que devem ser executados em uma armário para garantir um ambiente limpo de biossegurança trabalhando o meio ambiente e reduzir as chances de contaminação. Para garantir sua eficácia, utilize apenas soluções preparadas fungicida para tratamentos. Dado que o pólen é hidrofóbico, a solução fungicida / água estéril deve ser introduzida a depressão feita dentro de disposições de pólen. Isso maximiza o volume de líquido que permeiam através da prestação. No entanto, é importante que a depressão não perfurar a toda a profundidade da prestação, como resultaria na perda de volume da solução aderindo ao piso da cápsula. Os tratamentos individuais e controles devem ser conduzidos em placas bem separadas para reduzir as chances de contaminação cruzada de compostos voláteis e/ou transmitidas por pólen microbiota. Pedaços de fita dobrada devem ser anexados às bordas da placa para permitir abertura de ar suficiente, uma vez que as pálpebras estão no lugar. Durante observações diárias, as placas devem ser manuseadas cuidadosamente para minimizar a perturbação para as larvas. As observações devem ser feitas sob o microscópio com mínima intensidade de luz, e as tampas não devem ser removidas, a menos que a descartar as larvas mortas. Em caso de mortalidade generalizada inesperada, tanto as larvas e as suas disposições de pólen devem ser inspecionadas visualmente para verificar se há sinais de infecção e infestação. As placas bem contendo as repetições comprometidas devem ser imediatamente descartado, o espaço de trabalho desinfectado, e instrumentos esterilizados para evitar a propagação da infecção.

Não obstante sua aplicação abrangente, existem certas limitações para este método. Por exemplo, enquanto é prática recomendada usar pólen orgânico, sempre que disponível, criar plantas dentro de um ambiente de estufa para produzir quantidades suficientes de puro pólen contaminado é logisticamente proibitivo. Em tais casos, pólen coletado selvagem pode ser usado, desde que ele é exibido para a presença de resíduos de pesticidas. Outra estratégia para reduzir o risco de contaminação quando usando pólen coletado selvagem é obter o pólen de uma fonte que é menos provável que tenha sido pulverizada (por exemplo, imaculadas áreas não perturbadas localizadas longe as explorações agrícolas). O pólen de anfitrião utilizado neste estudo foi obtido de aninhamento canas que foram colocadas em florestas naturais e pastagens em torno da base da Cordilheira Wasatch perto Kaysville, Utah. Dado que esta região é dominada por florestas naturais selvagens, não gerenciadas, longe de quaisquer áreas agrícolas comerciais e que essas abelhas não voam tão longe como as abelhas quando forrageando83,84,85, é extremamente improvável que o pólen que eles coletaram teria sido pulverizado. Assim, os resíduos de pesticidas dentro o pólen coletado aqui são susceptíveis de ser trivial. Forrageamento em tais paisagens selvagens, a fêmea adulta é menos provável encontrar pólen contaminado, reduzindo o risco de exposição entre as larvas. O pólen de abelha comprado comercialmente utilizado neste estudo é coletado de áreas florestais naturais no norte de Wisconsin e Michigan. Comercializados para consumo humano, informações publicamente disponíveis e comunicação pessoal com o fornecedor indica que a urticária não é tratadas quimicamente, e o pólen é vendido na sua forma natural, crua, sem quaisquer modificações,86. Portanto, é razoável supor que a carga contaminante no pólen de abelha comprado comercialmente seriam mínima. Para estudos que não obter pólen de não gerenciadas áreas com vegetação natural selvagem, é aconselhável ter evidência empírica direta da análise química de pólen para garantir que o pólen utilizados em ensaios de risco é livre de contaminantes. Outra limitação envolve o artifício introduzido pelo ambiente de criação artificial. Apesar dos esforços, não é logisticamente viável para replicar o microambiente exata dentro de uma palheta de nidificação natural (ex., umidade, concentração de oxigênio, a estrutura tridimensional das câmaras individuais), que podem ter impacto larval aptidão para graus desconhecidos. Para defensivamente simular as características da dieta natural, dados preliminares da nidificação palhetas devem ser obtidos antes em vitro estudos de manipulação de dieta. Embora o pólen de host não utilizado neste estudo é obtido a partir de áreas onde a uva de Oregon é ausente ou rara87, pode haver vestígios de pólen anfitrião misturado dentro o pólen adquirido comercialmente, potencialmente afetando os resultados. Outra desvantagem dessa técnica é que lidar com o estresse durante o período experimental pode causar efeitos adversos sobre as abelhas. Finalmente, embora seja comum encontrar unhatched ovos em natureza63, sob condições de laboratório é difícil verificar se a falha para eclodir foi devido a lidar com stress, tratamento experimental ou um resultado de causas naturais. Uma vez que estes factores podem introduzir desconhecidos graus de parcialidade o estudo, um ter cautela ao interpretar os resultados obtidos.

Controlando-se para fatores que comprovadamente podem influenciar o resultado experimental (por exemplo, eficiência de forrageamento materna75, variações específicas de sexo77e pólen dietético68,72), o protocolo descrito fornece melhorias substanciais mais anteriormente publicado técnicas76e oferece um quadro mais rigoroso para o teste de hipóteses. Por exemplo, usando em vitro-abelhas criadas permite investigações sobre sexo-específicos respostas para tratamento de xenobióticos, que caso contrário poderia ser um desafio para estudar entre populações selvagens de cavidade-assentamento abelhas49,88. O potencial para manipular e testar vários fatores interagindo (por exemplo, dieta de qualidade e quantidade, microbiota associada a dieta, exposição a pesticidas sinérgicas), podem fornecer insights valiosos sobre os determinantes da aptidão de abelha. A flexibilidade do protocolo prontamente permite modificações (por exemplo, usando diferentes tamanho de placas bem para acomodar as larvas de diferentes tamanhos, alterando o tipo e a quantidade de dieta), tornando-se favorável para o uso com várias outras espécies de abelhas solitárias e as vespas 76. enquanto este estudo avaliado aptidão baseado no desenvolvimento e sobrevivência na fase de alimentação, insetos podem ser incubados até surgimento para obter dados adicionais sobre a taxa de surgimento, conversão alimentar-a-corpo e pós-emergência longevidade 49. esta informação pode ajudar a avaliar os efeitos sub-letais de tratamentos em ensaios de toxicidade. Com interesse crescente em função do pólen-microbiome, estudos baseados em laboratório podem identificar sensíveis contra espécies de abelha resistente baseado em seu pólen microbiota71. Diferenças na susceptibilidade de fungicida em grupos de abelha podem ser exploradas por sequenciamento a microbiota dentro de pólen armazenados na colmeia. Isso pode ajudar a determinar o papel do pólen microbiome para conferir graus variados de resistência a estressores xenobióticos. Estudos futuros também poderá ajudar a identificar as diferenças entre a microbiota natural do host e host não pólen, que pode servir como um fator subjacente oligolectic comportamento dentro da espécie abelha selecione a conduzir.

Em vitro criação das abelhas solitárias larvas pode ajudar a controlar a variabilidade natural experimentado em estado selvagem, delineando, assim, o papel de fatores individuais e interagindo em afetar a aptidão de abelha. Esta técnica acessível e barata expande toolkit dos entomologistas, permitindo que a manipulação de vários parâmetros, que pode ser facilmente modificado para objectivos específicos de pesquisa de endereço. Se evidências de experimentos em vitro podem ajudar a identificar as populações em situação de risco, o impacto sobre as estratégias de conservação de abelha será substancial.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecer Kimball Clark e Tim Krogh para fornecer Osmia aninhamento juncos, Meredith Nesbitt e Molly Bidwell para assistência em laboratório, os Drs Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter e três revisores anônimos para seus comentários úteis que melhorou o manuscrito. Este trabalho foi financiado por fundos de USDA-Agricultural Research Service, que se apropriou (atual Research Information System #3655-21220-001), Wisconsin, Ministério da agricultura, do comércio e defesa do consumidor (#197199), National Science Foundation (sob N º de Grant Deb-1442148), o centro de pesquisa de bioenergia do DOE grandes lagos (DOE escritório de ciência BER DE-FC02-07ER64494).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reeds Nativebees.com NA Freshly plugged reeds
Dissection set VWR 89259-964 Sterilize before use
Long Nose Pliers Husky 1006
6 well culture plates VWR 10062-892 Sterile sealed
48 well culture plates VWR 10062-898 Sterile sealed
Petri dishes VWR 25373100 Sterile sealed
Square Weighing Boats VWR 10770-448
Camel Hair Brush Bioquip 1153A
Tin capsules EA Consumables D1021 Sterilize before use
Sucrose VWR 470302-808
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Honey bee pollen Bee energised 897098001244 Untreated, natural, raw pollen
Microbalance VWR 10204-990
Pulverisette LAB SYNERGY INC. 30334913
Wooden sticks VWR 470146908 Sterilize before use
Sealing tape VWR 89097-912
Microscope VWR 89403-384
Planting tray VWR 470150-632
Ethanol VWR BDH1158-4LP
Centrifuge tube VWR 21008936
Microsyringe Cole-Palmer UX-07940-07
Rubber tweezer Amazon B0135HWPN4
Syringe needles VWR 89219-334
Freeze drier Labcono LFZ-1L
Statistical software SPSS Version 21.0

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<em>In Vitro</em> Criação de abelhas solitárias: uma ferramenta para avaliar os fatores de risco Larval
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Dharampal, P. S., Carlson, C. M., Diaz-Garcia, L., Steffan, S. A. In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors. J. Vis. Exp. (137), e57876, doi:10.3791/57876 (2018).

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